CN110894549A - 流行性造血器官坏死病毒(ehnv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 - Google Patents
流行性造血器官坏死病毒(ehnv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110894549A CN110894549A CN201811068906.1A CN201811068906A CN110894549A CN 110894549 A CN110894549 A CN 110894549A CN 201811068906 A CN201811068906 A CN 201811068906A CN 110894549 A CN110894549 A CN 110894549A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- necrosis virus
- hematopoietic necrosis
- epidemic
- raa
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 52
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 title claims abstract description 49
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 21
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 26
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 22
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 12
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 5
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 claims description 3
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims description 3
- VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N L-1,4-dithiothreitol Chemical compound SC[C@H](O)[C@@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims description 3
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 claims description 3
- 101710176276 SSB protein Proteins 0.000 claims description 3
- 101710126859 Single-stranded DNA-binding protein Proteins 0.000 claims description 3
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims description 3
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 claims description 3
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 101100300807 Drosophila melanogaster spn-A gene Proteins 0.000 claims description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 claims description 2
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 claims description 2
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 2
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims 1
- 239000003419 rna directed dna polymerase inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 abstract 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000711804 Infectious hematopoietic necrosis virus Species 0.000 description 3
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 3
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 241000701372 Iridovirus Species 0.000 description 2
- 101710082933 Single-strand DNA-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000701377 Iridoviridae Species 0.000 description 1
- 206010023424 Kidney infection Diseases 0.000 description 1
- 241001596950 Larimichthys crocea Species 0.000 description 1
- 241001327682 Oncorhynchus mykiss irideus Species 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 241000701382 Ranavirus Species 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 208000010824 fish disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种流行性造血器官坏死病毒(EHNV)RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、逆转录酶、重组聚合酶和对照品。本发明的试剂盒特异性强;检测灵敏度高,可达到6fg/μL;准确度高、可靠;操作简便快捷,适合现场检测,具有广泛的应用场景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,涉及海洋水产养殖业的检测方法,具体涉及一种流行性造血器官坏死病毒的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。
背景技术
