CN117866917A - 一种基于点突变的Bst DNA酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于点突变的Bst DNA酶突变体及其应用，所述Bst DNA酶突变体，其按照如下方法制备获得：通过将野生型Bst DNA聚合酶氨基酸序列中的第524位氨基酸S突变为A，获得基于点突变的Bst DNA酶突变体；所述野生型Bst DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述基于点突变的Bst DNA酶突变体，其氨基酸序列包括如SEQ ID NO.5所示的序列，该突变体与市售Bst DNA酶具有相同的蛋白能够，且酶活性更高、稳定性更强，能够减少非特异性扩增，尤其是还同时将其第312位氨基酸G突变为A，获得基于点突变的Bst DNA酶突变体，酶活性高且扩增速率高。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，更具体的涉及一种基于点突变的Bst DNA酶突变体及其应用。
背景技术
核酸检测常用于检测某种病原体如新冠病毒。目前核酸检测主要分为三种检测方式：高通量测序、荧光定量qPCR和环介导等温扩增技术(Loop-Mediated IsothermalAmplification，LAMP)。其中LAMP是一种在保守序列DNA的4-6条特异性引物和一种具有链置换酶Bst DNA聚合酶的作用下，可以在一个小时的恒温条件(65℃)下，完成10^9-10^10倍核酸扩增的恒温扩增技术。相比高通量测序和荧光定量qPCR，LAMP对检测设备和操作人员要求都比较低，适合普遍推广。
但目前市面上的商用化Bst DNA聚合酶种类少、成本高，同时还存在一些不足，如Bst DNA聚合酶链置换能力弱、热稳定性差、对很多制剂(如EDTA)的耐受性差、产物得率低、延伸能力差等问题，而且现有Bst DNA聚合酶保真性和特异性较差，极易产生非特异性扩增如Bst DNA聚合酶用于新冠快速检测的LAMP扩增体系。因此，亟需研究一种新型高效的BstDNA聚合酶，以满足市场上日益增长的需求。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种基于点突变的Bst DNA酶突变体及其应用，其目的在于发现现有野生型Bst DNA聚合酶(来自于嗜热地芽孢杆菌DNA polymerase I蛋白(uniprot，P52026)第289-876个氨基酸)的一个能增强扩增效率同时减弱非特异扩增的突变点位S524，将其第524位氨基酸S突变为A获得Bst DNA酶突变体具有更高的酶活且可减弱非特异扩增；尤其是将其第524位氨基酸S突变为A同时将其第312位氨基酸G突变为A获得的Bst DNA酶突变体，其扩增效率和灵敏度更高，由此解决现有BstDNA聚合酶扩增效率低且易产生非特异性扩增的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种基于点突变的Bst DNA酶突变体，其按照如下方法制备获得：
通过将野生型Bst DNA聚合酶氨基酸序列中的第524位氨基酸S突变为A，获得基于点突变的Bst DNA酶突变体；
所述野生型Bst DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述基于点突变的Bst DNA酶突变体，其氨基酸序列包括如SEQ ID NO.5所示的序列。
优选地，所述基于点突变的Bst DNA酶突变体，其将野生型Bst DNA聚合酶氨基酸序列中的第524位氨基酸S突变为A，同时将其第312位氨基酸G突变为A，获得基于点突变的Bst DNA酶突变体；
所述基于点突变的Bst DNA酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7。
优选地，所述基于点突变的Bst DNA酶突变体，其所述基于点突变的Bst DNA酶突变体，其表达基因如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
优选地，所述基于点突变的Bst DNA酶突变体，其所述基于点突变的Bst DNA酶突变体，其表达基因如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
