CN112981006A

CN112981006A - 一种高效五联检测虾病的引物以及试剂盒

Info

Publication number: CN112981006A
Application number: CN202110081338.4A
Authority: CN
Inventors: 卢先东; 钱冬; 刘艳红; 马荣荣
Original assignee: Ningbo Aigene Technology Co ltd; Ningbo University
Current assignee: Ningbo Aigene Technology Co ltd; Ningbo University
Priority date: 2021-01-21
Filing date: 2021-01-21
Publication date: 2021-06-18

Abstract

本发明公开一种高效五联检测虾病的引物以及试剂盒，本发明以改良后的LAMP技术为基因扩增反应原理，在反应体系里加入金纳米颗粒，吸附ssDNA和蛋白酶，抑制升温过程中的非特异性反应，达到热启动的目的，避免在升温过程中的非特异性反应；结合改良后的LAMP技术与微流控芯片技术，即可以快速给出准确的检测结果，又达到同一样品多个不同指标联检的目的，同时，反应试剂预埋于微流控芯片上，实现一样五指标检测，用户只需加入样品，操作简便，仪器配备锂电池，便于现场快检。

Description

一种高效五联检测虾病的引物以及试剂盒

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种高效五联检测虾病(对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(感染型)、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(通用型)、黄头病毒、偷死野田村病毒、桃拉病毒)的引物以及试剂盒。

背景技术

传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectioushypodermal and haematopoieticnecrosis virus,IHHNV)，也称细角滨对虾浓核病毒、十足类浓核病毒，是已知对虾病毒中最小的病毒，病毒粒子大小为22nm，是无囊膜二十面体，线性单链 DNA，长度约为3.9kb，包含3个开放阅读框。IHHNV基因型分为感染型和非感染型两种，其中感染型包括1型和2型；非感染型包括3A和3B型。IHHNV 在世界范围内广泛流行，引起的疾病为传染性皮下及造血组织坏死病，给对虾养殖业造成巨大损失，被世界动物卫生组织(OIE)列为须向其申报的甲壳类重要疾病。

黄头病毒(Yellow head virus，YHV)，属于套式病毒目，杆套病毒科，头甲病毒属成员。黄头病毒是一种杆状病毒，病毒大小为(40～60)nm×(150～ 200)nm，有囊膜，上有囊膜粒突起。核衣壳呈螺旋对称。病毒粒子由3种结构蛋白构成，即核蛋白p24和囊膜蛋白gp64、gp116；病毒基因组为单股正链RNA，长约26000核苷酸。黄头病是由黄头病毒引起的对虾传染性疾病，急性感染在2 天～4天即出现停食等症状，死亡率高，濒死虾头胸部因肝胰腺发黄而变成黄色，因此称为黄头病。我国将其列为二类疫病，OIE将其列为必须申报的疫病。

偷死野田村病毒(Covert mortality nodavirus,CMNV)，属于野田村病毒科α野田村病毒属，是一种单链RNA病毒，病毒粒子为球形(二十面体)，无囊膜，蔗糖密度梯度离心纯化的病毒粒子直径约为32nm。CMNV主要感染养殖虾类。偷死野田村病毒是导致养殖对虾发生偷死病的病毒性病原，发病对虾主要在池底深水区陆续死亡，不容易被观察到，因此，被称为“偷死病”或“死底症”。患病个体表现出肝胰腺颜色变浅、萎缩，空肠空胃，生长缓慢等症状，很多时候还可见病虾腹节肌肉不透明或局部发白。患病对虾在水温较高(28℃以上)时，死亡率升高，累计死亡率可达80％。

桃拉病毒(Taura Syndrome Virus,TSV)是一种可引起凡纳对虾等多种虾类严重死亡的RNA病毒。该病毒首次发现于瓜亚基尔湾托拉河口附近的对虾养殖场，造成池塘养殖的南美白对虾幼虾60％-90％死亡的灾难性损失。桃拉综合症病毒是对虾危害最大、造成死亡率最高的病毒之一。2000年在广东首次发现 TSV，随后在福建、广东、海南等地都有大规模发病死亡的情况发生，造成了巨大经济损失。对虾桃拉综合症病毒被世界动物卫生组织OIE列为必须申报的疾病。