在世界水产养殖业中,病毒所造成的危害一直都是非常巨大的。其中虹彩病毒的危害比较严重,其危害的分布范围比较广泛,并且鱼类一旦同时感染虹彩病毒和寄生虫,致死率可达90%以上。流行性造血器官坏死病毒(EHNV)是虹彩病毒科蛙病毒属的成员,能引起河鲈,虹鳟等多种鱼类的幼鱼和成鱼出现内脏坏死以致死亡。1986年在澳大利亚首次被发现,会感染坏死鱼的肾脏造血组织、肝脏和脾脏,对鱼的致死率可达100%。对于EHNV的防治尚无特效药,病毒的早期检测和诊断仍是最重要的防治手段。
对于病害检测这方面使用方法主要有镜检观察,分子检测和免疫学检测。PCR分子检测方法是最为常用的检测方法,其方法敏感、准确、快速而被广泛应用,但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场检测和普及使用。本发明建立了RAA恒温荧光来检测流行性造血器官坏死病毒的方法,快速方便,准确可靠,是适应口岸快速检测和大通关的时代要求,对促进中国水产养殖及其产品的贸易有重要作用。
重组酶介导扩增(Recombinase-aid Amplification,RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是,RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶,在37℃恒温下,该重组酶可与引物DNA紧密结合,形成酶和引物的聚合体,当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时,在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding,SSB)的帮助下,使模板DNA解链,并在DNA聚合酶的作用下,形成新的DNA互补链,反应产物也是以指数级增长,通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程,20分钟内,可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速,因为不需要高温循环,所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用,适用于食品快速检测领域。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的是提供流行性造血器官坏死病毒(EHNV)的RAA恒温荧光核酸检测试剂盒及检测方法。
为实现以上目的,本发明采用以下技术方案:
一种流行性造血器官坏死病毒(EHNV)核酸的检测试剂盒,包括:流行性造血器官坏死病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针,其中所述流行性造血器官坏死病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述流行性造血器官坏死病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3,其5’端标记有荧光报告基团,3’端标记有荧光淬灭基团。
在一些实施方案中,所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种,荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。
在一些实施方案中,所述的核酸检测试剂盒,还包括引物混合液、特异性荧光探针、A Buffer、B Buffer、RAA干粉试剂、流行性造血器官坏死病毒标准品和DEPC处理水中至少一种。
在一些实施方案中,所述的试剂盒,所述的逆转录体系由RTE逆转录酶、RNA酶抑制剂组成。
在一些实施方案中,所述的试剂盒,其中,所述A Buffer为20%PEG;B Buffer为280mM MgAc。
在一些实施方案中,所述的试剂盒,其中,所述的RAA干粉试剂的成分如下:1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μLRad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶,30ng/mL RTE逆转录酶、100mmol/L Tricine、20%PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。
在一些实施方案中,所述的核酸检测试剂盒,流行性造血器官坏死病毒标准品为含有流行性造血器官坏死病毒保守基因部分序列的阳性质粒。
在一些实施方案中,所述的试剂盒,所述含有流行性造血器官坏死病毒保守区域基因部分序列的阳性质粒的序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种流行性造血器官坏死病毒的RAA恒温荧光检测方法,提取待测样品的RNA,以待测样品的RNA为模板,在流行性造血器官坏死病毒的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及RAA干粉试剂、A Buffer、B Buffer和DEPC处理水存在下进行实时荧光RAA反应,根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样品;其中所述流行性造血器官坏死病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述流行性造血器官坏死病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3,其5’端标记有荧光报告基团,3’端标记有荧光淬灭基团。
在一些实施方案中,所述的流行性造血器官坏死病毒核酸RNA提取采用传统的Trizol-RNA试剂或者采用等效的RNA提取试剂盒。
在一些实施方案中,所述实施荧光RAA反应程序为:37℃,40s;37℃,20min,共计40个循环;
本发明所述检测方法需要实时荧光RAA反应结束后,利用实时荧光RAA仪分析软件,根据实时荧光RAA的扩增曲线分析待测样品。优选的,所述分析待测样品为待测样本FAM通道荧光曲线呈“S”型且CT值≤35,判断为流行性造血器官坏死病毒阳性结果;当待测样本曲线不呈“S”型或CT值>35,判断为流行性造血器官坏死病毒阴性结果。
有益效果
1、快速高效:整个扩增只需20-30min即可完成,扩增产量可以达到109-1010个拷贝;
2、操作简单:不需要特殊试剂,不需要预先解链等繁琐步骤,只需要恒温的荧光仪,条件比较温和;
3、高特异性:本发明对鱼类其他的病症SVCV、CYHV2、IHNV、CEV、FBS、VNNV的质粒DNA均不发生扩增。
4、高灵敏度:本发明的检测极限可以达到6fg/μL反应
5、鉴定简单:根据实时荧光数据,直接判断扩增结果,无需电泳检测,适合现场检测。
附图说明
图1为本发明中涉及的4对引物RAA扩增曲线图。
图2为RAA检测方法对EHNV的灵敏度实验图,从左到右依次为6pg/μL、600fg/μL、60fg/μL、6fg/μL、0.6fg/μL的阳性标准品的扩增结果。
图3为RAA检测方法对EHNV的特异性实验图。
具体实施方法
以下通过具体实施例对本发明进一步说明,但并不局限于此。
实施例1:
本发明对流行性造血器官坏死病毒在Genebank数据库中搜索流行性造血器官坏死病毒株基因序列,使用DNAMAN 6.0软件对多序列进行比对,找出保守的区段。在保守区域设计了4组引物和探针,并在NCBI数据库中进行BLAST比对,引物和探针的序列如表1所示。阳性样本扩增曲线如图1所示。
表1引物和探针序列:
