CN117385068A - 采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的引物、试剂盒与方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的引物、试剂盒与方法。通过交叉引物恒温扩增反应对目标序列快速进行恒温扩增，在1h内就能获得阳性结果，同时由于该反应所需的引物较多，检测结果准确度极高。通过扩增反应是否发生就可判断靶基因的存在与否，从而完成了对蜡样芽孢杆菌肠毒素Hbl的特异性检测。解决了目前快速检测领域难以特异性检测出致病性蜡样芽孢杆菌的难题。该方法针对蜡样芽孢杆菌的检测限为6.0ng/μL，灵敏度是常规PCR的百倍以上。

Description

采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢 杆菌的引物、试剂盒与方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的引物、试剂盒与方法。

背景技术

蜡样芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种革兰氏阳性菌，兼性需氧。虽然自然界中大多数的蜡样芽孢杆菌均不具有致病性，但蜡样芽孢杆菌仍是我国食品中最新常见的污染菌和条件致病菌之一。肠毒素Hbl是蜡样芽孢杆菌中常见的肠毒素之一，致病性蜡样芽孢杆菌该毒素的携带率在90％以上，因此开发一种快速准确的检测蜡样芽孢杆菌肠毒素Hbl的检测方法十分有必要。

目前检测蜡样芽孢杆菌的方法主要有三大类，分别为传统培养法、免疫学方法和分子生物学方法。传统培养法费时费力，效率低，并且完全无法区分致病性蜡样芽孢杆菌和非致病性蜡样芽孢杆菌。免疫学检测方法和传统分子生物学方法虽然可以特异性地检测蜡样芽孢杆菌肠毒素Hbl，但都存在一定的局限性，前者的缺点是检测成本高且准确率较低，而后者检测时间较长，并且对设备要求较高。

交叉引物恒温扩增技术作为一种新型的核酸恒温扩增技术不仅摆脱了传统分子生物学检测方法对控温仪器的依赖，相较于其它恒温扩增技术都有着更高的灵敏度和准确度。因此建立一种针对蜡样芽孢杆菌肠毒素Hbl的具有独立知识产权的采用交叉引物恒温扩增技术的检测方法具有重要的意义。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种采用交叉引物恒温扩增技术检测蜡样芽孢杆菌肠毒素Hbl的引物。

本发明的另一目的在于提供一种采用交叉引物恒温扩增技术检测蜡样芽孢杆菌肠毒素Hbl的试剂盒。

本发明的又一目的在于提供一种采用交叉引物恒温扩增技术检测蜡样芽孢杆菌肠毒素Hbl的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一组采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的引物，由剥离引物4s和5a、交叉引物2a1s、特异引物2a和3a构成，其核苷酸序列如下：

剥离引物4s：5’-TCATAACGCATACACTT-3’(SEQ ID NO.1)；

剥离引物5a：5’-CACTACTGCTACTACCG-3’(SEQ ID NO.2)；

交叉引物2a1s：5’-TGAAAGCCAATCAGCCCACAGGAACAAATGCGCCAAATGC-3’(SEQ IDNO.3)；

特异引物2a：5’-TGAAAGCCAATCAGCCCACA-3’(SEQ ID NO.4)；

特异引物3a：5’-CCACTCCACATATTATGAAC-3’(SEQ ID NO.5)。

一种采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的试剂盒，包括上述采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的引物。

所述的试剂盒中引物浓度均为10μM。

所述的试剂盒，还包括如下组分：

A、2×反应缓冲液：40.0mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2％(v/v)的Tween 20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs；

B、Bst DNA聚合酶；

组分B中所述的Bst DNA聚合酶优选为浓度为8U/μL的Bst DNA聚合酶水溶液。

上述采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的引物或交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的试剂盒在检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的应用。

一种根据上述试剂盒检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的非疾病诊断的实验研究方法，包括如下步骤：

(1)提取待检样品的细菌DNA作为模板，并确保模板DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值在1.8～2.0的范围内；

(2)建立检测蜡样芽孢杆菌hblB基因的交叉引物恒温扩增反应体系，于63℃水浴中保温至少60分钟进行交叉引物恒温扩增反应；

其中，交叉引物恒温扩增反应体系为：2×反应缓冲液12.5μL，10μM的剥离引物4s和10μM的剥离引物5a各1.5μL，10μM的交叉引物2a1s 2.5μL，10μM的特异引物2a和10μM的特异引物3a各1.25μL，DNA模板1.0μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1.0μL，加去核酸水补足至25μL；

