KR102336532B1 - 대장균, 대장균군 및 총균의 표적 서열 증폭을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 대장균, 대장균군 및 총균의 표적 서열 증폭을 위한 프라이머 세트 및 식품 등 시료로부터 상기 균주를 검출하기 위한 상기 프라이머 세트의 용도에 대한 것으로, 본 발명의 프라이머 쌍은 대장균, 대장균군 및 총균에 특이적인 서열을 증폭할 수 있으며, 상기 균주의 포함 여부를 신속하고 편리하게 검출할 수 있고, 아울러 교차 반응성이 적은 서열을 증폭하므로, 해당 균주에 대한 높은 특이성을 바탕으로 정확한 검출이 가능하다.
Description
본 발명은 대장균, 대장균군 및 총균의 표적 서열 증폭을 위한 프라이머 세트 및 식품 등 시료로부터 상기 균주를 검출하기 위한 상기 프라이머 세트의 용도에 대한 것이다.
식품의 제조, 유통 및 판매와 관련하여, 식품 내 미생물들의 존재는 위생의 척도이자 식품 안전에 위해를 가할 수도 있는 중대한 요소이다. 이는 곧 기업의 품질 신뢰도 하락으로 이어질 수 있어 식품 관련 기업에서는 미생물의 검출, 분석 및 관리에 중점을 두고 있다. 따라서 이러한 식품 내 미생물의 검출은 신속하면서도 정확한 검출 및 분석을 필요로 한다. 그러나 미생물이 낮은 농도로 오염되어 있는 경우에는, 그 핵산 함량이 적어 정성 및 정량 분석이 어렵다는 문제점이 있으며, 특히 어떠한 종류의 미생물인지 분석을 하는데 시간 및 비용이 상당히 소모되는 경우가 많은 문제점이 있다.
특히 식품에 오염될 경우, 문제를 일으키는 대장균군은 호기성 또는 통성 혐기성의 미생물로서, 젖당을 분해하여 가스를 생산하는 그람 음성인 무포자 간균을 말한다. 대장균군은 모두 LacZ 유전자를 가지고 있으므로, 이를 이용하여 대장균군을 검출하는 방법이 공지되어 있다. 하지만 LacZ 유전자의 경우 대장균군이 아닌 일반 세균들도 보유하고 있는 유전자로 다른 세균들이 대장균군과 혼합되어 있는 경우, 그 구별이 어렵고 위 양성의 결과가 나올 수 있다는 문제점이 있다. 또한, LacZ 유전자는 특정한 환경 조건에서는 발현하지 않는 경우가 있어, 이를 통한 대장균의 검출에 있어 오류 발생이 높게 나타날 수 있다는 문제점 또한 제기되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은, 대장균 및 대장균군에 속하는 세균을 특이적으로 검출할 수 있도록, 교차 반응성이 낮은 대장균, 대장균군 및 총균 검출용 실시간 PCR 프라이머에 대한 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, 대장균, 대장균군 및 총균의 동시 검출을 위하여, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 대장균 검출용 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 중 하나 이상을 포함하는 대장균군 검출용 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 중 하나 이상을 포함하는 총균 검출용 프라이머 세트를 포함하는 미생물 동시 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 대장균, 대장균군 및 총균 동시 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여, 대장균, 대장균군 및 총균에 속하는 미생물을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대장균, 대장균군 및 총균의 동시 검출을 위하여, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 대장균 검출용 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 중 하나 이상을 포함하는 대장균군 검출용 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 중 하나 이상을 포함하는 총균 검출용 프라이머 세트를 포함하는 미생물 동시 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 대장균, 대장균군 및 총균 동시 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여, 시료로부터 대장균, 대장균군 및 총균에 속하는 미생물을 검출하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 대장균, 대장균군 및 총균에 속하는 미생물에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트가 포함된 미생물 검출용 조성물에 대한 것이다. 본 발명의 상기 조성물은, 특히, 대장균 및 대장균군을 특이적으로 검출하기 위하여, 다른 종과 교차 반응성이 없는 특이적인 프라이머 및 총균에 공통적으로 포함된 서열에 특이적인 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 프라이머는 대장균, 대장균군 및 총균을 검출 대상으로 하며, 상기 미생물 유래의 핵산 분자로서, DNA 또는 RNA에 특이적으로 결합할 수 있는 것이다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 조성물은 대장균(Escherichia coli)의 ybbW 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 포함한다. ybbw 유전자는 대장균에만 존재하는 것으로, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드는 E. coli 유전자인 ybbW의 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 정방향 프라이머이고, 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드는 E. coli의 유전자인 ybbW의 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 역방향 프라이머이다.
