CN116004873A - 一种副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒及其制备方法以及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒及其制备方法以及应用，副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒包括：RPA扩增体系和CRISPR/Cas12a检测体系，所述CRISPR/Cas12a检测体系包括crRNA、CRISPR/Cas12a蛋白和ssDNA报告系统；所述crRNA的序列包括crRNA‑1；和/或，crRNA‑2，所述crRNA‑1序列如SEQ ID NO.1所示，所述crRNA‑2序列如SEQ ID NO.2所示；所述RPA扩增体系包括特异性引物，所述特异性引物包括正向引物和反向引物，正向引物的序列如；SEQ ID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；所述ssDNA报告系统包括用于酶标仪荧光检测或ssDNA FQ reporter，所述ssDNA FQ reporter为利用6‑羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA。本发明的副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒反应在常温下即可短时间内完成，不依赖高技术人员和高端设备，节省成本，适用于现场检测，且灵敏度高。

Description

一种副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒及其制备方法以及应用

技术领域

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒及其制备方法以及应用。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)具有很强的宿主特异性，只能感染猪，且可感染不同阶段的猪群，引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等病症，猪场首发时其临床症状比较严重，发病率和死亡率较高，耐过猪可出现发育不良而成为僵猪，给生猪养殖业造成巨大的经济损失。副猪嗜血杆菌副猪嗜血杆菌属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，是一种革兰氏阴性、需烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的多形态细小杆菌，目前已知至少15种血清型，其中5、4和13型最为常见。有研究表明，副猪嗜血杆菌可激活Wnt/β-catenin信号通路，上调β-catenin的表达，导致上皮细胞间隙间E-钙黏蛋白降解，引起上皮细胞通透性改变，造成纤维素性物质从血管淋巴管中渗出；可激活NF-kB和JNK信号通路，促进分泌促炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，是引起以呼吸道症状、胸腔纤维素性渗出、心包积液和关节炎等为特征的呼吸道疾病的部分原因。

当前的副猪嗜血杆菌核酸检测技术最常见的是PCR技术，针对其16srRNA保守序列设计引物进行PCR扩增，此外还有实时定量PCR、环介导等温扩增等用于副猪嗜血杆菌检测，但所需时间长、对仪器、实验人员和实验环境要求高。

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats),又是存在于大部分古细菌和部分细菌中的特殊DNA重复序列。Cas是CRISPR associatedprotein的缩写，即CRISPR相关蛋白，是CRISPR系统中具有核酸酶活性的一组或单一蛋白，能够通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来的核酸。两者共同组成CRISPR/Cas系统，最早发现它们是原核生物的一种免疫防御系统，可以抵抗外来病毒、噬菌体、质粒等遗传元件的入侵。该系统被分为6个类型和22个亚型，其中常被用于核酸检测的Cas12a(又称Cpf1)属于Ⅴ型CRISPR/Cas系统的核酸内切酶，引导RNA指导双链DNA裂解单个RuvC催化结构。随着研究的深入，人们发现Cas12a能够发挥2种酶促切割反应，一方面在crRNA指导下特异性切割与其互补的目标靶序列，另一方面在原型间隔区-靶标识别时激活非靶向侧链切割活性，又称“反式切割”，随机切割附近任何单链DNA(ssDNA)。利用CRISPR/Cas12a系统的“反式切割”活性，结合荧光报告探针，为高效准确检测副猪嗜血杆菌提供方法。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒，旨在解决现有技术中检测副猪嗜血杆菌对仪器、实验人员和实验环境要求高的问题。

为实现上述目的，所述副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒是基于CRISPR/Cas12a检测体系，所述副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒包括：RPA扩增体系和CRISPR/Cas12a检测体系，所述CRISPR/Cas12a检测体系包括crRNA、CRISPR/Cas12a蛋白和ssDNA报告系统；

