CN112795705A - 一种高效三联检测svcv、ihnv和cev的引物以及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种高效三联检测SVCV、IHNV和CEV的引物以及试剂盒，本发明以改良后的LAMP技术为基因扩增反应原理，在反应体系里加入金纳米颗粒，吸附ssDNA和蛋白酶，抑制升温过程中的非特异性反应，达到热启动的目的，避免在升温过程中的非特异性反应；结合改良后的LAMP技术与微流控芯片技术，既可以快速、准确的检测区分鲤春病毒血症病毒、传染性造血器官坏死病毒和鲤鱼浮肿病毒，同时，反应试剂预埋于微流控芯片上，实现一样三指标检测，又使用户操作简便。

Description

一种高效三联检测SVCV、IHNV和CEV的引物以及试剂盒

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种高效三联检测SVCV、IHNV和CEV的引物以及试剂盒。

背景技术

鲤春病毒血症病毒(spring viraemia of carp virus，简称SVCV)，又名鲤弹状病毒，属弹状病毒科水泡病毒属。有一层囊膜，病毒大小为180×70nm，单链RNA，目前研究证明鲤春病毒血症病毒只有一种血清型。该病毒主要可造成鲤鱼科鱼类大规模暴发鲤春病毒血症。

传染性造血器官坏死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)，属弹状病毒科(Rhabdoviridae)，诺拉弹状病毒属(Novirhabdovirus)，IHNV是该属代表种。IHNV病毒粒子含有一条全长约为11kb的线状、反义、单股RNA。传染性造血器官坏死病主要侵害虹鳟，包括硬头鳟、大磷大马哈鱼、红大马哈鱼和大西洋大马哈鱼。

鲤鱼浮肿病(Koi sleepy disease，KSD)，最早于1970年在日本养殖的锦鲤上发现并报道，其病原为鲤鱼浮肿病毒(Carp Edema Virus，CEV)，是一种大小为200nm、有囊膜的DNA病毒，属于痘病毒科(Poxviridae)。鲤鱼浮肿病主要感染养殖鲤鱼和锦鲤。

目前流行的诊断方法是PCR检测法。采用现有的PCR技术，由于其反应要在3个不同的温度区循环，对仪器要求高，成本也相对高昂，并且PCR技术仅仅1对扩增引物，易受干扰，特异性相对不足，且出结果时间较久，操作专业要求高，微量加量步骤多。而LAMP技术共有4条不同的特异性引物，故而检测结果准确度更高，但是由于是恒温反应，缺少类似PCR的热启动酶，在设备升温阶段容易产生非特异性扩增从而影响检测结果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的缺陷提供一种高效三联检测鲤春病毒血症病毒、传染性造血器官坏死病毒和鲤鱼浮肿病毒的引物以及试剂盒。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种高效三联检测SVCV、IHNV和CEV的引物，具体为：

SVCV-F3：GGGAAAGATGGGAAGATCC；

SVCV-B3：CCATTCTACCACTGCATCC；

SVCV-FIP：CGGCTTGGAAAGCATGTTGAA-CCCTTGAATATGATAGAATCAGGA；

SVCV-BIP：TTATCCCTCATCCTCATTATGACGA-TTCCATTTTCTCCAGTATTATCGA。

IHNV-F3：CTAATCTTCTAGATTGTTCTTCAAG；

IHNV-B3：TCTAGTCTAATTTGATCTGGAGAA；

IHNV-FIP：AGCAAGAGCTGCTGCACTTT-TTCCTTGTTGGAGCTGGT；

IHNV-BIP：TACCTAACTTTGTTTGGACAAGGT-GTATGCCTTAATTCCATACAGTT。

CEV-F3：CTAATCTTCTAGATTGTTCTTCAAG；

CEV-B3：TCTAGTCTAATTTGATCTGGAGAA；

CEV-FIP：GCTGCACTTTTAGGAGGACAAGT-AAAATCAATTGCTTTCCTTGTTG；

CEV-BIP：TACCTAACTTTGTTTGGACAAGGT-GTATGCCTTAATTCCATACAGTT。

本发明还提供一种高效三联检测SVCV、IHNV和CEV的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物以及反应液，所述反应液的组成为：

所述鲤春病毒血症病毒引物的浓度和体积为：90μM的SVCV-F3引物0.5μL、90μM的SVCV-B3引物0.5μL、180μM的SVCV-FIP引物2μL、180μM的SVCV-BIP引物2μL。所述传染性造血器官坏死病毒引物的浓度和体积为：90μM的IHNV-F3引物0.5μL、90μM的IHNV-B3引物0.5μL、180μM的IHNV-FIP引物2μL、180μM的IHNV-BIP引物2μL。所述鲤鱼浮肿病毒引物的浓度和体积为：90μM的CEV-F3引物0.5μL、90μM的CEV-B3引物0.5μL、180μM的CEV-FIP引物2μL、180μM的CEV-BIP引物2μL。其中，该试剂盒选用8样本芯片，即1个加样孔对应4个检测孔，第1检测孔位包埋扩增SVCV序列的引物，第2检测孔包埋扩增IHNV序列的引物，第3检测孔包埋扩增CEV序列的引物，第4检测孔包埋内参引物和内参质粒，如图1，冻干。

所述鲤春病毒血症病毒的核酸序列为AY842485，传染性造血器官坏死病毒的核酸序列为GQ413939，所述鲤鱼浮肿病毒的核酸序列为MH250199。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明以改良后的LAMP技术为基因扩增反应原理，在反应体系里加入金纳米颗粒，吸附ssDNA和蛋白酶，抑制升温过程中的非特异性反应，达到热启动的目的，避免在升温过程中的非特异性反应；结合改良后的LAMP技术与微流控芯片技术，既可以快速、准确的检测区分鲤春病毒血症病毒、传染性造血器官坏死病毒和鲤鱼浮肿病毒，同时，反应试剂预埋于微流控芯片上，实现一样三指标检测，又使用户操作简便。

附图说明

图1是8样本芯片测试孔位图；

图2是SVCV、IHNV和CEV引物敏感性扩增结果图；图中：A、B、C分图分别是SVCV、IHNV、CEV敏感性扩增结果。

图3是SVCV、IHNV和CEV引物重复性扩增图；图中：A、B、C分图分别是SVCV、IHNV、CEV重复性扩增结果。

图4是SVCV、IHNV和CEV引物特异性扩增图；图中：A、B、C图分别是SVCV、IHNV、CEV特异性扩增结果。

具体实施方式

实施例1

先通过NCBI GenBank寻找目标序列，并针对目标序列设计引物，并将其分别固定在微流控芯片相应位置后对微流控芯片进行封装，与从鱼肉及其各种脏器、血液、排泄物、环境样本和细胞培养物中提取的核酸模板混合反应后，加入到封装好的微流控芯片中，之后放入到带有离心功能、恒温功能及实时荧光检测的微流控芯片检测仪中，上述仪器和芯片均为市售产品，宁波爱基因科技有限公司也有相应公开产品，利用离心力驱动样品进入微流控芯片反应孔，进行恒温扩增。若样本中含有目的片段而得到恒温扩增，扩增产物与荧光物质进行有效的结合，通过荧光检测仪实时捕获荧光信号，直观的反应扩增产物的产生，根据实时荧光信号的出现时间、强度和位置，判断样本中是否含有鲤春病毒血症病毒、传染性造血器官坏死病毒和鲤鱼浮肿病毒。

具体的操作步骤如下：

1、微流控芯片检测体系中18μL反应液的组成如下：

所述鲤春病毒血症病毒引物的浓度和体积为：90μM的SVCV-F3引物0.5μL、90μM的SVCV-B3引物0.5μL、180μM的SVCV-FIP引物2μL、180μM的SVCV-BIP引物2μL。所述传染性造血器官坏死病毒引物的浓度和体积为：90μM的IHNV-F3引物0.5μL、90μM的IHNV-B3引物0.5μL、180μM的IHNV-FIP引物2μL、180μM的IHNV-BIP引物2μL。所述鲤鱼浮肿病毒引物的浓度和体积为：90μM的CEV-F3引物0.5μL、90μM的CEV-B3引物0.5μL、180μM的CEV-FIP引物2μL、180μM的CEV-BIP引物2μL。其中，该试剂盒选用8样本芯片，即1个加样孔对应4个检测孔，第1检测孔位包埋扩增SVCV序列的引物，第2检测孔包埋扩增IHNV序列的引物，第3检测孔包埋扩增CEV序列的引物，第4检测孔包埋内参引物和内参质粒，如图1，冻干。

所述鲤春病毒血症病毒的核酸序列为AY842485，传染性造血器官坏死病毒的核酸序列为GQ413939，所述鲤鱼浮肿病毒的核酸序列为MH250199。

并取11μL的SVCV的核酸，该核酸序列为AY842485；取11μL的IHNV的核酸，该核酸序列为GQ413939，再取11μL的CEV的核酸，该核酸序列为MH250199，三种核酸充分混匀，然后取32μL SVCV、IHNV和CEV模板核酸与18μL反应液混合，加入到芯片的加样孔，再将加样孔用封口膜封住，上机；

2、微流控芯片上机扩增：

由于本方法采用的是恒温扩增，不需要经过PCR扩增的变性、退火和延伸等变温过程，整个反应过程在恒温条件下完成，扩增程序：温度设定为63.5℃，反应时间设定为30min。运行程序：低速离心转速为1600r/min，低速离心时间为10sec，高速离心转速为4600r/min，高速离心时间为30sec。

3、微流控芯片结果判断：

3.1微流控芯片检测仪阈值线设置

阈值线一般情况设置为800(可根据实际情况进行调整，设定原则以阈值线刚好超过非典型S型扩增曲线的最高点，且Ct值显示为30)，仪器配套软件自动分析结果。

3.2质量控制

内参出现扩增曲线，且Ct值<30时，实验结果有效。

3.3结果判定

3.3.1实验成立条件

阳性对照：Ct<30，阳性对照的反应孔(1、2、3)和内标反应孔(4)有明显的典型S型扩增曲线。

阴性对照：阴性对照的反应孔(1、2、3)均无扩增曲线，内标反应孔(4)有明显的典型S型扩增曲线。

3.3.2判定标准

阳性：反应时间30分钟内，项目检测孔位出现明显扩增曲线，且Ct值<30，判定该孔对应的检测项目为阳性。

阴性：反应时间30分钟内，项目检测孔位未出现明显扩增曲线，判定该孔对应的检测项目为阴性。

在微流控芯片检测仪上进行微流控芯片的恒温扩增，仪器会进行实时荧光检测，根据荧光检测的有效扩增曲线进行判读，任意一检测孔中有标准的S型的扩增曲线，则该孔判断为阳性，即该样本中含有对应检测孔的病毒核酸；没有扩增曲线的检测孔判断为阴性，即该样本不含有对应检测孔的病毒核酸。

4、敏感性及检测限的验证

4.1实验材料试剂：反应液；1×10⁵copies/μL、1×10⁴copies/μL、1×10³copies/μL、1×10²copies/μL、1×10¹copies/μL、1×10⁰copies/μL的带有SVCV、IHNV和CEV基因片段的质粒；阴性对照；阳性对照。

仪器：恒温扩增仪；掌上离心机；移液器。

4.2检测体系

参照上述的检测体系进行实验操作，然后把上好样的芯片放进恒温扩增仪进行试验检测，扩增结果可如图2检测限的结果看，SVCV(3A)、IHNV(3B)和CEV(3C)引物的最低检测限分别为1×10¹copies/μL、1×10²copies/μL、1×10¹copies/μL的质粒，此时的Ct小于30min，说明灵敏度很高。

5、重复性的验证

5.1实验材料

试剂：反应液；SVCV、IHNV和CEV引物1×10⁴copies/μL的质粒；阴性对照；阳性对照。

仪器：恒温扩增仪；掌上离心机；移液器。

5.2检测体系

参照上述检测体系进行实验操作，然后把芯片放进恒温扩增仪进行试验检测。

5.3扩增结果

图3是SVCV、IHNV和CEV重复性实验扩增结果图。下图是SVCV、IHNV和CEV的Ct值的变异系数(CV，％)。

经计算，引物SVCV的Ct值的变异系数(CV，％)为3.2％，重复性好，小于5％，符合要求；引物IHNV的Ct值的变异系数(CV，％)为1.6％，重复性好，小于5％，符合要求。引物CEV的Ct值的变异系数(CV，％)为1.6％，重复性好，小于5％，符合要求。