按照本发明的另一方面，还提供了一种表达如本发明所述基于点突变的Bst DNA酶突变体的重组表达载体，其所述重组表达载体，携带有如SEQ ID NO.6和/或SEQ ID NO.8所示的目的基因。
优选地，所述重组表达载体，其携带有如SEQ ID NO.8所示的目的基因。
按照本发明的另一方面还提供了一种基于如本发明所述基于点突变的Bst DNA酶突变体检测新冠病毒的RT-LAMP引物组合物，其所述引物组合物，包括外引物、内引物和环引物，其中外引物包括N1-F3和N1-B3，内引物包括N1-F1P-3和N1-B1P-3、或者N1-F1P-7和N1-B1P-7中的一对引物，环引物包括N1-LF和N1-LB；
所述N1-F3，其碱基序列如SEQ ID NO.9所示的AGATCACATTGGCACCCG；
所述N1-B3，其碱基序列如SEQ ID NO.10所示的CCATTGCCAGCCATTCTAGC；
所述N1-F1P-3，其碱基序列如SEQ ID NO.11所示的TCCCTTCTGCGTAGAAGCCAATGCTGCAATCGTGCTAC；
所述N1-B1P-3，其碱基序列如SEQ ID NO.12所示的GGCAGTCAAGCCTCTTCCCTACTGCTGCCTGGAGTT；
所述N1-LF，其碱基序列如SEQ ID NO.13所示的GCAATGTTGTTCCTTGAGGAAGTT；
所述N1-LB，其碱基序列如SEQ ID NO.14所示的TCGTTCCTCATCACGTAGTCG。
所述N1-F1P-7，其碱基序列如SEQ ID NO.15所示的TTCTGCGTAGAAGCCAATGCTGCAATCGTGCTAC；
所述N1-B1P-7，其碱基序列如SEQ ID NO.16所示的GTCAAGCCTCTTCCCTACTGCTGCCTGGAGTT。
优选地，所述RT-LAMP引物组合物，其所述引物组合物由外引物、内引物、环引物以比例1:(6～8):2组成。
按照本发明的另一方面还提供了一种用于新冠病毒检测的RT-LAMP扩增试剂盒，其包括如本发明所述的基于点突变的Bst DNA酶突变体和/或如本发明所述的RT-LAMP引物组合物。
优选地，所述的用于新冠病毒检测的RT-LAMP扩增试剂盒，其特征在于，还包括BstDNA聚合酶缓冲液、MgSO4、dNTP、逆转录酶中一种或多种组合。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于在野生型BstDNA酶中发现一个能够减少特异性扩增的SNP位点S524，能够取得下列有益效果。
本发明提供的Bst DNA酶突变体，通过点突变将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第524为氨基酸S突变为A，获得的突变体，不仅与市售Bst DNA酶具有相同的蛋白功能，且其酶活性高于野生型Bst DNA酶和市售Bst DNA酶，稳定性更佳。
尤其是将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第524为氨基酸S突变为A，同时将其第312为氨基酸G突变为A获得的突变体，该Bst DNA酶突变体酶活最高，且扩增速率高于现有Bst DNA酶，用于新冠病毒的LAMP等温扩增体系，其检测灵敏度显著高于市售Bst DNA酶。
附图说明
图1Bst-V1，Bst-V2，V3，和Bst-V4原核表达诱导结果；
图2Bst-V1，Bst-V2，Bst-V3和Bst-V4，4个蛋白亲和纯化结果图；
图3纯化的Bst-V1/V2/V3/V4酶参与等温扩增反应后琼脂糖凝胶电泳图；
图4酚红变色法LAMP等温扩增反应结果；
图5染料法LAMP等温扩增结果；
图6纳磁Bst-V4同其他品牌Bst酶扩增口腔拭子中rActin基因的荧光染料法LAMP结果比较；
图7新冠LAMP引物优化结果展示；
图8纳磁新冠LAMP等温扩增试剂盒标准DNA灵敏度检测；
图9纳磁新冠LAMP等温扩增试剂盒标准RNA灵敏度检测；
图10纳磁Bst-V4同其他品牌Bst酶扩增标准RNA能力比较。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为实现预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。
本发明基于野生型Bst DNA酶，其来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)GIM1.543(购自中国工业微生物菌种保藏中心)的DNA polymerase I基因去除其N端288个氨基酸(864个碱基)后的剩余C端大片段序列)，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，通过基因重组方式将如SEQ ID NO.2所示的目的基因插入质粒中，构建重组表达载体，再通过定点突变，将Bst DNA聚合酶(记为Bst-V1酶)的第312位氨基酸G突变为A和/或将其第524位氨基酸S突变为A，获得突变体表达载体，通过蛋白表达和纯化提取获得基于点突变的Bst DNA酶突变体，经与现有市售的Bst DNA酶比较酶功能，发现获得的基于S524点突变的Bst DNA酶突变体，其蛋白功能与Bst DNA酶相同，能够用于LAMP核酸检测，该BstDNA酶突变体的酶活较NEB公司购买的Bst2.0Warmstart DNA polymerase(货号M0538)更高，且稳定性更强；尤其是将其第524位氨基酸S突变为A，同时将其第312位氨基酸G突变为A，获得的突变体的扩增速率最高，其检测灵敏度显著高于市售的Bst DNA聚合酶。
所述野生型Bst DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达该野生型Bst DNA聚合酶的基因如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。
其中将该野生型Bst DNA聚合酶的第312位氨基酸G突变为A，获得的基于点突变的Bst DNA酶突变体，记为Bst-V2酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，表达该Bst-V2酶的基因如SEQ ID NO.4所示核苷酸序列。
将该野生型Bst DNA聚合酶的第524位氨基酸S突变为A，获得的基于点突变的BstDNA酶突变体，记为Bst-V3酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，表达该Bst-V3酶的基因如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列。
将该野生型Bst DNA聚合酶的第524位氨基酸S突变为A，同时将其第312位氨基酸G突变为A，获得的基于点突变的Bst DNA酶突变体，记为Bst-V4酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，表达该Bst-V4酶的基因如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列。
优选将该野生型Bst DNA聚合酶的第524位氨基酸S突变为A，同时将其第312位氨基酸G突变为A，获得基于点突变的Bst DNA酶突变体，这两个点突同时突变得到的突变蛋白在RT-LAMP检测新冠病毒RNA方面敏感度更高且扩增速率也高。
基于此，本发明提供了一种基于点突变的Bst DNA酶突变体，其按照如下方法获得：
通过将野生型Bst DNA聚合酶(记为Bst-V1酶)的第524位氨基酸S突变为A，获得基于点突变的Bst DNA酶突变体；所述野生型Bst DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；在一些实施例中表达该野生型Bst DNA聚合酶的目的基因如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
所述基于点突变的Bst DNA酶突变体，其氨基酸序列包括如SEQ IDNO.5所示的序列。
优选将该野生型Bst DNA聚合酶(记为Bst-V1酶)的第524位氨基酸S突变为A，同时将其第312位氨基酸G突变为A，获得基于点突变的Bst DNA酶突变体，所述Bst DNA酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在一些实施例中所述基于点突变的Bst DNA酶突变体为将Bst DNA聚合(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的第524位氨基酸S突变为A，获得的基于点突变的Bst DNA酶突变体，记为Bst-V3酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，表达该Bst-V3酶的基因如SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列。该Bst DNA酶突变体(Bst-V3)的酶活和稳定性优于将野生型BstDNA聚合酶的第312位氨基酸G突变为A获得突变体。
在一些实施例中所述基于点突变的Bst DNA酶突变体为将Bst DNA聚合酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的第312位氨基酸G突变为A，同时将其第524位氨基酸S突变为A，获得的基于点突变的Bst DNA酶突变体，记为Bst-V4酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，表达该Bst-V4酶的基因如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，该突变体不仅酶活性高且扩增速率最高，检测更灵敏。
另外，本发明还提供了一种表达如本发明所述基于点突变的Bst DNA酶突变体的重组表达载体，其携带有如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8所示的一种或多种目的基因。
所述重组表达载体，优选携带如SEQ ID NO.6和/或SEQ ID NO.8所示的目的基因。
更优选携带如SEQ ID NO.8所示的目的基因。
另外，本发明还提供了一种工程菌，其含有如本发明所述的重组表达载体。
另外，本发明还提供了一种基于基于点突变的Bst DNA酶突变体检测新冠病毒的RT-LAMP引物组合物，所述引物组合物包括外引物、内引物和环引物，其中外引物包括N1-F3和N1-B3，内引物包括N1-F1P-3和N1-B1P-3)、或者(N1-F1P-7和N1-B1P-7)中的一对引物，环引物包括N1-LF和N1-LB；
所述N1-F3，其碱基序列如SEQ ID NO.9所示的AGATCACATTGGCACCCG；
所述N1-B3，其碱基序列如SEQ ID NO.10所示的CCATTGCCAGCCATTCTAGC；
所述N1-F1P-3，其碱基序列如SEQ ID NO.11所示的TCCCTTCTGCGTAGAAGCCAATGCTGCAATCGTGCTAC；
所述N1-B1P-3，其碱基序列如SEQ ID NO.12所示的GGCAGTCAAGCCTCTTCCCTACTGCTGCCTGGAGTT；
所述N1-LF，其碱基序列如SEQ ID NO.13所示的GCAATGTTGTTCCTTGAGGAAGTT；
所述N1-LB，其碱基序列如SEQ ID NO.14所示的TCGTTCCTCATCACGTAGTCG。
所述N1-F1P-7，其碱基序列如SEQ ID NO.15所示的TTCTGCGTAGAAGCCAATGCTGCAATCGTGCTAC；
所述N1-B1P-7，其碱基序列如SEQ ID NO.16所示的GTCAAGCCTCTTCCCTACTGCTGCCTGGAGTT。
优选所述RT-LAMP引物组合物由外引物、内引物、环引物以比例1:(6～8):2组成。
在一些实施例中所述RT-LAMP引物组合物由外引物(N1-F3和N1-B3)、内引物(N1-F1P-3和N1-B1P-3)、环引物(N1-LF和N1-LB)以比例为1:8:2组成。
在一些实施例中所述RT-LAMP引物组合物由外引物(N1-F3和N1-B3)、内引物(N1-F1P-7和N1-B1P-7)、环引物(N1-LF和N1-LB)以比例为1:6:2组成。
本发明还提供了一种用于新冠病毒检测的RT-LAMP扩增试剂盒，其包括如发明所述的Bst DNA聚合酶突变体和/或如本发明所述的RT-LAMP引物组合物。
优选包括如发明所述的Bst DNA聚合酶突变体和如本发明所述的RT-LAMP引物组合物。
更优选还包括Bst DNA聚合酶缓冲液、MgSO4、dNTP、逆转录酶中一种或多种组合。
以下为实施例
实施例1
根据Uniprot中Bst序列，选择去除其N端298个氨基酸后剩余的C端氨基酸序列(SEQ ID NO.1)为Bst-V1酶对应的氨基酸序列，该Bst-V1酶记为V1，其第312位氨基酸为G，第524位氨基酸为S，其中表达该Bst-V1酶的目的基因如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，以其对应的基因序列设计引物，以嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)GIM1.543(购自中国工业微生物菌种保藏中心)的BstI基因为模板，扩增得到Bst-v1基因片段，通过将Bst-v1基因和pET28a载体分别用相应内切酶双酶切，进而进行连接反应，得到pET28a-Bst-V1载体。
其中Bst-V1基因扩增引物序列如下：
Bst-V1F:5’-GGATCCatgacggatgaaggcgaa-3’，
Bst-V1R:5’-AAGCTTttatttggcgtcgtaccacg-3’，用于后续的扩增限制性内切位点以粗体和下划线表示，具体操作流程如下：
1.获取嗜热脂肪地芽孢杆菌基因组DNA
(1)取少量甘油冻存菌种嗜热脂肪地芽孢杆菌划线至无抗LB平板中，55℃恒温培养箱静置培养48h。
(2)挑取单菌落至无抗液体LB培养基中55℃，220rpm摇床培养过夜。
(3)用细菌基因组提取试剂盒(天根DP302)对嗜热脂肪地芽孢杆菌进行基因组提取。
2.扩增Bst-V1基因
以提取的基因组DNA为模板按照如下表反应体系和程序扩增Bst-V1基因。
表1PCR反应体系及反应程序
表2PCR程序设定
3.PCR产物检验
PCR反应结束后，取少量扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认条带正确并特异后将剩余扩增产物用omega公司PCR产物纯化试剂盒进行纯化，测量纯化产物浓度，结果为86ng/μL。
4.构建表达载体
采用HindIII和BamH I(购自Thermofisher)对纯化的BstI-V1基因片段和pET28a载体(购自云舟生物)分别进行37℃双酶切反应1hr，具体如下。
表3BstI-V1PCR产物双酶切反应体系
表4pET28a载体双酶切反应体系
1hr后进行琼脂糖凝胶电泳，将双酶切的pET28a片段和Bst-V1片段分别切胶回收(详细步骤参见omega琼脂糖凝胶回收试剂盒)。用Nanodrop测量浓度，并稀释到50ng/μL，4℃过夜连接(NEB T4DNA连接酶)，其中连接反应体系如下：
表5连接反应体系
第二天将连接产物10uL全部转化100μL DH5α感受态，涂布加了kana抗生素的LB平板，37℃培养过夜。挑2-3个单菌落送出测序分析，经分析与预期核苷酸序列完全一致，pET28a-Bst-V1重组质粒构建成功。
实施例2构建pET28a-Bst-V1突变体
以实施例1中的pET28a-Bst-V1为实验对象，在其位点G312和S524分别进行单独和同时突变，得到三种突变体，分别为pET28a-Bst-V2(G312A)，pET28a-Bst-V3(S524a)和pET28a-Bst-V4(G312A和S524A)。
其中突变体Bst-V2酶(记为V2)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，表达该蛋白的目的基因如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
突变体Bst-V3酶(记为V3)的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，表达该蛋白的目的基因如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
突变体Bst-V4酶(记为V4)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，表达该蛋白的目的基因如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
具体突变操作如下:
(1)引物设计
其中将V1氨基酸序列中第312位的G突变为A的突变克隆引物序列如下：
G312A-F：CCCGTGACGGCCAAAGTGCACACGATG；
G312A-R：GTGTGCACTTTGGCCGTCACGGGGTGCAC；
将524位点由S突变为A的突变克隆引物序列如下：
S524A-F：GATCGATCTAGCCGTGAGGCTGCGC；
S524A-R：GCAGCCTCACGGCTAGATCGATCATC。
(2)扩增反应
配制单位点点突的突变克隆反应体系，如下：