其中，所述crRNA的序列包括crRNA-1；和/或，crRNA-2，所述crRNA-1序列如SEQ IDNO.1所示，所述crRNA-2序列如SEQ ID NO.2所示；

所述RPA扩增体系包括特异性引物，所述特异性引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如；SEQ ID NO.3所示，所述反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；

所述ssDNA报告系统包括用于实时荧光定量PCR仪检测荧光检测或ssDNA FQreporter，所述ssDNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA，所述ssDNA标记产物如下：/5 6FAM/ATTATTT/3BHQ1/。

可选地，所述特异性crRNA引物的长度为25～28bp；和/或，

所述特异性crRNA引物的score分值大于70。

可选地，在所述RPA扩增体系中，所述特异性引物的长度在30-35bp；和/或，

所述特异性引物的GC含量在40％-60％；和/或，

所述特异性引物的扩增长度在250-500bp；和/或，

所述特异性引物包含所述特异性crRNA的片段。

本发明还提出了一种副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

针对副猪嗜血杆菌特异性基因，筛选出特异性crRNA引物；

根据特异性crRNA引物，设计并制备出RPA扩增体系中的特异性引物。

本发明还提出了一种副猪嗜血杆菌的检测方法，所述副猪嗜血杆菌含量的检测方法包括以下步骤：

S100、培养副猪嗜血杆菌菌液，用核酸快速裂解剂获得副猪嗜血杆菌核酸；

S101、将所述副猪嗜血杆菌核酸，利用特异性引物，加入到RPA扩增体系进行扩增，获得特异性扩增产物；

S102、将所述特异性扩增产物加入到所述的副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒中的CRISPR/Cas12a检测体系中进行检测反应，获得反应结果。

可选地，在步骤S100中，所述裂解的步骤包括：将副猪嗜血杆菌菌液加入离心管离心后，再加入核酸快速裂解剂混匀，金属浴加热后获得副猪嗜血杆菌核酸。

可选地，在步骤S101中，

所述RPA扩增的温度为37～42℃；和/或，

所述RPA扩增的时间为10～40min。

可选地，在步骤S102中，

所述检测反应的温度为35～39℃；和/或，

所述检测反应的时间为25～32min。

可选地，所述金属浴加热步骤中，

所述金属浴加热的温度为90～100℃；和/或，

所述金属浴加热的时间为2～4min。

可选地，所述S102的步骤中，所述检测结果是采用蓝光激发荧光检测或实时荧光定量PCR仪检测。

本发明提供的副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒是基于CRISPR/Cas12a检测体系，CRISPR/Cas12a检测体系中包含的Cas12a蛋白能够发挥2种酶促切割反应，当CRISPR/Cas12a检测体系中存在副猪嗜血杆菌基因时，会由在副猪嗜血杆菌特异性crRNA介导下特异性激活的CRISPR/Cas12a蛋白的核酸内切酶活性,激活后的CRISPR/Cas12a会随机切割附近任何由发光基团，淬灭基团标记的ssDNA FQ reporter，从而释放激活荧光基团，便可检测到荧光信号。因此，通过设计特异性crRNA，可以确定靶基因特异性，达到检测病菌的目的。该CRISPR/Cas12a检测体系检测灵敏度高可以达到埃摩尔级的灵敏度，同时基于CRISPR-Cas12检测副猪嗜血杆菌的研究较少，能为快速检测病原菌提供新思路，具有前瞻性。

此外，由于本发明提供的副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒，还包括RPA恒温扩增体系，所述RPA恒温扩增体系主要依赖与单链核酸结合的重组酶、结合蛋白及聚合酶，恒温条件下快速扩增，反应在常温下即可短时间内完成，且不依赖高技术人员和高端设备，节省成本，适用于现场检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1实施例1的核酸裂解结果图；

图2实施例1中采用蓝光激发荧光实验结果图；

图3实施例1中采用荧光值检测结果图；

图4基于CRISPR/Cas12a检测副猪嗜血杆菌特异性的蓝光激发荧光结果图；

图5基于CRISPR/Cas12a检测副猪嗜血杆菌特异性的荧光值检测结果图；

图6基于CRISPR/Cas12a检测副猪嗜血杆菌灵敏度的蓝光激发荧光结果图；

图7基于CRISPR/Cas12a检测副猪嗜血杆菌灵敏度的荧光值检测结果；

图8采用普通PCR检测副猪嗜血杆菌灵敏度的结果图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,副猪嗜血杆菌)具有很强的宿主特异性，只能感染猪，且可感染不同阶段的猪群，引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等病症，猪场首发时其临床症状比较严重，发病率和死亡率较高，耐过猪可出现发育不良而成为僵猪，给生猪养殖业造成巨大的经济损失。副猪嗜血杆菌副猪嗜血杆菌属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，是一种革兰氏阴性、需烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的多形态细小杆菌，目前已知至少15种血清型，其中5、4和13型最为常见。有研究表明，副猪嗜血杆菌可激活Wnt/β-catenin信号通路，上调β-catenin的表达，导致上皮细胞间隙间E-钙黏蛋白降解，引起上皮细胞通透性改变，造成纤维素性物质从血管淋巴管中渗出；可激活NF-kB和JNK信号通路，促进分泌促炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，是引起以呼吸道症状、胸腔纤维素性渗出、心包积液和关节炎等为特征的呼吸道疾病的部分原因。

当前的核酸检测技术大多基于核酸扩增来实现，如PCR、环介导等温扩增等，虽然灵敏度高，但对仪器、实验人员和实验环境要求高。

本发明提出一种副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒，所述副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒是基于CRISPR/Cas12a检测体系，所述副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒包括：RPA扩增体系和CRISPR/Cas12a检测体系，所述CRISPR/Cas12a检测体系包括crRNA、CRISPR/Cas12a蛋白和ssDNA报告系统；

其中，所述crRNA的序列包括crRNA-1；和/或，crRNA-2，所述crRNA-1序列如SEQ IDNO.1所示，所述crRNA-2序列如SEQ ID NO.2所示；

所述RPA扩增体系包括特异性引物，所述特异性引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如；SEQ ID NO.3所示，所述反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；

所述ssDNA报告系统包括用于实时荧光定量PCR仪检测或荧光检测的ssDNA FQreporter，所述ssDNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA，所述ssDNA标记产物如下：/5 6FAM/ATTATTT/3BHQ1/。

本发明提出的副猪嗜血杆菌快速检测检测方法，可使用实时荧光定量PCR检测荧光值，在使用实时荧光定量PCR检测时，在副猪嗜血杆菌特异性crRNA指导下，能够激活CRISPR/Cas12a蛋白的“反式切割”活性，随机切割ssDNA报告系统ssDNA FQ reporter，从而释放出荧光基团，使用实时荧光定量PCR检测其荧光值。

需要说明的是：本发明中根据CRISPR/Cas12a能识别PAM序列的特点，在实际实验中，本发明设计了2条特异性crRNA，分别为crRNA-1和crRNA-2，在实际试剂盒中，既可以将crRNA-1作为试剂盒中的特异性crRNA，也可以将crRNA-2作为试剂盒中的特异性crRNA，或者两种均可，其中，所述crRNA-1序列如SEQ ID NO.1所示，所述crRNA-2序列如SEQ ID NO.2所示，通过检测设计的特异性crRNA能够实现RPA扩增，并且识别副猪嗜血杆菌，通过实验结果筛选出效果好的crRNA，实验结果如附图2所示：crRNA-1和crRNA-2均能识别副猪嗜血杆菌，但是因为crRNA-1效果更好，因此选择crRNA-1进行后续CRISPR/Cas12a检测。

所述特异性crRNA引物的长度为25～28bp；和/或，所述特异性crRNA引物的score分值大于70。

具体地，在一些实施例中，只要特异性crRNA引物的长度设计在25～28bp之间，即可满足本发明的需求，实际中27bp效果最优，设计crRNA时软件会针对设计出的crRNA给个分数，分数越高越好，优先选择分数最高的crRNA，在本发明中选择的是70分以上的crRNA。

进一步地，所述特异性crRNA的设计步骤如下：

针对副猪嗜血杆菌的保守序列，寻找包含Cas12a识别PAM序列TTTN，PAM序列为TTTN(N为A、G、C任意核苷酸)，利用CRISPR RGEN Tools设计crRNA序列，设定参数：crRNA长度为27bp，score分值大于70，选择满足条件且评分高的2条crRNA作为候选，其中，所述crRNA-1序列如SEQ ID NO.1和所述crRNA-2序列如SEQ ID NO.2所示，并由金斯瑞生物合成。

所述特异性crRNA的序列信息如下表1

表1：特异性crRNA的序列信息

可选地，在所述RPA扩增体系中，所述特异性引物的长度在30-35bp；和/或，所述特异性引物的GC含量在40％-60％；和/或，所述特异性引物的扩增长度在250-500bp；和/或，所述特异性引物包含所述特异性crRNA的引物。

需要说明的是：所述特异性引物过短会影响重组酶活性，过长容易出现二聚体，故选择引物长度在30-35bp之间的。GC含量过高(＞70％)或过小(＜30％)均不利于RPA扩增，扩增长度超多500bp会影响RPA扩增效率。

具体地，所述RPA扩增体系中的特异性引物设计步骤如下：

针对副猪嗜血杆菌基因，在靶标序列中，利用Primer Premier5.0，选择引物长度在30-35bp，GC含量在40％-60％，扩增长度在250-500bp，且包含特异性crRNA的引物，所选引物在NCBI BLAST上检验特异性，筛选出特异性引物序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，设计好的引物由上海生物工程合成。

表2：RPA扩增体系中的特异性引物的序列信息

本发明还提出了本发明还提出了一种副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

针对副猪嗜血杆菌特异性基因，筛选出特异性crRNA引物；

根据特异性crRNA引物，设计并制备出RPA扩增体系中的特异性引物

进一步地，本发明还提出了一种副猪嗜血杆菌的检测方法，所述副猪嗜血杆菌含量的检测方法包括以下步骤：

提供上述所述的副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒；

S100、培养副猪嗜血杆菌菌液，用核酸快速裂解剂获得副猪嗜血杆菌核酸；

S101、将所述副猪嗜血杆菌核酸，利用特异性引物，加入到RPA扩增体系进行扩增，获得特异性扩增产物；

S102、将所述特异性扩增产物加入到所述的副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒中的CRISPR/Cas12a检测体系中进行检测反应，获得反应结果。

可选地，步骤S100中的所述裂解的步骤包括：将副猪嗜血杆菌菌液加入离心管离心后，再加入核酸快速裂解剂混匀，金属浴加热后获得副猪嗜血杆菌核酸。

在一些实施例中，具体操作如下：挑取副猪嗜血杆菌单菌落于TSB培养基中，37℃震荡培养过夜，收集菌液。再取过夜培养的副猪嗜血杆菌菌液，加入到离心管中，加入核酸快速裂解剂，振荡混匀，金属浴加热后，随即轻微振荡混匀后获取裂解产物，以用于后续RPA恒温扩增；再向所述裂解产物添加述副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒中的RPA扩增体系进行RPA扩增反应，获得特异性扩增产物，随后将特异性扩增产物加入到所述副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒中的CRISPR/Cas12a检测体系中进行反应，手弹混匀离心后置于金属浴加热后，用蓝光激发反应产物的荧光并拍照，获得反应结果，并且分别在25min、30min、35min记录荧光数值。

具体地，为了实现充分裂解，所述金属浴加热步骤中：所述金属浴加热的温度为90～100℃、所述金属浴加热的时间为2～4min。

步骤S101中：所述RPA扩增的温度为37～42℃、所述RPA扩增的时间为10～40min。

需要说明的是，在一些实施例中，所述检测反应的温度为35～39℃，所述检测反应的时间为25～32min。在实际试验中，25min、30min、32min都能出现荧光反应，在30min时候变化最大，25min荧光很弱，但是也可以区分出来。

进一步地，检测反应产物采用的是用蓝光激发荧光并拍照或实时荧光定量PCR仪检测。

综上所述，与现有副猪嗜血杆菌检测技术相比，本发明的积极效果是：

1)本发明结合RPA恒温扩增，利用CRISPR/Cas12a特异性识别核酸，联合蓝光切胶仪，实现对副猪嗜血杆菌特异、高效及可视化检测。根据选定的副猪嗜血杆菌保守序列设计特异性引物用于RPA扩增，根据CRISPR/Cas12a能识别PAM序列的特点，设计2条特异性crRNA，通过检测设计的引物能够实现RPA扩增，特异性crRNA能够特异性识别副猪嗜血杆菌，其中crRNA-1效果更好，因此选择crRMA-1进行CRISPR/Cas12a检测。

2)本发明基于CRISPR/Cas12a蛋白“反式切割”活性，切割ssDNA报告系统，从而释放出荧光基团，利用蓝光激发荧光实现结果快速判读。

3)本发明基于RPA快速恒温扩增，CRISPR/Cas12a特异性识别核酸并切割来实现对副猪嗜血杆菌高效、快速、灵敏和可视化检测。本发明建立的副猪嗜血杆菌快速、可视化检测方法，为实验室检测及临床检测提供新思路。

4)本发明公开了副猪嗜血杆菌用于RPA扩增的特异性引物，序列SEQ IDNO.3和SEQID NO.4；用于CRISPR/Cas12a检测的crRNA-1，crRNA-2，序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。本发明首次采用RPA扩增联CRISPR/Cas12a检测副猪嗜血杆菌，具有高效、快速、灵敏和现场可视化的优点，及不依赖大型试验设备、成本低等优势。这些优点使得本发明的基于CRISPR/Cas12a高效、可视化检测方法，为实验室和临床检测副猪嗜血杆菌提供新思路。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明中：细菌基因组提取试剂盒购自康为世纪、质粒小提试剂盒购自艾科瑞生物、RPA试剂盒购自乐尚生物、Cas12a蛋白购自易致生物、crRNA由金斯瑞生物合成，引物、ssDNA报告分子由上海生工生物合成，质粒由淼灵生物合成。

实施例1筛选最佳crRNA

1)副猪嗜血杆菌核酸制备

副猪嗜血杆菌细菌培养，设置4个重复，各取1ml菌液用快速裂解液提取副猪嗜血杆菌的核酸，其实验结果如图1所示：核酸裂解剂获得副猪嗜血杆菌的核酸，通过琼脂糖电泳显示，4个样本均呈现分子量较大且条带清晰，表明用核酸裂解剂获得的核酸质量较好，可用于后续检测反应的模板。

2)RPA扩增

利用本发明中设计的RPA特异性引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，进行RPA扩增反应，具体步骤如下：

取1uL上述提取的副猪嗜血杆菌的核酸，加入到RPA反应体系中：缓冲液25μL，正向引物SEQ ID NO.3(10μM)2μL，反向引物SEQ ID NO.4(10μM)2μL，ddH2O 17uL加入酶制剂中，轻弹至酶制剂干粉溶剂，短暂离心后加入3uL乙酸镁，轻弹混合均匀，于37℃短暂反应4min后轻弹混匀，让反应更充分，随后继续于37℃反应21min，获得特异性扩增产物作为下一步核酸检测模板。

3)CRISPR/Cas12a检测体系

本检测采用10uL体系如表3所示，其中，CRISPR/Cas12a检测体系中的crRNA包括crRNA-1和crRNA-2，分别为2管，另外用ddH2O为空白对照，总共分为3管，其余均不变；ssDNA为ssDNA FQ reporter

表3.实施例1的副猪嗜血杆菌的CRISPR/Cas12a检测体系

4)采用蓝光激发荧光检测或实时荧光定量PCR仪检测

采用蓝光激发荧光检测时：将上述体系中的1uL 10*Buffer、1.5uL CRISPR/Cas12a蛋白、1.5Ul crRNA-1(1.5UlcrRNA-2)、3uL ddH2O、2uL ssDNA、1uL DNA sample轻弹混匀后，于37℃反应30min，后用蓝光激发荧光观察并拍照记录。其中荧光激发用蓝光切胶仪进行操作，用有无荧光对结果进行判读，实现副猪嗜血杆菌的快速、可视化检测。

采用荧光定量PCR检测荧光时：将DNA sample加入CRISPR/Cas12a检测体系中，混匀后放进实时荧光定量PCR仪中，与37℃反应30min后检测荧光值，结合荧光对结果进行判读。其中CRISPR/Cas12a检测体系包括1uL10*Buffer、1.5uL CRISPR/Cas12a蛋白、1.5uLcrRNA、3uL ddH2O、2uL ssDNA、1uL DNA sample。

5)实验结果

蓝光激发荧光实验结果如图2所示，crRNA-1的荧光强于crRNA-2的荧光，说明crRNA-1的效果强于crRNA-2，或者用实时荧光定量PCR检测荧光值的结果如图3所示，crRNA-1的荧光值明显比crRNA-2的荧光值高，说明crRNA-1的效果强于crRNA-2，因此采用crRNA-1用于后续检测。

实施例2副猪嗜血杆菌快速特异性检测

利用本发明建立的检测方法，对包括副猪嗜血杆菌和大肠杆菌在内的常见细菌进行检测，并设立ddH₂O为空白对照。

1)副猪嗜血杆菌核酸制备

参照实施案例1中快速裂解液提取方法，提取上述细菌、病毒基因组，用于后续检测。

2)RPA扩增

取提取的各细菌、病毒基因组1uL分别加入到RPA反应体系，进行扩增反应：缓冲液25μL，正向引物SEQ ID NO.3(10μM)2μL，反向引物SEQ ID NO.4(10μM)2μL，ddH₂O 17uL加入酶制剂中，轻弹至酶制剂干粉溶剂，短暂离心后加入3uL乙酸镁，轻弹混匀，于37℃反应25min，获得特异性扩增产物作为下一步核酸检测模板。

3)CRISPR/Cas12a检测体系

本实施案例用CRISPR/Cas12a检测，根据实施例1的结果，crRNA对检测副猪嗜血杆菌有较高灵敏性，其中crRNA-1效果最佳，因此采用crRNA-1用于后续检测。本检测采用10uL体系如表4所示，但不仅限于此，包括体系及相应成分比例的调整:

表4.实施例2的副猪嗜血杆菌的CRISPR/Cas12a检测体系

其中ssDNA为ssDNA FQ reporter。

4)采用蓝光激发荧光检测或实时荧光定量PCR仪检测

本实施案例中，用荧光法判定检测结果，使用蓝光激发荧光观察并拍照记录。其中荧光激发用蓝光切胶仪进行操作，用有无荧光对结果进行判读，实现副猪嗜血杆菌的快速、可视化检测。采用实时荧光定量PCR检测荧光值，于37℃反应30min后检测荧光值。

5)实验结果

实验结果如图4所示，副猪嗜血杆菌有较强荧光，显示阳性；大肠杆菌荧光微弱，显示阴性；空白对照无荧光。或者用实时荧光定量PCR检测荧光值的结果如图5所示，副猪嗜血杆菌荧光值接近1500，而大肠杆菌荧光值在500左右，副猪嗜血杆菌的荧光值显著高于大肠杆菌，结合图4、图5结果，表明用本发明检测副猪嗜血杆菌有较好特异性。

