CN116287465A - 石斑鱼虹彩病毒实时定量pcr检测引物及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测引物及检测试剂盒，属于石斑鱼虹彩病毒检测技术领域。本发明解决的技术问题是提供石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测引物和检测试剂盒。该PCR检测引物的核苷酸序列为：正向引物075R 241‑F的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，反向引物075R 241‑R的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。本发明基于对不同种类石斑鱼中SGIV的检测，筛选出适用于不同种类石斑鱼的最佳特异性引物，该引物具有更良好的特异性，可以避免检测SGIV过程中不同种类石斑鱼和其他病原的交叉反应的可能，提高SGIV实时定量PCR检测的准确性和高效性。
Description
技术领域
本发明涉及石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测引物及检测试剂盒，属于石斑鱼虹彩病毒检测技术领域。
背景技术
虹彩病毒(Iridovirus)是公认的高致病性、高传染性的病毒病原，在石斑鱼、鳜鱼、真鲷、鲈鱼、虹鳟、大黄鱼、大菱鲆等多种淡水和海水养殖鱼类中均有报道，致死率高，造成了严重的经济损失。石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)最初是从新加坡养殖的患病石斑鱼中分离和鉴定的高致病性虹彩病毒，属于虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Iridovirus)。目前对SGIV尚无较好的治疗手段，主要以预防为主，需及早检测发现。所以，建立快速、准确和高效的石斑鱼虹彩病毒检测方法至关重要。
目前，对于SGIV的检测方法主要有组织病理学观察、PCR检测法、LAMP检测法、光学显微镜观察、免疫学检测法和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。但由于组织病理学观察需要在鱼发病过程中进行，需临床症状明显，且人为判断误差较大；常规PCR是病原检测中常用并且操作简单的方法，但是其灵敏度有限，且不能定量检测病毒；免疫学检测操作繁琐、周期长；光学显微镜观察耗时长，准确度小；LAMP检测法具有简便、快速和敏感性高等特点，但是操作过程中容易形成气溶胶污染，国内大多数普通实验室不能严格分区，假阳性问题严重，并且引物设计要求高，难以实现绝对定量。
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)技术因其具有快速、灵敏、准确和能够实现定量的特点，在人类、畜禽和水生动物传染病的检测上得到了广泛的应用。赵玉然等发表在《渔业科学进展》2011年第2期111-116页上的文献《真鲷虹彩病毒实时定量PCR检测方法的建立与应用》一文公开了以真鲷虹彩病毒主要衣壳蛋白的保守片段为靶序列，建立了一种针对真鲷虹彩病毒的实时定量PCR检测方法，但未应用于石斑鱼虹彩病毒的检测。
发表在《应用微生物学杂志》的文献《环介导等温扩增快速灵敏检测新加坡石斑鱼虹彩病毒》(Mao XL,Zhou S,Xu D,et al.Rapid and sensitive detection of Singaporegrouper iridovirus by loop-mediated isothermal amplification.J ApplMicrobiol.2008,105(2):389-97)公开了一种石斑鱼虹彩病毒PCR检测论文中设计的引物序列，但我们研究发现，该引物是针对巨石斑鱼(又名褐点石斑鱼E.tauvina)中SGIV检测的常规PCR引物，在东星斑、斜带石斑鱼和棕点石斑鱼样品的PCR和qPCR检测均会中出现不同程度的非特异性扩增。
申请号为200510042129.X的中国发明专利公开了一种用于鱼类虹彩病毒荧光定量PCR检测方法，设计合成了检测的特异性引物和探针，建立了实时定量PCR方法，但探针检测成本较高，且该特异性引物在不同种类石斑鱼SGIV检测中会出现非特异性扩增的问题。
发明内容
针对以上缺陷，本发明解决的技术问题是提供石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测引物和检测试剂盒。
本发明石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测引物，其核苷酸序列为：
正向引物075R 241-F的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，反向引物075R 241-R的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。
本发明基于对不同种类石斑鱼中SGIV的检测，筛选出适用于不同种类石斑鱼的最佳特异性引物，以解决同一引物应用于不同石斑鱼样品时发生非特异性扩增的问题，提高SGIV实时定量PCR检测的准确性和高效性。
本发明还提供本发明所述石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测引物在制备石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测试剂盒中的应用。
本发明还提供一种石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测试剂盒。
本发明石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测试剂盒，包含上述的石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测引物。
在本发明一个实施方式中，所述试剂盒还包含用于qPCR反应的试剂。
本领域常用的qPCR反应的试剂均适用于本发明，包括但不限于市售的SYBR GreenMaster等。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明筛选获得了一对检测石斑鱼虹彩病毒的特异性PCR引物(075R-241)，该引物具有更良好的特异性，可以避免检测SGIV过程中不同种类石斑鱼和其他病原的交叉反应的可能。本发明还利用该对引物构建质粒标准品和并进行了定量检测标准曲线的绘制，建立了SGIV的绝对定量检测。模板应在酶、无菌水、引物之后加入，并且实验于两处独立的空间进行，以减少气溶胶污染而产生假阳性影响结果判断。质粒标准品现配现用，避免反复冻融，减少因模板部分降解而影响标准曲线的线性关系。
附图说明
图1为实施例1中qPCR扩增曲线和熔解曲线。
图2为实施例1中10种常见石斑鱼DNA样品的常规PCR扩增凝胶电泳图。
图3为实施例1中10种常见石斑鱼实时定量PCR扩增曲线。
图4为实施例2中梯度稀释的SGIV重组质粒的定量PCR反应扩增曲线。
图5为实施例2中梯度稀释的SGIV重组质粒的定量PCR反应熔解曲线。
图6为实施例2中实时定量PCR检测SGIV重组质粒的标准曲线。
图7为实施例2中实时定量PCR梯度稀释扩增曲线。
图8为实施例2中常规PCR梯度稀释凝胶电泳图。
图9为实施例3中实时定量PCR检测SGIV的特异性试验扩增曲线。
图10为实施例4中石斑鱼样品SGIV检测结果。
具体实施方式
本发明石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测引物，其核苷酸序列为：
正向引物075R 241-F的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，反向引物075R 241-R的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。
本发明基于对不同种类石斑鱼中SGIV的检测，筛选出适用于不同种类石斑鱼的最佳特异性引物，以解决同一引物应用于不同石斑鱼样品时发生非特异性扩增的问题，提高SGIV实时定量PCR检测的准确性和高效性。
本发明所述石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测引物，可应用在制备石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测试剂盒中。
本发明石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测试剂盒，包含上述的石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测引物。
在本发明一个实施方式中，所述试剂盒还包含用于qPCR反应的试剂。
本领域常用的qPCR反应的试剂均适用于本发明，包括但不限于市售的SYBR GreenMaster等。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1特异性引物的筛选及通用性验证
1.实时定量PCR引物设计
登录NCBI核酸数据库，下载石斑鱼虹彩病毒主要支架蛋白ORF-075R cDNA作为靶序列，利用Primer 6.0软件设计合成引物，同时合成Mao等文章中针对巨石斑虹彩病毒检测设计的引物和陈等人专利设计的用于鱼类虹彩病毒检测的特异性引物。
表1：引物信息
其中，对比例1的P1/P2为专利CN200510042129中的特异性引物；对比例2的014L-F/R为文献《环介导等温扩增快速灵敏检测新加坡石斑鱼虹彩病毒》一文中的石斑鱼虹彩病毒PCR检测论文中设计的引物序列。
2.特异性引物的筛选
2.1引物筛选
将实验室保存的三种SGIV阳性样品验证表1引物。SGIV阳性样品与表1中引物进行qPCR。qPCR反应体系如表2，反应程序为：95℃2min，95℃10s，60℃10s，重复40个循环，接着95℃15s，60℃1min。比较三对引物的反应结果，对其中特异性强的引物进行常规PCR检测，反应体系如表2；反应程为：94℃5min，94℃1min，60℃40s，72℃30s，72℃5min，重复30个循环，琼脂糖凝胶电泳结合凝胶成像系统检测所得到的PCR产物，并送华大生物公司测序，确认其扩增产物为该特异性引物的目的序列。
表2 qPCR反应体系和常规PCR反应体系
2.2引物特异性和通用性的验证
①10种常见养殖石斑鱼的DNA提取
分别取10种常见养殖石斑鱼，分别为：斜带石斑鱼(E.coioides)、点带石斑鱼(E.malabaricus)、赤点石斑鱼(E.akaara)、青石斑鱼(E.awoara)、褐石斑鱼(E.bruneus)、鞍带石斑鱼(E.lanceolatus)、驼背鲈(Chromileptes altivelis)、豹纹鳃棘鲈(Plectropomus leopardus)、褐点石斑鱼(E.tauvina)和棕点石斑鱼(E.fuscoguttatus)。肝脏组织样品约30mg，加入液氮研磨，根据Omega基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取。
②引物特异性和通用性验证
将筛选的特异性引物与提取的10种常见养殖石斑鱼的DNA同时进行常规PCR和qPCR反应，反应体系和程序参照2.1。
2.3结果
qPCR扩增曲线和熔解曲线如图1所示(图1：ABC分别为引物075R 241-F/R、014L-F/R、P1/P2的扩增曲线，abc为它们对应的熔解曲线；1：斜带石斑鱼，2：棕点石斑鱼，3：豹纹鳃棘鲈，N：阴性对照)，引物075R 241-F/R均能扩增石斑鱼SGIV阳性模板，扩增曲线呈“S”型，阴性对照无扩增；熔解曲线为单一峰，说明无非特异性扩增；引物014L-F/R和棕点石斑鱼SGIV阳性样品qPCR反应扩增曲线不呈“S”型且熔解曲线Tm值不单一；引物P1/P2与阳性样品反应扩增曲线均不呈“S”型且有非特异性峰，说明该引物不能有效扩增以上三种石斑鱼虹彩病毒阳性样品，同时容易产生引物二聚体影响结果判断。综上，初步确定075R241-F/R为最佳引物。常规PCR反应产物纯化测序结果经BLAST比对后确定为SGIV ORF-075R部分序列。
10种常见石斑鱼DNA样品的常规PCR扩增凝胶电泳结果如图2所示(M：Maker，1：点带石斑鱼、2：赤点石斑鱼、3：青石斑鱼、4：褐石斑鱼、5：鞍带石斑鱼、6：驼背鲈、7：斜带石斑鱼、8：豹纹鳃棘鲈、9：褐点斑鱼、10：棕点石斑鱼；N：阴性对照)，阳性模板电泳条带单一，无非特异性扩增；阴性对照无扩增条带。qPCR扩增曲线如图3所示(1：点带石斑鱼、2：赤点石斑鱼、3：青石斑鱼、4：褐石斑鱼、5：鞍带石斑鱼、6：驼背鲈、7：斜带石斑鱼、8：豹纹鳃棘鲈、9：褐点斑鱼、10：棕点石斑鱼；N：阴性对照)，斜带石斑鱼和棕点石斑鱼为阳性扩增，呈“S”型扩增曲线，其他石斑鱼样品未见非特异性扩增，表明引物075R 241-F/R能特异性检测SGIV并对不同种类石斑鱼具有通用性。
实施例2标准曲线绘制及其与常规PCR检测灵敏度的比较
1.阳性质控品的制备
引物075R 241-F/R与SGIV阳性样品进行常规PCR扩增，反应体系如表2。反应程为：94℃5min，94℃1min，60℃40s，72℃30s，72℃5min，重复30个循环，扩增产物纯化回收并测序鉴定，将纯化的产物连接到PEASY-T1Sample载体，构建重组质粒PEASY-SGIV-075R。重组质粒转化入感受态细胞(大肠杆菌DH5α)，并涂布于含有氨苄青霉素的LB平板，37℃恒温培养箱培养至长出菌落。挑取菌落稀释于无菌水中，使用载体引物及菌落PCR筛选阳性克隆。将阳性克隆子接种于LB液体培养基中培养过夜，取部分送华大生物公司测序，一部分按照质粒DNA提取试剂盒说明书提取质粒DNA，经超微量分光光度计检测质粒DNA浓度为275.35ng/μL，根据阿伏伽德罗常数换算出每1μL质粒的拷贝数为6.0×1010copies/μL，保存于-20℃备用。
2.荧光定量PCR扩增及标准曲线的绘制
将6.0×1010copies/μL的质粒标准品进行10倍浓度梯度稀释，取稀释浓度为6.0×107～6.0×100copies/μL的质粒标准品为模板进行qPCR反应，反应体系和反应程序如前述2.1，每个稀释度重复平行试验3次。获得质粒标准品拷贝数和Ct值的对应关系，绘制标准曲线。
3.实时定量PCR与常规PCR的灵敏度比较
以步骤2中同样的模板进行常规PCR检测，反应体系和程序与实施例1中的2.1常规PCR相同，比较常规PCR和qPCR的最低检出限。
4.结果
①阳性质控品的制备及标准曲线绘制结果
实时定量PCR反应扩增曲线如图4，图中1～7分别代表：质粒拷贝数分别为6.0×107、6.0×106、6.0×105、6.0×104、6.0×103、6.0×102、6.0×101copies/μL，质粒标准品不同稀释度间扩增平行性好，平行样品间扩增效率相近；通过查看质粒标准品梯度稀释荧光定量PCR熔解曲线可知引物075R 241-F/R的Tm值是85.5(图5)；以Ct值为纵坐标，已知拷贝数质粒标准品为横坐标绘制标准曲线如图6所示，结果显示质粒标准品在6.0×107～6.0×101copies/μL与Ct值呈良好的线性关系，质粒浓度(x)与Ct值(y)关系为：y＝-3.34lg(x)+33.16，相关系数R2＝0.9988。