6、特异性的验证

6.1实验材料

试剂：试剂：反应液；鲤春病毒血症病毒样本核酸、传染性造血器官坏死病毒样本核酸、鲤鱼浮肿病毒样本核酸；阴性对照。

仪器：恒温扩增仪；掌上离心机；移液器。

6.2检测体系

参照上述1中的检测体系进行实验操作，然后把芯片放进恒温扩增仪进行试验检测。

6.3扩增结果

SVCV、IHNV和CEV特异性实验扩增结果可参考图4，从SVCV的扩增结果可知，除鲤春病毒血症病毒样本核酸扩增结果为阳性，传染性造血器官坏死病毒样本核酸、鲤鱼浮肿病毒样本核酸和阴性对照均无扩增曲线，说明SVCV引物只能特异性地扩增检测出鲤春病毒血症病毒样本核酸，特异性好，一般不会与传染性造血器官坏死病毒样本核酸、鲤鱼浮肿病毒产生交叉反应。从IHNV的扩增结果可知，除传染性造血器官坏死病毒样本核酸扩增结果为阳性，鲤春病毒血症病毒样本核酸、鲤鱼浮肿病毒样本核酸和阴性对照均无扩增曲线，说明IHNV引物只能特异性地扩增出传染性造血器官坏死病毒样本核酸，特异性好，一般不会与鲤春病毒血症病毒、鲤鱼浮肿病毒产生交叉反应。从CEV的扩增结果可知，除鲤鱼浮肿病毒样本核酸扩增结果为阳性，鲤春病毒血症病毒样本核酸、传染性造血器官坏死病毒样本核酸和阴性对照均无扩增曲线，说明CEV引物只能特异性地扩增出鲤鱼浮肿病毒样本核酸，特异性好，一般不会与鲤春病毒血症病毒、传染性造血器官坏死病毒产生交叉反应。

以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。

Claims (3)

1.一种高效三联检测SVCV、IHNV和CEV的引物，其特征在于，具体为：

SVCV-F3：GGGAAAGATGGGAAGATCC ；

SVCV-B3：CCATTCTACCACTGCATCC ；

SVCV-FIP：CGGCTTGGAAAGCATGTTGAA-CCCTTGAATATGATAGAATCAGGA；

SVCV-BIP：TTATCCCTCATCCTCATTATGACGA-TTCCATTTTCTCCAGTATTATCGA ；

IHNV-F3：CTAATCTTCTAGATTGTTCTTCAAG ；

IHNV-B3：TCTAGTCTAATTTGATCTGGAGAA；

IHNV-FIP：AGCAAGAGCTGCTGCACTTT-TTCCTTGTTGGAGCTGGT ；

IHNV-BIP：TACCTAACTTTGTTTGGACAAGGT-GTATGCCTTAATTCCATACAGTT ；

CEV-F3：CTAATCTTCTAGATTGTTCTTCAAG ；

CEV-B3：TCTAGTCTAATTTGATCTGGAGAA ；

CEV-FIP：GCTGCACTTTTAGGAGGACAAGT-AAAATCAATTGCTTTCCTTGTTG ；

CEV-BIP：TACCTAACTTTGTTTGGACAAGGT-GTATGCCTTAATTCCATACAGTT 。

2. 一种高效三联检测SVCV、IHNV和CEV的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述引物以及反应液，所述反应液的组成为：

20 mM Tris-HCl 0.2 μL

40 mM KCl 6.8 μL

100 mM （NH₄）₂SO₄ 1.8 μL

80 mM MgSO₄ 1.8 μL

1% Tween-20 1.8 μL

28 mM dNTPs 0.9 μL

8000U/mL Bst酶 1.8 μL

10000U/mL Invitrogen SuperScript IV反转录酶 0.1 μL

10Mm Reverse Transcriptase Inhibitors 0.1 μL

1 mM SYBRGREEN荧光染料 0.9 μL

4.0×10^-6 mol/L 金纳米颗粒 1.8 μL。

3. 根据权利要求2所述的高效三联检测SVCV、IHNV和CEV的试剂盒，其特征在于，所述鲤春病毒血症病毒引物的浓度和体积为：90 μM的SVCV-F3引物0.5 μL、90 μM的SVCV-B3引物0.5 μL、180 μM的SVCV-FIP引物2 μL、180 μM的SVCV-BIP引物2 μL；所述传染性造血器官坏死病毒引物的浓度和体积为：90 μM的IHNV-F3引物0.5 μL、90 μM的IHNV-B3引物0.5 μL、180 μM的IHNV-FIP引物2 μL、180 μM的IHNV-BIP引物2 μL；所述鲤鱼浮肿病毒引物的浓度和体积为：90 μM的CEV-F3引物0.5 μL、90 μM的CEV-B3引物0.5 μL、180 μM的CEV-FIP引物2μL、180 μM的CEV-BIP引物2 μL。

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