CN115852495B - 一种基因突变文库的合成方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基因突变文库的合成方法及其应用,所述方法包括:通过PCR反应将双链形式的目标DNA转换成含有dUTP的单链DNA;通过梯度降温式退火反应将Trimer引物连接至上述含有dUTP的单链DNA上,所述退火反应的程序为90‑95℃孵育5‑10min,以0.1‑0.2℃/s从90‑95℃降至20‑30℃,20‑30℃孵育30‑35min;退火后经过序列延伸、连接反应,形成Trimer结合下的双链杂合DNA突变序列集合;将所述集合经UDG酶消化,以消化产物为模板进行PCR扩增,获得目标基因特定区域多样化的突变序列集合;将所得序列集合与载体重组连接形成重组质粒,得到基因突变文库。
Description
技术领域
本发明属于合成生物学技术领域,具体涉及一种基因突变文库的合成方法及其应用。
背景技术
目前,以PCR技术为基础的基因突变文库构建方法主要有随机突变法和定点突变法。其中,随机突变法,如Error-prone PCR法即易错PCR法,也是目前应用最广泛的技术之一,主要利用非高保真DNA聚合酶在PCR扩增过程中随机产生突变点(Wang Y et al.,Directed Evolution:Methodologies and Applications.Chem Rev.2021Oct 27;121(20):12384-12444)。随机突变法的优势在于无需知晓蛋白质结构-功能关系知识的情况下可以快速工程目标蛋白。定点突变法,针对特定位点设计大量定点突变引物,通过PCR方法系统地构建突变体文库序列。定点突变法的优势在于对调控功能蛋白稳定性、活性等关键位点进行突变,创建小而精确的文库。尽管上述这些方法的出现推动了酶、抗体等功能蛋白的定向进化过程,但是在实际应用过程中仍有不同程度的局限性。
CN110951762A公开了一种利用dITP进行基因随机突变的方法,在Taq DNA聚合酶的PCR体系中加入dITP,得到PCR扩增产物;dITP与4种碱基都能够配对,因此在目标基因中引入了大量的突变碱基。将扩增的PCR产物克隆到目的载体,获得目标基因的全位点随机突变文库。该发明的基因突变文库的突变覆盖度高,突变丰度可调,是一种构建基因随机突变文库的良好方法,可用于目标基因定向进化突变筛选。但是,随机突变法无法精确控制文库突变体的突变类型,突变效率低,而且容易引入终止密码子。
CN110894499A公开了一种基因定点突变的方法,该发明通过先对目标基因片段进行重叠延伸PCR扩增,以对目标基因片段进行定点突变,得到含有突变位点的基因片段,然后将该含有突变位点的基因片段与连入合适的载体,即可获得重组质粒,作为重叠延伸PCR法的扩展,避免了以重叠延伸PCR法直接对长基因进行全长基因扩增时难以获得含有突变位点的扩增产物的问题。虽然定点突变法虽优于随机突变法,但PCR扩增过程中易产生密码子偏好性,而且随着突变位点数目增多,定点突变序列的正确率也会大幅度降低。
对于一些基因序列多样化需求高的生物学功能研究,需对基因的多个可变区同时进行多样化,从而得到序列更加丰富的基因突变文库,为挖掘基因的多样化功能及实现功能蛋白的定向进化提供更多可能性。现有的基因定点突变方法虽然可以快速实现一个基因上多个可变区同时多样化,但是技术流程仍不成熟,存在效率低下的步骤,不能保证每个区域的正确率:随着可变区域数目的增加,每个可变区多样化的正确率会出现不同比率的降低。如何保证一个基因上多个可变区域同时多样化的正确率仍是业界一大难题。
为提高一个基因上多个可变区域同时多样化的效率,开发一种基因突变文库合成方法,为推动功能蛋白的定向进化,对抗体工程、酶工程、合成生物学等领域关键基因功能的挖掘与优化具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足,本发明的目的在于提供一种基因突变文库的合成方法及其应用,所述方法基于一种操作简单、综合成本低的PCR技术以及结合其它分子生物学技术,能够快速实现高正确率、高多样化的基因突变文库合成,尤其适用于一个在基因中的多个区域同时进行多样化文库构建。
为达到此发明目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种基因突变文库的合成方法,所述合成方法包括如下步骤:
(a)采用PCR反应将双链形式的目标DNA转换成含有dUTP的单链DNA;
(b)通过梯度降温式退火反应将Trimer引物连接至步骤(a)所得的含有dUTP的单链DNA上,所述梯度降温式退火反应的程序为90-95℃孵育5-10min,以0.1-0.2℃/s从90-95℃降至20-30℃,20-30℃孵育25-35min;结合到含有dUTP单链DNA上的Trimer引物经过序列延伸、连接反应,形成Trimer结合下的双链杂合DNA突变序列集合;
(c)将步骤(b)的产物经过UDG酶消化,以消化产物为模板进行PCR扩增,获得大量可用于克隆建库的目标基因特定区域多样化的突变序列集合;
(d)将步骤(c)中序列集合与载体重组连接形成重组质粒,得到基因突变文库。
本发明中,所述基因突变文库合成方法在PCR技术背景下通过模板形式的多次转换,最终一次性实现一个基因序列上多个区域同时多样化。依据此方法构建的基因突变文库的正确率高达76.9%。与现有的技术相比,具有操作简单、效率高、综合成本低等优势;减小工作量的同时提高了基因突变的序列多样性;实现了一次性完成一个基因序列上多个区域同时多样化的技术突破。本发明的基因突变文库合成方法为酶、抗体等功能蛋白的定向进化提供合成生物学解决方案。
优选地,步骤(a)中,所述PCR反应的具体步骤包括:
(a1)通过PCR反应将目的基因转换并扩增为含有dUTP的双链DNA模板,所述双链DNA模板的一条链5’端为磷酸化修饰,另一条链5’端为Blocker修饰;
(a2)通过λ核酸外切酶将所述含有dUTP的双链DNA模板中磷酸化标记的DNA单链降解,获得的含有dUTP的单链DNA粗产物,经过异丙醇沉淀、RP-HPLC双重纯化,获得精制的含有dUTP的单链DNA模板,用于下一步实验。
优选地,步骤(a1)中,所述PCR的反应体系包括缓冲液、dNTP混合物、上游引物、下游引物、模板DNA和DNA聚合酶。
优选地,所述模板DNA的存在形式为双链DNA。
本发明中,所述模板DNA包括但不限于质粒或目的基因片段等。
优选地,所述上游引物5’端为磷酸化修饰的。
优选地,所述下游引物5’端为Blocker修饰的。
优选地,所述下游引物5’端的修饰采用的基团包括烃基基团、氨基基团或荧光基团。
优选地,所述烃基基团包括C6烃基基团或C7烃基基团。
优选地,所述荧光基团包括FAM、HEX、TAMARA或ROX。
优选地,所述dNTP混合物为dUTP/dATP/dCTP/dGTP混合物。
优选地,步骤(a1)中,所述PCR反应结束后,还包括采用DpnI酶降解反应体系中的模板DNA的步骤。
本发明中,所述的λ核酸外切酶酶切反应组分为:步骤1)的纯化产物、10×λ核酸外切酶缓冲液、λ核酸外切酶。
优选地,步骤(a2)中,纯化后还包括PCR扩增检测的步骤。
优选地,所述PCR扩增检测采用高保真酶进行,优选为Phusion高保真酶。
优选地,所述PCR扩增检测的判定标准为:阳性对照可以扩增出目的片段;以纯化后的含dUTP的单链DNA为模板无法扩增出目的条带。
本发明中,经提纯后的产物需进行PCR扩增检测,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,无目的条带产生,表明λ核酸外切酶酶切彻底,可进行下一步实验。
步骤(b)中,所述梯度降温式退火反应的反应体系包括:含有dUTP的单链DNA、缓冲液、dNTP混合物、正向首引物和5’端磷酸修饰Trimer引物。
优选地,所述含有dUTP的单链DNA的浓度为100-300ng/μL。
优选地,步骤(b)中,所述延伸、连接的反应体系包括:步骤(b1)制备的退火产物、DNA聚合酶和DNA连接酶。
优选地,所述DNA聚合酶包括Phanta U超高保真DNA聚合酶。
优选地,所述DNA连接酶包括Taq DNA连接酶。
优选地,步骤(c)中,所述PCR扩增的反应体系包括:步骤(b)制备的DNA突变序列集合、UDG酶、正向引物、反向引物、缓冲液、dNTP混合物和DNA聚合酶。
优选地,所述DNA聚合酶包括Hotstart高保真聚合酶。
优选地,步骤(c)中,所述PCR扩增的反应程序在启动前还包括采用UDG酶消化带有dUTP的DNA链的步骤,所述消化条件为:在37-42℃反应15-20min。
