CN115595378A - 一锅法检测虾肝肠胞虫的rpa-crispr方法及应用 - Google Patents

一锅法检测虾肝肠胞虫的rpa-crispr方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115595378A
CN115595378A CN202211265658.6A CN202211265658A CN115595378A CN 115595378 A CN115595378 A CN 115595378A CN 202211265658 A CN202211265658 A CN 202211265658A CN 115595378 A CN115595378 A CN 115595378A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rpa
crispr
primer
identifying
shrimp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211265658.6A
Other languages
English (en)
Inventor
高嵩
张雪
王佩
果波
王昱
赵陈洁
杨丽红
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Ocean University
Original Assignee
Jiangsu Ocean University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Ocean University filed Critical Jiangsu Ocean University
Priority to CN202211265658.6A priority Critical patent/CN115595378A/zh
Publication of CN115595378A publication Critical patent/CN115595378A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一锅法检测虾肝肠胞虫的RPA‑CRISPR方法及应用。RPA‑CRISPR方法采用一锅式设计，快捷方便，在37℃下反应，适用于POCT。可不依赖于精密仪器，在蓝色LED灯下，可凭肉眼观察到FAM荧光信号。样品预处理和DNA提取采用手持式研磨机和磁珠法，从样本提取到DNA检测信号读取，可在POCT环境中实现EHP检测，该方法在预防虾类养殖业的EHP感染方面具有重要的应用价值。

