CN111996293A - 一种高效检测猪流行性乙型脑炎病毒的引物以及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种高效检测猪流行性乙型脑炎病毒的引物及试剂盒，发明以改良后的LAMP技术为基因扩增反应原理，在反应体系里加入金纳米颗粒，吸附ssDNA和蛋白酶，抑制升温过程中的非特异性反应，达到热启动的目的，避免在升温过程中的非特异性反应；结合改良后的LAMP技术与微流控芯片技术，即可以快速给出准确的检测结果，又达到同一样品多个不同指标联检的目的，同时，反应试剂预埋于微流控芯片上，用户只需加入样品，操作简便。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种高效检测猪流行性乙型脑炎病毒的引物以及试剂盒。
背景技术
猪流行性乙型脑炎是由乙型脑炎病毒引起。主要以母猪流产、死胎和公猪睾丸炎为特征。流行性乙型脑炎病毒又称日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)，简称乙脑病毒，所引起的疾病简称乙脑，乙脑是一种人畜共患的病毒性传染病，可以感染人类和多种动物，可以导致人的中枢神经系统疾病和猪的繁殖障碍，严重危害着人类的健康和畜牧业的发展。目前的诊断方法有：免疫细胞化学法和RT-PCR技术。采用现有的PCR技术，由于其反应要在2个不同的温度区循环，对仪器要求高，成本也相对高昂，并且PCR技术仅仅1对扩增引物，易受干扰，特异性相对不足，且出结果时间较久，操作专业要求高，微量加量步骤多。而LAMP技术共有4条不同的特异性引物，故而检测结果准确度更高，但是由于是恒温反应，缺少类似PCR的热启动酶，在设备升温阶段容易产生非特异性扩增从而影响检测结果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的缺陷提供一种高效检测猪流行性乙型脑炎病毒的引物及试剂盒。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种高效检测猪流行性乙型脑炎病毒的引物，具体为：
NS5-F3：ATGAGCTTGTTGGACGGC；
NS5-B3：TTTCTGCCCCGCTTGTTC；
NS5-FIP：
CTTGGTCGGGGCTAATGCTGTA-GAGGGCCAGTACGTTTYGTG；
NS5-BIP：
AGCRGTGGAAAAGAGTGTRGCA-ACGGCRTCAATGAGTGTTCC。
本发明提供一种高效检测猪流行性乙型脑炎病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物以及反应液，所述反应液的组成为：
20 mM Tris-HCl 0.2 μL；
40 mM KCl 6.8 μL；
100 mM （NH4）2SO4 1.8 μL；
80 mM MgSO4 1.8 μL；
1 % Tween-20 1.8 μL；
28 mM dNTPs 0.9 μL；
8000 U/mL Bst酶 1.8 μL；
10000 U/mL Invitrogen SuperScript IV反转录酶 0.1 μL；
10 Mm Reverse Transcriptase Inhibitors 0.1 μL；
1 mM SYBRGREEN荧光染料 0.9 μL；
4.0×10-6 mol/L 金纳米颗粒 1.8 μL。
所述引物的浓度和体积为：90 μM的NS5-F3引物0.5 μL、90 μM的NS5 -B3引物0.5μL、180 μM的NS5 -FIP引物2 μL、180 μM的NS5 -BIP引物2 μL。其中，该试剂盒选用8样本芯片，即1个加样孔对应4个检测孔，第1检测孔和第2检测孔各包埋扩增JEV序列的引物，第3检测孔是空白，第4检测孔包埋内参引物和内参质粒，冻干。