基因检测技术目前以PCR检测法为主。PCR技术较为经典，但其反应要在 2个不同的温度区循环，对仪器要求高，成本也相对高昂，同时，PCR技术仅仅 1对扩增引物，易受干扰，特异性相对不足，且出结果时间较久，操作专业要求高，微量加量步骤多。而LAMP技术共有4条不同的特异性引物，故而检测结果准确度更高，但是由于是恒温反应，缺少类似PCR的热启动酶，在设备升温阶段容易产生非特异性扩增从而影响检测结果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的缺陷提供一种高效五联检测虾病(对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(感染型)、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(通用型)、黄头病毒、偷死野田村病毒、桃拉病毒)的引物以及试剂盒。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种高效五联检测虾病的引物，具体为：

IHHNV-I-F3 TCATCAGAGAAAAACCACAACC；

IHHNV-I-B3 TAGTCGCTTCAGCTTCGG；

IHHNV-I-FIP TGTGCCAGTGGTCACCATGA-GAAGACTCTCCGGACGA AC；

IHHNV-I-BIP TCACATACTCCGGACACCCAAC-TGGCAGCAAAGGTAA CTCC；

IHHNV-U-F3 CAATATAAAGACAAACTCAGAGGAA；

IHHNV-U-B3 ACAAGAGTGTTTATTTTGTCCA；

IHHNV-U-FIP TTGTCGTAGTCTGGTTTTCTTTTGG-CAAGAAAAAGTC AAACCAAAGC；

IHHNV-U-BIP AATACATGTTAGCCAACAACGACA-GCTACGATGATTAT CCAAGC；

YHV-F3 GGAGATTCCATACGGGAGA；

YHV-B3 GTGAGTGTTTCTGACGAATT；

YHV-FIP TTGTGAGGGTGTAAGACGGG-GCTCCTAAGCGTTTCTTCA；

YHV-BIP ACATCTTAATCTATCTACACACGCC-CTGTCTAACAACGTAA CAGTT；

CMNV-F3 TGCGATCGAGTTGAAGGC；

CMNV-B3 CTTTATCGGCGGCATTTTGG；

CMNV-FIP CGCAGCTCCACCATACAATCGA-TGACAGATGCCCTTACAC CA；

CMNV-BIP AAGACTGAAGCGCAAAACCAGC-CCAGGAACCATCATTCG TCA；

TSV-F3 GCCAAAGATGGCATAGTGG；

TSV-B3 TCCTGTTCGTCATCACTTG；

TSV-FIP TACTTTCTCCAATGGGCGCC-TGTTAGTTTGGGTATTTTTGCG；

TSV-BIP CAGGCCAATAAGACACGTGTGT-CCAAGAAACTTAGGTAATATC TTCT。

一种高效五联检测虾病的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物以及反应液，所述反应液的组成为：

所述IHHNV-I即对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(感染型)引物的浓度和体积为：90μM的IHHNV-I-F3引物0.5μL、90μM的IHHNV-I-B3引物0.5 μL、180μM的IHHNV-I-FIP引物2μL、180μM的IHHNV-I-BIP引物2μL。

所述IHHNV-U即对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(通用型)引物的浓度和体积为：90μM的IHHNV-U-F3引物0.5μL、90μM的IHHNV-U-B3引物 0.5μL、180μM的IHHNV-U-FIP引物2μL、180μM的IHHNV-U-BIP引物2μL。

所述YHV即黄头病毒引物的浓度和体积为：90μM的YHV-F3引物0.5μL、 90μM的YHV-B3引物0.5μL、180μM的YHV-FIP引物2μL、180μM的YHV-BIP 引物2μL。

所述CMNV即偷死野田村病毒引物的浓度和体积为：90μM的CMNV-F3 引物0.5μL、90μM的CMNV-B3引物0.5μL、180μM的CMNV-FIP引物2μL、 180μM的CMNV-BIP引物2μL。