本发明中,在37-42℃反应15-20min的作用为采用UDG酶消化带有dUTP的DNA链。将PCR反应的产物全部进行琼脂糖凝胶电泳,将目标条带回收纯化,回收产物即为文库序列,可直接用于下一步文库构建。
优选地,步骤(d)中,连接形成重组质粒后,还包括筛选的步骤:
将所得重组质粒转化至大肠杆菌,经过培养、筛选,获得阳性转化子,收集阳性转化子,进行质粒抽提,最终获得的质粒集合即为基因突变序列文库。
优选地,所述转化的方式包括电穿孔转化。
第二方面,本发明提供一种基因突变文库,所述基因突变文库是使用第一方面所述的基因突变文库的合成方法构建的。
第三方面,本发明提供一种用于构建基因突变文库的试剂盒,所述试剂盒采用第一方面所述的基因突变文库的合成方法进行基因突变文库构建。
第四方面,本发明提供第一方面所述的基因突变文库的合成方法在构建基因突变文库构建中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值,还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值,限于篇幅及出于简明的考虑,本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
本发明所述基因突变文库合成方法构建的基因突变文库的技术流程容易掌握,重现性好,正确率高达76.9%。与现有的技术相比,本发明所述合成方法具有操作容易掌握、效率高、综合成本低等优势;保证高效率的同时提高了基因突变的序列多样性;实现了一次性完成一个基因序列上多个区域同时多样化的技术突破,为酶和抗体等功能蛋白的定向进化提供合成生物学解决方案。
附图说明
图1为本发明的原理模式图。
图2为PCR技术检测含有dUTP的单链DNA纯度的电泳展示图;泳道1为以纯化后含dUTP的单链DNA为模板的PCR扩增产物电泳结果;泳道2为阳性对照,以双链目标基因DNA为模板的PCR扩增产物电泳结果;泳道M为DNA marker;框出区域为扩增产物序列的理论大小。
图3为PCR扩增所得文库序列集合的电泳展示图;泳道1-10分别为10个单位PCR扩增体系所得文库序列集合的电泳结果,泳道M为DNA marker;框出区域为目标基因序列理论大小。
图4为菌落PCR技术检测文库正确率结果展示图;泳道1-13为13个阳性菌落分别进行目标序列PCR扩增检测的电泳结果,泳道M为DNA marker;框出区域为目标基因序列理论大小。
图5A为Sanger测序检测文库序列正确率的序列比对结果展示图(可变区1)
图5B为Sanger测序检测文库序列正确率的序列比对结果展示图(可变区2)
图5C为Sanger测序检测文库序列正确率的序列比对结果展示图(可变区3)
图5D为Sanger测序检测文库序列正确率的序列比对结果展示图(可变区4)
图5E为Sanger测序检测文库序列正确率的序列比对结果展示图(可变区5);
图5F为Sanger测序检测文库序列正确率的序列比对结果展示图(可变区6);图5A-F的分段序列比对图依次首、尾相连即为序列的完整比对结果;文库序列中N表示A、C、G、T中的任意碱基。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1一种全合成人源化抗体多区域基因突变文库构建
所述突变文库构建的过程参照图1,本实施例提供一种基因突变文库的构建方法,所述方法通过PCR模板形式的多次转换实现目标基因多个特定区域序列同时发生多样性变化,具体步骤为:
(1)引物合成。
设计合成用于合成一条链5’端为磷酸化修饰,另一条链5’端为C6 Blocker修饰的含dUTP的DNA双链模板的引物。
上游引物-F(SEQ ID NO:1):PHO-GGAAGAAGGTGTTCAATTG;
下游引物-R(SEQ ID NO:2):C6-TAGAATCGAGACCGAGGAGAG。
(2)PCR扩增产生含有dUTP的DNA双链目标基因。
以带有目标基因原始序列的质粒为模板采用PCR反应进行模板扩增,扩增的反应体系为表1中20×Rxn的两倍。反应体系见表1,反应程序见表2。
表1
表2
(3)利用DpnI酶消除体系中带有目标基因原始序列的质粒。