所述猪流行性乙型脑炎病毒的核酸序列为AB569982。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明以改良后的LAMP技术为基因扩增反应原理，在反应体系里加入金纳米颗粒，吸附ssDNA和蛋白酶，抑制升温过程中的非特异性反应，达到热启动的目的，避免在升温过程中的非特异性反应；结合改良后的LAMP技术与微流控芯片技术，即可以快速、准确的给出检测结果，同时，反应试剂预埋于微流控芯片上，用户操作简便。
附图说明
图1是JEV引物敏感性扩增结果图。
图2是JEV特异性扩增结果图。
具体实施方式
实施例1
先通过NCBI GenBank寻找目标序列，并针对目标序列设计引物，并将其分别固定在微流控芯片相应位置后对微流控芯片进行封装，与从猪肉及其各种脏器、血液、排泄物、环境样本和细胞培养物中提取的核酸模板混合反应后，加入到封装好的微流控芯片中，之后放入到带有离心功能、恒温功能及实时荧光检测的微流控芯片检测仪中，上述仪器和芯片均为市售产品，宁波爱基因科技有限公司也有相应公开产品，利用离心力驱动样品进入微流控芯片反应孔，进行恒温扩增。若样本中含有目的片段而得到恒温扩增，扩增产物与荧光物质进行有效的结合，通过荧光检测仪实时捕获荧光信号，直观的反应扩增产物的产生，根据实时荧光信号的出现时间、强度和位置，判断样本中是否含有猪流行性乙型脑炎病毒。
具体的操作步骤如下：
1、微流控芯片检测体系中18 μL反应液的组成如下：
20 mM Tris-HCl 0.2 μL；
40 mM KCl 6.8 μL；
100 mM （NH4）2SO4 1.8 μL；
80 mM MgSO4 1.8 μL；
1 % Tween-20 1.8 μL；
28 mM dNTPs 0.9 μL；
8000 U/mL Bst酶 1.8 μL；
10000 U/mL Invitrogen SuperScript IV反转录酶 0.1 μL；
10 Mm Reverse Transcriptase Inhibitors 0.1 μL；
1 mM SYBRGREEN荧光染料 0.9 μL；
4.0×10-6 mol/L 金纳米颗粒 1.8 μL；
所述引物的浓度和体积为：90 μM的NS5 -F3引物0.5 μL、90 μM的NS5 -B3引物0.5 μL、180 μM的NS5 -FIP引物2 μL、180 μM的NS5 -BIP引物2 μL。其中，该试剂盒选用8样本芯片，即1个加样孔对应4个检测孔，第1检测孔和第2检测孔各包埋扩增JEV序列的引物，第3检测孔是空白，第4检测孔包埋内参引物和内参质粒如图1，冻干。
所述猪流行性乙型脑炎病毒的核酸序列为AB569982。
并取32 μL的JEV的核酸，该核酸的序列参考AB569982；
然后将反应液18 μL与模板核酸32 μL混合，加入到芯片的加样孔，再将加样孔用封口膜封住，上机；
温度设定为63.5℃，反应时间设定为30 min。
2、微流控芯片上机扩增：
由于本方法采用的是恒温扩增，不需要经过PCR扩增的变性、退火和延伸等变温过程，整个反应过程在恒温条件下完成，扩增程序：温度设定为63.5℃，反应时间设定为30 min。运行程序：低速离心转速为1600 r/min，低速离心时间为10 sec，高速离心转速为4600 r/min，高速离心时间为30 sec。
3、微流控芯片结果判断：
3.1微流控芯片检测仪阈值线设置
阈值线一般情况设置为800(可根据实际情况进行调整，设定原则以阈值线刚好超过非典型S型扩增曲线的最高点，且Ct值显示为30)，仪器配套软件自动分析结果。
3.2质量控制
阳性对照：Ct<30，阳性对照的反应孔有明显的典型S型扩增曲线。
阴性对照：Ct<30，阴性对照的反应孔无扩增曲线。
3.3结果判定
3.3.1实验成立条件
阳性对照：Ct 值≤30，对应检测孔有明显的典型S型扩增曲线。
阴性对照：Ct 值＞30 或Ct值为0，对应检测孔无明显的典型S型扩增曲线。
3.3.2判定标准
阳性：反应孔出现Ct<30，有明显扩增曲线，判定为阳性。
阴性：反应孔出现Ct<30，无扩增曲线，判定为阴性。