所述TSV即桃拉病毒引物的浓度和体积为：90μM的TSV-F3引物0.5μL、 90μM的TSV-B3引物0.5μL、180μM的TSV-FIP引物2μL、180μM的TSV-BIP 引物2μL。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明以改良后的LAMP技术为基因扩增反应原理，在反应体系里加入金纳米颗粒，吸附ssDNA和蛋白酶，抑制升温过程中的非特异性反应，达到热启动的目的，避免在升温过程中的非特异性反应；结合改良后的LAMP技术与微流控芯片技术，即可以快速给出准确的检测结果，又达到同一样品多个不同指标联检的目的，同时，反应试剂预埋于微流控芯片上，实现一样五指标检测，用户只需加入样品，操作简便，仪器配备锂电池，便于现场快检。

附图说明

图1是8样本芯片测试孔位图。

图2是IHHNV-I、IHHNV-U、YHV、CMNV、TSV引物敏感性扩增结果组图；组图中A、B、C、D、E图分别是IHHNV-I、IHHNV-U、YHV、CMNV、 TSV敏感性扩增结果。

图3是IHHNV-I、IHHNV-U、YHV、CMNV、TSV引物重复性扩增组图；组图中A、B、C、D、E图分别是IHHNV-I、IHHNV-U、YHV、CMNV、TSV 重复性扩增结果。

图4是IHHNV-I、IHHNV-U、YHV、CMNV、TSV引物特异性扩增组图；组图中A、B、C、D、E图分别是IHHNV-I、IHHNV-U、YHV、CMNV、TSV 引物特异性扩增图。

具体实施方式

实施例1

先通过NCBI GenBank寻找目标序列，并针对目标序列设计引物，并将其分别固定在微流控芯片相应位置后对微流控芯片进行封装，与从虾肉及肝胰腺、环境样本和细胞培养物中提取的核酸模板混合反应后，加入到封装好的微流控芯片中，之后放入到带有离心功能、恒温功能及实时荧光检测的微流控芯片检测仪中，上述仪器和芯片均为市售产品，宁波爱基因科技有限公司也有相应公开产品，利用离心力驱动样品进入微流控芯片反应孔，进行恒温扩增。若样本中含有目的片段而得到恒温扩增，扩增产物与荧光物质进行有效的结合，通过荧光检测仪实时捕获荧光信号，直观的反应扩增产物的产生，根据实时荧光信号的出现时间、强度和位置，判断样本中是否含有对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒。

具体的操作步骤如下：

1、微流控芯片检测体系中18μL反应液的组成如下：

所述对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(感染型)引物的浓度和体积为： 90μM的IHHNV-I-F3引物0.5μL、90μM的IHHNV-I-B3引物0.5μL、180μM 的IHHNV-I-FIP引物2μL、180μM的IHHNV-I-BIP引物2μL。

所述对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(通用型)引物的浓度和体积为：90μM的IHHNV-U-F3引物0.5μL、90μM的IHHNV-U-B3引物0.5μL、180μM 的IHHNV-U-FIP引物2μL、180μM的IHHNV-U-BIP引物2μL。

所述黄头病毒引物的浓度和体积为：90μM的YHV-F3引物0.5μL、90μM 的YHV-B3引物0.5μL、180μM的YHV-FIP引物2μL、180μM的YHV-BIP引物2μL。

所述偷死野田村病毒引物的浓度和体积为：90μM的CMNV-F3引物0.5μL、 90μM的CMNV-B3引物0.5μL、180μM的CMNV-FIP引物2μL、180μM的 CMNV-BIP引物2μL。

所述桃拉病毒引物的浓度和体积为：90μM的TSV-F3引物0.5μL、90μM 的TSV-B3引物0.5μL、180μM的TSV-FIP引物2μL、180μM的TSV-BIP引物2μL。

其中，该试剂盒选用8样本芯片，即2个加样孔对应8个检测孔，第1检测孔位包埋扩增IHHNV-I序列的引物，第2检测孔位包埋扩增IHHNV-U序列的引物，第3检测孔包埋扩增YHV序列的引物，第4检测孔包埋扩增CMNV序列的引物，第5检测孔包埋扩增TSV序列的引物，第6、7检测孔为空白，第8检测孔包埋内参引物和内参质粒，如图1，冻干。