Description

一锅法检测虾肝肠胞虫的RPA-CRISPR方法及应用
技术领域
本发明属于水生生物病原检测技术领域，具体涉及基于一锅法检测虾肝肠胞虫的RPA-CRISPR方法及应用。
背景技术
虾肝肠胞虫(EHP)是一种微孢子虫病原体，会感染虾的肝胰腺，导致虾生长发育不良、壳软、嗜睡，甚至引起白粪综合征。由于EHP感染，每年虾产量减少10-20％，是一个重大的经济损失，及早发现感染对预防EHP至关重要。
定期监测和早期检测是预防虾肝肠胞虫感染的重要手段。随着现代分子生物学技术的发展，已经开发了许多检测虾肝肠胞虫的方法，包括巢式PCR、荧光定量PCR技术、环介导等温扩增法和重组酶聚合酶扩增等技术。目前以其胞壁蛋白SWP序列为靶基因进行的检测，具有较高的特异性。目前已建立以SWP为靶基因的nested-PCR检测技术，但该技术只能用于定性检测，且操作繁琐，需要多对引物进行多次扩增反应，耗时较长，灵敏度低和假阳性率高，依赖热循环仪器。近年来，各种核酸酶层出不穷，由于多数核酸酶具有可编程性且容易表达，因此被广泛用于分子检测。CRISPR-Cas12a是一种应用广泛的核酸检测系统，它具有非特异性单链切割活性(即反式切割活性)和特异性识别性(即顺式切割活性)，并且目前还没有将CRISPR-Cas12a应用于水产养殖传染病检测的相关报道。另外，现有的虾肝肠胞虫检测方法灵敏度不足，且对样本要求较高。因此开发出一种快速、敏感的检测EHP的即时检测(POCT)方法将非常有价值。
发明内容
本发明将重组酶聚合酶扩增(RPA)与CRISPR-Cas12a系统相结合，建立了一种适用于即时检测EHP感染的一锅法检测方法。该组合方法将RPA的扩增能力和CRISPR的高特异性相结合，具有更好的准确性和可靠性。通过对crRNA的设计和筛选以及对反应的系统优化，实现了一锅法，成功地解决了RPA与Cas12a两种体系不兼容的问题。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明的第一方面，提供一种引物组，包括对靶基因SWP进行RPA扩增的引物对，以及CRISPR反应的引导RNA和分子探针ssDNA-FQ，序列如下：
RPA-F：TAAAAAGAGACGATATTTACACAGACACAG；
RPA-R：TCATTCATTTTCCTTTTATCTTCTGATATG；
引导RNA(crRNA):UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAAUACAGUUGGAGACAAACA；
分子探针(ssDNA-FQ)：FAM-TTATT-BHQ1。
本发明的第二方面，提供所述引物组的用途，包括：鉴定或辅助鉴定虾肝肠胞虫；鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有虾肝肠胞虫。
本发明的第三方面，提供一种试剂盒，包括上述引物组、RPA核酸扩增冻干酶和Cas12a核酸酶。
本发明的第四方面，提供所述试剂盒中的用途，包括：鉴定或辅助鉴定虾肝肠胞虫；鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有虾肝肠胞虫。
本发明的第五方面，提供一种鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有虾肝肠胞虫的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样本中的核酸，提取液作为RPA-CRISPR反应的模板；
(2)制备RPA预混液，在1管RPA核酸扩增试剂冻干酶中加入缓冲液A、RPA-F引物、RPA-R引物、DEPC水；
(3)制备CRISPR-Cas12a预混液，将LbCas12a、10X NEB Buffer 2.1和crRNA混合；
(4)然后分别取RPA预混液、CRISPR-Cas12a预混液、分子探针ssDNA-FQ和模板DNA进行混合，所述模板为步骤(1)的提取液；
(5)加入RPA Buffer B启动反应；
(6)每隔1分钟在波长465-510nm采集FAM荧光信号，若荧光值与阴性对照相比有显著差异，则判断RPA产物中含有虾肝肠胞虫的特异性扩增产物，从而推断样品中含有虾肝肠胞虫；若荧光值与阴性对照相比没有显著差异，则判断RPA产物中不含有虾肝肠胞虫的特异性扩增产物，从而推断样品中不含有虾肝肠胞虫。
优选地，在一锅反应体系中RPA引物、Cas12a、crRNA和ssDNA-FQ的最终浓度分别为333nM、50nM、30nM和250nM。
优选地，步骤(2)中RPA预混液中各组分的加入量为：25μl缓冲液A、2μl浓度为10μM的RPA-F引物、2μl浓度为10μM的RPA-R引物和10.5μl DEPC水。
优选地，步骤(3)中CRISPR-Cas12a预混液中各组分的加入量为：3μl浓度为1μM的LbCas12a、6μl 10X NEB Buffer 2.1和2μl浓度为900nM的crRNA。
优选地，步骤(4)中各组分的加入量为：9.8μl的RPA预混液、2.75μl的CRISPR-Cas12a预混液、0.75μl浓度为5μM的分子探针ssDNA-FQ和1μl模板DNA。
优选地，步骤(5)中反应条件为：37℃下反应1小时，RPA Buffer B中含280mM醋酸镁，加入量为0.7μl。
本发明的具体原理是：利用RPA反应对样本核酸进行扩增，利用引导RNA和Cas12a蛋白对特定序列进行酶切，根据分子探针相对于对照组荧光强度的强弱进行判别是否含有目标序列(图1)。
本发明的有益效果：本发明采用一锅式设计RPA-CRISPR反应方法，快捷方便，在37℃下反应，适用于POCT。可不依赖于精密仪器，在蓝色LED灯下，可凭肉眼观察到FAM荧光信号。样品预处理和DNA提取采用手持式研磨机和磁珠法，从样本提取到DNA检测信号读取，可在POCT环境中实现EHP检测，该方法在预防虾类养殖业的EHP感染方面具有重要的应用价值。
相关定义
RPA：重组酶聚合酶等温核酸扩增技术
附图说明
图1RPA-CRISPR方法示意图
图2RPA-CRISPR方法特异性(2A、2B和2C)及灵敏度(2D、2E和2F)
图3RPA-CRISPR方法检测临床样本
具体实施方案
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
样本来源
临床样本基因组DNA以及细菌菌株，由江苏海洋与海洋渔业研究所提供，-80℃保存。
试剂和仪器
Magnetic Universal Genomic DNA Kit购自天根生化科技(北京)有限公司；T7High Efficiency Transcription Kit购自北京全式金生物技术股份有限公司；RPA核酸扩增试剂盒购自杭州众测生物科技有限公司；LbCas12a蛋白、10X NEB Buffer 2.1购自NewEngland Biolabs(美国)；限制性内切酶XhoI购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；Qubit4荧光计、NanoDrop Lite分光光度计购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；RocheLightCycler 480II qPCR仪购自瑞士罗氏公司；蓝光透射仪购自天津诺禾致源生物信息科技有限公司；第三代低速组织研磨器购自天根生化科技(北京)有限公司。
引物及crRNA的设计
根据靶标基因swp序列利用Primer Premier 5软件设计引物，引物由通用生物系统(安徽)有限公司合成。对于CrRNA，利用Geneious v4.8.5软件对理论RPA扩增子序列进行分析，寻找CRISPR-Cas12a切割反应的潜在PAM(原间距相邻基序)序列TTTN。设计相应的crRNA序列，序列见表1。
表1引物和探针序列
Figure BDA0003893081320000041
注：有下划线的碱基序列代表该片段为双链互补片段
DNA提取
取1克感染虾或临床样本用第三代低速组织研磨器匀浆，使用磁性通用基因组DNA试剂盒提取DNA，并使用Qubit 4荧光计进行定量。
制备crRNA
将两端是T7启动子和终止子，中间是crRNA的DNA序列构建到载体pUC57上，获得pUC57-crRNA质粒，用T7 RNA聚合酶体外转录。DNA合成和测序由通用生物有限公司完成。pUC57-crRNA质粒用限制性内切酶XhoI线性化，柱纯化，并用NanoDrop Lite分光光度计定量。将1μg线性化的DNA按照T7 High Efficiency Transcription Kit的指示，在37℃下体外转录16小时。crRNA通过苯酚/氯仿萃取纯化，溶于DEPC水中，用Qubit 4荧光计定量，并保存在-80℃。
实施例1RPA-CRISPR反应
制备RPA预混液，在1管RPA核酸扩增试剂冻干酶中加入缓冲液A 25μl、RPA-F引物(10μM)2μl、RPA-R引物(10μM)2μl、DEPC水10.5μl；
制备CRISPR-Cas12a预混液，将3μl LbCas12a(1μM)、6μl 10X NEB Buffer 2.1和2μl crRNA(900nM)混合；
然后分别取9.8μl的RPA预混液、2.75μl的CRISPR-Cas12a预混液、0.75μl的荧光分子ssDNA-FQ(5μM)(表1)和1μl模板DNA进行一锅反应；
加入0.7μl的RPA Buffer B(含280mM醋酸镁)启动反应；在一锅反应中，RPA引物、Cas12a、crRNA和ssDNA-FQ的最终浓度分别为333nM、50nM、30nM和250nM。
在Roche Light Cycler 480II qPCR机器中，37℃下进行一锅反应，反应1小时，每隔1分钟在波长465-510采集FAM荧光信号。终点定量是依靠LED蓝色光源显示荧光，记录图像。
实施例2RPA-CRISPR方法特异性及灵敏度
为了验证一锅RPA-CRISPR法的特异性，对虾养殖中常见的一系列病原体进行了检测，包括EHP,WSSV,SHIV,VPAHPND,non-VPAHPND和V.vulnificus。从感染虾中提取EHP,WSSV,SHIV,VPAHPND样本的DNA模板。将non-VPAHPND和V.vulnificus从各自的菌株培养后，沸煮释放DNA。仅在EHP阳性样品产生荧光信号，说明该方法特异性较好(图2A-C)。将从病虾中提取的EHP基因组DNA，10倍梯度稀释至103、102、101和100copies/μl，评估RPA-CRISPR方法敏感性。荧光曲线、终点信号和蓝光显示结果都表明，建立的RPA-CRISPR方法最低检测限为101copies/μl(图2D-F)。
实施例3RPA-CRISPR方法检测临床样本
在中国青岛、如东、盐城、连云港、日照和祁东的虾场采集了20份临床虾样本(S1-S20)，其中16份虾标本EHP阳性，4份虾标本EHP阴性，验证了该方法的有效性。结果与预期相符(图3)，验证了一锅RPA-CRISPR法的准确性和可靠性。