또한, 본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 조성물은 대장균군(Coliform group)을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 포함한다. 대장균군은 대장균과 유사한 특징을 가지는 균주들로서, 에스케리키아 속(Escherichia sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.), 클렙시엘라 속(Klebsiella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.) 및 하프니아 속(Hafnia sp.)에 속하는 균주를 포함한다.
본 발명의 상기 대장균군에 특이적인 프라이머 쌍은 대장균군에 공통적으로 존재하면서, 대장균군을 제외한 다른 세균에는 존재하지 않는 16s rRNA 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 것으로, 서열번호 3, 5, 7의 올리고뉴클레오티드는 상기 대장균군의 16s rRNA 염기서열에 대한 정방향 프라이머, 서열번호 4, 6, 8의 올리고뉴클레오티드는 역방향 프라이머이다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 프라이머 쌍은 에스케리키아 콜라이(E. coli), 엔테로박터 클로아카(Enterobacter cloacae), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 시트로박터 프레운디(Citrobacter freundii) 및 하프니아 알베이(Hafnia alvei)를 특이적으로 증폭한다. 이와 관련하여 본 발명의 일 실시예에서는 상기 프라이머가 대장균군에 속하는 균주 중, 에스케리키아 콜라이(E. coli), 엔테로박터 클로아카(Enterobacter cloacae), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae)로부터 유래된 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 증폭하는 것을 확인하였으며, 이로부터 상기 균주들에 대한 검출이 가능함을 확인하였다.
본 발명의 일 실시 양태로서, 본 발명의 조성물은 시료에 감염된 총균을 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 포함한다. 상기 총균은 대장균군에 속하지 않는 다른 세균을 모두 포함하는 개념으로, 본 발명의 조성물에는 상기 총균에 공통적으로 존재하는 16s rRNA 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 쌍을 포함한다. 이는, 대장균, 대장균군 및 총균에 속하는 미생물을 동시에 확인할 수 있는 용도로 사용되는 것이다. 상기 총균에는 대장균군에 속하는 균주 외에, 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 및 브로코트릭스 속(Brochothrix sp.)에 속하는 균주가 추가로 포함된다.
본 발명의 상기 총균의 16s rRNA 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 쌍은 서열번호 9, 11의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 10, 12의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 역방향 프라이머를 각각 포함한다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 프라이머는 대장균 및 대장균군과 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 및 브로코트릭스 속(Brochothrix sp.)을 포함하는 총균을 모두 검출할 수 있다. 이와 관련하여 본 발명의 일 실시예에서는 상기 프라이머를 이용하여 대장균, 대장균군 및 총균(슈도모나스 애루지노사, 스타필로코커스 아우레우스)에 속하는 균주를 모두 증폭할 수 있음을 실험적으로 확인하였다.
즉, 본 발명의 조성물은 하기를 포함하는 검출용 조성물이다 :
대장균을 검출할 수 있는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 쌍;
대장균군을 검출할 수 있는 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 쌍 중 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍;
총균을 검출할 수 있는 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 쌍 중 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 대장균, 대장균군 및 총균 동시 검출용 키트에 대한 것이다. 상기 키트는 이에 제한되는 것은 아니나, 비등온 핵산 증폭 키트 또는 등온 핵산 증폭 키트일 수 있으며, 보다 구체적으로는 중합효소연쇄반응(PCR)과 같은 비등온 핵산 증폭 키트, 또는 LCR(Ligase Chain Reaction), SDA(Standard Displacement Amplification), NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), TMA(Transcription Mediated Amplification), SMART(Signal mediated amplification of RNA technology), IMDA(Isothermal multiple displacement amplification), RPA(Recombinase polymerase amplification) 및 LAMP(loop-mediated isothermal amplification)과 같은 등온 증폭 분석 키트에도 확장하여 적용할 수 있다. 또한, 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 프라이머는 다중 PCR 분석을 사용할 수 있으며, 다중 PCR은 2종 이상의 다른 균주를 검출할 수 있는 프라이머를 동시에 사용할 수 있는 방법으로서, 본 발명에서는 대장균, 대장균군 및 총균의 검출을 위하여 상기 분석 방법을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 프라이머 쌍을 이용하여 대장균, 대장균군 및 총균을 검출하는 방법에 대한 것이다. 본 발명은 특히 식품 등의 시료에 포함된 균주를 검출하는 방법을 제공하기 위하여, 상기 프라이머 쌍이 포함된 조성물에 시료 또는 이로부터 추출한 핵산을 혼합하고; PCR을 수행하여 포함되어 있는 미생물의 DNA를 증폭한 후; 상기 증폭된 결과로부터, 대장균 및 대장균군의 포함 여부를 확인하는 단계를 수행한다.