(3)待反应完成后于80℃水浴中加热2分钟终止反应，然后进行琼脂糖凝胶电泳。如果电泳结果出现梯形条带，说明待检样品中含有蜡样芽孢杆菌hblB基因；如电泳结果无条带，说明待检样品中不含蜡样芽孢杆菌hblB基因。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明中所提供的针对蜡样芽孢杆菌肠毒素基因hblB所设计的交叉引物恒温扩增方法，解决了现有技术方法检测时间长，灵敏度低，操作繁琐，成本高，现场应用困难等缺陷，弥补了快速检测领域致病性蜡样芽孢杆菌特异性检测的空白。

(2)本发明反应在等温条件下进行，不需要变温的过程，节省了大量的时间，在60分钟就可完成并获得检测结果，同其他恒温扩增技术相比在检测时间上也有着一定的优势，对新型恒温扩增技术扩增的开发及微生物的现场检测的应用具有重要的意义。此外，该方法不需要特殊、昂贵的仪器，检测成本较低。本发明的试剂盒及方法特别适用中小型食品企业的产品的自测及其他现场检测。同时，本发明还公开了针对蜡样芽孢杆菌肠毒素Hbl的特异性靶序列保守区的特异区域并设计了一组检测引物，从而保证了检测结果的可靠性。

附图说明

图1为交叉引物恒温扩增反应技术检测蜡样芽孢杆菌肠毒素Hbl的凝胶电泳结果图；其中，M-DNA marker，泳道1为阳性对照，2为阴性对照。

图2为采用交叉引物恒温扩增技术检测蜡样芽孢杆菌肠毒素Hbl的特异性实验的凝胶电泳结果图。

其中M为DNA Marker，泳道1-10分别为蜡样芽孢杆菌ATCC14579，金黄色葡萄球ATCC25923，大肠杆菌ATCC43894，铜绿假单胞ATCC27853，沙门氏菌ATCC14028，单增李斯特菌ATCC19118，副溶血性弧菌ATCC17802，苏云金芽孢杆菌ATCC10792，屎肠球菌1230，福氏志贺氏菌10，泳道11为阴性对照。

图3为采用交叉引物恒温扩增技术检测蜡样芽孢杆菌肠毒素Hbl的灵敏度实验的凝胶电泳结果图。

其中，M为DNA Marker，泳道1-7所加入的DNA模板浓度分别为60μg/mL，6.0μg/mL，600ng/mL，60ng/mL，6.0ng/mL，600pg/mL，60pg/mL。泳道8为阴性对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂、材料和菌株均可通过市售获得。

实施例1采用交叉引物恒温扩增反应技术(CPA)检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的引物的设计

(1)在GenBank上搜索该检测对象(本专利申请为蜡样芽孢杆菌)的全部基因组序列，共计1982个，进一步搜索并获得检测靶点hblB的基因序列；(2)在GenBank上搜索一百多条hblB基因序列，结合步骤(1)中获得的序列应用Clustaw软件进行alignment分析，通过不同序列间进行多重比对，获得最高保守度的区域序列；(3)进一步应用Primer Premier等软件对所获得的区域序列进行分析，同时结合该序列所使用的测序平台与方法，进行综合容错度分析，例如Sanger测序方法存在前20-30和后20-30个碱基序列可信度较低，可通过两端通测等方式进行排除；例如PacBio测序则存在碱基错对现象，可通过Illumina或Sanger测序等进行校对；通过以上综合分析，可进一步对序列容错度进行精确判断，从而获得hblB中的高保守区域序列。通过上述分析，发现hblB中最高保守度区域，并用于此进行引物设计。