所述对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(感染型)的核酸序列为 AF218266。所述对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(通用型)的核酸序列为 AF218266。所述黄头病毒的核酸序列为NC_043505。所述偷死野田村病毒的核酸序列为KM112247。所述对虾桃拉病毒的核酸序列为AY997025。

分别取6.4μL IHHNV-I模板核酸、6.4μL IHHNV-U模板核酸、6.4μL YHV 模板核酸、6.4μL CMNV模板核酸、6.4μL TSV模板核酸与18μL反应液混合，加入到芯片的两个加样孔，再将加样孔用封口膜封住，上机；

温度设定为63.5℃，反应时间设定为30min。

2、微流控芯片上机扩增：

由于本方法采用的是恒温扩增，不需要经过PCR扩增的变性、退火和延伸等变温过程，整个反应过程在恒温条件下完成，扩增程序：温度设定为63.5℃，反应时间设定为30min。运行程序：低速离心转速为1600r/min，低速离心时间为10sec，高速离心转速为4600r/min，高速离心时间为30sec。

3、微流控芯片结果判断：

3.1微流控芯片检测仪阈值线设置

阈值线一般情况设置为800(可根据实际情况进行调整，设定原则以阈值线刚好超过非典型S型扩增曲线的最高点，且Ct值显示为30)，仪器配套软件自动分析结果。

3.2质量控制

内参出现扩增曲线，且Ct值<30时，实验结果有效。

3.3结果判定

3.3.1实验成立条件

阳性对照：Ct<30，阳性对照的反应孔(1、2、3)和内标反应孔(4)有明显的典型S型扩增曲线。

阴性对照：Ct<30，阴性对照的反应孔(1、2、3)均无扩增曲线，内标反应孔(4)有明显的典型S型扩增曲线。

3.3.2判定标准

阳性：反应时间30分钟内，项目检测孔位出现明显扩增曲线，且Ct值<30，判定该孔对应的检测项目为阳性。

阴性：反应时间30分钟内，项目检测孔位未出现明显扩增曲线，判定该孔对应的检测项目为阴性。

在微流控芯片检测仪上进行微流控芯片的恒温扩增，仪器会进行实时荧光检测，根据荧光检测的有效扩增曲线进行判读，任意一检测孔中有标准的S型的扩增曲线，则该孔判断为阳性，即该样本中含有对应检测孔的病毒核酸；没有扩增曲线的检测孔判断为阴性，即该样本不含有对应检测孔的病毒核酸。

4、敏感性及检测限的验证

4.1实验材料

试剂：反应液；1×10⁵copies/μL、1×10⁴copies/μL、1×10³copies/μL、1×10²copies/μL、 1×10¹copies/μL、1×10⁰copies/μL的带有IHHNV-I、IHHNV-U、YHV、CMNV、TSV基因片段的质粒；阴性对照；阳性对照。

仪器：恒温扩增仪；掌上离心机；移液器。

4.2检测体系

参照上述的检测体系进行实验操作，然后把上好样的芯片放进恒温扩增仪进行试验检测，扩增结果可如图2检测限的结果看，IHHNV-I(2A)、IHHNV-U (2B)、YHV(2C)、CMNV(2D)、TSV(2E)引物的最低检测限为1×10² copies/μL的质粒，此时的Ct小于30min，说明灵敏度很高。

5、重复性的验证

5.1实验材料试剂：反应液；、IHHNV-I、IHHNV-U、YHV、CMNV、TSV引物1×10⁴copies/μL 的质粒；阴性对照；阳性对照。

仪器：恒温扩增仪；掌上离心机；移液器。

5.2检测体系

参照上述检测体系进行实验操作，然后把芯片放进恒温扩增仪进行试验检测。

5.3扩增结果

图3是IHHNV-I(3A)、IHHNV-U(3B)、YHV(3C)、CMNV(3D)、TSV (3E)引物重复性实验扩增结果图。下表是引物IHHNV-I、IHHNV-U、YHV、 CMNV、TSV的Ct值的变异系数(CV，％)。