在微流控芯片检测仪上进行微流控芯片的恒温扩增，仪器会进行实时荧光检测，根据荧光检测的有效扩增曲线进行判读，任意一孔或者多孔中有标准的S型的扩增曲线，则该孔判断为阳性，即该样本中含有对应检测孔的病毒核酸；没有扩增曲线的孔为判断为阴性，即该样本不含有对应检测孔的病毒核酸。
4、敏感性及检测限的验证
4.1 实验材料
试剂：反应液；1×106 copies/µL、1×105 copies/µL、1×104 copies/µL、1×103copies/µL、1×102 copies/µL、1×101 copies/µL、1×100 copies/µL的带有JEV基因片段的质粒；阴性对照；阳性对照。
仪器：恒温扩增仪；掌上离心机；移液器。
4.2 检测体系
参照上述的检测体系进行实验操作，然后把上好样的芯片放进恒温扩增仪进行试验检测，扩增结果可如图1检测限的结果看，最低检测限是1×101 copies/µL的质粒，此时的Ct小于30 min，说明灵敏度很高。
5、重复性的验证
5.1 实验材料
试剂：反应液；1×104 copies/µL的质粒；阴性对照；阳性对照。
仪器：恒温扩增仪；掌上离心机；移液器。
5.2 检测体系
参照上述检测体系进行实验操作，然后把芯片放进恒温扩增仪进行试验检测。
5.3 扩增结果
经计算，Ct值的变异系数（CV，%）为1.5%，重复性好，小于5%，符合要求。
6、特异性的验证
6.1 实验材料
试剂：试剂：反应液；猪瘟活疫苗核酸；猪繁殖与呼吸综合征活疫苗核酸；猪伪狂犬病活疫苗核酸；猪圆环病毒2型培养液核酸；猪细小病毒细胞培养液核酸；阴性对照；阳性对照。
仪器：恒温扩增仪；掌上离心机；移液器。
6.2 检测体系
参照上述1中的检测体系进行实验操作，然后把芯片放进恒温扩增仪进行试验检测。
6.3 扩增结果
扩增结果可参考图2，从图2的结果可知，试剂：反应液；猪瘟活疫苗核酸；猪繁殖与呼吸综合征活疫苗核酸；猪伪狂犬病活疫苗核酸；猪圆环病毒2型培养液核酸；猪细小病毒细胞培养液核酸和阴性对照均无扩增曲线，说明该引物只能特异性地扩增检测出猪流行性乙型脑炎，特异性好，一般不会与其它病原菌产生交叉反应。
以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。
Claims (3)
1.一种高效检测猪流行性乙型脑炎病毒的引物，其特征在于，具体为：
NS5-F3：ATGAGCTTGTTGGACGGC；
NS5-B3：TTTCTGCCCCGCTTGTTC；
NS5-FIP：
CTTGGTCGGGGCTAATGCTGTA-GAGGGCCAGTACGTTTYGTG；
NS5-BIP：
AGCRGTGGAAAAGAGTGTRGCA-ACGGCRTCAATGAGTGTTCC。
2.一种高效检测猪流行性乙型脑炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述引物以及反应液，所述反应液的组成为：
20 mM Tris-HCl 0.2 μL；
40 mM KCl 6.8 μL；
100 mM （NH4）2SO4 1.8 μL；
80 mM MgSO4 1.8 μL；
1 % Tween-20 1.8 μL；
28 mM dNTPs 0.9 μL；
8000 U/mL Bst酶 1.8 μL；
10000 U/mL Invitrogen SuperScript IV反转录酶 0.1 μL；
10 Mm Reverse Transcriptase Inhibitors 0.1 μL；
1 mM SYBRGREEN荧光染料 0.9 μL；
4.0×10-6 mol/L 金纳米颗粒 1.8 μL。
3. 根据权利要求2所述的高效检测猪流行性乙型脑炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度和体积为：90 μM的NS5 -F3引物0.5 μL、90 μM的NS5-B3引物0.5 μL、180 μM的NS5 -FIP引物2 μL、180 μM的NS5 -BIP引物2 μL。
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