상기 검출 방법에 있어서, 본 발명의 일 실시예에서는 대장균을 검출하기 위한 프라이머 쌍 (서열번호 1 및 서열번호 2)을 시료에 처리하고, 대장균군을 검출하기 위한 프라이머 쌍(서열번호 3 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8)을 처리한 후, 총균의 포함 여부를 확인하기 위한 프라이머 쌍 (서열번호 9 및 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12)을 처리하여 상기 처리된 시료를 각각 PCR 분석을 통해 증폭 및 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명의 프라이머 쌍은 대장균, 대장균군 및 총균에 특이적인 서열을 동시에 증폭할 수 있으며, 상기 균주의 포함 여부를 신속하고 편리하게 검출할 수 있는 효과를 가진다. 또한, 교차 반응성이 적은 서열을 이용함으로 인하여, 해당 균주에 대한 높은 특이성으로, 정확한 검출이 가능한 특징을 가진다.
도 1은 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트 1을 이용하여, 대장균을 검출한 결과를 나타낸 것이며, NTC(no template control)는 대조군이다.
도 2는 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 세트 2를 이용하여, 대장균군에 포함되는 균주를 검출한 결과를 나타낸 것이며, NTC(no template control)는 대조군이다.
도 3은 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트 3을 이용하여, 대장균군에 포함되는 균주를 검출한 결과를 나타낸 것이며, NTC(no template control)는 대조군이다.
도 4는 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트 4를 이용하여, 대장균군에 포함되는 균주를 검출한 결과를 나타낸 것이며, NTC(no template control)는 대조군이다.
도 5는 서열번호 9 및 10로 이루어진 프라이머 세트 5를 이용하여, 총균에 포함되는 균주를 검출한 결과를 나타낸 것이며, NTC(no template control)는 대조군이다.
도 6은 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머 세트 6을 이용하여, 총균에 포함되는 균주를 검출한 결과를 나타낸 것이며, NTC(no template control)는 대조군이다.
도 2는 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 세트 2를 이용하여, 대장균군에 포함되는 균주를 검출한 결과를 나타낸 것이며, NTC(no template control)는 대조군이다.
도 3은 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트 3을 이용하여, 대장균군에 포함되는 균주를 검출한 결과를 나타낸 것이며, NTC(no template control)는 대조군이다.
도 4는 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트 4를 이용하여, 대장균군에 포함되는 균주를 검출한 결과를 나타낸 것이며, NTC(no template control)는 대조군이다.
도 5는 서열번호 9 및 10로 이루어진 프라이머 세트 5를 이용하여, 총균에 포함되는 균주를 검출한 결과를 나타낸 것이며, NTC(no template control)는 대조군이다.
도 6은 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머 세트 6을 이용하여, 총균에 포함되는 균주를 검출한 결과를 나타낸 것이며, NTC(no template control)는 대조군이다.
이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 실험 대상 균주 준비
실험에 사용하는 5개의 균주를 생물 자원 센터에서 분양 받아 준비 하였다. (표 1). 각각의 균은 -80
의 초저온 냉동고에 보관하면서 실험에 사용 하였다.
| 종류 | 균주명 | 분양기관 및 구매회사 |
| 대장균 및 대장균군 | E. coli | 생물자원센터 |
| Enterobacter cloacae | 생물자원센터 | |
| Klebsiella pneumoniae | 생물자원센터 | |
| Citrobacter freundii | 생물자원센터 | |
| Hafnia alvei | 생물자원센터 | |
| 일반세균 | Pseudomonas aeruginosa | 생물자원센터 |
| Staphylococcus aureus | 생물자원센터 | |
| Lactobacillus brevis | 생물자원센터 | |
| Brochothrix thermosphacta | 생물자원센터 |
실시예 2. 균 검출 특이적 프라이머 제작
대장균, 대장균군 및 총균을 검출하기 위하여, 대장균(1종), 대장균군(4종) 및 총균(4종) 각각의 프라이머 세트를 제작하였다(표 2). 프라이머 세트의 제작 시, 일치하는 서열 부분(conserved region)을 찾기 위해 DNAstar 및 프라이머 제작 프로그램인 DECIPHER(http://www2.decipher.codes/DesignPrimers.html)를 이용하였다.
