CN116462742B - 一种猴痘病毒假病毒颗粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猴痘病毒假病毒颗粒及其制备方法。本发明所述猴痘病毒假病毒颗粒中同时含有6种不同的猴痘病毒基因，即猴痘病毒F3L基因、F4L基因、B2R基因、B6R基因、B7R基因和J2R基因，可满足猴痘病毒分型检测的需要。此外，本发明所述猴痘病毒假病毒颗粒的制备方法简单，稳定性好，经反复冻融和加速老化后仍可以取得理想的检测效果，可作为猴痘病毒核酸检测及猴痘病毒分型检测所需质控品，保证检测结果的准确性。

Description

一种猴痘病毒假病毒颗粒及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种猴痘病毒假病毒颗粒及其制备方法。
背景技术
猴痘(Monkeypox)是一种因感染猴痘病毒(Monkeypox Virus，MPV)引起的病毒性人畜共患病，其临床表现类似天花，但死亡率较天花要低。猴痘病毒可以通过直接接触由动物传染给人，也可以在人与人之间传播，虽其引起的症状较天花要轻，但对免疫系统薄弱以及处于妊娠或哺乳期等的人来说，感染猴痘病毒可能更容易患重病或死亡。因此，对猴痘病毒进行检测，是阻碍猴痘传播。也是开展及时、准确的治疗的关键。
目前，国内外许多研究者建立了猴痘病毒的分子生物学诊断方法，但所使用的质控品多为猴痘病毒基因片段的串联质粒，此种质控品存在稳定性不足的缺陷，且有传播风险。另现虽已有猴痘FL3基因的假病毒颗粒产品，但对猴痘病毒的分型检测来说，由于其基于单个基因不足以设计得到可实现猴痘病毒分型检测的产品，因此，仅含单个基因的假病毒颗粒不足以满足分型检测的需要，需提供含有多个猴痘病毒靶基因的猴痘病毒假病毒颗粒。但将多个基因片段包裹进噬菌体外壳蛋白制备得到的假病毒颗粒也存在稳定性不足的缺陷，无法满足质控品需长期稳定保存的需要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种猴痘病毒假病毒颗粒及其制备方法。
本发明的第一个目的是提供一种猴痘病毒假病毒颗粒。
本发明的第二个目的是提供一种猴痘病毒假病毒颗粒的制备方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种稳定性好的猴痘病毒假病毒颗粒，所述假病毒颗粒由噬菌体M13K07外壳蛋白包裹猴痘病毒基因形成。
具体地，所述基因选自猴痘病毒F3L基因、F4L基因、B2R基因、B6R基因、B7R基因、J2R基因中的一种或多种。
本发明还提供了所述猴痘病毒假病毒颗粒的制备方法，包括以下步骤：
S1.通过合成或扩增得到猴痘病毒基因的基因序列，构建所得基因的重组质粒并转化至宿主菌中，得含猴痘病毒基因的重组菌；
S2.将所得重组菌与噬菌体M13K07混合培养，使用PEG沉淀噬菌体颗粒即得所述猴痘病毒假病毒颗粒。
具体地，所述猴痘病毒基因选自猴痘病毒F3L基因、F4L基因、B2R基因、B6R基因、B7R基因、J2R基因中的一种或多种。
具体地，步骤S1中所用质粒为pUC118。
具体地，步骤S1中所用宿主菌为大肠杆菌。
具体地，步骤S1中所述重组菌的制备包括以下步骤：
S11.通过合成或扩增得到猴痘病毒基因的基因序列，利用pUC118质粒构建所得基因的重组质粒并转化至大肠杆菌DH5α中，筛选阳性单克隆；
S12.活化培养步骤S11所得阳性单克隆并提取其中的重组质粒，将质粒转化至大肠杆菌MV1184，筛选阳性单克隆并鉴定，得含猴痘病毒基因的重组菌。
具体地，步骤S2包括以下步骤：
S21.将步骤S1构建所得重组菌的单菌落用培养基培养至OD600为0.8；
S22.用培养基稀释噬菌体M13K07并涂板，挑选单个噬菌斑接种与含抗生素的培养基中培养12～16小时，离心保存上清；