经计算，引物IHHNV-I的Ct值的变异系数(CV，％)为2.1％，重复性好，小于5％，符合要求；

引物IHHNV-U的Ct值的变异系数(CV，％)为1.8％，重复性好，小于5％，符合要求；

引物YHV的Ct值的变异系数(CV，％)为2.3％，重复性好，小于5％，符合要求；

引物CMNV的Ct值的变异系数(CV，％)为4.1％，重复性好，小于5％，符合要求；

引物TSV的Ct值的变异系数(CV，％)为0.2％，重复性好，小于5％，符合要求；

6、特异性的验证

6.1实验材料

试剂：反应液；对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒样本核酸、黄头病毒样本核酸、偷死野田村病毒样本核酸、桃拉病毒样本核酸、虾肠胞虫样本核酸、虾急性肝胰腺坏死病毒样本核酸、对虾白斑综合症病毒样本核酸、虾虹彩病毒样本核酸；阴性对照。

仪器：恒温扩增仪；掌上离心机；移液器。

6.2检测体系

参照上述1中的检测体系进行实验操作，然后把芯片放进恒温扩增仪进行试验检测。

6.3扩增结果

IHHNV-I、IHHNV-U、YHV、CMNV、TSV引物特异性实验扩增结果可参考图4，从扩增结果可知，除对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒样本核酸扩增结果为阳性，黄头病毒样本核酸、偷死野田村病毒样本核酸、桃拉病毒样本核酸、虾肠胞虫样本核酸、虾急性肝胰腺坏死病毒样本核酸、对虾白斑综合症病毒样本核酸、虾虹彩病毒样本核酸和阴性对照均无扩增曲线，说明IHHNV-I、IHHNV-U 引物只能特异性地扩增检测出对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒样本核酸，特异性好，一般不会与虾肠胞虫、虾急性肝胰腺坏死病毒、对虾白斑综合症病毒、虾虹彩病毒产生交叉反应。

除黄头病毒样本核酸扩增结果为阳性，对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒样本核酸、偷死野田村病毒样本核酸、桃拉病毒样本核酸、虾肠胞虫样本核酸、虾急性肝胰腺坏死病毒样本核酸、对虾白斑综合症病毒样本核酸、虾虹彩病毒样本核酸和阴性对照均无扩增曲线，说明YHV引物只能特异性地扩增检测出黄头病毒样本核酸，特异性好，一般不会与对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒样本核酸、偷死野田村病毒样本核酸、桃拉病毒样本核酸、虾肠胞虫样本核酸、虾急性肝胰腺坏死病毒样本核酸、对虾白斑综合症病毒样本核酸、虾虹彩病毒产生交叉反应。

除偷死野田村病毒样本核酸扩增结果为阳性，对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒样本核酸、黄头病毒样本核酸、桃拉病毒样本核酸、虾肠胞虫样本核酸、虾急性肝胰腺坏死病毒样本核酸、对虾白斑综合症病毒样本核酸、虾虹彩病毒样本核酸和阴性对照均无扩增曲线，说明CMNV引物只能特异性地扩增检测出偷死野田村病毒样本核酸，特异性好，一般不会与对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒样本核酸、黄头样本核酸、桃拉病毒样本核酸、虾肠胞虫样本核酸、虾急性肝胰腺坏死病毒样本核酸、对虾白斑综合症病毒样本核酸、虾虹彩病毒产生交叉反应。

除桃拉病毒样本核酸扩增结果为阳性，对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒样本核酸、黄头病毒样本核酸、偷死野田村病毒样本核酸、虾肠胞虫样本核酸、虾急性肝胰腺坏死病毒样本核酸、对虾白斑综合症病毒样本核酸、虾虹彩病毒样本核酸和阴性对照均无扩增曲线，说明TSV引物只能特异性地扩增检测出桃拉病毒样本核酸，特异性好，一般不会与对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒样本核酸、黄头样本核酸、偷死野田村病毒样本核酸、虾肠胞虫样本核酸、虾急性肝胰腺坏死病毒样本核酸、对虾白斑综合症病毒样本核酸、虾虹彩病毒产生交叉反应。

以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。

Claims

1.一种高效五联检测虾病的引物，其特征在于，具体为：

IHHNV-I-F3 TCATCAGAGAAAAACCACAACC；

IHHNV-I-B3 TAGTCGCTTCAGCTTCGG；

IHHNV-I-FIP TGTGCCAGTGGTCACCATGA-GAAGACTCTCCGGACGAAC；

IHHNV-I-BIP TCACATACTCCGGACACCCAAC-TGGCAGCAAAGGTAACTCC；

IHHNV-U-F3 CAATATAAAGACAAACTCAGAGGAA；

IHHNV-U-B3 ACAAGAGTGTTTATTTTGTCCA；

IHHNV-U-FIP TTGTCGTAGTCTGGTTTTCTTTTGG-CAAGAAAAAGTCAAACCAAAGC；

IHHNV-U-BIP AATACATGTTAGCCAACAACGACA-GCTACGATGATTATCCAAGC；

YHV-F3 GGAGATTCCATACGGGAGA；

YHV-B3 GTGAGTGTTTCTGACGAATT；

YHV-FIP TTGTGAGGGTGTAAGACGGG-GCTCCTAAGCGTTTCTTCA；

YHV-BIP ACATCTTAATCTATCTACACACGCC-CTGTCTAACAACGTAACAGTT；

CMNV-F3 TGCGATCGAGTTGAAGGC；

CMNV-B3 CTTTATCGGCGGCATTTTGG；

CMNV-FIP CGCAGCTCCACCATACAATCGA-TGACAGATGCCCTTACACCA；

CMNV-BIP AAGACTGAAGCGCAAAACCAGC-CCAGGAACCATCATTCGTCA；

TSV-F3 GCCAAAGATGGCATAGTGG；

TSV-B3 TCCTGTTCGTCATCACTTG；

TSV-FIP TACTTTCTCCAATGGGCGCC-TGTTAGTTTGGGTATTTTTGCG；

TSV-BIP CAGGCCAATAAGACACGTGTGT-CCAAGAAACTTAGGTAATATCTTCT。

2.一种高效五联检测虾病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物以及反应液，所述反应液的组成为：

20 mM Tris-HCl 0.2 μL；

40 mM KCl 6.8 μL；

100 mM （NH₄）₂SO₄ 1.8 μL；

80 mM MgSO₄ 1.8 μL；

1% Tween-20 1.8 μL；

28 mM dNTPs 0.9 μL；

8000U/mL Bst酶 1.8 μL；

1 mM SYBRGREEN荧光染料 0.9 μL；

4.0×10^-6mol/L 金纳米颗粒 1.8 μL；

ddH₂O 0.2 μL。

3.根据权利要求2所述的高效五联检测虾病的试剂盒，其特征在于，所述IHHNV-I引物的浓度和体积为：90 μM的IHHNV-I-F3引物0.5 μL、90 μM的IHHNV-I-B3引物0.5 μL、180 μM的IHHNV-I-FIP引物2 μL、180 μM的IHHNV-I-BIP引物2 μL。

4.根据权利要求2所述的高效五联检测虾病的试剂盒，其特征在于，所述IHHNV-U引物的浓度和体积为：90 μM的IHHNV-U-F3引物0.5 μL、90 μM的IHHNV-U-B3引物0.5 μL、180 μM的IHHNV-U-FIP引物2 μL、180 μM的IHHNV-U-BIP引物2 μL。

5.根据权利要求2所述的高效五联检测虾病的试剂盒，其特征在于，所述YHV引物的浓度和体积为：90 μM的YHV-F3引物0.5 μL、90 μM的YHV-B3引物0.5 μL、180 μM的YHV-FIP引物2 μL、180 μM的YHV-BIP引物2 μL。

6.根据权利要求2所述的高效五联检测虾病的试剂盒，其特征在于，所述CMNV引物的浓度和体积为：90 μM的CMNV-F3引物0.5 μL、90 μM的CMNV-B3引物0.5 μL、180 μM的CMNV-FIP引物2 μL、180 μM的CMNV-BIP引物2 μL。

7.根据权利要求2所述的高效五联检测虾病的试剂盒，其特征在于，所述TSV引物的浓度和体积为：90 μM的TSV -F3引物0.5 μL、90 μM的TSV -B3引物0.5 μL、180 μM的TSV -FIP引物2 μL、180 μM的TSV -BIP引物2 μL。