由图1结果可见,第四组引物和探针的扩增曲线最为典型,有明显的指数期和平台期,有较高荧光强度(纵坐标值),且CT值较小(曲线与阈值线的交叉点所对应的横坐标)结果分析见表2。其它引物探针曲线上升高度较低,CT值较大,平台期不明显;或者没有出现扩增,出现漏检。说明第四组引物和探针目的产物的复制速度更快、数量更多,扩增反应效率更高。
组别\结果 | CT值 | 荧光强度 |
第一组 | 7.48 | 415,000 |
第二组 | 6.65 | 425,000 |
第三组 | 7.71 | 507,750 |
第四组 | 5.42 | 415,450 |
表2引物探针筛选结果分析
实时例2:所述试剂盒流行性造血器官坏死病毒
本发明所述的核酸检测试剂盒,还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、BBuffer、RAA干粉试剂、流行性造血器官坏死病毒标准品和DEPC处理水。
本发明所述的试剂盒,其中,所述的ABuffer为20%PEG;B Buffer为280mM MgAc。
本发明所述的试剂盒,其中,所述的RAA干粉试剂的成分如下:1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶,100mmol/LTricine、20%PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶、30ng/mL RTE逆转录酶。
本发明所述的引物混合液中,所述的正向引物碱基序列如SEQ ID NO.1所示,所述反向引物的碱基序列SEQ ID NO.2所示,正向引物和反向引物的摩尔配比为SEQ ID NO.1:SEQ ID NO.2为1:1。
本发明提供的流行性造血器官坏死病毒的特异性探针碱基序列如SEQ ID NO.3所示,探针的5’端标记有FAM荧光报告基团,3’端标记有BHQ1荧光淬灭基团。
本发明提供的流行性造血器官坏死病毒标准品包含有流行性造血器官坏死病毒保守区基因序列的阳性质粒,该质粒的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。
质粒的碱基序列(SEQ ID NO.4):
CGCAGTCAAGGCCCTGATGTTTATGGTGCAGAACGTCACACACCCTTCCGTCGGCTCCAATTACACCTGCGCCACTCCCGTCGTGGGAGTCGACAACACGGTCCTGGAGCCAGCCCTGGCGGTGGATCCCGTCAAGAGCGCCAGCCTGGTGTACGAAAACACCACAAGGCTCCCCGACCTGGGAGTCGAGTACTACTCGCTGGTGCAGCCCTGGTACTATGCCACCTCCATCCCAGTCAGCACCGGGCACCACCTCTACTCTTATGCCCTCAGCCTGCAGGACCCCCACCCATCCGGATCCACCAATTACGGCAGACTGACCAACGCCAGCCTTAACGTCACCCTGTCCGCTGAGGCCACCACGGCCTCCGCAGGAGGCGGAGGCGACAACTCTGGGTACACCACCGCCCAAAAGTACGCCCTCATCGTTCTGGCCATCAACCACAACATTATCCGCATCATGAACGGCTCGATGGGATTCCCAATCTTGTAAAGAGTATTTTTCAGCGCAAAGTCTTTTCCGTCATGGGTCCTCCATGATGGAAATAAAACATGAA
本发明提供的DEPC处理水购买于Solarbio公司。
实例3:本发明所述试剂盒流行性造血器官坏死病毒
1、阳性样品核酸的提取
1.1、核酸提取:采用传统的Trizol-RNA试剂或者采用等效的RNA提取试剂盒。
2、RAA反应体系的配置:每个检测样品对应一个RAA反应干粉管,每个RAA反应干粉管中各反应组分和所加入的体积如表3所示。
表3:
RAA反应体系组分 | 体积(μL) |
A Buffer | 12.5μL |
B Buffer | 2.5μL |
引物混合液 | 4μL |
特异性荧光探针 | 0.6μL |
RNA模板 | 2μL |
DEPC处理水 | 28.4μL |
总体积 | 50μL |
A Buffer为20%PEG;B Buffer为280mM MgAc
3、将配置好反应体系的RAA反应管放置于ABI7500扩增仪中,按照下列程序进行RAA扩增:39℃,40s;39℃,20min,共计40个循环。每个循环收集FAM通道的荧光。
4、扩增结束后根据荧光曲线判断和CT值判定流行性造血器官坏死病毒阳性或阴性结果。
判定结果:FAM通道荧光曲线呈“S”型且CT值≤35,判断为流行性造血器官坏死病毒阳性结果;当待测样本曲线不呈“S”型或CT值>35,判断为流行性造血器官坏死病毒阴性结果。
实施例4:本发明RAA检测试剂盒在临床实际应用中的评估
采用本发明试剂盒进行临床盲样的实验,检测20份大黄鱼;实验结果表明,本发明的第四引物对可以区分出流行性造血器官坏死病毒,与反转录PCR阳性符合率很高。在20份中,反转录PCR,有16份为阳性结果,4份为阴性结果,通过RAA方法检测的结果为4份为阳性,有4份也为阴性结果,两组实验的结果一致,说明本发明的RAA检测与PCR检测具有相同的可靠性。
试验例1:本发明所述试剂盒的灵敏度试验
本发明实施例2所述试剂盒提供的流行性造血器官坏死病毒标准品质粒,提取阳性质粒,并用NanoDrop测量阳性质粒的浓度,并将其分别稀释到6pg/μL、600fg/μL、60fg/μL、6fg/μL、0.6fg/μL 5个浓度梯度进行灵敏度试验。
检测结果如图2所示,从左到右依次为6pg/μL、600fg/μL、60fg/μL、6fg/μL、0.6fg/μL的阳性标准品的扩增结果,从中可以看出本发明的RAA荧光扩增试剂和检测的灵敏度可达6fg/μL,精确性优于普通PCR检测方法,表明本发明的RAA恒温荧光检测试剂盒和检测方法对EHNV的诊断具有高度的灵敏性。
试验例2:本发明所述试剂盒的特异性试验
为了检测本发明试剂盒的特异性,采用实例3中的检测方法,分别对病毒SVCV、CYHV2、IHNV、CEV、FBS、VNNV样本进行检测,分析本试剂盒对EHNV和鱼类其他常见病毒的检测情况。
检测结果表明:仅EHNV样品出现正常扩增,阴性对照(DEPC处理水)及SVCV、CYHV2、IHNV、CEV、FBS、VNNV样品均未出现扩增(如图3所示)。上述结果说明,本发明RAA恒温荧光检测试剂盒能特异性扩增出EHNV中的靶序列,而不与其他病毒核酸发生交叉反应。说明本发明方法及试剂盒特异性好,未出现假阴性。
同时,采用本发明设计的2-3对引物进行同样的特异性实验,发现这些引物不能很好的特异区分不同的样本,特异性不是很好(具体实验数据略)。
在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下,可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制,并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物,而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解,尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明,但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用,并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。