ATTGCGTCAGACTGTAGATTATAAAATAACATTGAATCGTATAGTTGGAGTTGCATTTCATAATATTAGTGATATGCATAGTATGCTTGATAGTGCTATCACTGCTCTTACTTATATGTCTACGCAATGGGAGGATTTAGATTCTCAATATTCGGGTGTACTGGGACATATTGATAAAGCTGATCAAAAAGCTGATCAAAATAAATATAAATTCTTAACCCCTAGCTTGAATGCAGCGAAAAACAGTTGGAAAACATTAAAAACAGATGTTGTCACTTTGCAAGAAGGGATAAAAATTGCAGAGAAAAAAGAACAGGATTTTTTGAATCAGCTTCGTCCATCAAACGTTTTCTACTTTTATAAAAAAATTCATAACGCATACACTTTTGAAATAAAGACTGGAACAAATGCGCCAAATGCGTCTTATAAAGTTATGAATTTAACGAAAAACACTGTTCATAATATGTGGAGTGGAGGGGCTAATACTAACATGTGGGCTGATTGGCTTTCATTCAATCCAAATGATGAATTTGCGGTAGTAGCAGTAGTGGATGGTAAAGAATATGTTGTGTATAAAGACAAAGTACAAAATATAATGAACTGA

(4)根据交叉引物恒温扩增(CPA)的反应原理，使用Primer Premier软件针对上述靶点hblB最保守区域设计引物；其核苷酸序列如下表所示：

剥离引物4：5’-TCATAACGCATACACTT-3’(SEQ ID NO.1)；

剥离引物5a：5’-CACTACTGCTACTACCG-3’(SEQ ID NO.2)；

交叉引物2a1s：5’-TGAAAGCCAATCAGCCCACAGGAACAAATGCGCCAAATGC-3’(SEQ IDNO.3)；

特异引物2a：5’-TGAAAGCCAATCAGCCCACA-3’(SEQ ID NO.4)；

特异引物3a：5’-CCACTCCACATATTATGAAC-3’(SEQ ID NO.5)。

实施例2采用交叉引物恒温扩增反应技术检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的方法

(1)所需试剂：

a.浓度均为10μM的剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a，引物序列如实施例1中SEQ ID NO.1～5所示；

b.配制2×反应储液：

①20×反应储液：含0.2M的氯化钾，0.2M的硫酸铵，160mM的硫酸镁及2％(v/v)Tween 20(以上均为终浓度，用去核酸水配制)；

②2×反应储液：100μL 20×反应储液，500μL 3.2M甜菜碱，280μL 10mM dNTPs(each)，27μL 1.5M Tris-HCl，93μL去核酸水；

c.浓度为8U/μL的Bst DNA聚合酶(大片段，NEB公司)水溶液。

(2)提取待检样品的DNA作为模板DNA：

本实施例同时设置实验组和空白对照组，其中，实验组为蜡样芽孢杆菌ATCC14579，以去核酸水作为空白对照。

采用细菌基因组DNA快速提取试剂盒(广东东盛生物科技有限公司，货号N1152)提取细菌DNA，按照试剂盒说明书操作，实验组所得细菌DNA水溶液的OD260/OD280的值(260nm和280nm下吸光光度比值)为1.8。

(2)建立检测hblB靶点的交叉引物恒温扩增反应体系：

在反应管中配制总体积为25μL的交叉引物恒温扩增反应体系：分别加入2×反应储液12.5μL，4s与5a等体积混合引物混合液3.0μL，交叉引物2a1s 2.5μL，特异引物2a与3a等体积混合液2.5μL，Bst DNA聚合酶1μL，DNA模板1.0μL，用去核酸水补充体积至25μL，混匀即可。此时各物质浓度为：Tris-HCl 20.0mM，硫酸铵10.0mM，氯化钾10.0mM，硫酸镁8.0mM，Tween 20 0.1％(v/v)，甜菜碱0.7M，dNTPs 1.4mM，Bst DNA聚合酶8U，剥离引物4s、5a各0.6μM，交叉引物2a1s 1.0μM，特异引物2a及3a各0.5μM。将反应管置于63℃水浴中保温反应60分钟，再于80℃水浴中保温2分钟终止反应。

(3)对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳。

实验组呈现梯形条带，空白对照组无扩增条带，与预期结果一致(图1)。

实施例3采用交叉引物恒温扩增反应技术检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的方法的特异性试验

将蜡样芽孢杆菌ATCC14579的基因组DNA和其他非蜡样芽孢杆菌的基因组DNA按照实施例2中的反应体系和条件建立交叉引物恒温扩增反应检测方法，进行特异性试验；其中，非蜡样芽孢杆菌分别为：金黄色葡萄球ATCC25923，大肠杆菌ATCC43894，铜绿假单胞ATCC27853，沙门氏菌ATCC14028，单增李斯特菌ATCC19118，副溶血性弧菌ATCC17802，苏云金芽孢杆菌ATCC10792，屎肠球菌1230，福氏志贺氏菌10。设置蜡样芽孢杆菌ATCC14579的基因组为阳性对照，去核酸水为阴性对照。对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳。