| 검출 균주 | 프라이머 세트 번호 | 프라이머 명 | 염기 서열(5’→3’) | |
| 대장균 | E. coli | 1 | Ybbw-F (서열번호 1) | gcc att gca ccg aca aaa ctg acc t |
| Ybbw-R (서열번호 2) | acc gga cca agc att ccg ccg ata a | |||
| 대장균군 |
E. coli
E. cloacae K. pneumoniae C. freundii H. alvei |
2 | 16s coliform 1-F (서열번호 3) | TAG AGG GGG GTA GAA TTC CAG |
| 16s coliform 1-R (서열번호 4) | CGC ACC TGA GCG TCA GTC TT | |||
| 3 | 16s coliform 2-F (서열번호 5) | GGA CGG GTG AGT AAG GTC TG | ||
| 16s coliform 2-R (서열번호 6) | AGC TAA TCC CAT CTT GGC AC | |||
| 4 | 16s coliform 3-F (서열번호 7) | GGA CGG GTG AGT AAG GTA TG | ||
| 16s coliform 3-R (서열번호 8) | AGC TAA TCC CAT CTT GGA AC | |||
| 총균 |
E. coli
E. cloacae K. pneumoniae C. freundii H. alvei P. aeruginosa S. aureus L. Brevis B. thermosphacta |
5 | universal 30-F (서열번호 9) | AAC AGG ATT AGA TAC CCT GGT AGT CCA |
| universal 30-R (서열번호 10) | GAA TTA AAC CAC ATG CTC CAC CGC TTG TGC | |||
| 6 | universal 20-F (서열번호 11) | AGG ATT AGA TAC CCT GGT AGT CCA | ||
| universal 20-R (서열번호 12) | CCT TGC GGY* CGT ACT CCC CAG GCG G |
*Y T/C (pyrimidine)
실시예 3. total RNA 분리 및 프라이머 특이성 확인
3-1) 세균 및 바이러스로부터 gDNA 추출
Luria-Bertani 액체 배지에서 배양된 세균의 gDNA Total DNA extraction S&V kit(bionics)를 이용하여 추출하였다. 추출된 gDNA는 nanodrop를 이용하여 정량하였다.
3-2) 제작된 프라이머의 PCR 조건 확립
추출된 gDNA를 정량한 후 각 균의 gDNA 농도를 8.4ng/uL가 되도록 희석하였다. 희석된 gDNA를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였고 이를 통해 설계된 프라이머 세트(표 2)의 각 균에 대한 특이성을 확인하였다.
특이성 검정을 위한 실시간 PCR은 TOPreal?? qPCR 2X PreMIX (enzynomisc)를 이용하여 진행하였고 희석한 gDNA 중 1㎕의 gDNA를 주형으로 이용하였다. 1㎕의 5', 3'-프라이머(10μM), 10㎕의 qPCR pre-mix, 7㎕의 DEPC D.W.를 첨가하여 전체 부피를 20㎕로 조절하였다. PCR 온도 조건은 어닐링 온도(annealing temperature)를 55
로 설정하고 95
분 간 변성시킨 다음, 95℃에서 15초, 어닐링 온도에서 15초, 72
에서 30초간의 과정으로 20~40회 반복 수행하였다.
3-3) 제작된 PCR 프라이머 특이성 확인
상기 프라이머 중, 대장균 검출용 프라이머는 E. coli에서만 특이적으로 발견되는 유전자인 ybbw의 염기서열을 이용하여, 서열번호 1 및 2의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 1을 제작하였다.
대장균군 검출용 프라이머는 계통학적으로 보존적인 염기 서열을 가지고 있는 16s rRNA의 염기서열 중 대장균군에 속하는 균에서 공통적으로 존재하는 부분을 선별하여 비 대장균과 구별될 수 있도록 서열번호 3 및 4의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 2, 서열번호 5 및 6의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 3을 각각 합성하였다. 또한, 프라이머 검출 효율을 향상하기 위하여, 즉, 의도적인 미스매치 서열을 도입하였을 때, 비 대장균과 대장균 군 사이의 구별을 더 효과적으로 할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 상기 프라이머 세트 3에서 N-2 위치에 미스매치를 유발한 서열번호 7 및 8의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 4를 추가 제작하였다.
총균 검출용 프라이머 역시 16s rRNA의 염기서열을 이용하였으며, 서열번호 9 및 10의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 5, 서열번호 11 및 12의 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 6을 제작하여 사용하였다.