将步骤(2)中产物先混合并充分混匀,再等体积分装于两个1.5mL的离心管中,向其中分别加入10μL DpnI酶,37℃孵育(以便消除非磷酸化的模板),30min后进行回收纯化。
(4)获得含有dUTP的单链DNA。
将步骤(3)的纯化产物进行λ核酸外切酶消化反应,消除产物DNA的磷酸化修饰链,最终产物为5’端为C6 Blocker修饰、含有dUTP的单链DNA集合,酶消化反应的反应体系及程序如表3所示。
表3
(5)将步骤(4)所得PCR产物进行纯化回收。纯化方式为异丙醇沉淀与RP-HPLC纯化。
(6)检测步骤(5)纯化产物的纯度。
以步骤(5)的产物为模板,进行Phusion高保真酶参与的PCR扩增检测,Phusion高保真酶无法以含有dUTP的单链DNA为模板扩增出目的条带。反应体系(表4)及反应程序(表5)如下所示。
表4
表5
结果显示(图2)阳性对照可以扩增出目的片段,而以步骤(5)的产物为模板进行扩增的产物不能扩增出目的条带。这表明λ核酸外切酶消化反应彻底,产物均为含有dUTP的单链DNA,可用于下一步实验。
(7)根据抗体序列可变区(CDR)设计合成Trimer引物。
目标基因序列共有6个可变区,据此设计6个Trimer引物。每个Trimer引物由可变区序列和可变区两端各20nt的非可变区序列(重组臂)组成。其中,Trimer引物的5’端为磷酸化修饰,可变区的X表示20种氨基酸种的任一一种。因此每个Trimer引物种类是多样的,如下Trimer 1有8个可变氨基酸,则Trimer1的种类有208种。6个Trimer引物如下所示:
Trimer 1:
P-GATTGTCTTGTGCTGCTTCTX1X2X3X4X5X6X7X8ATGTCTTGGGTTA GACAAG。
Trimer 2:
P-GTTTGGAATGGGTTGCTAATX9X10X11X12X13X14X15X16TACTATGT CGACTCTGTC。
Trimer 3:
P-CTGTTTATTACTGTGCTAGAX17X18X19X20X21X22X23X24X25X26TGGGGTCAAGGTACTTTG。
Trimer 4:
P-CTTGTAGATCTTCTCAATCTX27X28X29X30X31X32X33X34TATTTGA ATTGGTTTCAAC。
Trimer 5:
P-CTCCAAGGAGGTTGATTTATX35X36X37AATAGGGATTCTGGTGTTC。
Trimer 6:
P-GACGTCGGTGTTTACTATTGTX38X39X40X41X42X43X44X45ACTTTT GGTCAAGGTAC。
(8)Trimer引物经退火反应,通过重组臂与含有dUTP的单链DNA模板进行互补配对连接。包括5’端磷酸化修饰的正向首引物与Trimer引物同时退火连接至含有dUTP的单链DNA模板。具体反应体系(表6)及反应程序(表7)如下所示。反应体系中所述含有dUTP的单链DNA的浓度为200ng/μL。
表6
表7
(9)合成DNA杂合双链。
在Phanta U超高保真DNA聚合酶的作用下,步骤(8)产物上的引物以含有dUTP的单链DNA为模板进行延伸,形成以含有dUTP的单链DNA模板结合下的7个基因片段,Taq连接酶作用下将7个DNA片段连接,最终形成DNA杂合双链。具体反应体系(表8)及反应程序(表9)如下所示:
表8
表9
(10)PCR扩增抗体基因多样化序列:以步骤(9)中产物DNA杂合双链为模板进行PCR序列扩增。PCR扩增所用引物如下所示:
上游引物-F:GGAAGAAGGTGTTCAATTG;
下游引物-R:TAGAATCGAGACCGAGGAGAG。
在反应体系中加入UDG酶用于消除DNA杂合双链中含dUTP的单链,PCR反应体系数为10×Rxn。具体PCR反应体系(表10)及反应程序(表11)如下所示:
表10
表11
将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果如图3所示。将含有目的条带的琼脂糖凝胶切下并纯化,纯化产物作为目标基因突变文库序列进行下一步实验。
(11)将步骤(10)中产物抗体基因多样化序列与载体质粒pYD5进行重组连接,重组反应体系及程序如表12所示:
表12
(12)将步骤(11)的重组质粒经电穿孔转化至大肠杆菌菌株Stbl3,在温度为30℃,转速为200rpm的摇床中复苏1h,然后在特定抗性固态培养基上培养并筛选。
(13)从固态培养基上随机选取13个阳性单菌落分别置于200μL液体LB培养基中并于37℃,200rpm的摇床中孵育3h,随后分别吸取2μL进行目标基因的菌落PCR扩增并通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳结果如图4所示:除了菌落5、6及11扩增产物不符合目标基因序列大小,其它10个均符合,初步推测建库序列正确率为76.9%。
(14)为进一步验证上述正确率结果,将上述符合目标基因大小的菌落分别进行Sanger测序,然后将测序结果与目标基因序列进行比对。
为实现目标基因可变区可视化,本实施例将其可变区的碱基用相同数目的“N”表示而其它部分碱基不变,将这种表示的序列称为文库基因序列。11个含目的基因的菌落Sanger测序结果(分别标记为1-11)与目标基因及文库基因序列比对结果如图5A-F所示:1-11的序列可变区的碱基数目与文库基因序列的N的数目一致,而且每条序列的6个可变区序列均与目标基因可变区序列不同。进一步应证了步骤(13)的结果。这表明本发明通过上述PCR技术实现了一次性完成一个基因上6个可变区的同时多样化。
(15)将所有阳性菌落收集后进行质粒抽提,所得质粒集合即为全合成人源化抗体多区域基因突变文库。
实施例2
本实施参照实施例1的基因突变文库的构建方法,对Trimer引物经退火反应体系中不同单链DNA的浓度的比较。
以实施例1中步骤(6)纯化鉴定后的含有dUTP的单链DNA为模板,重复实施例1中的(8)-(13)。考察不同单链DNA的浓度的构建结果,结果如表13所示。
表13
单链DNA的浓度 | 建库序列正确率 |
100ng/μL | 64.2% |
250ng/μL | 71.3% |
300ng/μL | 75.3% |
50ng/μL | 10.28% |
350ng/μL | 31.4% |
通过表13的结果可知,当单链DNA浓度在100-300ng/μL的范围内,建库序列正确在60%-75%之间,当浓度超出这个范围如50ng/μL及350ng/μL,正确率分别为10.28%、31.4%,正确率不同程度下降;这表明单链DNA浓度100-300ng/μL为建库最优浓度范围。
实施例3
本实施例参照实施例1的基因突变文库的构建方法,对比了不同温度控制退火反应程序的建库效果。
实验1:Trimer引物经退火反应的程序如表14所示,其余步骤参照实施例1。
表14
实验2:Trimer引物经退火反应的程序如表15所示,其余步骤参照实施例1。
表15
实验3:Trimer引物经退火反应的程序如表16所示,其余步骤参照实施例1。
表16
实验4:Trimer引物经退火反应的程序如表17所示,其余步骤参照实施例1。
表17
实验5:Trimer引物经退火反应的程序如表18所示,其余步骤参照实施例1。
表18
实验6:Trimer引物经退火反应的程序如表19所示,其余步骤参照实施例1。
表19
实验7:Trimer引物经退火反应的程序如表20所示,其余步骤参照实施例1。
表20
实验8:Trimer引物经退火反应的程序为恒温退火,退火的程序为90℃退火5min,其余步骤参照实施例1。
实验9:Trimer引物经退火反应的程序为恒温退火,退火的程序为50℃退火20min,其余步骤参照实施例1。
对实验1-9的退火反应所得产物进行延伸合成DNA杂合双链,重复实施例1中的(9)-(13),考察不同退火反应方式的构建结果,检测结果如表21所示。
表21
样品 | 建库序列正确率 |
实验1 | 69.23% |
实验2 | 67.56% |
实验3 | 72.41% |
实验4 | 42.01% |
实验5 | 54.2% |
实验6 | 50.31% |
实验7 | 48.36% |
实验8 | 16.39% |
实验9 | 22.81% |
从表21的结果可知,实验1-3条件下的建库序列正确率均大于65%,明显高于其它实验组,这表明退火反应的最佳程序范围为90-95℃孵育5-10min,以0.1-0.2℃/s从90-95℃降至20-30℃,20-30℃孵育30-35min。
对比例1
本对比例提供一种基因突变文库的构建方法,所述方法与实施例1的区别仅在于,所述构建方法不进行步骤(5)中的纯化回收步骤,其余步骤参照实施例1。