Claims (10)

1.一种引物组，包括对靶基因SWP进行RPA扩增的引物对，以及CRISPR反应的引导RNA和分子探针ssDNA-FQ，序列如下：
RPA-F：TAAAAAGAGACGATATTTACACAGACACAG；
RPA-R：TCATTCATTTTCCTTTTATCTTCTGATATG；
引导RNA:UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAAUACAGUUGGAGACAAACA；
分子探针：FAM-TTATT-BHQ1。
2.权利要求1所述引物组的用途，包括：鉴定或辅助鉴定虾肝肠胞虫；鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有虾肝肠胞虫。
3.一种试剂盒，包括权利要求1所述的引物组、RPA核酸扩增冻干酶和Cas12a核酸酶。
4.权利要求3所述试剂盒中的用途，包括：鉴定或辅助鉴定虾肝肠胞虫；鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有虾肝肠胞虫。
5.一种鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有虾肝肠胞虫的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样本中的核酸，提取液作为RPA-CRISPR反应的模板；
(2)制备RPA预混液，在1管RPA核酸扩增试剂冻干酶中加入缓冲液A、RPA-F引物、RPA-R引物、DEPC水；
(3)制备CRISPR-Cas12a预混液，将LbCas12a、10X NEB Buffer 2.1和crRNA混合；
(4)然后分别取RPA预混液、CRISPR-Cas12a预混液、分子探针ssDNA-FQ和模板DNA进行混合，所述模板为步骤(1)的提取液；
(5)加入RPA Buffer B启动反应；
(6)每隔1分钟在波长465-510nm采集FAM荧光信号，若荧光值与阴性对照相比有显著差异，则判断RPA产物中含有虾肝肠胞虫的特异性扩增产物，从而推断样品中含有虾肝肠胞虫；若荧光值与阴性对照相比没有显著差异，则判断RPA产物中不含有虾肝肠胞虫的特异性扩增产物，从而推断样品中不含有虾肝肠胞虫。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(5)体系中RPA引物、Cas12a、crRNA和ssDNA-FQ的最终浓度分别为333nM、50nM、30nM和250nM。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中RPA预混液中各组分的加入量为：25μl缓冲液A、2μl浓度为10μM的RPA-F引物、2μl浓度为10μM的RPA-R引物和10.5μl DEPC水。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中CRISPR-Cas12a预混液中各组分的加入量为：3μl浓度为1μM的LbCas12a、6μl 10X NEB Buffer 2.1和2μl浓度为900nM的crRNA。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(4)中各组分的加入量为：9.8μl的RPA预混液、2.75μl的CRISPR-Cas12a预混液、0.75μl浓度为5μM的分子探针ssDNA-FQ和1μl模板DNA。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(5)中RPA Buffer B中含280mM醋酸镁，加入量为0.7μl，步骤(5)中反应条件为37℃下反应1小时。
CN202211265658.6A 2022-10-17 2022-10-17 一锅法检测虾肝肠胞虫的rpa-crispr方法及应用 Pending CN115595378A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211265658.6A CN115595378A (zh) 2022-10-17 2022-10-17 一锅法检测虾肝肠胞虫的rpa-crispr方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211265658.6A CN115595378A (zh) 2022-10-17 2022-10-17 一锅法检测虾肝肠胞虫的rpa-crispr方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115595378A true CN115595378A (zh) 2023-01-13