S23.将步骤S21所得重组菌菌液与步骤S22所得上清液混合培养至少1.5小时，用PEG沉淀噬菌体颗粒，即得所述猴痘病毒假病毒颗粒。
具体地，步骤S21中所用培养基为YT培养基。
具体地，步骤S22中所用培养基为2×YT培养基。
具体地，步骤S22中所用抗生素为氨苄霉素。
具体地，所用培养条件为36～38℃。
更具体地，所用培养条件为37℃。
本发明通过利用不同的质粒、宿主菌和噬菌体，提供了一种猴痘病毒假病毒颗粒及其制备方法，利用本发明所述方法制备得到的猴痘病毒假病毒颗粒的稳定性好，经加速冻融后仍能取得较佳的检测效果。
本发明还申请保护由上述方法制备所得猴痘病毒假病毒颗粒。
经测试，本发明制备所得猴痘病毒假病毒颗粒能满足质控品要求，因此，本发明还请求保护所得猴痘病毒假病毒颗粒在制备猴痘病毒检测试剂盒中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种含有多个检测靶基因的猴痘病毒假病毒颗粒及其制备方法。本发明所述猴痘病毒假病毒颗粒中同时含有6种不同的猴痘病毒基因，即猴痘病毒F3L基因、F4L基因、B2R基因、B6R基因、B7R基因和J2R基因，可满足猴痘病毒分型检测的需要。此外，本发明所述猴痘病毒假病毒颗粒的稳定性好，经反复冻融和加速老化后仍可以取得理想的检测效果，所述猴痘病毒假病毒颗粒可作为猴痘病毒核酸检测及猴痘病毒分型检测所需质控品，保证检测结果的准确性。
附图说明
图1为猴痘病毒基因的PCR扩增产物的电泳图；图中M为2kb DNA Ladder；泳道1为F3L基因；泳道2为B7R基因；泳道3为F4L基因；泳道4为B2R基因；泳道5为B6R基因；泳道6为J2R基因。
图2为以提取得到的猴痘病毒假病毒颗粒的DNA为模板扩增所得的PCR扩增产物的电泳图；图中M为2kb DNA Ladder；泳道1为F3L基因；泳道2为B7R基因；泳道3为F4L基因；泳道4为B2R基因；泳道5为B6R基因；泳道6为J2R基因。
图3为以提取得到的猴痘病毒假病毒颗粒的DNA为模板扩增所得的F3L基因的测序比对结果。
图4为以提取得到的猴痘病毒假病毒颗粒的DNA为模板扩增所得的F4L基因的测序比对结果。
图5为以提取得到的猴痘病毒假病毒颗粒的DNA为模板扩增所得的B2R基因的测序比对结果。
图6为以提取得到的猴痘病毒假病毒颗粒的DNA为模板扩增所得的B6R基因的测序比对结果。
图7为以提取得到的猴痘病毒假病毒颗粒的DNA为模板扩增所得的B7R基因的测序比对结果。
图8为以提取得到的猴痘病毒假病毒颗粒的DNA为模板扩增所得的J2R基因的测序比对结果。
图9为以提取得到的猴痘病毒假病毒颗粒的DNA为模板进行多重荧光PCR检测的检测结果。
图10为实施例1制备所得猴痘病毒假病毒颗粒经加速破坏后的检测结果。
图11为对比假病毒颗粒1经加速破坏后的检测结果。
图12为对比假病毒颗粒2经加速破坏后的检测结果。
图13为实施例1制备所得猴痘病毒假病毒颗粒经反复冻融后的检测结果。
图14为对比假病毒颗粒1经反复冻融后的检测结果。
图15为对比假病毒颗粒2经反复冻融后的检测结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明实施例中所用的试剂包括High Affinity HotStart Taq；限制性核酸内切酶EcoR I-HF；Hind III-HF；ClonExpress MμLtiS One Step Cloning Kit。
本发明实施例中所用的仪器包括艾本德5430R高速离心机；博日TC-96/G/H基因扩增仪；宏石SLAN-96S荧光PCR仪。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