基因突变文库构建后,对建库序列正确率进行检测,结果表明,不进行步骤(5)中的纯化回收步骤后,建库序列正确率为43.68%,远低于实施例中的方法,说明实施例1中所述构建方法更好,具有更高重现性和正确率。
综上,本发明提供一种基因突变文库合成方法,所述方法基于一种操作简单、综合成本低的PCR技术以及综合其他多种分子生物学技术,能够快速实现高正确率、高多样化的基因突变文库合成方法,尤其适用于一个在基因中的多个区域同时进行构建多样化文库。
申请人声明,以上所述仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,所属技术领域的技术人员应该明了,任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (24)
1.一种基因突变文库的合成方法,其特征在于,所述合成方法包括如下步骤:
(a)采用PCR反应将双链形式的目标DNA转换成含有dUTP的单链DNA;
(a1)通过PCR反应将目的基因转换并扩增为含有dUTP的双链DNA模板,所述双链DNA模板的一条链5’端为磷酸化修饰,另一条链5’端为Blocker修饰;
(a2)通过λ核酸外切酶将所述含有dUTP的双链DNA模板中磷酸化标记的DNA单链降解,获得的含有dUTP的单链DNA粗产物,经过异丙醇沉淀、RP-HPLC双重纯化,获得精制的含有dUTP的单链DNA模板,用于下一步实验反应;
(b)通过梯度降温式退火反应将Trimer引物连接至步骤(a)所得的含有dUTP的单链DNA上,所述梯度降温式退火反应的程序为90-95℃孵育5-10 min,以0.1-0.2℃/s从90-95℃降至20-30℃,20-30℃孵育30-35 min;结合到含有dUTP单链DNA上的Trimer引物经过序列延伸、连接反应,形成Trimer引物结合下的双链杂合DNA突变序列集合;
所述梯度降温式退火反应的反应体系包括:含有dUTP的单链DNA、缓冲液、dNTP混合物、正向首引物和5’端磷酸修饰Trimer引物;所述dNTP混合物为dTTP/dATP/dCTP/dGTP混合物;所述含有dUTP的单链DNA的浓度为100-300 ng/μL;
(c)将步骤(b)的产物经过UDG酶消化,以消化产物为模板进行PCR扩增,获得大量可用于克隆建库的目标基因特定区域多样化的突变序列集合;
(d)将步骤(c)中序列集合与载体重组连接形成重组质粒,得到基因突变文库。
2.根据权利要求1所述的基因突变文库的合成方法,其特征在于,步骤(a1)中,所述PCR的反应体系包括缓冲液、dNTP混合物、上游引物、下游引物、模板DNA和DNA聚合酶。
3.根据权利要求2所述的基因突变文库的合成方法,其特征在于,所述模板DNA的存在形式为双链DNA。
4.根据权利要求2所述的基因突变文库的合成方法,其特征在于,所述上游引物5’端为磷酸化修饰的。
5.根据权利要求2所述的基因突变文库的合成方法,其特征在于,所述下游引物5’端为Blocker修饰的。
6.根据权利要求5所述的基因突变文库的合成方法,其特征在于,所述下游引物5’端的修饰采用的基团包括烃基基团、氨基基团或荧光基团。
7.根据权利要求6所述的基因突变文库的合成方法,其特征在于,所述烃基基团包括C6烃基基团或C7烃基基团。
8.根据权利要求6所述的基因突变文库的合成方法,其特征在于,所述荧光基团包括FAM、HEX、TAMARA或ROX。
9.根据权利要求2所述的基因突变文库的合成方法,其特征在于,所述dNTP混合物为dUTP/dATP/dCTP/dGTP混合物。
10.根据权利要求1所述的基因突变文库的合成方法,其特征在于,步骤(a1)中,所述PCR反应结束后,还包括采用DpnI酶降解反应体系中的模板DNA的步骤。
11.根据权利要求1所述的基因突变文库的合成方法,其特征在于,步骤(a2)中,纯化后还包括PCR扩增检测的步骤。
12.根据权利要求11所述的基因突变文库的合成方法,其特征在于,所述PCR扩增检测采用高保真酶进行。
13.根据权利要求12所述的基因突变文库的合成方法,其特征在于,所述PCR扩增检测采用Phusion高保真酶进行。
14.根据权利要求11所述的基因突变文库的合成方法,其特征在于,所述PCR扩增检测的判定标准为:阳性对照可以扩增出目的片段;以纯化后的含dUTP的单链DNA为模板无法扩增出目的条带。
15.根据权利要求1所述的基因突变文库的合成方法,其特征在于,步骤(b)中,所述延伸、连接的反应体系包括:制备的退火产物、DNA聚合酶和DNA连接酶。
16.根据权利要求15所述的基因突变文库的合成方法,其特征在于,所述DNA聚合酶包括Phanta U超高保真DNA聚合酶。
17.根据权利要求15所述的基因突变文库的合成方法,其特征在于,所述DNA连接酶包括Taq DNA连接酶。
18.根据权利要求1所述的基因突变文库的合成方法,其特征在于,步骤(c)中,所述PCR扩增的反应体系包括:步骤(b)制备的DNA突变序列集合、UDG酶、正向引物、反向引物、缓冲液、dNTP混合物和DNA聚合酶。
19.根据权利要求18所述的基因突变文库的合成方法,其特征在于,所述DNA聚合酶包括Hotstart高保真聚合酶。
20.根据权利要求1所述的基因突变文库的合成方法,其特征在于,步骤(c)中,所述PCR扩增的反应程序在启动前还包括采用UDG酶消化带有dUTP的DNA链的步骤,所述消化条件为:在37-42℃反应15-20 min。
21.根据权利要求1所述的基因突变文库的合成方法,其特征在于,步骤(d)中,连接形成重组质粒后,还包括筛选的步骤:
将所得重组质粒转化至大肠杆菌,经过培养、筛选,获得阳性转化子,收集阳性转化子,进行质粒抽提,最终获得的质粒集合即为基因突变序列文库。
22.根据权利要求21所述的基因突变文库的合成方法,其特征在于,所述转化的方式包括电穿孔转化。
23.一种用于构建基因突变文库的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒采用权利要求1-22中任一项所述的基因突变文库的合成方法进行基因突变文库构建。
24.权利要求1-22中任一项所述的基因突变文库的合成方法在构建基因突变文库构建中的应用。
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WO2000005412A1 (en) * | 1998-07-24 | 2000-02-03 | Lumigen, Inc. | Methods of synthesizing polynucleotides by ligation of multiple oligomers |
CN105143525A (zh) * | 2013-03-15 | 2015-12-09 | 纽亘技术公司 | 用于生成成链rna或dna文库的方法、组合物和试剂盒 |
CN107250447A (zh) * | 2015-04-20 | 2017-10-13 | 深圳华大基因研究院 | 一种长片段dna文库构建方法 |
CN109609495A (zh) * | 2018-12-31 | 2019-04-12 | 吴江近岸蛋白质科技有限公司 | 一种高纯度单链dna制备方法及其应用 |
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Patent Citations (4)
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---|---|---|---|---|
WO2000005412A1 (en) * | 1998-07-24 | 2000-02-03 | Lumigen, Inc. | Methods of synthesizing polynucleotides by ligation of multiple oligomers |
CN105143525A (zh) * | 2013-03-15 | 2015-12-09 | 纽亘技术公司 | 用于生成成链rna或dna文库的方法、组合物和试剂盒 |
CN107250447A (zh) * | 2015-04-20 | 2017-10-13 | 深圳华大基因研究院 | 一种长片段dna文库构建方法 |
CN109609495A (zh) * | 2018-12-31 | 2019-04-12 | 吴江近岸蛋白质科技有限公司 | 一种高纯度单链dna制备方法及其应用 |
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