CN110257555B

CN110257555B - 一种猪常见传染病病原的快速检测监控方法

Info

Publication number: CN110257555B
Application number: CN201910365373.1A
Authority: CN
Inventors: 刘华勇; 陈翀; 谢婵芳
Original assignee: Guangzhou Pushi Lihua Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Pushi Lihua Technology Co ltd
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2019-04-30
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2039-04-30
Also published as: CN110257555A

Abstract

本发明公开了一种猪常见传染病病原的快速检测监控方法。本发明研究得到一系列可用于检测常见猪传染病病原的特异性核酸序列位点，针对该位点开发了可实现猪传染病病原定性检测的检测技术，并构建了方便、快捷、成本低的猪传染病病原核酸检测方法和和检测试剂盒对猪传染病病原检测特异性好、灵敏度高，能够实现多位点同时检测，对猪常见传染病病原的快速检测、筛查、监控具有广阔的应用前景。

Description

一种猪常见传染病病原的快速检测监控方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种猪常见传染病病原的快速检测监控方法。

背景技术

猪常见传染病的病原分布广泛，具有很强感染性。随着农村生产结构的调整,养猪规模化程度的不断提高，生猪及其产品流通日益频繁，导致猪传染病疫情时常发生。加上部分生猪饲养密集区及猪场的检测防疫能力较弱，传染病一旦发生，若不能及时诊断和控制，将导致生猪大规模发病和死亡，给养猪户带来巨大的经济损失，也会大大增加整个社会在疫情防控中流通成本。为实现猪传染病的早期检测并控制其传播风险，开发低成本、准确、高效、快速地检测猪传染病病原的诊断方法显得尤为重要。

常规的兽用病原检测技术如(1)分离培养技术：病原体分离培养，特别是对于病原微生物和病毒的分离培养，是早期的病原体检测的金标准。但该方法分离培养耗时长，无法实现短时间内迅速得到检测结果，必须高度依赖检测实验室硬件及实验操作人员条件，且不适用于目前未有成熟培养手段的病原微生物和病毒的检测。(2)免疫学检测：以基于抗原-抗体的免疫反应，识别病原相关蛋白，从蛋白水平对病原体进行检测。该方法存在检测灵敏度较低，且特异性受环境等影响较大，检测的窗口期较长，无法满足诊疗需求，仅适用于初筛而不能作为及时确诊的依据，不能够识别同一类病原的不同亚型等问题。

基于分子的诊断方法可以提高检测抗性基因的速度和准确性，这对防疫站和养殖环境中的感染控制、预防、治疗很有意义。目前分子诊断方法主要是聚合酶链反应(PCR)：包括普通PCR、等位基因特异性PCR、实时荧光定量PCR、PCR-基因芯片技术等。PCR是从核酸水平对病原体进行检测，整个实验需要1～2小时完成。该方法的主要缺点在于进行PCR检测时需要依赖PCR仪或昂贵的实时定量PCR仪，及其它多种配套设备，以及专门的PCR实验室和专业操作人员。PCR检测无法实现即时检验、床旁诊断和无特定实验室检测条件的场景应用，因此无法满足基层、用户终端、现场的检验需求。同时，PCR检测可能存在假阳性和灵敏度不足等问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有猪传染病病原检测技术的缺陷和不足，研究得到一种基于CRISPR/Cas12a系统的猪传染病病原核酸检测位点，针对该位点利用CRISPR/Cas12a系统可实现猪传染病病原的核酸检测，特异性好、灵敏度高，假阳性低。

本发明的目的是提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的猪传染病病原核酸检测位点及gRNA组合。

本发明另一目的是提供一种针对猪传染病病原的CRISPR/Cas12a检测系统。

本发明再一目的是提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的猪传染病病原核酸的检测方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明研究发现一种基于CRISPR/Cas12a系统的猪传染病病原核酸检测靶标位点，针对该位点可进行基于CRISPR/Cas12a系统的猪传染病病原核酸检测，检测特异性好、灵敏度高。

所述猪传染病病原核酸检测靶标位点的序列如SEQ ID NO.1-7任一所示。能特异性区分猪传染病病原的不同型别且包含Cas12a识别的PAM序列。

同时所述靶标位点在作为猪传染病病原核酸检测位点方面的应用，以及作为基于CRISPR/Cas12a系统的猪传染病病原核酸检测位点方面的应用，均应在本发明的保护范围之内。

基于上述研究成果，本发明还提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的猪传染病病原检测方法，是利用CRISPR/Cas12a系统检测上述靶标位点。

具体是利用Cas12a蛋白和对应所述靶标位点的gRNA进行CRISPR核酸检测。

所述gRNA以所述靶标位点为靶序列进行设计，设计原则为：在选取gRNA靶向序列时，靶向序列5’端应具有5’-TTTN-3’序列，且靶向序列本身、靶向序列和其余序列间不形成稳定二级结构。

作为优选的可选择方案，所述gRNA靶向序列如SEQ ID NO.8-23任一所示。

同时本发明还提供一种猪传染病病原核酸的CRISPR/Cas12a检测系统或试剂盒，包括Cas12a蛋白和gRNA，所述gRNA靶向序列对应于SEQ ID NO.1-7任一所示靶标位点。优选地，所述gRNA靶向序列如SEQ ID NO.8-23任一或任几个所示。

另外，上述Cas12a蛋白为具有核酸内切酶活性且具有附属切割活性的Cas12a蛋白。比如LbCas12a、SsCas12a、ScCas12a、FnCas12a、AsCas12a等。

所述ScCas12a的序列如SEQ ID NO.24所示，所述SsCas12a的序列如SEQ ID NO.25所示，所述LbCas12a的序列参照Addgene号pMAL-his-LbCpf1-EC(Plasmid#79008)，FnCas12a的序列参照Addgene号6-His-MBP-TEV-FnCpf1(Plasmid#90094)、AsCas12a的序列参照Addgene号AsCpf1-2NLS(Plasmid#102565)。

本发明具有以下有益效果：

本发明研究发现一种基于CRISPR/Cas12a系统的猪传染病病原核酸检测靶标位点，针对该位点利用CRISPR/Cas12a系统可实现猪传染病病原核酸检测，检测特异性好、灵敏度高，可在25-37℃的室温下实现高灵敏、高精度的分子检测，具有更好的特异性和兼容性，检测成本低廉、操作方便、快捷。检测限值可达到阿摩尔级(10^-18摩尔/L)，实现靶标单分子检测。同时还能实现多位点同时检测，临床检测效果优异，对于猪传染病病原的检测与筛查具有重要的意义。

附图说明

图1为实施例2中对非洲猪瘟病毒(ASFV)的不同靶标位点的gRNA检测效果。

图2为实施例2中猪口蹄疫病毒(FMDV)的不同靶标位点的gRNA检测效果。

图3为实施例2中对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的不同靶标位点的gRNA检测效果。

图4为实施例2中对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的不同靶标位点的gRNA检测效果。

图5为实施例2中对猪轮状病毒(PRV)的不同靶标位点的gRNA检测效果。

图6为实施例4中对13例疑似感染非洲猪瘟病毒的临床样本的检测效果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。对于本领域技术人员来说，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

除非另有说明，本发明采用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等是本领域的常规技能。参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR2:实用方法》(PCR2:A PRACTICALAPPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))、哈洛(Harlow)和拉内(Lane)编辑(1988)《抗体：实验室手册》(ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL)，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。

实施例1基于CRISPR/Cas12a系统的猪传染病病原核酸检测位点的发现

我们获取猪传染病病原基因组序列，通过生物信息学分析比对，寻找猪传染病病原各株型的特异性鉴定区域。在本专利中我们筛选的猪传染病病原有：非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)，猪口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease virus,FMDV),猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)，猪轮状病毒A群(Porcine rotavirus group A，PRV)，猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissiblegastroenteritis virus,TGEV)。

具体操作方法如下，在NCBI核酸序列库查找本病原的全基因组序列，获取本病原的现有的所有全基因组序列并根据序列完整度筛选出参考基因组；对上述基因组序列进行同源性分析，寻找该病原在不同基因组序列间保守但相对于人基因组(hg19)特异性的靶标基因序列。以20bp碱基为单位，在上述序列中搜寻含有“TTTN”的序列并导出相关序列作为gRNA靶向序列的备选数据库。

通过评估相关病原靶点不同的型别差异，各备选gRNA序列在不同菌株间的特异性，备选gRNA序列的GC含量、碱基均一性、序列保守性等系列参数，并经过大量的实验，针对不同区域设计gRNA并构建CRISPR/Cas12a系统进行研究，最终确认得到猪传染病病原的特异的鉴定靶标区域，序列如SEQ ID NO.1-7所示。以SEQ ID NO.8-23所示序列为基于CRISPR/Cas12a系统的猪传染病病原核酸检测gRNA，所得检测方案均具有很好的检测效果。在本专利中，经过大量探索研究和实验验证，得出了一组基于CRISPR/Cas12a的检测靶标基因及对应的靶向gRNA序列(表1)。

表1本专利中提及的靶标基因及对应的gRNA靶向序列

实施例2基于CRISPR/Cas12a系统的猪传染病病原核酸检测案例

1、CRISPR/Cas12a基因克隆及蛋白表达

采用源自Lachnospiraceae bacterium的Cas12a蛋白基因，经过密码子优化，使基因更适合在哺乳动物细胞中表达。优化后的Cas12a蛋白基因克隆入带6-His组氨酸标签的pET28a质粒，方便蛋白纯化表达。Cas12a蛋白重组表达载体转化，表达菌采用BL21 star(DE3)。

具体蛋白表达条件为：在培养菌液OD₆₀₀＝0.6时加入0.5mMIPTG培养4小时。收集菌体进行蛋白纯化。纯化条件为：将菌体重悬于裂解液(50mM Tris,pH8.0，300mM NaCl，5％甘油，20mM咪唑)，进行超声破碎(70％振幅，2s On/4s Off，3分钟，Sonics 750w超声仪)，离心分离上清液，以镍柱纯化，以含250mM咪唑的裂解液洗脱，浓缩洗脱组分，以Superdex 200，Tricorn 10/300凝胶色谱柱进行纯化。SDS-PAGE检测以及凝胶柱纯化，获得的纯化后的Cas12a蛋白，放-80℃保存。

2、制备靶标DNA

靶核苷酸可经过PCR扩增、重组酶聚合酶扩增(RPA)，NASBA等温扩增、或环介导等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)和切口酶扩增反应(NEAR)方式扩增靶DNA。

重组酶聚合酶扩增RPA(Recombinase Polymerase Amplification)：采用NCBIPrimer blast设计RPA引物，扩增片段大小为80-120nt，引物的变性温度可为54-67℃、Opt＝60，长度为30-35nt、Opt＝32，引物中GC含量为40-60％，根据设计序列合成DNA引物。

模版序列为实施例1中SEQ ID NO.1所示(来源于ASFV基因组序列)。

其中RPA引物包括：

FP:TGGTGATAAAGCGCTCGCCGAAGGGAATGGAT

RP:GAACGTGCAGCCATACCAACCCGAAATTTC

分别参考

Basic和

BasicRT(TwistDx)试剂盒进行RPA反应，不同的是，在模板片段加入之前，先加入280mM的MgAc，即乙酸镁。在37℃下反应30分钟。采用MinElute gel extraction kit(Qiagen)试剂盒纯化后获得靶标DNA。

3、制备gRNA

gRNA引物序列设计原则：选取靶向序列时，靶向序列5’端应具有5’-TTTN-3’序列；且靶向序列本身、靶向序列和其余序列间不形成稳定二级结构。可通过http://www.rgenome.net/cas-designer/在线软件辅助设计。

gRNA引物结构：

5’-靶向序列-“ATCTACACTTAGTAGAAATTA”-CCCTATAGTGAGTCGTA TTACA-3’

其中“ATCTACACTTAGTAGAAATTA”序列可替换为“ATCTACAACAGTAG AAATTA”或“ATCTACAACAGTAGAAATTA”或“ATCTACAACAGTAGAAATT A”或“GCATGAGAACCATGCATTTC”或“ACCTAATTACTAGGTAATTT”或“ATC TACAAAAGTAGAAATCC”或“ATCTACAATAGTAGAAATTA”或“ATCTACAAA GTAGAAATTAT”或“ATCTACAAACAGTAGAAATT”。

参照T7 RNApolymerase kit(Thermo)试剂盒说明书，将带T7启动子的DNA片段、T7引物、T7聚合酶混合，37℃孵育过夜；再采用RNeasy mini kit(Qiagen)，获得纯化的gRNAs。

T7引物序列：TGTAATACGACTCACTATAGGG

T7 gRNA引物序列：

“靶向序列”-5’-ATCTACACTTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTAT TACA-3’

靶向序列包括：SEQ ID NO.8-23。

4、单重CRISPR/Cas12a病原检测体系的有效性验证

检测体系包括：2μl RPA产物，45nM纯化的LbCas12a，22.5nM gRNA，100nM在LbCas12a切割时可发出荧光的报告DNA链，即非特异单链DNA荧光探针(DNAseAlert QCSystem,Thermo Scientific)，0.5μl RNase抑制剂(Promega)，及核酸酶检测缓冲液(20mMTris,60mM NaCl,10mM MgCl2,pH7.3)。反应体系置于荧光分析仪(BioTek)，在37℃(除非另有说明)下反应30min，取终末荧光值进行结果判读。

分析CRISPR/Cas12a反应荧光数据：为了计算去除背景的荧光数据，方便不同条件之间的比较，样品的初始荧光被去除。背景荧光(无靶核苷酸或无gRNA的条件下)会从样品中去除，从而获得扣除背景荧光的数据。去除样本背景荧光后，大于或等于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为阳性，小于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为阴性。

检测结果如图1-5所示，结果表明：所述Cas12a蛋白和所设计的gRNA可识别切割靶标位点并产生荧光信号，说明设计的gRNA序列可特异性识别相关的病原靶标序列，可用于相关病原的定性检测。

5、单重CRISPR/Cas12a检测体系的特异性验证

设置3组实验，取3种不同靶标基因的RPA产物，分别选择与其对应的一种gRNA和两种不相关gRNA进行组合反应，验证gRNA序列的特异性。具体操作：从表1中的7种靶标序列中选择3种靶标基因(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4)，取这3种不同靶标基因的RPA产物，分别对3种不同的gRNA(SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.14)进行上述的CRISPR/Cas12a剪切反应，灭菌水做空白对照，无靶核酸的样本为阴性对照，其它条件不变。去除样本背景荧光后，大于或等于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为阳性。

结果显示：SEQ ID NO.1与其对应的gRNA(SEQ ID NO.8)反应为阳性，与其非对应的gRNA(SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.14)反应，检测结果无荧光值产生，为阴性。SEQ IDNO.2与其对应的gRNA(SEQ ID NO.12)反应为阳性，与其非对应的gRNA(SEQ ID NO.8和SEQID NO.14)反应，检测结果无荧光值产生，为阴性。SEQ ID NO.4与其对应的gRNA(SEQ IDNO.14)反应为阳性，与其非对应的gRNA(SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.12)反应，检测结果无荧光值产生，为阴性。上述结果证明三种病原的靶标序列与gRNA序列互为特异，相对应的gRNA具有良好的特异性。具体结果如表2所示。

表2.单重CRISPR/Cas12a检测体系特异性验证组合及实验结果

实施例3基于CRISPR/Cas12a系统的多重猪传染病病原核酸检测方法

为了实现对多种病原菌的同时检测，我们开发了针对上述病原靶标的多重检测体系。由于猪传染病病原中除了非洲猪瘟病毒为DNA病毒外，其他4种病毒均为RNA病毒，需要RT-RPA后才能进行CRISPR/Cas12a检测。对这4种病原的基因组的鉴定区域及对应gRNA序列进行分析，根据序列的相似性、GC含量、碱基均一性、有无形成二级发夹结构、同一反应有无交叉反应等参数，对反应体系和gRNA组合方式进行优化。

1、具体操作：按照实施例2中步骤3的方法制备好gRNA后，取4种gRNA按等比例混合(SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.23)，然后按照实施例2中步骤4的方法配制CRISPR/Cas12a检测体系，检测多重gRNA方法的特异性。检测反应中的模板则分别为所选gRNA对应靶标基因的RT-RPA产物，他们是SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQ IDNO.6，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.1。RT-RPA流程与普通RPA流程类似，只需要在RPA反应体系中加入2U的反转录酶M-MLV，具体分别参考

Basic和

BasicRT(TwistDx)试剂盒进行RT-RPA反应，在37℃下反应30分钟。实验中灭菌水做空白对照，无靶核酸的样本为阴性对照，其它条件不变。结果分析时去除样本背景荧光后，大于或等于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为阳性。

实验结果表明，特异性的靶标基因的RT-RPA产物(SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，SEQID NO.6和SEQ ID NO.7)加入多重gRNA反应体系后，均有特异性荧光产生，结果为阳性；非特异性的靶标基因的RPA产物(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)加入多重gRNA反应体系后，没有荧光产生，结果为阴性；说明实验建立的多重CRISPR/Cas12a检测体系具有良好的特异性。

2、基于以上实验结果，为了实现对上述4种猪传染病病原同时进行定性检测，我们对本专利筛选出的靶标基因和gRNA序列进行组合和优化，每种病原挑选1-2靶标位点和对应的gRNA进行组合。根据GC含量、无发夹结构、无无交叉反应等原则，优化组合方式。在本实施例中，我们通过计算模拟和实验验证，挑选了以下组合方案。将4种gRNA等比混合，4种gRNA分别为：SEQ ID NO.14(靶标序列为SEQ ID NO.4)，SEQ ID NO.17(靶标序列为SEQ IDNO.5)，SEQ ID NO.20(靶标序列为SEQ ID NO.6)，SEQ ID NO.23(靶标序列为SEQ IDNO.7)。为了验证上述方案，我们分别使用口蹄疫病毒基因组，猪流行性腹泻病毒基因组，猪传染性胃肠炎病毒基因组，猪轮状病毒A群基因组做为模板，验证上述gRNA组合的特异性。按照前述的RT-RPA反应步骤和实施例2中步骤4的方法配制CRISPR/Cas12a检测体系，检测多重gRNA方法的特异性。实验结果表明，四种病原的基因组核酸经RT-RPA后，加入上述组合的多重gRNA反应体系后，均有特异性荧光产生，结果为阳性(表3)。说明针对4种猪传染病病原建立的多重CRISPR/Cas12a检测体系具有良好的特异性。

表3.多重CRISPR/Cas12a检测体系特异性验证组合及实验结果

本实施例中，我们只呈现了对病原基因组核酸样本的一种gRNA组合方案为例，运用本专利中列出的gRNA序列进行其他形式组合，都应在本专利的保护范围之内。本领域技术人员可以理解的是，可以采用本领域常规的替代方法替换本发明实施例中常规的Cas12a基因的克隆、重组表达载体的构建、Cas12a蛋白的表达及纯化、靶核苷酸/目标基因片段的扩增等步骤中的一种或多种，以期获得类似或等同的效果。

实施例4基于CRISPR/Cas12a系统的临床样本检测

我们收集了13例疑似非洲猪瘟病毒灭活的血清样本，经荧光定量PCR试剂盒检测，其中12例样本为非洲猪瘟病毒阳性，1例为阴性(临床样本6)。对该批样本进行灭活和核酸提取后，利用本发明技术进行CRISPR/Cas12a检测。

具体方法：

1、核酸处理：选取200μl血清样本，采用柱提法提取核酸(微量样品基因组DNA提取试剂盒)，用30μl灭菌水溶解核酸产物。

2、CRISPR/Cas12a基因克隆及蛋白表达，gRNA制备(SEQ ID NO.12)、病原检测体系及荧光检测方法参考上述实施例2，其中阳性对照为合成的靶标基因质粒(SEQ ID NO.2)。

3、实验结果如图6所示，12例经荧光定量PCR验证为阳性的临床样本均有荧光产生，为阳性；荧光定量PCR验证为阴性的临床样本6，无荧光产生，为阴性；以上检测结果说明CRISPR/Cas12a系统可用于非洲猪瘟病毒临床样本的检测，具有良好的特异性。

另外上文中SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示序列如下：

SEQ ID NO.24：(ScCas12a的序列)

ATGCAGACCCTGTTTGAGAACTTCACAAATCAGTACCCAGTGTCCAAGACCCTGCGCTTTGAGCTGATCCCCCAGGGCAAGACAAAGGACTTCATCGAGCAGAAGGGCCTGCTGAAGAAGGATGAGGACCGGGCCGAGAAGTATAAGAAGGTGAAGAACATCATCGATGAGTACCACAAGGACTTCATCGAGAAGTCTCTGAATGGCCTGAAGCTGGACGGCCTGGAGGAATACAAGACCCTGTATCTGAAGCAGGAGAAGGACGATAAGGATAAGAAGGCCTTTGACAAGGAGAAGGAGAACCTGCGCAAGCAGATCGCCAATGCCTTCCGGAACAATGAGAAGTTTAAGACACTGTTCGCCAAGGAGCTGATCAAGAACGATCTGATGTCTTTCGCCTGCGAGGAGGACAAGAAGAATGTGAAGGAGTTTGAGGCCTTCACCACATACTTCACCGGCTTCCACCAGAACCGCGCCAATATGTACGTGGCCGATGAGAAGAGAACAGCCATCGCCAGCAGGCTGATCCACGAGAACCTGCCAAAGTTTATCGACAATATCAAGATCTTCGAGAAGATGAAGAAGGAGGCCCCCGAGCTGCTGTCTCCTTTCAACCAGACCCTGAAGGATATGAAGGACGTGATCAAGGGCACCACACTGGAGGAGATCTTTAGCCTGGATTATTTCAACAAGACCCTGACACAGAGCGGCATCGACATCTACAATTCCGTGATCGGCGGCAGAACCCCTGAGGAGGGCAAGACAAAGATCAAGGGCCTGAACGAGTACATCAATACCGACTTCAACCAGAAGCAGACAGACAAGAAGAAGCGGCAGCCAAAGTTCAAGCAGCTGTATAAGCAGATCCTGAGCGATAGGCAGAGCCTGTCCTTTATCGCCGAGGCCTTCAAGAACGACACCGAGATCCTGGAGGCCATCGAGAAGTTTTACGTGAATGAGCTGCTGCACTTCAGCAATGAGGGCAAGTCCACAAACGTGCTGGACGCCATCAAGAATGCCGTGTCTAACCTGGAGAGCTTTAACCTGACCAAGATCTATTTCCGCTCCGGCACCTCTCTGACAGACGTGAGCCGGAAGGTGTTTGGCGAGTGGAGCATCATCAATAGAGCCCTGGACAACTACTATGCCACCACATATCCAATCAAGCCCAGAGAGAAGTCTGAGAAGTACGAGGAGAGGAAGGAGAAGTGGCTGAAGCAGGACTTCAACGTGAGCCTGATCCAGACCGCCATCGATGAGTACGACAACGAGACAGTGAAGGGCAAGAACAGCGGCAAAGTGATCGTCGATTATTTTGCCAAGTTCTGCGACGATAAGGAGACAGACCTGATCCAGAAGGTGAACGAGGGCTACATCGCCGTGAAGGATCTGCTGAATACACCCTGTCCTGAGAACGAGAAGCTGGGCAGCAATAAGGACCAGGTGAAGCAGATCAAGGCCTTTATGGATTCTATCATGGACATCATGCACTTCGTGCGCCCCCTGAGCCTGAAGGATACCGACAAGGAGAAGGATGAGACATTCTACTCCCTGTTCACACCTCTGTACGACCACCTGACCCAGACAATCGCCCTGTATAACAAGGTGCGGAACTATCTGACCCAGAAGCCTTACAGCACAGAGAAGATCAAGCTGAACTTCGAGAACAGCACCCTGCTGGGCGGCTGGGATCTGAATAAGGAGACAGACAACACAGCCATCATCCTGAGGAAGGAAAACCTGTACTATCTGGGCATCATGGACAAGAGGCACAATCGCATCTTTCGGAACGTGCCCAAGGCCGATAAGAAGGACTCTTGCTACGAGAAGATGGTGTATAAGCTGCTGCCTGGCGCCAACAAGATGCTGCCAAAGGTGTTCTTTTCTCAGAGCAGAATCCAGGAGTTTACCCCTTCCGCCAAGCTGCTGGAGAACTACGAAAATGAGACACACAAGAAGGGCGATAATTTCAACCTGAATCACTGTCACCAGCTGATCGATTTCTTTAAGGACTCTATCAACAAGCACGAGGATTGGAAGAATTTCGACTTTAGGTTCAGCGCCACCTCCACCTACGCCGACCTGAGCGGCTTTTACCACGAGGTGGAGCACCAGGGCTACAAGATCTCTTTTCAGAGCATCGCCGATTCCTTCATCGACGATCTGGTGAACGAGGGCAAGCTGTACCTGTTCCAGATCTATAATAAGGACTTTTCCCCATTCTCTAAGGGCAAGCCCAACCTGCACACCCTGTACTGGAAGATGCTGTTTGATGAGAACAATCTGAAGGACGTGGTGTATAAGCTGAATGGCGAGGCCGAGGTGTTCTACCGCAAGAAGAGCATTGCCGAGAAGAACACCACAATCCACAAGGCCAATGAGTCCATCATCAACAAGAATCCTGATAACCCAAAGGCCACCAGCACCTTCAACTATGATATCGTGAAGGACAAGAGATACACCATCGACAAGTTTCAGTTCCACATCCCAATCACAATGAACTTTAAGGCCGAGGGCATCTTCAACATGAATCAGAGGGTGAATCAGTTCCTGAAGGCCAATCCCGATATCAACATCATCGGCATCGACAGAGGCGAGAGGCACCTGCTGTACTATGCCCTGATCAACCAGAAGGGCAAGATCCTGAAGCAGGATACCCTGAATGTGATCGCCAACGAGAAGCAGAAGGTGGACTACCACAATCTGCTGGATAAGAAGGAGGGCGACCGCGCAACCGCAAGGCAGGAGTGGGGCGTGATCGAGACAATCAAGGAGCTGAAGGAGGGCTATCTGTCCCAGGTCATCCACAAGCTGACCGATCTGATGATCGAGAACAATGCCATCATCGTGATGGAGGACCTGAACTTTGGCTTCAAGCGGGGCAGACAGAAGGTGGAGAAGCAGGTGTATCAGAAGTTTGAGAAGATGCTGATCGATAAGCTGAATTACCTGGTGGACAAGAATAAGAAGGCAAACGAGCTGGGAGGCCTGCTGAACGCATTCCAGCTGGCCAATAAGTTTGAGTCCTTCCAGAAGATGGGCAAGCAGAACGGCTTTATCTTCTACGTGCCCGCCTGGAATACCTCTAAGACAGATCCTGCCACCGGCTTTATCGACTTCCTGAAGCCCCGCTATGAGAACCTGAATCAGGCCAAGGATTTCTTTGAGAAGTTTGACTCTATCCGGCTGAACAGCAAGGCCGATTACTTTGAGTTCGCCTTTGACTTCAAGAATTTCACCGAGAAGGCCGATGGCGGCAGAACCAAGTGGACAGTGTGCACCACAAACGAGGACAGATATGCCTGGAATAGGGCCCTGAACAATAACAGGGGCAGCCAGGAGAAGTACGACATCACAGCCGAGCTGAAGTCCCTGTTCGATGGCAAGGTGGACTATAAGTCTGGCAAGGATCTGAAGCAGCAGATCGCCAGCCAGGAGTCCGCCGACTTCTTTAAGGCCCTGATGAAGAACCTGTCCATCACCCTGTCTCTGAGACACAATAACGGCGAGAAGGGCGATAATGAGCAGGACTACATCCTGTCCCCTGTGGCCGATTCTAAGGGCCGCTTCTTTGACTCCCGGAAGGCCGACGATGACATGCCAAAGAATGCCGACGCCAACGGCGCCTATCACATCGCCCTGAAGGGCCTGTGGTGTCTGGAGCAGATCAGCAAGACCGATGACCTGAAGAAGGTGAAGCTGGCCATCTCCAACAAGGAGTGGCTGGAGTTCGTGCAGACACTGAAGGGCAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCCSEQ ID NO.25：(SsCas12a的序列)

ATGCAGACCCTGTTTGAGAACTTCACAAATCAGTACCCAGTGTCCAAGACCCTGCGCTTTGAGCTGATCCCCCAGGGCAAGACAAAGGACTTCATCGAGCAGAAGGGCCTGCTGAAGAAGGATGAGGACCGGGCCGAGAAGTATAAGAAGGTGAAGAACATCATCGATGAGTACCACAAGGACTTCATCGAGAAGTCTCTGAATGGCCTGAAGCTGGACGGCCTGGAGAAGTACAAGACCCTGTATCTGAAGCAGGAGAAGGACGATAAGGATAAGAAGGCCTTTGACAAGGAGAAGGAGAACCTGCGCAAGCAGATCGCCAATGCCTTCCGGAACAATGAGAAGTTTAAGACACTGTTCGCCAAGGAGCTGATCAAGAACGATCTGATGTCTTTCGCCTGCGAGGAGGACAAGAAGAATGTGAAGGAGTTTGAGGCCTTCACCACATACTTCACCGGCTTCCACCAGAACCGCGCCAATATGTACGTGGCCGATGAGAAGAGAACAGCCATCGCCAGCAGGCTGATCCACGAGAACCTGCCAAAGTTTATCGACAATATCAAGATCTTCGAGAAGATGAAGAAGGAGGCCCCCGAGCTGCTGTCTCCTTTCAACCAGACCCTGAAGGATATGAAGGACGTGATCAAGGGCACCACACTGGAGGAGATCTTTAGCCTGGATTATTTCAACAAGACCCTGACACAGAGCGGCATCGACATCTACAATTCCGTGATCGGCGGCAGAACCCCTGAGGAGGGCAAGACAAAGATCAAGGGCCTGAACGAGTACATCAATACCGACTTCAACCAGAAGCAGACAGACAAGAAGAAGCGGCAGCCAAAGTTCAAGCAGCTGTATAAGCAGATCCTGAGCGATAGGCAGAGCCTGTCCTTTATCGCCGAGGCCTTCAAGAACGACACCGAGATCCTGGAGGCCATCGAGAAGTTTTACGTGAATGAGCTGCTGCACTTCAGCAATGAGGGCAAGTCCACAAACGTGCTGGACGCCATCAAGAATGCCGTGTCTAACCTGGAGAGCTTTAACCTGACCAAGATGTATTTCCGCTCCGGCGCCTCTCTGACAGACGTGAGCCGGAAGGTGTTTGGCGAGTGGAGCATCATCAATAGAGCCCTGGACAACTACTATGCCACCACATATCCAATCAAGCCCAGAGAGAAGTCTGAGAAGTACGAGGAGAGGAAGGAGAAGTGGCTGAAGCAGGACTTCAACGTGAGCCTGATCCAGACCGCCATCGATGAGTACGACAACGAGACAGTGAAGGGCAAGAACAGCGGCAAAGTGATCGCCGATTATTTTGCCAAGTTCTGCGACGATAAGGAGACAGACCTGATCCAGAAGGTGAACGAGGGCTACATCGCCGTGAAGGATCTGCTGAATACACCCTGTCCTGAGAACGAGAAGCTGGGCAGCAATAAGGACCAGGTGAAGCAGATCAAGGCCTTTATGGATTCTATCATGGACATCATGCACTTCGTGCGCCCCCTGAGCCTGAAGGATACCGACAAGGAGAAGGATGAGACATTCTACTCCCTGTTCACACCTCTGTACGACCACCTGACCCAGACAATCGCCCTGTATAACAAGGTGCGGAACTATCTGACCCAGAAGCCTTACAGCACAGAGAAGATCAAGCTGAACTTCGAGAACAGCACCCTGCTGGGCGGCTGGGATCTGAATAAGGAGACAGACAACACAGCCATCATCCTGAGGAAGGATAACCTGTACTATCTGGGCATCATGGACAAGAGGCACAATCGCATCTTTCGGAACGTGCCCAAGGCCGATAAGAAGGACTTCTGCTACGAGAAGATGGTGTATAAGCTGCTGCCTGGCGCCAACAAGATGCTGCCAAAGGTGTTCTTTTCTCAGAGCAGAATCCAGGAGTTTACCCCTTCCGCCAAGCTGCTGGAGAACTACGCCAATGAGACACACAAGAAGGGCGATAATTTCAACCTGAATCACTGTCACAAGCTGATCGATTTCTTTAAGGACTCTATCAACAAGCACGAGGATTGGAAGAATTTCGACTTTAGGTTCAGCGCCACCTCCACCTACGCCGACCTGAGCGGCTTTTACCACGAGGTGGAGCACCAGGGCTACAAGATCTCTTTTCAGAGCGTGGCCGATTCCTTCATCGACGATCTGGTGAACGAGGGCAAGCTGTACCTGTTCCAGATCTATAATAAGGACTTTTCCCCATTCTCTAAGGGCAAGCCCAACCTGCACACCCTGTACTGGAAGATGCTGTTTGATGAGAACAATCTGAAGGACGTGGTGTATAAGCTGAATGGCGAGGCCGAGGTGTTCTACCGCAAGAAGAGCATTGCCGAGAAGAACACCACAATCCACAAGGCCAATGAGTCCATCATCAACAAGAATCCTGATAACCCAAAGGCCACCAGCACCTTCAACTATGATATCGTGAAGGACAAGAGATACACCATCGACAAGTTTCAGTTCCACATCCCAATCACAATGAACTTTAAGGCCGAGGGCATCTTCAACATGAATCAGAGGGTGAATCAGTTCCTGAAGGCCAATCCCGATATCAACATCATCGGCATCGACAGAGGCGAGAGGCACCTGCTGTACTATGCCCTGATCAACCAGAAGGGCAAGATCCTGAAGCAGGATACCCTGAATGTGATCGCCAACGAGAAGCAGAAGGTGGACTACCACAATCTGCTGGATAAGAAGGAGGGCGACCGCGCAACCGCAAGGCAGGAGTGGGGCGTGATCGAGACAATCAAGGAGCTGAAGGAGGGCTATCTGTCCCAGGTCATCCACAAGCTGACCGATCTGATGATCGAGAACAATGCCATCATCGTGATGGAGGACCTGAACTTTGGCTTCAAGCGGGGCAGACAGAAGGTGGAGAAGCAGGTGTATCAGAAGTTTGAGAAGATGCTGATCGATAAGCTGAATTACCTGGTGGACAAGAATAAGAAGGCAAACGAGCTGGGAGGCCTGCTGAACGCATTCCAGCTGGCCAATAAGTTTGAGTCCTTCCAGAAGATGGGCAAGCAGAACGGCTTTATCTTCTACGTGCCCGCCTGGAATACCTCTAAGACAGATCCTGCCACCGGCTTTATCGACTTCCTGAAGCCCCGCTATGAGAACCTGAATCAGGCCAAGGATTTCTTTGAGAAGTTTGACTCTATCCGGCTGAACAGCAAGGCCGATTACTTTGAGTTCGCCTTTGACTTCAAGAATTTCACCGAGAAGGCCGATGGCGGCAGAACCAAGTGGACAGTGTGCACCACAAACGAGGACAGATATGCCTGGAATAGGGCCCTGAACAATAACAGGGGCAGCCAGGAGAAGTACGACATCACAGCCGAGCTGAAGTCCCTGTTCGATGGCAAGGTGGACTATAAGTCTGGCAAGGATCTGAAGCAGCAGATCGCCAGCCAGGAGTCCGCCGACTTCTTTAAGGCCCTGATGAAGAACCTGTCCATCACCCTGTCTCTGAGACACAATAACGGCGAGAAGGGCGATAATGAGCAGGACTACATCCTGTCCCCTGTGGCCGATTCTAAGGGCCGCTTCTTTGACTCCCGGAAGGCCGACGATGACATGCCAAAGAATGCCGACGCCAACGGCGCCTATCACATCGCCCTGAAGGGCCTGTGGTGTCTGGAGCAGATCAGCAAGACCGATGACCTGAAGAAGGTGAAGCTGGCCATCTCCAACAAGGAGTGGCTGGAGTTCGTGCAGACACTGAAGGGCAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCC

序列表

<110> 广州普世利华科技有限公司

<120> 一种猪常见传染病病原的快速检测监控方法

<140> 2019103653731

<141> 2019-04-30

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 280

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtgataa agcgctcgcc gaagggaatg gatactgagg gaatagcaag gttcacgttc 60

tcgttaaacc aaaagcgcag cttaatccag agcgcaagag ggggctgata gtatttaggg 120

gtttgaggtc cattacagct gtaatgaaca ttacgtctta tgtccagata cgttgcgtcc 180

gtgataggag tgatatcttg tttacctgct gtttggatat tgtgagagtt ctcgggaaaa 240

tgttgtgaaa gaaatttcgg gttggtatgg ctgcacgttc 280

<210> 2

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttatcttaaa aaattacagg atatttataa gaagcttgag ggtcacccct ttctttttag 60

tccgtcgaaa accaatgaaa aagagtttat tactctgcta aaccaagcct tggcctcgac 120

gcagctttac cgcagcatac aacagctgtt tttaacgatg tataagctag atcccattgg 180

gtttgttaac tatattaaag cgagtaaaca agagtattta tgtctgttga ttaatcctaa 240

actagtcact aagtttttaa aaataacgag ctttaaaatt tacattaatt tcaggctaaa 300

aactttctat ataagtccta ataa 324

<210> 3

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggcattttg caattgtgag cttccaggag ggtttataag cgcaattaac cattttaatc 60

atacaatgat gcattaccct acctttaact gggtagcctc ctccctttac cccagttcag 120

aaacagatgc cttggaagac cactatggtc tttatcagtg caatccggat aactggctca 180

tgcagtctcc tttactgaaa aaaaatatgg attataataa cggggacgtg actatagcta 240

gcaatgtaaa aaatctggcg cttaaagcca cacagaagct gactcccatc catctatata 300

cggctgatgg aggtattaat gtag 324

<210> 4

<211> 269

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggtcagtcc atcactgacg tcactttcct caagaggcac ttccacatgg attatggaac 60

tgggttttac aaacctgtga tggcttcgaa gaccctcgaa gccatcctct cctttgcacg 120

ccgtgggacc atacaggaga agttgatctc tgtggcagga ctcgccgtcc actcaggacc 180

tgacgagtac cggcgtctct tcgaaccctt tcagggtctc tttgagattc caagctacag 240

atcactttac ctgcgttggg tgaacgccg 269

<210> 5

<211> 340

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcatcctta tggcttgcat cactcttatg ctgtggataa tgtactttgt caatagcatt 60

cggttgtggc gcaggacaca ttcttggtgg tctttcaatc ctgaaacaga cgcgcttctc 120

actacttctg tgatgggccg acaggtctgc attccagtgc ttggagcacc aactggtgta 180

acgctaacac tccttagtgg tacattgctt gtagagggct ataaggttgc tactggcgta 240

caggtaagtc aattacctaa tttcgtcaca gtcgccaagg ccactacaac aattgtctac 300

ggacgtgttg gtcgttcagt caatgcttca tctggcactg 340

<210> 6

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggaagagaac tgcaggtaaa ggtgatgtga caagatttta tggagctaga agcagttcag 60

ccaattttgg tgacagtgac ctcgttgcca atgggagcag tgccaagcat tacccacaat 120

tggctgaatg tgttccatct gtgtctagca ttctgtttgg aagctattgg acttcaaagg 180

aagatggcga ccagatagaa gtcacgttca cacacaaata ccacttgcca 230

<210> 7

<211> 352

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gccatctggc tctgcgtgct gtgctcccgg cgccgggcgg cctcgcggcc gttccgggtg 60

ccgacgcggg cgcggacgca catgctctct ccggtgtaca ccagcctgcc cacgcacgag 120

gactactacg acggcgacga cgacgacgac gaggaggcgg gcgtcatccg ccggcggccc 180

gcctccccca gcggagacag cggctacgag gggccgtacg cgagcctgga ccccgaggac 240

gagttcagca gcgacgagga cgacgggctg tacgtgcgcc ccgaggaggc gccccgctcc 300

ggcttcgacg tctggttccg cgatccggag aaaccggaag tgacgaatgg ac 352

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggtccatta cagctgtaat 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctgctgttt ggatattgtg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccgagaactc tcacaatatc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acgagaacgt gaaccttgct 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acgatgtata agctagatcc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tcagtgcaat ccggataact 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

caaacctgtg atggcttcga 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cacgccgtgg gaccatacag 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agggtctctt tgagattcca 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tcaatagcat tcggttgtgg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aatcctgaaa cagacgcgct 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gtcacagtcg ccaaggccac 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tggagctaga agcagttcag 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gtgacagtga cctcgttgcc 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aagtccaata gcttccaaac 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tccggatcgc ggaaccagac 20

<210> 24

<211> 3885

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

atgcagaccc tgtttgagaa cttcacaaat cagtacccag tgtccaagac cctgcgcttt 60

gagctgatcc cccagggcaa gacaaaggac ttcatcgagc agaagggcct gctgaagaag 120

gatgaggacc gggccgagaa gtataagaag gtgaagaaca tcatcgatga gtaccacaag 180

gacttcatcg agaagtctct gaatggcctg aagctggacg gcctggagga atacaagacc 240

ctgtatctga agcaggagaa ggacgataag gataagaagg cctttgacaa ggagaaggag 300

aacctgcgca agcagatcgc caatgccttc cggaacaatg agaagtttaa gacactgttc 360

gccaaggagc tgatcaagaa cgatctgatg tctttcgcct gcgaggagga caagaagaat 420

gtgaaggagt ttgaggcctt caccacatac ttcaccggct tccaccagaa ccgcgccaat 480

atgtacgtgg ccgatgagaa gagaacagcc atcgccagca ggctgatcca cgagaacctg 540

ccaaagttta tcgacaatat caagatcttc gagaagatga agaaggaggc ccccgagctg 600

ctgtctcctt tcaaccagac cctgaaggat atgaaggacg tgatcaaggg caccacactg 660

gaggagatct ttagcctgga ttatttcaac aagaccctga cacagagcgg catcgacatc 720

tacaattccg tgatcggcgg cagaacccct gaggagggca agacaaagat caagggcctg 780

aacgagtaca tcaataccga cttcaaccag aagcagacag acaagaagaa gcggcagcca 840

aagttcaagc agctgtataa gcagatcctg agcgataggc agagcctgtc ctttatcgcc 900

gaggccttca agaacgacac cgagatcctg gaggccatcg agaagtttta cgtgaatgag 960

ctgctgcact tcagcaatga gggcaagtcc acaaacgtgc tggacgccat caagaatgcc 1020

gtgtctaacc tggagagctt taacctgacc aagatctatt tccgctccgg cacctctctg 1080

acagacgtga gccggaaggt gtttggcgag tggagcatca tcaatagagc cctggacaac 1140

tactatgcca ccacatatcc aatcaagccc agagagaagt ctgagaagta cgaggagagg 1200

aaggagaagt ggctgaagca ggacttcaac gtgagcctga tccagaccgc catcgatgag 1260

tacgacaacg agacagtgaa gggcaagaac agcggcaaag tgatcgtcga ttattttgcc 1320

aagttctgcg acgataagga gacagacctg atccagaagg tgaacgaggg ctacatcgcc 1380

gtgaaggatc tgctgaatac accctgtcct gagaacgaga agctgggcag caataaggac 1440

caggtgaagc agatcaaggc ctttatggat tctatcatgg acatcatgca cttcgtgcgc 1500

cccctgagcc tgaaggatac cgacaaggag aaggatgaga cattctactc cctgttcaca 1560

cctctgtacg accacctgac ccagacaatc gccctgtata acaaggtgcg gaactatctg 1620

acccagaagc cttacagcac agagaagatc aagctgaact tcgagaacag caccctgctg 1680

ggcggctggg atctgaataa ggagacagac aacacagcca tcatcctgag gaaggaaaac 1740

ctgtactatc tgggcatcat ggacaagagg cacaatcgca tctttcggaa cgtgcccaag 1800

gccgataaga aggactcttg ctacgagaag atggtgtata agctgctgcc tggcgccaac 1860

aagatgctgc caaaggtgtt cttttctcag agcagaatcc aggagtttac cccttccgcc 1920

aagctgctgg agaactacga aaatgagaca cacaagaagg gcgataattt caacctgaat 1980

cactgtcacc agctgatcga tttctttaag gactctatca acaagcacga ggattggaag 2040

aatttcgact ttaggttcag cgccacctcc acctacgccg acctgagcgg cttttaccac 2100

gaggtggagc accagggcta caagatctct tttcagagca tcgccgattc cttcatcgac 2160

gatctggtga acgagggcaa gctgtacctg ttccagatct ataataagga cttttcccca 2220

ttctctaagg gcaagcccaa cctgcacacc ctgtactgga agatgctgtt tgatgagaac 2280

aatctgaagg acgtggtgta taagctgaat ggcgaggccg aggtgttcta ccgcaagaag 2340

agcattgccg agaagaacac cacaatccac aaggccaatg agtccatcat caacaagaat 2400

cctgataacc caaaggccac cagcaccttc aactatgata tcgtgaagga caagagatac 2460

accatcgaca agtttcagtt ccacatccca atcacaatga actttaaggc cgagggcatc 2520

ttcaacatga atcagagggt gaatcagttc ctgaaggcca atcccgatat caacatcatc 2580

ggcatcgaca gaggcgagag gcacctgctg tactatgccc tgatcaacca gaagggcaag 2640

atcctgaagc aggataccct gaatgtgatc gccaacgaga agcagaaggt ggactaccac 2700

aatctgctgg ataagaagga gggcgaccgc gcaaccgcaa ggcaggagtg gggcgtgatc 2760

gagacaatca aggagctgaa ggagggctat ctgtcccagg tcatccacaa gctgaccgat 2820

ctgatgatcg agaacaatgc catcatcgtg atggaggacc tgaactttgg cttcaagcgg 2880

ggcagacaga aggtggagaa gcaggtgtat cagaagtttg agaagatgct gatcgataag 2940

ctgaattacc tggtggacaa gaataagaag gcaaacgagc tgggaggcct gctgaacgca 3000

ttccagctgg ccaataagtt tgagtccttc cagaagatgg gcaagcagaa cggctttatc 3060

ttctacgtgc ccgcctggaa tacctctaag acagatcctg ccaccggctt tatcgacttc 3120

ctgaagcccc gctatgagaa cctgaatcag gccaaggatt tctttgagaa gtttgactct 3180

atccggctga acagcaaggc cgattacttt gagttcgcct ttgacttcaa gaatttcacc 3240

gagaaggccg atggcggcag aaccaagtgg acagtgtgca ccacaaacga ggacagatat 3300

gcctggaata gggccctgaa caataacagg ggcagccagg agaagtacga catcacagcc 3360

gagctgaagt ccctgttcga tggcaaggtg gactataagt ctggcaagga tctgaagcag 3420

cagatcgcca gccaggagtc cgccgacttc tttaaggccc tgatgaagaa cctgtccatc 3480

accctgtctc tgagacacaa taacggcgag aagggcgata atgagcagga ctacatcctg 3540

tcccctgtgg ccgattctaa gggccgcttc tttgactccc ggaaggccga cgatgacatg 3600

ccaaagaatg ccgacgccaa cggcgcctat cacatcgccc tgaagggcct gtggtgtctg 3660

gagcagatca gcaagaccga tgacctgaag aaggtgaagc tggccatctc caacaaggag 3720

tggctggagt tcgtgcagac actgaagggc aaaaggccgg cggccacgaa aaaggccggc 3780

caggcaaaaa agaaaaaggg atcctaccca tacgatgttc cagattacgc ttatccctac 3840

gacgtgcctg attatgcata cccatatgat gtccccgact atgcc 3885

<210> 25

<211> 3885

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

atgcagaccc tgtttgagaa cttcacaaat cagtacccag tgtccaagac cctgcgcttt 60

gagctgatcc cccagggcaa gacaaaggac ttcatcgagc agaagggcct gctgaagaag 120

gatgaggacc gggccgagaa gtataagaag gtgaagaaca tcatcgatga gtaccacaag 180

gacttcatcg agaagtctct gaatggcctg aagctggacg gcctggagaa gtacaagacc 240

ctgtatctga agcaggagaa ggacgataag gataagaagg cctttgacaa ggagaaggag 300

aacctgcgca agcagatcgc caatgccttc cggaacaatg agaagtttaa gacactgttc 360

gccaaggagc tgatcaagaa cgatctgatg tctttcgcct gcgaggagga caagaagaat 420

gtgaaggagt ttgaggcctt caccacatac ttcaccggct tccaccagaa ccgcgccaat 480

atgtacgtgg ccgatgagaa gagaacagcc atcgccagca ggctgatcca cgagaacctg 540

ccaaagttta tcgacaatat caagatcttc gagaagatga agaaggaggc ccccgagctg 600

ctgtctcctt tcaaccagac cctgaaggat atgaaggacg tgatcaaggg caccacactg 660

gaggagatct ttagcctgga ttatttcaac aagaccctga cacagagcgg catcgacatc 720

tacaattccg tgatcggcgg cagaacccct gaggagggca agacaaagat caagggcctg 780

aacgagtaca tcaataccga cttcaaccag aagcagacag acaagaagaa gcggcagcca 840

aagttcaagc agctgtataa gcagatcctg agcgataggc agagcctgtc ctttatcgcc 900

gaggccttca agaacgacac cgagatcctg gaggccatcg agaagtttta cgtgaatgag 960

ctgctgcact tcagcaatga gggcaagtcc acaaacgtgc tggacgccat caagaatgcc 1020

gtgtctaacc tggagagctt taacctgacc aagatgtatt tccgctccgg cgcctctctg 1080

acagacgtga gccggaaggt gtttggcgag tggagcatca tcaatagagc cctggacaac 1140

tactatgcca ccacatatcc aatcaagccc agagagaagt ctgagaagta cgaggagagg 1200

aaggagaagt ggctgaagca ggacttcaac gtgagcctga tccagaccgc catcgatgag 1260

tacgacaacg agacagtgaa gggcaagaac agcggcaaag tgatcgccga ttattttgcc 1320

aagttctgcg acgataagga gacagacctg atccagaagg tgaacgaggg ctacatcgcc 1380

gtgaaggatc tgctgaatac accctgtcct gagaacgaga agctgggcag caataaggac 1440

caggtgaagc agatcaaggc ctttatggat tctatcatgg acatcatgca cttcgtgcgc 1500

cccctgagcc tgaaggatac cgacaaggag aaggatgaga cattctactc cctgttcaca 1560

cctctgtacg accacctgac ccagacaatc gccctgtata acaaggtgcg gaactatctg 1620

acccagaagc cttacagcac agagaagatc aagctgaact tcgagaacag caccctgctg 1680

ggcggctggg atctgaataa ggagacagac aacacagcca tcatcctgag gaaggataac 1740

ctgtactatc tgggcatcat ggacaagagg cacaatcgca tctttcggaa cgtgcccaag 1800

gccgataaga aggacttctg ctacgagaag atggtgtata agctgctgcc tggcgccaac 1860

aagatgctgc caaaggtgtt cttttctcag agcagaatcc aggagtttac cccttccgcc 1920

aagctgctgg agaactacgc caatgagaca cacaagaagg gcgataattt caacctgaat 1980

cactgtcaca agctgatcga tttctttaag gactctatca acaagcacga ggattggaag 2040

aatttcgact ttaggttcag cgccacctcc acctacgccg acctgagcgg cttttaccac 2100

gaggtggagc accagggcta caagatctct tttcagagcg tggccgattc cttcatcgac 2160

gatctggtga acgagggcaa gctgtacctg ttccagatct ataataagga cttttcccca 2220

ttctctaagg gcaagcccaa cctgcacacc ctgtactgga agatgctgtt tgatgagaac 2280

aatctgaagg acgtggtgta taagctgaat ggcgaggccg aggtgttcta ccgcaagaag 2340

agcattgccg agaagaacac cacaatccac aaggccaatg agtccatcat caacaagaat 2400

cctgataacc caaaggccac cagcaccttc aactatgata tcgtgaagga caagagatac 2460

accatcgaca agtttcagtt ccacatccca atcacaatga actttaaggc cgagggcatc 2520

ttcaacatga atcagagggt gaatcagttc ctgaaggcca atcccgatat caacatcatc 2580

ggcatcgaca gaggcgagag gcacctgctg tactatgccc tgatcaacca gaagggcaag 2640

atcctgaagc aggataccct gaatgtgatc gccaacgaga agcagaaggt ggactaccac 2700

aatctgctgg ataagaagga gggcgaccgc gcaaccgcaa ggcaggagtg gggcgtgatc 2760

gagacaatca aggagctgaa ggagggctat ctgtcccagg tcatccacaa gctgaccgat 2820

ctgatgatcg agaacaatgc catcatcgtg atggaggacc tgaactttgg cttcaagcgg 2880

ggcagacaga aggtggagaa gcaggtgtat cagaagtttg agaagatgct gatcgataag 2940

ctgaattacc tggtggacaa gaataagaag gcaaacgagc tgggaggcct gctgaacgca 3000

ttccagctgg ccaataagtt tgagtccttc cagaagatgg gcaagcagaa cggctttatc 3060

ttctacgtgc ccgcctggaa tacctctaag acagatcctg ccaccggctt tatcgacttc 3120

ctgaagcccc gctatgagaa cctgaatcag gccaaggatt tctttgagaa gtttgactct 3180

atccggctga acagcaaggc cgattacttt gagttcgcct ttgacttcaa gaatttcacc 3240

gagaaggccg atggcggcag aaccaagtgg acagtgtgca ccacaaacga ggacagatat 3300

gcctggaata gggccctgaa caataacagg ggcagccagg agaagtacga catcacagcc 3360

gagctgaagt ccctgttcga tggcaaggtg gactataagt ctggcaagga tctgaagcag 3420

cagatcgcca gccaggagtc cgccgacttc tttaaggccc tgatgaagaa cctgtccatc 3480

accctgtctc tgagacacaa taacggcgag aagggcgata atgagcagga ctacatcctg 3540

tcccctgtgg ccgattctaa gggccgcttc tttgactccc ggaaggccga cgatgacatg 3600

ccaaagaatg ccgacgccaa cggcgcctat cacatcgccc tgaagggcct gtggtgtctg 3660

gagcagatca gcaagaccga tgacctgaag aaggtgaagc tggccatctc caacaaggag 3720

tggctggagt tcgtgcagac actgaagggc aaaaggccgg cggccacgaa aaaggccggc 3780

caggcaaaaa agaaaaaggg atcctaccca tacgatgttc cagattacgc ttatccctac 3840

gacgtgcctg attatgcata cccatatgat gtccccgact atgcc 3885

Claims

1.一种基于CRISPR/Cas12a技术的猪传染病病原核酸检测试剂盒，其特征在于，所述猪传染病病原为非洲猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒，所述检测试剂盒包括Cas12a蛋白和gRNA，所述gRNA以所述猪传染病病原的靶标位点为靶序列进行设计，设计原则为：在选取gRNA靶向序列时，靶向序列5’端应具有5’-TTTN-3’序列，且靶向序列本身、靶向序列和其余序列间不形成稳定二级结构；

其中，用于检测非洲猪瘟病毒的gRNA以SEQ ID NO.1-3任一所示靶标位点为靶序列进行设计；以SEQ ID NO.1所示靶标位点为靶序列时，则所述gRNA的序列如SEQ ID NO.8-10任一所示；以SEQ ID NO.2所示靶标位点为靶序列时，则所述gRNA的序列如SEQ ID NO.12所示；以SEQ ID NO.3所示靶标位点为靶序列，则所述gRNA的序列如SEQ ID NO.13所示；

用于检测猪口蹄疫病毒的gRNA以SEQ ID NO.4所示靶标位点为靶序列进行设计，所述gRNA的序列如SEQ ID NO.16所示；

用于检测猪流行性腹泻病毒的gRNA以SEQ ID NO.5所示靶标位点为靶序列进行设计，所述gRNA的序列如SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.19所示；

用于检测猪传染性胃肠炎病毒的gRNA以SEQ ID NO.6所示靶标位点为靶序列进行设计，所述gRNA的序列如SEQ ID NO.20所示；

用于检测猪轮状病毒的gRNA以SEQ ID NO.7所示靶标位点为靶序列进行设计，所述gRNA的序列如SEQ ID NO.23所示。

2. gRNA在制备基于CRISPR/Cas12a技术的猪传染病病原核酸检测产品中的应用，其特征在于，所述猪传染病病原为非洲猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒；所述用于检测非洲猪瘟病毒的gRNA的序列如SEQ ID NO.8-10、12-13任一所示；所述用于检测猪口蹄疫病毒的gRNA的序列如SEQ ID NO.16所示；所述用于检测猪流行性腹泻病毒的gRNA的序列如SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.19所示；所述用于检测猪传染性胃肠炎病毒的gRNA的序列如SEQ ID NO.20所示；所述用于检测猪轮状病毒的gRNA的序列如SEQ ID NO.23所示。