YT(固体)培养基购于雷根公司，货号为CM0038。
实施例1猴痘病毒假病毒颗粒的制备
为贴合国家参考品及保证涵盖尽量大的检测范围，本发明选取了猴痘病毒中的F3L基因、F4L基因、B2R基因、B6R基因、B7R基因和J2R基因构建了猴痘病毒假病毒颗粒，其制备过程具体如下：
1、扩增猴痘病毒基因序列，构建含猴痘病毒基因的重组菌；
(1)扩增猴痘病毒基因序列
本发明利用NCBI数据库，获得了上述猴痘病毒基因的基因序列，同时委托生工生物公司合成了各基因的全基因质粒；各基因的登录号如下表1所示：
表1
基于上述各基因的基因序列，本发明设计的扩增引物如表2所示：
表2
以合成的各基因的全基因质粒为模板，本发明利用表2所示扩增引物和HighAffinity HotStart Taq酶，分别扩增得到了猴痘病毒F3L基因、F4L基因、B2R基因、B6R基因、B7R基因和J2R基因的基因序列。扩增所用反应体系为：dNTPs(2.5mM，each)1.6μL，10×HABuffer 2.0μL，High Affininity HotStarTaq(5U/μL)0.2μL，上、下游引物(10μM)各0.5μL，补充ddH2O至20μL；所用反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸1min，40个循环；72℃补充延伸5min。扩增结束后，将所得扩增产物进行电泳分析，猴痘病毒基因的PCR扩增产物的电泳图如图1所示；图中M为2kb DNA Ladder；泳道1为F3L基因；泳道2为B7R基因；泳道3为F4L基因；泳道4为B2R基因；泳道5为B6R基因；泳道6为J2R基因。由图1可知，本发明成功扩增得到了猴痘病毒F3L基因、F4L基因、B2R基因、B6R基因、B7R基因和J2R基因的基因序列，大小与预期相符。
(2)构建含猴痘病毒基因的重组质粒
使用切胶回收试剂盒MuLtiS One Step Cloning Kit回收扩增产物；使用EcoR I-HF和Hind III-HF对pUC118进行双酶切，将线性化的载体pUC118与上述6个基因的扩增产物混合，使用同源重组连接酶/>MultiS One Step Cloning Kit进行同源重组连接，得到含猴痘病毒F3L基因、F4L基因、B2R基因、B6R基因、B7R基因和J2R基因的重组质粒，命名为pMPV。
本发明在引物设计的过程中，采用同源重组连接酶的方式，在引物中同时引入了上下两端基因序列。具体地，F3L的引物组合可将序列F3L与EcoR I酶切切口及F4L序列的前端连接，F4L的引物组合将序列F4L与F3L末端及B2R的前端连接，B2R的引物组合将序列B2R与F4L末端及B6R的前端连接，B6R的引物组合将B6R与B2R末端及B7R的前端连接，B7R的引物组合将B7R与B6R的末端及J2R的前端连接，J2R的引物组合将J2R与B7R的末端及Hind III酶切切口连接。按照上述顺序，可将6段基因同时连入pUC118载体中。
(3)构建含猴痘病毒基因的重组菌
先将构建的重组质粒pMPV转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选、鉴定、保存阳性克隆菌液，再提取阳性克隆菌液中的重组质粒，转化至大肠杆菌MV1184感受态细胞，获得含猴痘病毒基因的重组菌。
具体过程如下：将重组质粒pMPV与大肠杆菌DH5α感受态细胞混合，冰上放置30分钟后，42℃热击90秒，迅速取出立即置于冰上2分钟，放入不含抗生素的LB培养基中，37℃、100～150rpm条件下振荡培养1h，12000rpm离心1分钟，去掉大部分上清液，将剩余的菌液混匀，均匀地涂布在含有氨苄青霉素的YT固体培养基上，37℃倒置培养至长出单菌落；挑选单菌落于含有氨苄青霉素的培养基中，于37℃、180～200rpm条件下过夜培养(12～14小时)，筛选、鉴定阳性克隆，保存经鉴定过的阳性克隆菌液，以便有需要时进行活化和质粒提取。
提取阳性克隆菌液中的重组质粒pMPV，采用与前述转化大肠杆菌DH5α感受态细胞相同的方法，将重组质粒pMPV转化至大肠杆菌MV1184中，筛选并鉴定阳性克隆，所得阳性克隆菌即为重组菌MV1184-pMPV。
2、将重组菌MV1184-pMPV与噬菌体M13K07混合培养得猴痘病毒假病毒颗粒
(1)重组菌MV1184-pMPV的培养：取经鉴定的重组菌MV1184-pMPV接种于新鲜的YT培养基，37℃条件下振荡培养至OD600达到0.8。
(2)重组菌MV1184-pMPV与噬菌体M13K07的混合培养：将重组菌MV1184-pMPV的培养液和噬菌体M13K07的培养液按体积比为100：1的比例混合，37℃、300r/min条件下振荡培养1.5小时，使用溶于2.5mol/LNaCl的20％PEG沉淀噬菌体颗粒，即得所述猴痘病毒假病毒颗粒。
测定所得噬菌体颗粒的滴度，后续检测可使用含RNase的TE(pH 8.0)对噬菌体进行重悬。
在制备猴痘病毒假病毒颗粒的过程中，若考虑将其作为质控品，则需制备噬菌体M13K07的单个噬菌斑并通过凝胶电泳估计噬菌粒单链DNA的得率。具体方法为：
将噬菌体M13K07用2×YT培养基作10倍系列稀释(10-6～10-9)；分别取10μL或100μL各个稀释度的噬菌体溶液加入含铺板细菌的YT琼脂平板中，挑选分离良好的单个噬菌斑接种于含氨苄青霉素的2×YT培养基中，250rpm、37℃条件下培养12～16小时，离心后保存上清；取部分上清用凝胶电泳估计噬菌粒单链DNA的得率：在0.5mL微量离心管中分别加入40μL上清与2μL 2％ SDS，轻拍管壁混合内容物，65℃温育5min，在每个噬菌粒DNA样品中加入5pL加样缓冲液，混合后加至0.7％琼脂糖凝胶的加样孔；6V/cm电泳数小时，至溴酚蓝迁移至胶的大约一半时，在紫外线下检查和照相，通常的得率为约1pg/mL培养物。获得培养物后使用数字pcr测定拷贝数，105copies/mL左右视为满足质控品要求。
实施例2猴痘病毒假病毒颗粒的鉴定
1、猴痘病毒假病毒颗粒的PCR扩增及测序分析
将实施例1中制备所得的猴痘病毒假病毒颗粒重悬后，用DNA核酸提取试剂盒提取核酸，以所得DNA为模板，用表2所示引物分别进行PCR扩增。将扩增产物分为两份，一份进行电泳检测，一份送往生工生物公司测序并比对。
以提取得到的猴痘病毒假病毒颗粒的DNA为模板进行扩增所得的PCR扩增产物的电泳图如图2所示；图中M为2kb DNA Ladder；泳道1为F3L基因；泳道2为B7R基因；泳道3为F4L基因；泳道4为B2R基因；泳道5为B6R基因；泳道6为J2R基因。由图2可知，以提取得到的猴痘病毒假病毒颗粒的DNA为模板扩增所得各基因条带的大小与预期相符。
以提取得到的猴痘病毒假病毒颗粒的DNA为模板，扩增F3L基因、F4L基因、B2R基因、B6R基因、B7R基因和J2R基因所得PCR扩增产物的测序比对结果依次如图3～8所示。由图3～8可知，本发明扩增所得猴痘病毒F3L基因、F4L基因、B2R基因、B6R基因、B7R基因和J2R基因的基因序列与NCBI参考序列基本相同。上述结果表明，本发明成功构建得到了含F3L基因、F4L基因、B2R基因、B6R基因、B7R基因和J2R基因的猴痘病毒假病毒颗粒。
2、荧光PCR检测
将实施例1中制备所得的猴痘病毒假病毒颗粒重悬后，用DNA核酸提取试剂盒提取核酸，以所得DNA为模板，使用自研的猴痘核酸检测试剂盒(该试剂盒是以B6R为靶基因进行设计，利用多重荧光PCR法检测，靶基因使用的是FAM通道，内参使用的是Rox通道)，以验证制备所得猴痘病毒假病毒颗粒是否可用于猴痘病毒的检测和猴痘疫病的监测。