本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考,就如同每个单独的出版物被具体和单独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献的任何及所有材料和信息结合入本申请中的权利。
序列表
<110> 杭州众测生物科技有限公司
<120> 流行性造血器官坏死病毒(EHNV)的RAA恒温荧光检测方法及试剂
<130> 18-100070-00006985
<141> 2018-09-13
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcagccctg gtactatgcc acctccatcc 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagggtgacg ttaaggctgg cgttggtcag 30
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctccatccc agtcagcacc gggcaccacc cactcttatg ccctcag 47
<210> 4
<211> 557
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgcagtcaag gccctgatgt ttatggtgca gaacgtcaca cacccttccg tcggctccaa 60
ttacacctgc gccactcccg tcgtgggagt cgacaacacg gtcctggagc cagccctggc 120
ggtggatccc gtcaagagcg ccagcctggt gtacgaaaac accacaaggc tccccgacct 180
gggagtcgag tactactcgc tggtgcagcc ctggtactat gccacctcca tcccagtcag 240
caccgggcac cacctctact cttatgccct cagcctgcag gacccccacc catccggatc 300
caccaattac ggcagactga ccaacgccag ccttaacgtc accctgtccg ctgaggccac 360
cacggcctcc gcaggaggcg gaggcgacaa ctctgggtac accaccgccc aaaagtacgc 420
cctcatcgtt ctggccatca accacaacat tatccgcatc atgaacggct cgatgggatt 480
cccaatcttg taaagagtat ttttcagcgc aaagtctttt ccgtcatggg tcctccatga 540
tggaaataaa acatgaa 557
Claims (10)
1.一种流行性造血器官坏死病毒(EHNV)核酸的检测试剂盒,包括:流行性造血器官坏死病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针,其中所述流行性造血器官坏死病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述流行性造血器官坏死病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3,其5’端标记有荧光报告基团,3’端标记有荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒,所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种,荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。
3.根据权利要求1和2所述的核酸检测试剂盒,还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、B Buffer、RAA干粉试剂、流行性造血器官坏死病毒标准品和DEPC处理水中至少一种。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,所述的逆转录体系由RTE逆转录酶、RNA酶抑制剂组成。
5.根据权利要求3所述的试剂盒,其中,所述A Buffer为20% PEG ;B Buffer为280mMMgAc。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其中,所述的RAA干粉试剂的成分如下:1mmol/LdNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶, 30ng/mL RTE逆转录酶、 100mmol/L Tricine、20% PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。
7.根据权利要求1-5任意一项所述的核酸检测试剂盒,流行性造血器官坏死病毒标准品为含有流行性造血器官坏死病毒保守区基因部分序列的阳性质粒。
8.根据权利要求6所述的试剂盒,所述含有流行性造血器官坏死病毒保守区基因部分序列的阳性质粒的序列如SEQ ID NO.4所示。
9.流行性造血器官坏死病毒的RAA恒温荧光检测方法,提取待测样品的RNA,以待测样品的RNA 为模板,在流行性造血器官坏死病毒的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及RAA干粉试剂、A Buffer、B Buffer和DEPC处理水存在下进行实时荧光RAA反应,根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样品;其中所述流行性造血器官坏死病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示、所述流行性造血器官坏死病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示,所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3,其5’端标记有荧光报告基团,3’端标记有荧光淬灭基团。
10.根据权利要求9所述,流行性造血器官坏死病毒核酸RNA提取采用传统的Trizol-RNA试剂或者采用等效的RNA提取试剂盒。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811068906.1A CN110894549A (zh) | 2018-09-13 | 2018-09-13 | 流行性造血器官坏死病毒(ehnv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811068906.1A CN110894549A (zh) | 2018-09-13 | 2018-09-13 | 流行性造血器官坏死病毒(ehnv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110894549A true CN110894549A (zh) | 2020-03-20 |
Family
ID=69785566
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811068906.1A Pending CN110894549A (zh) | 2018-09-13 | 2018-09-13 | 流行性造血器官坏死病毒(ehnv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110894549A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112795705A (zh) * | 2021-03-12 | 2021-05-14 | 长沙海关技术中心 | 一种高效三联检测svcv、ihnv和cev的引物以及试剂盒 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101948937A (zh) * | 2010-10-15 | 2011-01-19 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 流行性造血器官坏死病毒的pcr检测试剂盒及检测方法 |
CN103173572A (zh) * | 2013-04-03 | 2013-06-26 | 中华人民共和国烟台出入境检验检疫局 | 基于液相芯片检测流行性造血器官坏死病毒的方法 |
CN108103240A (zh) * | 2017-11-10 | 2018-06-01 | 杭州众测生物科技有限公司 | 对虾传染性肌肉坏死病毒(imnv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 |
-
2018
- 2018-09-13 CN CN201811068906.1A patent/CN110894549A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101948937A (zh) * | 2010-10-15 | 2011-01-19 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 流行性造血器官坏死病毒的pcr检测试剂盒及检测方法 |
CN103173572A (zh) * | 2013-04-03 | 2013-06-26 | 中华人民共和国烟台出入境检验检疫局 | 基于液相芯片检测流行性造血器官坏死病毒的方法 |
CN108103240A (zh) * | 2017-11-10 | 2018-06-01 | 杭州众测生物科技有限公司 | 对虾传染性肌肉坏死病毒(imnv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
GENBANK: "GenBank: AY187045.1" * |
吕蓓等: "用重组酶介导扩增技术快速扩增核酸" * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112795705A (zh) * | 2021-03-12 | 2021-05-14 | 长沙海关技术中心 | 一种高效三联检测svcv、ihnv和cev的引物以及试剂盒 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107988428B (zh) | 虾虹彩病毒(siv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN107988325B (zh) | 虾肝肠胞虫(ehp)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN107828914B (zh) | 传染性皮下及造血组织坏死病毒(ihhnv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN108103240A (zh) | 对虾传染性肌肉坏死病毒(imnv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN108754000B (zh) | 耐药基因mcr-4/5/8荧光定量PCR检测方法 | |
CN110699490B (zh) | 非洲猪瘟病毒cd2v基因的raa恒温荧光检测引物探针组、试剂盒及方法 | |
CN110564895A (zh) | 猫疱疹病毒fhv-1的raa恒温荧光检测引物探针组、试剂盒及方法 | |
CN107988326A (zh) | 对虾急性肝胰腺坏死病(ahpnd)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN110592268A (zh) | 罗湖病毒(TiLV)的RAA恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN107988427A (zh) | 对虾肝胰腺细小病毒(hpv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN107828915A (zh) | 虾黄头病毒(yhv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN107828913A (zh) | 对虾白斑综合症(wssv)的raa恒温荧光检测方法及试剂盒 | |
CN107988426A (zh) | 对虾桃拉病毒(tsv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN110894546A (zh) | 鱼类病毒性神经坏死病病毒(vnnv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN110592274A (zh) | 大黄鱼虹彩病毒(lyciv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN110894550A (zh) | 鳗鲡疱疹病毒(hva)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN110894532A (zh) | 细菌性败血症(fbs)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN110592269A (zh) | 草鱼出血病2型病毒(gcrv-2)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN108998576B (zh) | 用于检测鲤春病毒的特异性引物对、探针、检测试剂盒 | |
CN110894549A (zh) | 流行性造血器官坏死病毒(ehnv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN116287433A (zh) | 一种高灵敏度猴痘病毒检测试剂盒及检测方法 | |
CN113481326B (zh) | 一种等温核酸扩增反应试剂、等温核酸扩增方法及其应用 | |
CN110894551A (zh) | 草鱼出血病i型病毒(gcrv-i)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN108588274A (zh) | 对虾偷死野田村病毒(cmnv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
CN110592270A (zh) | 锦鲤疱疹病毒(khv)的raa恒温荧光检测方法及试剂 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20200320 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |