CN117965770A - 一种用于检测对虾急性肝胰腺坏死病的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测对虾急性肝胰腺坏死病的试剂盒及其应用；所述试剂盒中包含crRNA，所述crRNA包括crRNA2、crRNA3、crRNA4和crRNA5中的至少一种。本发明方案通过将RPA技术与CRISPR/Cas12a系统联合，针对AHPND的毒力基因PirVPA设计特异性的检测位点，先通过等温扩增目的片段，再通过CRISPR检测体系特异性识别检测位点和剪切反应，最后通过试纸条或者荧光信号的方式呈现检测结果，检测快速、灵敏、特异，且不依赖大型实验设备，能将结果可视化展示，为各实验室和养殖企业提供一种快速检测AHPND的方法选择。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测对虾急性肝胰腺坏死病的试剂盒及其应用。
背景技术
AHPND严重影响了对虾产业的发展。鉴于该病的危害严重，目前世界动物卫生组织(OIE)已将其列入水生动物疫病法定报告目录。对虾急性肝胰腺坏死病(AcuteHepatopancreatic Necrosis Disease，AHPND)，又称早期死亡综合征(early mortalitysyndrome，EMS)，是一种致命性的细菌性疾病，主要危害斑节对虾(Penaeusmonodon)、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)。
AHPND病原诊断的方法主要是组织病理观察和PCR诊断方法，组织病理观察诊断法具有方便、快速、简单等优点，但是对工作人员的实践经验要求较高；PCR诊断是近年来的流行的检测手段，如普通PCR和qPCR等方法有灵敏度高、特异性强、通量高的优势，但需要在实验室内依靠专业的技术人员和实验仪器才能实现检测。目前仍需要开发快速、便捷的AHPND检测方法，以用于现场的快速检测。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于检测对虾急性肝胰腺坏死病PirVPA基因的crRNA。
本发明还提出一种等温扩增对虾急性肝胰腺坏死病PirVPA基因的RPA引物对。
本发明还提出一种用于对虾急性肝胰腺坏死病快速检测的CRISPR/Cas12a检测体系。
本发明还提出一种试剂盒。
本发明还提出上述crRNA、RPA引物对、CRISPR/Cas12a检测体系和试剂盒的应用。
根据本发明的第一方面，提出了一种用于检测对虾急性肝胰腺坏死病PirVPA基因的crRNA，所述crRNA包括crRNA2、crRNA3、crRNA4和crRNA5中的至少一种；所述crRNA2的引物序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示；所述crRNA3的引物序列如SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4所示；所述crRNA4的引物序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示；所述crRNA5的引物序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示。
根据本发明的第二方面，提出了等温扩增对虾急性肝胰腺坏死病PirVPA基因的RPA引物对；所述RPA引物对的序列选自以下(1)～(5)中的至少一种：
(1)序列如SEQ ID NO:9所示的正向引物，序列如SEQ ID NO:10所示的反向引物；
(2)序列如SEQ ID NO:11所示的正向引物，序列如SEQ ID NO:12所示的反向引物；
(3)序列如SEQ ID NO:13所示的正向引物，序列如SEQ ID NO:14所示的反向引物；
(4)序列如SEQ ID NO:15所示的正向引物，序列如SEQ ID NO:16所示的反向引物；
(5)序列如SEQ ID NO:17所示的正向引物，序列如SEQ ID NO:18所示的反向引物。
根据本发明的第三方面，提出了一种用于检测对虾急性肝胰腺坏死病的CRISPR/Cas12a检测体系，所述CRISPR/Cas12a检测体系包括：上述crRNA、Cas12a蛋白和单链DNA报告系统。
在本发明的一些实施方式中，所述Cas蛋白为LbCas12a蛋白。
在本发明的一些实施方式中，所述单链DNA报告系统包括用于荧光检测的ssDNAFQ reporter和/或用于免疫胶体金试纸条检测的ssDNA FB reporter。
在本发明的一些实施方式中，所述ssDNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的单链DNA，标记产物如下：5’-6FAM-TTATT-TAMRA-3’；所述ssDNA FBreporter为利用6-羧基荧光素和生物素标记的单链DNA，标记产物如下：5’-6FAM-TTATT-Biotin-3’。
根据本发明的第四方面，提出了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述等温扩增对虾急性肝胰腺坏死病PirVPA基因的RPA引物对和CRISPR/Cas12a检测体系。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括检测试纸条。
在本发明的一些实施方式中，所述检测试纸条包括胶体金检测试纸条。
根据本发明的第五方面，提出了上述crRNA、RPA引物对、CRISPR/Cas12a检测体系和试剂盒在制备检测对虾急性肝胰腺坏死病的产品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述检测具体包括以下步骤：利用上述试剂盒对待测样品进行检测。
在本发明的一些实施方式中，所述检测具体包括以下步骤：
(1)提取待测样品DNA；
(2)利用上述等温扩增对虾急性肝胰腺坏死病PirVPA基因的RPA引物对扩增待测样品中的目的片段得到特异性RPA产物；
(3)将步骤(2)的扩增得到特异性RPA产物加入CRISPR/Cas12a检测体系，进行反应后得到反应产物；将所述反应产物通过荧光或试纸条进行检测。
在本发明的一些实施方式中，步骤(2)中，所述扩增采用的反应体系包括如下组分：0.3-0.6μM RPA引物、Primer Free Rehydration buffer 28-31μL、模板DNA0.5-2μL、水11-15μL和12-15mM醋酸镁。
在本发明的一些实施方式中，所述扩增的反应条件为：35-42℃反应18-24min。
在本发明的一些实施方式中，步骤(3)中所述反应采用的反应体系如下：
在本发明的一些实施方式中，步骤(3)中所述反应采用的反应条件如下：35-38℃反应0.5-2h。
根据本发明的一些实施方式，至少具有如下有益效果：本发明方案通过将RPA技术与CRISPR/Cas12a系统联合，针对AHPND的毒力基因PirVPA设计特异性的检测位点，先通过等温扩增目的片段，再通过CRISPR检测体系特异性识别检测位点和剪切反应，最后通过试纸条或者荧光信号的方式呈现检测结果，检测快速、灵敏、特异，且不依赖大型实验设备，能将结果可视化展示，为各实验室和养殖企业提供一种快速检测AHPND的方法选择。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1中的琼脂糖检测结果图；
图2为本发明实施例1中的crRNA与RPA等温扩增引物的筛选检测结果图；
图3为本发明实施例1中的反应体系优化检测结果图；
图4为本发明实施例2中的试纸检测结果图，其中，1、2、3分别为AHPND阳性质粒的检测结果图；4为阴性质粒的检测结果图；
图5为本发明实施例3中的灵敏度检测结果图；
图6为本发明实施例4中的特异性检测结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供了一种用于对虾急性肝胰腺坏死病快速检测的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测对虾急性肝胰腺坏死病PirVPA基因的crRNA、等温扩增对虾急性肝胰腺坏死病PirVPA基因的RPA引物对、Cas12a蛋白和单链DNA报告系统。具体制备过程如下：
1、crRNA的DNA模板引物设计
根据AHPND的毒力基因PirVPA，筛选CRISPR/Cas12a识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计得到4条长度为20nt的crRNA，将设计的crRNA序列的5’端加上T7转录序列组成crRNA转录引物(AP-crRNA2、AP-crRNA3、AP-crRNA4和AP-crRNA5，具体序列如表1所示)，将crRNA转录引物交由通用生物(安徽)股份有限公司合成单链DNA oligo序列后，两条互补的Oligos序列以100μM浓度等比例混匀，通过退火(具体退火的条件为：95℃变性5min，水浴锅中自然冷却过夜，或者PCR仪中95℃5min，然后按照1℃/min的速度降至25℃，最后4℃保存)合并成双链DNA。
制备好的合并转录引物加无菌水稀释成10uM的DNA双链，作为转录的DNA模板。诺唯赞(Vazyme)的T7 High Yield Transcription Kit试剂盒进行通过体外转录获得目的crRNA，反应体系参考说明书。4组crRNA转录产物(crRNA2、crRNA3、crRNA4和crRNA5)分别使用美基(Magen)HiPure RNA PureMicro Kits试剂盒进行纯化。
表1crRNA转录引物
其中，下划线标记表示crRNA序列，横线表示LbCas12a蛋白对应的茎环结构序列，波浪线表示与靶基因匹配的序列。
2.RPA等温扩增引物设计与合成
针对AHPND的毒力基因PirVPA(Genebank No.：KM067908.1)设计了5对RPA扩增引物，引物序列如表2所示，选出引物扩增的区域的序列制备AHPND病原的阳性对照质粒，引物和质粒交由通用生物(安徽)股份有限公司进行合成。
用阳性质粒样品作为模板，分别对5组引物进行RPA扩增，RPA反应使用的Basic reaction，反应体系和反应条件如下：10μM RPA引物F和R各2.4μL，Primer Free Rehydration buffer 29.5μL，阳性质粒模板1μL，水13.2μL，涡旋混匀并且离心，加入2.5μL 280mM Magnesium Acetate(醋酸镁)，离心混匀后39℃反应20min，得到RPA产物。RPA产物用琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，从图中可以看出，5组引物均能正常扩增目标片段。
表2RPA引物
3.CRISPR反应检测
当靶标DNA存在时，Cas12a在crRNA的引导下，与靶标DNA形成三元复合物(Cas12a/crRNA/target DNA)，激发Cas12a剪切活性，将反应体系中带有荧光基团和淬灭基团修饰的单链DNA的报告系统(ssDNA FQ reporter，为利用6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的单链DNA，标记产物如下：5’-6FAM-TTATT-TAMRA-3’)切碎，可以通过报告系统的荧光信号检测反应中的靶位DNA。利用步骤2制备得到的RPA产物、制备的crRNA、ssDNA FQ reporter和Cas蛋白进行CRISPR反应检测，Cas蛋白为LbCas12a(Cpf1)，购于吐露港生物科技有限公司，ssDNAFQ reporter交由通用生物(安徽)股份有限公司合成，CRISPR反应检测体系如表3所示。
表3
| 组分 | 添加量(μL) |
| 10×HOLMES Buffer1 | 2μL |
| 1μM LbCas12aNuclease | 1μL |
| 2.5μM crRNA | 1μL |
| RPA产物 | 4μL |
| 10μM ssDNA-FQ Reporter | 0.5μL |
| Nuclease-free Water | 补足20μL |
反应程序为：37℃1h，每个反应重复3次，每隔60s记录一次荧光信号值。
4.CRISPR反应体系的优化
(1)crRNA与RPA等温扩增引物的筛选
根据方案3.CRISPR反应检测的方案以及反应程序，对靶标序列crRNA2、crRNA3、crRNA4和crRNA5进行筛选，结果如图2所示，从图中可以看出，筛选得到终点荧光值最高crRNA2和对应的RPA-T02。
(2)反应体系的优化
采用crRNA2和RPA-T02进行反应体系优化，具体反应体系同方案3.CRISPR反应检测的方案以及反应程序一致，区别仅在于，Cas12a的浓度分别为1、2、5、7、10μM，和crRNA2的浓度分别为0.625、1.25、2.5、5、10μM，将其组合进行实验，根据荧光值的变化确定最佳的反应体系。
不同组合的荧光值的变化情况如图3所示，从图中可以看出，当crRNA2浓度为1～5μM，Cas12a浓度为1～2μM时，荧光值变化比较明显，终点荧光值最高组合为crRNA2浓度为2.5μM，Cas12a浓度为1μM。
实施例2试纸条测试
将实施例1中制备得到的RPA产物进行CRISPR/Cas12a反应检测，反应中的单链报告系统为一段端标记生物素(Biotin)，另一端标记6-羧基荧光素(6-FAM)的探针。反应体系如下表3所示。
表3
反应程序：37℃30min，反应结束后向反应液中再加入40μL ddH2O混匀，加入试纸条(Cas12/13专用核酸检测试纸条)，质控带显色后5min内观察检测带。
实验结果如图4所示，从图中可以看出，3个浓度的测试组都有阳性条带，阴性对照为阴性条带。
实施例3灵敏度测试
为了测试RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的灵敏度，对已知拷贝数的阳性质粒DNA进行10倍浓度梯度稀释，以浓度为101～107copies/μL阳性质粒标准品为模板，对试剂盒进行灵敏度测试，测试方案参见实施例1。
测试结果如图5所示，从图中可以看出，浓度为101copies/μL阳性质粒样品仍有区别于阴性对照的荧光信号变化，因此，检测灵敏度为101copies/μL。
实施例4特异性测试
用传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、对虾白斑综合病病毒(WSSV)、桃拉病毒(TSV)、肝胰腺细小病毒(HPV)这四种对虾常见病毒来测试本方法的特异性。
检测方法如下：分别用AHPND的RPA引物扩增AHPND、IHHNV、WSSV、TSV、HPV五种病原阳性质粒(通用生物(安徽)股份有限公司进行合成)，RPA产物用CRISPR/Cas12a反应，反应物采用试纸条进行检测，具体检测方法同实施例2一致。
结果如图6所示，从图中可以看出，AHPND病毒阳性样本为阳性，而其余病原阳性样品检测结果均为阴性，说明本检测方法具有良好的特异性。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种用于检测对虾急性肝胰腺坏死病PirVPA基因的crRNA，其特征在于，所述crRNA包括crRNA2、crRNA3、crRNA4和crRNA5中的至少一种；所述crRNA2的引物序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示；所述crRNA3的引物序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示；所述crRNA4的引物序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示；所述crRNA5的引物序列如SEQ ID NO:7、SEQID NO:8所示。
2.等温扩增对虾急性肝胰腺坏死病PirVPA基因的RPA引物对；所述RPA引物对的序列选自以下(1)～(5)中的至少一种：
(1)序列如SEQ ID NO:9所示的正向引物，序列如SEQ ID NO:10所示的反向引物；
(2)序列如SEQ ID NO:11所示的正向引物，序列如SEQ ID NO:12所示的反向引物；
(3)序列如SEQ ID NO:13所示的正向引物，序列如SEQ ID NO:14所示的反向引物；
(4)序列如SEQ ID NO:15所示的正向引物，序列如SEQ ID NO:16所示的反向引物；
(5)序列如SEQ ID NO:17所示的正向引物，序列如SEQ ID NO:18所示的反向引物。
3.一种用于检测对虾急性肝胰腺坏死病的CRISPR/Cas12a检测体系，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a检测体系包括：权利要求1所述的crRNA、Cas12a蛋白和单链DNA报告系统。
4.根据权利要求3所述的CRISPR/Cas12a检测体系，其特征在于，所述单链DNA报告系统包括用于荧光检测的ssDNA FQ reporter和/或用于免疫胶体金试纸条检测的ssDNA FBreporter；
优选地，所述ssDNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的单链DNA，标记产物如下：5’-6FAM-TTATT-TAMRA-3’；所述ssDNA FB reporter为利用6-羧基荧光素和生物素标记的单链DNA，标记产物如下：5’-6FAM-TTATT-Biotin-3’。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的RPA引物对和权利要求3-5任一项所述的CRISPR/Cas12a检测体系。
6.权利要求1所述的crRNA、权利要求2所述的RPA引物对、权利要求3-4任一项所述的CRISPR/Cas12a检测体系和权利要求5所述的试剂盒中的至少一种在制备检测对虾急性肝胰腺坏死病的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测包括以下步骤：利用权利要求5所述的试剂盒对待测样品进行检测。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测具体包括以下步骤：
(1)提取待测样品DNA；
(2)利用权利要求2所述的等温扩增对虾急性肝胰腺坏死病PirVPA基因的RPA引物对扩增待测样品中的目的片段得到特异性RPA产物；
(3)将步骤(2)的扩增得到特异性RPA产物加入权利要求3-4任一项所述的CRISPR/Cas12a检测体系，进行反应后得到反应产物；将所述反应产物通过荧光或试纸条进行检测。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述扩增采用的反应体系包括如下组分：0.3-0.6μM RPA引物、Primer Free Rehydration buffer 28-31μL、模板DNA0.5-2μL、水11-15μL和12-15mM醋酸镁；
和/或，所述扩增的反应条件为：35-42℃反应18-24min。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(3)中所述反应采用的反应体系如下：
优选地，步骤(3)中所述反应采用的反应条件如下：35-38℃反应0.5-2h。
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