以提取得到的猴痘病毒假病毒颗粒的DNA为模板进行多重荧光PCR检测的检测结果如图9所示。由图9可知，以提取得到的猴痘病毒假病毒颗粒的DNA为模板可以成功得到扩增曲线，依据判定标准，为核酸阳性，表明本发明所述猴痘病毒假病毒颗粒可以作为猴痘病毒核酸检测的质控品。
实施例3稳定性检测
除实施例1制备所得猴痘病毒假病毒颗粒外，本发明曾采用相同的方法，利用不同的质粒、宿主菌和噬菌体制备了不同的猴痘病毒假病毒颗粒，其中部分猴痘病毒假病毒颗粒所使用的质粒、宿主菌和噬菌体如表3所示。本发明分别对实施例1制备所得猴痘病毒假病毒颗粒和表3所示猴痘假病毒颗粒(对比假病毒颗粒1和2)的稳定性进行了检测，具体过程和相关检测结果如下：
表3
为比较实施例1制备所得猴痘病毒假病毒颗粒与对比假病毒颗粒1和2的稳定性，分别对其进行加速破坏和冻融稳定性测试。
加速破坏：将上述三种假病毒颗粒分别置于-20℃、4℃、25℃、37℃条件下进行加速破坏1、2、3、4、5、6、7天，取出重悬并使用DNA核酸提取试剂盒提取，以所得DNA为模板，使用实施例2中所述的自研猴痘核酸检测试剂盒(多重荧光PCR法)进行检测。实施例1制备所得猴痘病毒假病毒颗粒经加速破坏后的检测结果如图10所示，对比假病毒颗粒1经加速破坏后的检测结果如图11所示，对比假病毒颗粒2经加速破坏后的检测结果如图12所示。图10～12检测的靶基因为B6R基因，图中各曲线对应的样本和Ct值如表4所示。
表4
结合图10～12和表4可知，在进行加速破坏后，本发明实施例1制备所得猴痘病毒假病毒颗粒的检测效果较对比假病毒颗粒1和2更好。从表4所示Ct值上看，图10对应的Ct值基本集中在29.5～31.5之间，图11对应的Ct值集中在30～32.5之间，图11对应的Ct值集中在31～33.5之间；整体上看图10、图11对应Ct值波动较小。从扩增曲线上看，图10的扩增曲线基本呈现为“S”型扩增曲线，而图11、12出现部分样本扩增曲线线型较差。综合来看，图10(即所述猴痘病毒假病毒颗粒)检测结果的稳定性相对更好。上述结果表明，本发明实施例1制备所得猴痘病毒假病毒颗粒的稳定性更高，更适合于用作猴痘病毒核酸检测所需质控品。
冻融稳定性：将上述三种假病毒颗粒分别冻存于-20℃冰箱，分别冻融5、6和10次后，取出重悬并用DNA核酸提取试剂盒提取，以所得DNA为模板，使用实施例2中所述的自研猴痘核酸检测试剂盒(多重荧光PCR法)进行检测。
实施例1制备所得猴痘病毒假病毒颗粒经反复冻融后的检测结果如图13所示，对比假病毒颗粒1经反复冻融后的检测结果如图14所示，对比假病毒颗粒2经反复冻融后的检测结果如图15所示。图13～15检测的靶基因为B6R基因，图中各曲线对应的样本和Ct值如表5所示。
表5
结合图13～15可知，在反复冻融后，本发明实施例1制备所得猴痘病毒假病毒颗粒的检测效果较对比假病毒颗粒1和2更好。从表5所示Ct值上看，图13对应的Ct值基本集中在30～31之间，波动较小，而图14、15对应的Ct值波动较大；从扩增曲线上看，图13的扩增曲线基本呈现为“S”型扩增曲线，图14、15出现部分样本扩增曲线线型线型较差。综合来看，图13(即所述猴痘病毒假病毒颗粒)检测结果的稳定性相对更好。上述结果表明，本发明实施例1制备所得猴痘病毒假病毒颗粒的稳定性更高，更适合于用作猴痘病毒核酸检测所需质控品。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种猴痘病毒假病毒颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.通过合成或扩增得到猴痘病毒基因的基因序列，构建所得基因的重组质粒并转化至宿主菌中，得含猴痘病毒基因的重组菌；所述猴痘病毒基因为猴痘病毒F3L基因、F4L基因、B2R基因、B6R基因、B7R基因和J2R基因，将6段基因同时连入pUC118载体中并转化大肠杆菌；