②qPCR与常规PCR灵敏度比较
以拷贝数为6.0×107～6.0×100copies/μL的质粒标准品为模板的实时定量PCR扩增结果如图7(M:DL 2000DNA Marker；1～7：6.0×107copies/μL～6.0×100copies/μL,N：阴性对照)，结果显示实时定量PCR方法的最低检出限为6.0×101copies/μL；常规PCR在6.0×107copies/μL～6.0×104copies/μL 240bp处有明显亮带(图8，M:DL 2000DNA Marker；1～8：6.0×107copies/μL～6.0×100copies/μL,N：阴性对照)，其最低检出限为6.0×103copies/μL。实时定量PCR检测方法比常规PCR敏感性高100倍，表明建立的实时定量PCR方法敏感性性更高。
实施例3实时定量PCR检测SGIV的特异性和重复性
1.特异性检验
以感染神经坏死病毒(viral nervous necrosis，VNN)的石斑鱼样品的cDNA和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)DNA、哈维氏弧菌(V.harveyi)DNA、刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)DNA为检测模板进行实时荧光PCR扩增，对本研究建立的SGIV实时荧光PCR检测方法的特异性进行测试。
2.重复性试验
将构建的PEASY-SGIV-075R质粒进行10倍梯度稀释，取浓度为6.0×105copies/μL、6.0×104copies/μL和6.0×103copies/μL的质粒标准品利用建立的实时定量PCR扩增，每个浓度重复3次，进行组内重复性分析，再将上述3个浓度的质粒标准品不同次实验重复3次扩增，进行重复性分析。
3.结果
用建立的实时定量PCR对5种常见石斑鱼病原进行检测，结果发现神经坏死病毒、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、刺激隐核虫和阴性对照的检测结果均未出现扩增曲线，仅石斑鱼SGIV阳性组织DNA样品的检测出现了“S”型扩增曲线(图9，1～5：石斑鱼虹彩病毒重组质粒、2：副溶血弧菌、3：哈维氏弧菌、4：神经坏死病毒、5：刺激隐核虫、N:阴性对照)，表明该方法可特异性检测SGIV。
重复性试验结果如表3所示，组内和组间变异系数均小于1.5％，表明该检测方法的重复性和稳定性均较好。
表3实时定量PCR重复性试验结果
实施例4在石斑鱼样品虹彩病毒检测中的应用
1.石斑鱼组织DNA提取
斜带石斑鱼、棕点石斑鱼、豹纹鳃棘鲈、驼背鲈各取20尾，获取其肝脏组织，每个组织约取30mg放入1.5ml EP管中，加入磁珠，使用组织匀浆仪进行组织研磨，根据Omega基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取。
2.实时定量PCR检测石斑鱼DNA样品
以提取的石斑鱼肝脏组织DNA为模板，进行qPCR检测，反应体系如表3，反应程序为：95℃2min，95℃10s，60℃10s，重复40个循环，95℃15s，60℃1min。反应结束后查看Ct值，代入质粒浓度(x)与Ct值(y)关系公式：y＝-3.34lg(x)+33.16，计算各模板病毒拷贝数。
3.结果
应用建立的实时定量PCR方法对四批不同种类石斑鱼(斜带石斑鱼、棕点石斑鱼、豹纹鳃棘鲈、驼背鲈)样品(共80尾)进行SGIV检测，最后计算的病毒拷贝数如图10所示。本次检测石斑鱼解剖时无明显临床症状和器官病变，但检测结果显示每种石斑鱼都携带不同程度的SGIV，因此，该方法可以用于石斑鱼养殖过程中SGIV的定量检测。
Claims (4)
1.石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测引物，其特征在于：其核苷酸序列为：
正向引物075R 241-F的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，反向引物075R 241-R的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述的石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测引物在制备石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测试剂盒中的应用。
3.石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测引物。
4.根据权利要求1所述的石斑鱼虹彩病毒实时定量PCR检测试剂盒，其特征在于：还包含用于qPCR反应的试剂。
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