用荧光定量检测所示副猪嗜血杆菌有荧光，代表有该副猪嗜血杆菌，其他细菌、病毒均无荧光，因此，本发明检测副猪嗜血杆菌有较好特异性。

实施例3CRISPR/Cas12a检测副猪嗜血杆菌的灵敏度

1)质粒标准品制备

将副猪嗜血杆菌保守序列构建到载体pUC57上，由淼灵生物合成干粉质粒。干粉质粒用无酶水溶解后取2uL加入到100uLDH5α感受态中冰浴30min，随后42℃金属浴中热激90s，再冰浴2min，加入900μl无抗LB液体培养基，180rpm震荡培养45min，6000rpm离心5min，保留100μl上清液用于混匀菌体沉淀，混匀后的菌液加到Amp抗性的LB培养板上，用玻璃三角涂布棒转圈涂抹均匀，将涂好的平板(封口膜封口)于37℃培养箱先正向培养1h，再倒置培养12h-16h，10μl枪头挑取单克隆菌落后置于含有Amp抗性的LB培养基中，震荡培养12-16h，取2uL菌液用质粒提取试剂盒提取质粒，随后用超微分光光度计测质粒浓度，算出拷贝数。

计算拷贝数后进行10倍梯度稀释，获得每微升含有细菌基因组，需要RPA特异性产物，1.3*e8，1.3*e7、1.3*e6、1.3*e5、1.3*e4、1.3*e3、1.3*e2、1.3*e1和1.3*e0拷贝数(copies/uL)，分别对应得9管稀释的样品，并用ddH2O作为空白对照，总共10管。

2)RPA扩增

从9管稀释的样品及空白样品中分别取1uL加入到RPA反应体系，进行扩增反应：缓冲液25μL，正向引物SEQ ID NO.3(10μM)2μL，反向引物SEQ ID NO.4(10μM)2μL，ddH2O 17uL加入酶制剂中，轻弹至酶制剂干粉溶剂，短暂离心后加入3uL乙酸镁，轻弹混匀，于37℃反应25min，获得特异性扩增产物。

3)CRISPR/Cas12a检测体系

本实施例中继续采用crRNA-1用于后续检测。本检测采用10uL体系如表3所示，但不仅限于此，包括体系及相应成分比例的调整:

表5.实施例3的副猪嗜血杆菌的CRISPR/Cas12a检测体系

其中ssDN为ssDNA FQ reporter。

4)采用蓝光激发荧光检测或实时荧光定量PCR仪检测

本实施案例中，用荧光法判定检测结果，使用蓝光激发荧光观察并拍照记录。其中荧光激发用蓝光切胶仪进行操作，用有无荧光对结果进行判读，实现副猪嗜血杆菌的快速、可视化检测。采用实时荧光定量PCR检测荧光值，于37℃反应30min后检测荧光值。

5)实验结果

本案例中图6为荧光检测结果，1.3*e8～1.3*e0 copies/uL均有较强荧光，空白对照荧光很微弱，表明用本发明检测副猪嗜血杆菌有着较好灵敏性，能够实现1.3*e0copies/uL的高灵敏度检出。或者用实时荧光定量PCR检测荧光值结果如图7所示，1.3*e8～1.3*e0copies/uL均有较高荧光值且高于500，与空白对照差异显著，表明本发明方法检测副猪嗜血杆菌具有高灵敏性。

对比例1

用普通PCR的方法检测副猪嗜血杆菌灵敏度，以此对比本研究方法检测副猪嗜血杆菌灵敏度的效果。

1)质粒标准品制备步骤同案例3步骤(1)