S2.将所得重组菌与噬菌体M13K07混合培养，使用PEG沉淀噬菌体颗粒即得所述猴痘病毒假病毒颗粒。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1中所述重组菌的制备包括以下步骤：
S11.通过合成或扩增得到猴痘病毒基因的基因序列，利用pUC118质粒构建所得基因的重组质粒并转化至大肠杆菌DH5α中，筛选阳性单克隆；
S12.活化培养步骤S11所得阳性单克隆并提取其中的重组质粒，将质粒转化至大肠杆菌MV1184，筛选阳性单克隆并鉴定，得含猴痘病毒基因的重组菌。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2包括以下步骤：
S21.将步骤S1构建所得重组菌的单菌落用培养基培养至OD600为0.8；
S22.用培养基稀释噬菌体M13K07并涂板，挑选单个噬菌斑接种于含抗生素的培养基中培养12～16小时，离心保存上清；
S23.将步骤S21所得重组菌菌液与步骤S22所得上清液混合培养至少1.5小时，用PEG沉淀噬菌体颗粒，即得所述猴痘病毒假病毒颗粒。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所用培养条件为36～38℃。
5.权利要求1～4任一所述方法制备所得的猴痘病毒假病毒颗粒。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105200018A (zh) * 2015-10-27 2015-12-30 广东和信健康科技有限公司 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用
CN109402069A (zh) * 2018-11-13 2019-03-01 海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用
CN115725789A (zh) * 2022-09-07 2023-03-03 华中科技大学协和深圳医院 一种用于检测猴痘病毒的核酸组合、试剂盒及方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105200018A (zh) * 2015-10-27 2015-12-30 广东和信健康科技有限公司 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用
CN109402069A (zh) * 2018-11-13 2019-03-01 海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用
CN115725789A (zh) * 2022-09-07 2023-03-03 华中科技大学协和深圳医院 一种用于检测猴痘病毒的核酸组合、试剂盒及方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Evaluation and validation of an RT-PCR assay for specific detection of monkeypox virus (MPXV);Alberto Paniz-Mondolfi等;J Med Virol;第95卷(第1期);第1-12页 *

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