Family

ID=84847889

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211265658.6A Pending CN115595378A (zh) 2022-10-17 2022-10-17 一锅法检测虾肝肠胞虫的rpa-crispr方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115595378A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110551846B (zh) 一种用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法
CN107988325B (zh) 虾肝肠胞虫(ehp)的raa恒温荧光检测方法及试剂
CN107828914B (zh) 传染性皮下及造血组织坏死病毒（ihhnv）的raa恒温荧光检测方法及试剂
CN107988326A (zh) 对虾急性肝胰腺坏死病（ahpnd）的raa恒温荧光检测方法及试剂
AU2020104007A4 (en) Rt-lamp detection primer group, kit and method for tilapia lake virus
Wang et al. A one-pot RPA-CRISPR detection method for point-of-care testing of Enterocytozoon hepatopenaei infection in shrimp
CN113249499B (zh) 一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒、其制备方法及其应用
CN110551845A (zh) 一种用于检测传染性脾肾坏死病毒的数字pcr检测引物及试剂盒
Dangtip et al. Colorimetric detection of scale drop disease virus in Asian sea bass using loop-mediated isothermal amplification with xylenol orange
CN111485035A (zh) 用于检测鳜鱼传染性脾肾坏死病毒荧光定量pcr的方法及相应试剂盒
CN110592268A (zh) 罗湖病毒（TiLV）的RAA恒温荧光检测方法及试剂
US20230250497A1 (en) One-step nested pcr primers set and kit modified with locked nucleic acid for detecting african swine fever virus
CN108998575B (zh) 鸡细小病毒和鸡新城疫病毒二重pcr检测方法的建立
CN116287465A (zh) 石斑鱼虹彩病毒实时定量pcr检测引物及检测试剂盒
CN116179763A (zh) 一种基于era技术的基因ⅰ型和基因ⅱ型黄头病毒多重快速检测方法及检测用引物和探针
CN114085929B (zh) 一种用于检测非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株的试剂盒
CN110592269A (zh) 草鱼出血病2型病毒（gcrv-2）的raa恒温荧光检测方法及试剂
CN111485017A (zh) 用于检测对虾虾肝肠孢虫的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒
CN115595378A (zh) 一锅法检测虾肝肠胞虫的rpa-crispr方法及应用
CN110894532A (zh) 细菌性败血症（fbs）的raa恒温荧光检测方法及试剂
CN114381551A (zh) 一种用于检测大口黑鲈虹彩病毒的实时荧光raa引物、探针及试剂盒
Wu et al. Rapid visual detection of Vibrio parahaemolyticus by combining LAMP-CRISPR/Cas12b with heat-labile uracil-DNA glycosylase to eliminate carry-over contamination
CN110894551A (zh) 草鱼出血病i型病毒（gcrv-i）的raa恒温荧光检测方法及试剂
CN111534634A (zh) 一种ⅱ型犬腺病毒的可视化等温扩增检测试剂及其应用
CN110863067A (zh) 检测鳗鲡疱疹病毒的引物对及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination