CN110592129A - 一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法，包括实验材料的准备、单点突变、目的基因片段扩增、表达载体双酶切及T5外切酶处理、转化、阳性转化子检测、测序比对以及碱基缺失。本发明在目的基因突变位点周围分成两段DNA片段，分别设计两对引物F1、R1，F2、R2，其中突变或缺失碱基位点设计在R1、F2中，R1与F2要有至少20bp的同源臂，F1与R2要分别和表达载体插入位置有至少20bp的同源臂，基因片段和载体片段在T5外切酶作用后，利用大肠杆菌自身的修复系统就可以得到含有目标位点的环状质粒，该方法同样适用于多位点碱基突变或缺失。

Description

一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法。
背景技术
蛋白质氨基酸的定点突变体或缺失在其结构和功能研究中发挥非常关键的作用，比如蛋白质相互作用区域的界定，蛋白质结构与功能的研究，磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化等修饰位点的确定，蛋白质细胞内定位序列的确定等。目前，基因点突变体或碱基缺失构建的常规方法有：A，OverlapPCR方法；该方法基本原理是将基因从突变位点前后分为两段，在引物中引入点突变，分别PCR后进行OverlapPCR将基因片段连接为完整基因，然后利用基因两段设计的酶切位点，经酶切后再插入至表达载体中。
但是在实验中我们发现该方法比较繁琐、耗时较长、要设计两对引物，进行两轮PCR，第一轮PCR结束后必须进行胶回收以去除模板对后续实验的干扰，另外第二轮PCR结束后需要再回收、酶切、与酶切后的载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞，酶切及测序鉴定，而第二轮PCR经常有可能扩增失败，需要多次摸索扩增条件，费时费力；B，反向PCR方法。该方法的原理是在基因突变的位点处设计一对带有点突变的反向互补(至少20bp)引物,以带有目的基因的重组载体为模板，进行反向PCR，将PCR产物回收利用DpnI酶处理去除模板后，转化大肠杆菌，验证后即可获得带有点突变的重组载体。该方法虽然方便快捷，但需要建立在高保真可以扩增很大片段的DNA聚合酶，同时如果PCR过程中在目的基因外的载体上发生了突变，后果是无法预估的。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
设计一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法，具体包括如下步骤：
S1、实验材料的准备：大肠杆菌Trans5α克隆感受态、融合目的基因的质粒载体pET28a-XXX和空载体pET28a、限制性内切酶BamHI和XhoI、Pfu高保真DNA聚合酶、金牌MIX、T5外切酶，同时实验还需要用到引物F1:5’—3’；
S2、单点突变：在突变位点处将基因分成两段，分别设计两对引物F1、R1和F2、R2，其中R1与F2有20bp同源臂，F1和R2分别与载体pET28a被BamHI和XhoI双酶切之后有20bp同源臂；
S3、目的基因片段扩增：通过PCR分别扩增出基因的两个片段，分别为片段1以及片段2，以含有目的基因的载体pET28a-XXX为模板，以F1、R1和F2、R2为引物对进行PCR扩增；
S4、表达载体双酶切及T5处理：pET28a空载体用BamHI和XhoI进行双酶切后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行胶回收，将基因片段1、2和载体pET28a、BamHI和XhoI双酶切在T5反应体系下30℃，40mins，然后将样品置于冰上终止反应，T5反应体系为20uL，具体包括基因片段1为3n、基因片段2为3n、载体片段为n、T5反应buffer为4uL、T5外切酶为0.35uL、无菌ddH2O补至20uL，其中n为摩尔数、uL表示无序列表；
S5、转化：终止T5反应后，立即进行克隆转化，从反应体系中取10uL样品于冰上与100uL Trans5α克隆感受态混合，并冰浴30mins，然后在42℃水浴锅中热激90s，立即放入冰上，3mins后在体系中加入500uL SOC培养基，在37℃摇床中孵育1h后，将样品涂布于抗性卡那霉素固体平板，在37℃培养箱中倒置培养12h；
S6、阳性转化子检测：在完成S5步骤后，从上述的转化平板中挑取5个单菌落于10uL无菌水中，即为PCR模板,以全长目的基因前后引物F1、R2为引物对，进行菌落PCR，菌落PCR体系为10uL，具体包括模板为1uL、正向引物以及反向引物均为0.5uL、金牌MIX为8uL；
S7、在完成S6步骤后进行测序比对；
S8、双点突变：在两个突变位点处将基因分成三段，分别设计两对引物F1、R1，F2、R2和F3、R3，其中R1与F2有20bp同源臂，R2与F3有20bp同源臂，F1和R3分别与载体pET28a被BamHI和XhoI双酶切作用后有20bp同源臂。
优选的，所述在S3步骤目的基因片段扩增中，PCR扩增具体包括PCR反应体系为50uL，质粒模板为1uL、dNTP为5uL、Pfu DNA聚合酶为0.5uL、正向引物与反向引物为2.5uL、Pfubuffer 10X为5uL、ddH2O为33.5uL。
优选的，所述正向引物与反向引物的浓度均为10μM。
优选的，所述在S3步骤目的基因片段扩增中的反应条件具体为95℃预变性5min，然后95℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸70s，25个循环，最后72℃延伸5min，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒纯化。
优选的，所述S7步骤中的测序比对具体包括挑选两个菌落PCR检测为阳性转化子的菌株取去测序，将目的基因序列与测序结果进行比对。
优选的，所述在进行S6步骤阳性转化子检测时，PCR反应条件具体为98℃预变性5min，然后98℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸70s，28个循环，最后72℃延伸5min，取5ul菌落PCR产物以1％的低熔点琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。
本发明提出的一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法，有益效果在于：该构建基因碱基定点突变及缺失的新方法在突变位点周围分成两段DNA片段，分别设计两对引物F1、R1，F2、R2，其中突变或缺失碱基位点设计在R1、F2中，R1与F2要有至少20bp的同源臂，F1与R2要分别和表达载体插入位置有至少20bp的同源臂，基因片段和载体片段在T5外切酶作用后，利用大肠杆菌自身的修复系统就可以得到含有目标位点的环状质粒，该方法同样适用于多位点碱基突变或缺失。
附图说明
图1为本发明提出的一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法的基因突变流程图。
图2为本发明提出的一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法的突变引物R1、F2设计图。
图3为本发明提出的一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法的缺失引物R1、F2设计图。
图4为本发明提出的一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法的Gene1 432(CAA-GAA)位点测序结果比较图。
图5为本发明提出的一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法的Gene1 445(CAC-CGC)位点测序结果比较图。
图6为本发明提出的一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法的Gene1 429,430,431三个连续位点缺失测序结果比较图。
图7为本发明提出的一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法的Gene1 436,437两个连续位点缺失测序结果比较图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
参照图1-7，一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法，具体包括如下步骤：
S1、实验材料的准备：大肠杆菌DH5α克隆感受态、融合目的基因的质粒载体pET28a-XXX和空载体pET28a、限制性内切酶BamHI和XhoI、Pfu高保真DNA聚合酶、金牌MIX、T5外切酶，同时实验用引物包括F1:5’—3’包括：
Gene1FP：TGGACAGCAAATGGGTCGCGATGGCAGATTCCCGCCAGAGCA
Gene1mut432RP：ctggtccatgaattcGCTCAGCTGGCTGGTGCCGAAG
Gene1mut432FP：accagccagctgagcGAATTCATGGACCAGAACAACC
Gene1RP：AGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTACGCAAGATCCTCGACACTT
Gene1mut445RP：cagtcggcgcttgcgGGTCAACCCCGACAGCGGGTTG
Gene1mut445FP：ctgtcggggttgaccCGCAAGCGCCGACTGTCGGCGC
Gene1Del429-431RP：ctggtccatgaattgGCTGGTGCCGAAGAACTCCTTG
Gene1Del429-431FP：ttcttcggcaccagcCAATTCATGGACCAGAACAACC
Gene1Del436/437RP：ccccgacagcgggttGTCCATGAATTGGCTCAGCTGG
Gene1Del436/437FP：agccaattcatggacAACCCGCTGTCGGGGTTGACCC
实施例1
S2、单点突变：将基因Gene1在突变位点周围将基因分成两段，分别设计两对引物Gene1FP、Gene1mut432RP和Gene1mut432FP、Gene1RP，在引物Gene1mut432RP与Gene1mut432FP中引入突变，同时Gene1mut432RP与Gene1mut432FP有30bp同源臂，Gene1FP和Gene1RP分别与载体pET28a(被BamHI和XhoI双酶切)有20bp同源臂；
实施例2
S2、单点突变：将基因Gene1在突变位点周围将基因分成两段，分别设计两对引物Gene1FP、Gene1mut445RP、和Gene1mut445FP、Gene1RP，在引物Gene1mut445RP与Gene1mut445FP中引入突变，同时Gene1mut445RP与Gene1mut445FP有30bp同源臂，Gene1FP和Gene1RP分别与载体pET28a(被BamHI和XhoI双酶切)有20bp同源臂；
实施例3
S2、单点突变：将基因Gene1在缺失位点周围将基因分成两段，分别设计两对引物Gene1FP、Gene1Del429-431RP和Gene1Del429-431FP、Gene1RP，在引物Gene1Del429-431RP与Gene1Del429-431FP中引入突变，同时Gene1Del429-431RP与Gene1Del429-431FP有30bp同源臂，Gene1FP和Gene1RP分别与载体pET28a(被BamHI和XhoI双酶切)有20bp同源臂；
实施例4
S2、单点突变：将基因Gene1在缺失位点周围将基因分成两段，分别设计两对引物Gene1FP、Gene1Del436/437RP和Gene1Del436/437FP、Gene1RP，在引物Gene1Del436/437RP与Gene1Del436/437FP中引入突变，同时Gene1Del436/437RP与Gene1Del436/437FP有30bp同源臂，Gene1FP和Gene1RP分别与载体pET28a(被BamHI和XhoI双酶切)有20bp同源臂；
S3、目的基因片段扩增：以含有目的基因的载体pET28a-XXX为模板，以F1、R1和F2、R2为引物对进行PCR扩增，分别扩增出基因的两个片段，分别为片段1以及片段2；
S4、表达载体双酶切及T5处理：pET28a空载体用BamHI和XhoI进行双酶切后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行胶回收，将基因片段1、2和载体pET28a(BamHI和XhoI双酶切)、BamHI和XhoI双酶切在T5反应体系下30℃，40mins，然后将样品置于冰上终止反应，T5反应体系为20uL，具体包括基因片段1为3n、基因片段2为3n、载体片段为n、5×T5外切酶反应buffer为4uL、T5外切酶为0.1-0.3uL、无菌ddH2O补至20uL，其中n为摩尔数、uL表示加样体积；
S5、转化：终止T5反应后，立即进行克隆转化，从反应体系中取10uL样品于冰上与100uL DH5α克隆感受态混合，并冰浴30mins，然后在42℃水浴锅中热激90s，立即放入冰上，3mins后在体系中加入500uL SOC培养基，在37℃摇床中孵育1h后，将样品涂布于抗性卡那霉素固体平板，在37℃培养箱中倒置培养12h；
S6、阳性转化子检测：在完成S5步骤后，从上述的转化平板中挑取5个单菌落于10uL无菌水中，即为PCR模板,以全长目的基因前后引物F1、R2为引物对，进行菌落PCR，菌落PCR体系为10uL，具体包括模板为1uL、正向引物以及反向引物均为0.5uL、金牌MIX为8uL；
S7、在完成S6步骤后进行测序比对，测序比对具体包括挑选两个菌落PCR检测为阳性转化子的菌株取去测序，将目的基因序列与测序结果进行比对；
S8、碱基缺失：在目的碱基缺失位点处将基因分成两段，分别设计两对引物F1、R1和F2、R2，其中R1与F2有20bp同源臂，F1和R2分别与载体pET28a(被BamHI和XhoI双酶切)有20bp同源臂。碱基缺失突变除了引物与点突变引物有区别外，实验过程与点突变过程一致。
该构建基因碱基定点突变及缺失的新方法在突变位点周围分成两段DNA片段，分别设计两对引物F1、R1，F2、R2，其中突变或缺失碱基位点设计在R1、F2中，R1与F2要有至少20bp的同源臂，F1与R2要分别和表达载体插入位置有至少20bp的同源臂，基因片段和载体片段在T5外切酶作用后，利用大肠杆菌自身的修复系统就可以得到含有目标位点的环状质粒，该方法同样适用于多位点碱基突变或缺失。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1、实验材料的准备：大肠杆菌DH5α克隆感受态、融合目的基因的质粒载体pET28a-XXX和空载体pET28a、限制性内切酶BamHI和XhoI、Pfu高保真DNA聚合酶、金牌MIX、T5外切酶，同时实验室需要用到引物F1:5’—3’；
S2、单点突变：在突变位点处将基因分成两段，分别设计两对引物F1、R1和F2、R2，其中R1与F2有20bp同源臂，F1和R2分别与载体pET28a被BamHI和XhoI双酶切之后两端有20bp同源臂；
S3、目的基因片段扩增：以含有目的基因的载体pET28a-XXX为模板，以F1、R1和F2、R2为引物对进行PCR扩增，分别扩增出基因的两个片段，分别为片段1以及片段2；
S4、表达载体双酶切及T5处理：pET28a空载体用BamHI和XhoI进行双酶切后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行胶回收，将基因片段1、2和载体pET28a(BamHI和XhoI双酶切)、BamHI和XhoI双酶切在T5反应体系下30℃，40mins，然后将样品置于冰上终止反应，T5反应体系为20uL，具体包括基因片段1为3n、基因片段2为3n、载体片段为n、5×T5外切酶反应buffer为4uL、T5外切酶为1-0.3uL、无菌ddH2O补至20uL，其中n为摩尔数、uL表示加样体积；
S5、转化：终止T5反应后，立即进行克隆转化，从反应体系中取10uL样品于冰上与100uLDH5α克隆感受态混合，并冰浴30mins，然后在42℃水浴锅中热激90s，立即放入冰上，3mins后在体系中加入500uL SOC培养基，在37℃摇床中孵育1h后，将样品涂布于抗性卡那霉素固体平板，在37℃培养箱中倒置培养12h；
S6、阳性转化子检测：在完成S5步骤后，从上述的转化平板中挑取5个单菌落于10uL无菌水中，即为PCR模板,以全长目的基因前后引物F1、R2为引物对，进行菌落PCR，菌落PCR体系为10uL，具体包括模板为1uL、正向引物以及反向引物均为0.5uL、金牌MIX为8uL；
S7、在完成S6步骤后进行测序比对；
S8、碱基缺失：在目的碱基缺失位点处将基因分成两段，分别设计两对引物F1、R1和F2、R2，其中R1与F2有20bp同源臂，F1和R2分别与载体pET28a(被BamHI和XhoI双酶切)有20bp同源臂。碱基缺失突变除了引物与点突变引物有区别外，实验过程与点突变过程一致。
2.根据权利要求1所述的一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法，其特征在于，在S3步骤目的基因片段扩增中，PCR扩增具体包括PCR反应体系为50uL，质粒模板为1uL、dNTP为5uL、Pfu DNA聚合酶为0.5uL、正向引物与反向引物为2.5uL、Pfubuffer 10X为5uL、ddH2O为33.5uL。
3.根据权利要求2所述的一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法，其特征在于，正向引物与反向引物的浓度均为10μM。
4.根据权利要求2所述的一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法，其特征在于，在S3步骤目的基因片段扩增中的反应条件具体为95℃预变性5min，然后95℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸70s，25个循环，最后72℃延伸5min，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒纯化。
5.根据权利要求1所述的一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法，其特征在于，S7步骤中的测序比对具体包括挑选两个菌落PCR检测为阳性转化子的菌株取去测序，将目的基因序列与测序结果进行比对。
6.根据权利要求1所述的一种构建基因碱基定点突变及缺失的新方法，其特征在于，在进行S6步骤阳性转化子检测时，PCR反应条件具体为98℃预变性5min，然后98℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸70s，28个循环，最后72℃延伸5min，取5ul菌落PCR产物以1％的低熔点琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。
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