2)取1uL不同拷贝数的质粒样品(分别含有1.3*e8，1.3*e7、1.3*e6、1.3*e5、1.3*e4、1.3*e3、1.3*e2、1.3*e1和1.3*e0拷贝数(copies/uL))，进行普通PCR反应：rTaq酶5μL，正向引物SEQ ID NO.3(10μM)0.5μL，反向引物SEQ ID NO.4(10μM)0.5μL，ddH2O 3uL，短暂涡旋离心，进行PCR反应，其中PCR程序为94℃5min；94℃30s、60℃30s、72℃10s(35cycle)；72℃10min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

3)制备1％的凝胶：0.25g琼脂糖加入25mL 1×TAE，加热溶解至澄清透明，倒入制胶板内，待凝固后取5uL PCR产物点样，于135V 15min条件下跑电泳，用凝胶成像系统照胶，结果如图8所示。

实验结果：如图8中所示，拷贝数1.3*e8～1.3*e3copies/uL有清晰且明亮条带，1.3*e2copies/uL的条带微弱，表明普通PCR方法检测极限为1.3*e2copies/uL。综上所述，本发明检测副猪嗜血杆菌方法的敏感性高出常规PCR检测100倍，表明本发明检测副猪嗜血杆菌有着较高灵敏性。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒是基于CRISPR/Cas12a检测体系，所述副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒包括：RPA扩增体系和CRISPR/Cas12a检测体系，所述CRISPR/Cas12a检测体系包括crRNA、CRISPR/Cas12a蛋白和ssDNA报告系统；

其中，所述crRNA的序列包括crRNA-1；和/或，crRNA-2，所述crRNA-1序列如SEQ IDNO.1所示，所述crRNA-2序列如SEQ ID NO.2所示；

所述RPA扩增体系包括特异性引物，所述特异性引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；

所述ssDNA报告系统包括用于实时荧光定量PCR仪检测或荧光检测的ssDNA FQreporter，所述ssDNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA，所述ssDNA标记产物如下：/5 6FAM/ATTATTT/3BHQ1/。

2.如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述特异性crRNA引物的长度为25～28bp；和/或，

所述特异性crRNA引物的score分值大于70。

3.如权利要求2所述的副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述RPA扩增体系中，

所述特异性引物的长度在30-35bp；和/或，

所述特异性引物的GC含量在40％-60％；和/或，

所述特异性引物的扩增长度在250-500bp；和/或，

所述特异性引物包含所述特异性crRNA的片段。

4.一种副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

针对副猪嗜血杆菌特异性基因，筛选出特异性crRNA引物；

根据特异性crRNA引物，设计并制备出RPA扩增体系中的特异性引物。

5.一种副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌含量的检测方法包括以下步骤：

提供上述所述的副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒；

S100、培养副猪嗜血杆菌菌液，用核酸快速裂解剂获得副猪嗜血杆菌核酸；

S101、将所述副猪嗜血杆菌核酸，利用特异性引物，加入到RPA扩增体系进行扩增，获得特异性扩增产物；

S102、将所述特异性扩增产物加入到所述的副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒中的CRISPR/Cas12a检测体系中进行检测反应，获得反应结果。

6.如权利要求5所述副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于，在步骤S100中，所述裂解的步骤包括：将副猪嗜血杆菌菌液加入离心管离心后，再加入核酸快速裂解剂混匀，金属浴加热后获得副猪嗜血杆菌核酸。

7.如权利要求5所述副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤S101中，

所述RPA扩增的温度为35～39℃；和/或，

所述RPA扩增的时间为10～40min。

8.如权利要求5所述副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤S102中，

所述检测反应的温度为35～39℃；和/或，

所述检测反应的时间为25～32min。

9.如权利要求8所述副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述金属浴加热步骤中，

所述金属浴加热的温度为90～100℃；和/或，

所述金属浴加热的时间为2～4min。

10.如权利要求5所述副猪嗜血杆菌快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述S102的步骤中，所述检测结果是采用蓝光激发荧光检测或实时荧光定量PCR仪检测。

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