表6突变克隆PCR反应体系
按照上表，分别配制好G312A和S524A单个位点点突变克隆的反应体系，放置到PCR仪器中，按照如下程序运行。
表7突变克隆PCR反应程序
扩增程序结束后，向反应体系中加入0.8uL DpnI，1.2uL DpnI反应buffer，放入PCR仪中，继续37℃反应1hr，16℃反应1hr。
将最终反应产物取5uL转化DH5a，长出单克隆后，分别挑选2-3个测序。测序正确的保留质粒，即得到pET28a-Bst-V2和pET28a-Bst-V3质粒。
再以pET28a-Bst-V2质粒为模板，突变克隆引物S524A-F和S524A-R为引物，按照步骤2.2-2.4操作，获得pET28a-Bst-V4质粒。
实施例3制备Bst-V1，Bst-V2，Bst-V3和Bst-V4蛋白酶
将实施例1测序正确的pET28a-Bst-V1和实施例2中测序正确的pET28a-Bst-V2、pET28a-Bst-V3和pET28a-Bst-V4质粒载体分别转化Roseta感受态(参照唯地公司感受态转化流程)。挑取单菌落，用含有相应抗生素的液体LB培养基37℃振荡培养，待OD600到达0.6～0.8后，加入0.5mM IPTG，25℃诱导3h后离心收集菌体。用含1％ Triton-x-100和1mM DTT的1*TBS重悬菌体，超声破碎，12000rpm，4℃，离心10min，分别取上清和沉淀进行SDA-PAGE，之后通过考马斯亮蓝染色，检测蛋白诱导表达情况，结果如图1所示。
由图1可知，His-Bst-V1，His-Bst-V2，His-Bst-V3，His-Bst-V4融合蛋白均被成功诱导表达，并且都在上清中有较高的表达，说明这几个蛋白在该诱导表达条件下能可溶性表达，后续可以使用可溶蛋白纯化方法纯化。
进一步，我们购买了奕圣的HisSep Ni-NTA Agarose resin(His标签蛋白琼脂糖纯化树脂，货号20502ES10)，并按照其说明书对4个蛋白进行了纯化，结果如图2所示，其中上清和沉淀为纯化前超声破碎后离心分离的上清和沉淀，其中上清部分用于后续的亲和纯化；FT，flowthrough，流穿液，W1/W2/W3为3次wash(清洗)液，E1，E2为第一次和第二次洗脱下来的蛋白，图中所示E1和E2中所含为最终洗脱下的经过亲和纯化的目的蛋白。
由图2可知，相对于纯化前样本(上清)，最终洗脱下来的蛋白更加单一纯净。
实施例4Bst DNA聚合酶突变体功能检测
将实施例3纯化得到的蛋白E1和E2合并为1管，使用浓缩管超速离心方式逐渐将原来洗脱液换成Bst DNA聚合酶保存液(10mM Tris-HCl，50mM KCl，1mM DTT，0.1％ Triton-X-100，0.1mM EDTA，50％甘油，pH7.0)，用BCA法测浓度，并用Bst聚合酶保存液将4个蛋白浓度均稀释为0.08mg/mL后使用。
Bst酶的主要应用在于环等温扩增(LAMP)。LAMP主要是基于靶基因3'和5'端的6个区域设计3对特异性引物，包括1对外引物、1对环状引物和1对内引物，3种特异引物依靠链置换Bst DNA聚合酶，使得链置换DNA合成不停地自我循环，从而实现快速扩增。反应1h后可根据扩增副产物焦磷酸镁沉淀形成的浊度或者荧光染料结合核酸进行判断扩增情况，也可以通过扩增过程中pH值得改变，用酚红法来判定是否扩增。为了验证我们所纯化的几个Bst蛋白是否具有链置换Bst DNA聚合酶的功能，我们设计了LAMP反应来进行检测。
我们先使用NEB购买的引物和体系，对我们获得的四个酶进行检测，反应体系如下表8所示：
表8NEB LAMP扩增反应体系
上表中，除Bst酶使用NEB公司购买的Bst2.0Warmstart DNA polymerase(货号M0538)，或者我们自己纯化的V1、V2、V3、V4外，10*primer为NEB货号为S1882中提供的“GeneN2prime Set”序列在上海生物工程公司合成，按照F1P:B1P:F3:B3：LOOPF:LOOP B＝160uM:160uM:20uM:20uM:40uM:40uM配成的母液(10*，MgSO4和10×Isothermal AmplificationBuffer为随Bst 2.0warmstart DNA polymerase产品附带，模板N基因(N2117S)和dDTP为NEB公司购买。
表9NEB LAMP等温扩增引物组序列
/>
体系配置好后，65℃反应30min，跑琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。
由图3可知，上述获得的Bst-V1/Bst-V2/Bst-V3和Bst-V4同NEB的Bst2.0一样能够扩增，而不加酶的扩增体系没有出现扩增条带，说明我们纯化的蛋白同NEB Bst2.0一样具有酶活。
除此外，我们还自配了10*酚红母液，如下：
表10酚红变色法LAMP等温扩增反应体系
采用如表10所示的酚红反应体系进一步验证它们各自酶活，结果如图4所示。
由图4可知，我们纯化的4个酶同NEB酶具有一样的蛋白功能，且V3和V4酶活性高于V1和V2，NEB居于中间。
为了进一步比较V1，V2，V3，V4活性强弱，我们采用荧光染料法检测5个酶的扩增速率，即通过qPCR仪检测各反应的起峰时间，其中设置30s为一个循环，因此出峰时间(min)＝cq值/2。其中荧光染料法LAMP等温扩增反应体系如下：
表11荧光染料法LAMP等温扩增反应体系
上述荧光染料法LAMP等温扩增反应结果如图5所示，由图5可知，Bst-V4扩增速率最高，cq值大约在17，即17/2＝8.5min左右可以出峰，检测到质粒DNA存在。然后是Bst-V3，Bst-V2，均高于野生型Bst-V1和NEB的Bst2.0。
我们还合成了NEB推荐的针对人rAtin基因的引物组，配制荧光染料法LAMP等温扩增反应体系(各品牌按照各自说明书配制反应体系，纳磁按照表11来配置，其中的模板质粒换成口腔拭子模板，口腔拭子取样方法为：用手握住取样拭子的手柄，伸进口腔一侧用力擦动15-20下，并在另一侧重复该动作，然后将拭子放入1mL TE缓冲液中，搅动10-15下，弃拭子，得到拭子溶液，取1μL作为模板)，分别使用纳磁Bst-V4和市面上常用的3家的商品酶分别编号为A品牌(博迈德Bst 2.0)、B品牌(NEB Bst 2.0)、C品牌(百时美的Bst-Ⅱ)作为对照，检测口腔拭子中actin基因，通过其CT值来验证使用效果，结果如图6所示。
由图6可知，Bst-V4在口腔拭子支扩能力实验中表现最优，其次是A品牌和C品牌的Bst酶，最后是B品牌。
实施例5基于Bst-V4的新冠LAMP引物组优化
由于使用NEB推荐的N2引物组来进行LAMP扩增，灵敏度只能达到1000copies/mL，为了进一步提高LAMP反应的灵敏度，我们利用Primer-Primer软件，重新合成了一对N基因LAMP引物组，分别命名为N1-F3、N1-B3、N1-LF、N1-LB、N1-F1P、N1-B1P，其引物序列如表12所示。
表12针对新冠N基因的LAMP等温扩增引物组序列设计及其基于N1-F1F/B1P进行优化的引物对
/>
/>
利用该对引物N1和NEB-N2引物组分别对N基因的梯度稀释质粒进行LAMP扩增，结果如图7所示。
由图7可知，我们提供的N1引物组灵敏度比NEB推荐引物组N2扩增的灵敏度高一个数量级，说明本发明提供的N1引物组的灵敏度更高。
为了进一步对引物组进行优化，我们通过改变F1P和B1P引物长度和引物加入比例，结果如图7所示，发现N1-3(8:1:2)和N1-7(6:1:2)引物组组合的LAMP反应，在不加阳性质粒的对照组(-)中一直没有出现扩增(90min内)；而二者中，N1-3(8:1:2)组合又比N1-7(6:1:2)组合扩增反应速率更高，能够在更短时间内起峰，检测到模板质粒。
实施例6基于LAMP扩增体系检测新冠
基于上述优化后的引物，我们使用优化后的新冠LAMP引物和Bst-V4酶进行了DNA体系(体系见上表11，模板从固定浓度换成不同拷贝数浓度梯度的质粒)和RNA体系(表13)(RT-LAMP，在LAMP体系中加入了反转录酶)的扩增，测试该体系的检测灵敏度。
表13荧光染料法RT-LAMP等温扩增反应体系
/>
上述检测结果如图8、图9所示。
由图8结果发现优化后的等温扩增检测体系能够检测到25copies/test的新冠标准质粒；
由图9结果发现优化后的等温扩增检测体系还能检测到10copies/test的标准新冠RNA，显著优于市面上多数报道的新冠LAMP检测体系检测限(200copies/mL)。
接着，基于该引物和试剂体系，我们将我们的酶扩增标准RNA的能力同市面上其他3个友商品牌即A品牌(博迈德Bst 2.0)、B品牌(NEB Bst 2.0)、C品牌(百时美的Bst-Ⅱ)进行比较，结果如图10所示。
图10结果显示，本发明提供的酶体系扩增新冠标准RNA的能力远远优于其他品牌。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种基于点突变的Bst DNA酶突变体，其特征在于，按照如下方法制备获得：
通过将野生型Bst DNA聚合酶氨基酸序列中的第524位氨基酸S突变为A，获得基于点突变的Bst DNA酶突变体；
所述野生型Bst DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述基于点突变的Bst DNA酶突变体，其氨基酸序列包括如SEQ ID NO.5所示的序列。
2.如权利要求1所述的基于点突变的Bst DNA酶突变体，其特征在于，将野生型Bst DNA聚合酶氨基酸序列中的第524位氨基酸S突变为A，同时将其第312位氨基酸G突变为A，获得基于点突变的Bst DNA酶突变体；
所述基于点突变的Bst DNA酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7。
3.如权利要求1或2所述的基于点突变的Bst DNA酶突变体，其特征在于，所述基于点突变的Bst DNA酶突变体，其表达基因如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的基于点突变的Bst DNA酶突变体，其特征在于，所述基于点突变的Bst DNA酶突变体，其表达基因如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
5.一种表达如权利要求1至4任意一项所述基于点突变的Bst DNA酶突变体的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体，携带有如SEQ ID NO.6和/或SEQ ID NO.8所示的目的基因。
6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，携带如SEQ ID NO.8所示的目的基因。
7.一种基于如权利要求1至4任意一项所述基于点突变的Bst DNA酶突变体检测新冠病毒的RT-LAMP引物组合物，其特征在于，所述引物组合物，包括外引物、内引物和环引物，其中外引物包括N1-F3和N1-B3，内引物包括N1-F1P-3和N1-B1P-3、或者N1-F1P-7和N1-B1P-7中的一对引物，环引物包括N1-LF和N1-LB；
所述N1-F3，其碱基序列如SEQ ID NO.9所示的AGATCACATTGGCACCCG；
所述N1-B3，其碱基序列如SEQ ID NO.10所示的CCATTGCCAGCCATTCTAGC；
所述N1-F1P-3，其碱基序列如SEQ ID NO.11所示的TCCCTTCTGCGTAGAAGCCAATGCTGCAATCGTGCTAC；
所述N1-B1P-3，其碱基序列如SEQ ID NO.12所示的GGCAGTCAAGCCTCTTCCCTACTGCTGCCTGGAGTT；
所述N1-LF，其碱基序列如SEQ ID NO.13所示的GCAATGTTGTTCCTTGAGGAAGTT；
所述N1-LB，其碱基序列如SEQ ID NO.14所示的TCGTTCCTCATCACGTAGTCG；
所述N1-F1P-7，其碱基序列如SEQ ID NO.15所示的TTCTGCGTAGAAGCCAATGCTGCAATCGTGCTAC；
所述N1-B1P-7，其碱基序列如SEQ ID NO.16所示的GTCAAGCCTCTTCCCTACTGCTGCCTGGAGTT。
8.如权利要求7所述的RT-LAMP引物组合物，其特征在于，所述引物组合物由外引物、内引物、环引物以比例1:(6～8):2组成。
9.一种用于新冠病毒检测的RT-LAMP扩增试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至4任意一项所述的基于点突变的Bst DNA酶突变体和/或如权利要求7或8所述的RT-LAMP引物组合物。
10.如权利要求9所述的用于新冠病毒检测的RT-LAMP扩增试剂盒，其特征在于，还包括Bst DNA聚合酶缓冲液、MgSO4、dNTP、逆转录酶中一种或多种组合。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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