结果如图2所示：结果表明只有蜡样芽孢杆菌出现梯形条带(泳道1)，非蜡样芽孢杆菌则无梯形条带。如此表明，本发明设计的采用交叉引物恒温扩增反应检测蜡样芽孢杆菌的引物具有较好的特异性。

实施例4采用交叉引物恒温扩增反应技术检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的方法的灵敏度对比试验

将蜡样芽孢杆菌ATCC14579的基因组进行10倍浓度梯度稀释，分别为60μg/mL，6.0μg/mL，600ng/mL，60ng/mL，6.0ng/mL，600pg/mL，60pg/mL。。同时设置阴性对照(去核酸水)，按照实施例2中的反应体系构建交叉恒温扩增方法并对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，以确定该检测方法的灵敏度。

电泳结果如图3所示：结果表明本发明建立的针对蜡样芽孢杆菌hblB靶点的交叉引物恒温扩增反应方法可检测样品中DNA浓度为6.0ng/mL的蜡样芽孢杆菌。

结论：

从上述实验结果可以看出，交叉恒温扩增反应扩增方法相较于现有的检测方法具有如下优点：

快速、准确：通过交叉引物恒温扩增反应对目标序列快速进行恒温扩增，在1h内就能获得阳性结果，同时由于该反应所需的引物较多，检测结果准确度极高。

特异性强：通过扩增反应是否发生就可判断靶基因的存在与否，从而完成了对蜡样芽孢杆菌肠毒素Hbl的特异性检测。解决了目前快速检测领域难以特异性检测出致病性蜡样芽孢杆菌的难题。

灵敏度高:该方法针对蜡样芽孢杆菌的检测限为6.0ng/μL，灵敏度是常规PCR的百倍以上。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一组采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的引物，其特征在于由剥离引物4s和5a、交叉引物2a1s、特异引物2a和3a构成，其核苷酸序列如下：

剥离引物4s：5’-TCATAACGCATACACTT-3’(SEQ ID NO.1)；

剥离引物5a：5’-CACTACTGCTACTACCG-3’(SEQ ID NO.2)；

交叉引物2a1s：5’-TGAAAGCCAATCAGCCCACAGGAACAAATGCGCCAAATGC-3’(SEQ ID NO.3)；

特异引物2a：5’-TGAAAGCCAATCAGCCCACA-3’(SEQ ID NO.4)；

特异引物3a：5’-CCACTCCACATATTATGAAC-3’(SEQ ID NO.5)。

2.一种采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于：

包括上述采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：

所述的试剂盒中引物浓度均为10μM。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：

所述的试剂盒，还包括如下组分：

A、2×反应缓冲液：40.0mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，体积浓度为0.2％的Tween 20，1.4M的甜菜碱，10.0mM的dNTPs；

B、Bst DNA聚合酶。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：

组分B中所述的Bst DNA聚合酶为浓度为8U/μL的Bst DNA聚合酶水溶液。

6.权利要求1所述的采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的引物或权利要求2～5任一所述的采用交叉引物恒温扩增技术检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的试剂盒在检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的应用。

7.一种根据权利要求2～5任一所述的试剂盒检测产生肠毒素Hbl的蜡样芽孢杆菌的非疾病诊断的实验研究方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)提取待检样品的细菌DNA作为模板，并确保模板DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值在1.8～2.0的范围内；

(2)建立检测蜡样芽孢杆菌hblB基因的交叉引物恒温扩增反应体系，于63℃水浴中保温至少60分钟进行交叉引物恒温扩增反应；

其中，交叉引物恒温扩增反应体系为：2×反应缓冲液12.5μL，10μM的剥离引物4s和10μM的剥离引物5a各1.5μL，10μM的交叉引物2a1s 2.5μL，10μM的特异引物2a和10μM的特异引物3a各1.25μL，DNA模板1.0μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1.0μL，加去核酸水补足至25μL；

(3)待反应完成后于80℃水浴中加热2分钟终止反应，然后进行琼脂糖凝胶电泳；如果电泳结果出现梯形条带，说明待检样品中含有蜡样芽孢杆菌hblB基因；如电泳结果无条带，说明待检样品中不含蜡样芽孢杆菌hblB基因。