즉, 각 균의 염기서열을 나열한 후 일치하는 서열을 찾아 이 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 디자인하였으며, 그 결과, 각 세균에서 추출한 gDNA(DNA copy number: 2X105)를 동량으로 혼합한 시료에 합성된 프라이머 세트(표 2)를 넣고 실시간 PCR을 수행하였다. 이 때, 대조군(NTC, no template control)으로, F/R 프라이머만을 넣고 동일하게 실험을 수행하였으며, 이는 샘플의 공기중 오염 또는 프라이머-다이머에 의한 위양성 발생 유무를 확인하기 위한 것이다.
그 결과, 프라이머 세트 1을 사용하였을 때는 E.coli를 제외한 모든 균에서 증폭이 일어나지 않았다(도 1). 프라이머 세트 2 및 3 에서는 E.coli, K. pneumoniae, E. cloacae에서는 증폭 산물이 확인되었지만 P. aeruginosa, S. aureus 에서는 증폭이 되지 않았다(도 2, 도 3 및 도 4).
또한 프라이머 세트 5 및 6을 사용하여 PCR을 수행하였을 때, 모든 균에서 증폭이 일어남을 확인하였다. (도 5 및 도 6)
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
삭제
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> coliform 16s rRNA forward primer 1
<400> 3
tagagggggg tagaattcca g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> coliform 16s rRNA reverse primer 1
<400> 4
cgcacctgag cgtcagtctt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> coliform 16s rRNA forward primer 2
<400> 5
ggacgggtga gtaaggtctg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> coliform 16s rRNA reverse primer 2
<400> 6
agctaatccc atcttggcac 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> coliform 16s rRNA forward primer 3
<400> 7
ggacgggtga gtaaggtatg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> coliform 16s rRNA reverse primer 3
<400> 8
agctaatccc atcttggaac 20
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> universal 16s rRNA forward primer 30
<400> 9
aacaggatta gataccctgg tagtcca 27
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> universal 16s rRNA reverse primer 30
<400> 10
gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc 30
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> universal 16s rRNA forward primer 20
<400> 11
aggattagat accctggtag tcca 24
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> universal 16s rRNA reverse primer 20
<400> 12
ccttgcggyc gtactcccca ggcgg 25
Claims (10)
- 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 대장균 검출용 프라이머 세트;
서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 대장균군 검출용 프라이머 세트; 및
서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 총균 검출용 프라이머 세트를 포함하는 대장균, 대장균군 및 총균 동시 검출용 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 대장균군은 에스케리키아 속(Escherichia sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.), 클렙시엘라 속(Klebsiella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.) 및 하프니아 속(Hafnia sp.) 균을 포함하는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 총균은 제3항의 대장균군 외에, 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 및 브로코트릭스 속(Brochothrix sp.) 균을 추가로 포함하는 것인 조성물.
- 제1항의 조성물을 포함하는 대장균, 대장균군 및 총균 동시 검출용 키트.
- 제5항에 있어서, 상기 키트는 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 이용하는 것인, 키트.
- 제5항에 있어서, 상기 키트는 DNA 중합효소, dNTP 및 반응완충액을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 제1항의 조성물을 시료와 혼합하여, 중합효소 연쇄반응을 수행하여 DNA 를 증폭하는 단계; 및
상기 증폭된 DNA를 이용하여, 대장균, 대장균군 및 총균에 속하는 미생물의 검출을 확인하는 단계를 포함하는 대장균, 대장균군 및 총균 동시 검출 방법. - 제8항에 있어서, 상기 검출 방법은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 시료에 처리하는 단계;
서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 또는 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 시료에 처리하는 단계; 및
서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 시료에 처리하는 단계를 포함하는 검출 방법. - 제9항에 있어서, 상기 단계는 각각 동시에 또는 순차적으로 수행되는 것인 검출 방법.
Priority Applications (1)
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| KR1020200100646A KR102336532B1 (ko) | 2020-08-11 | 2020-08-11 | 대장균, 대장균군 및 총균의 표적 서열 증폭을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020200100646A KR102336532B1 (ko) | 2020-08-11 | 2020-08-11 | 대장균, 대장균군 및 총균의 표적 서열 증폭을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Publications (1)
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| KR102336532B1 true KR102336532B1 (ko) | 2021-12-06 |
Family
ID=78936300
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020200100646A KR102336532B1 (ko) | 2020-08-11 | 2020-08-11 | 대장균, 대장균군 및 총균의 표적 서열 증폭을 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 |
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|---|---|
| KR (1) | KR102336532B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113265351A (zh) * | 2021-05-11 | 2021-08-17 | 昆明理工大学 | 一株乳杆菌w8172及其应用 |
Citations (3)
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| US5376528A (en) * | 1989-02-06 | 1994-12-27 | Amoco Corporation | Probes and methods for the detection of Listeria |
| KR20090031716A (ko) * | 2006-07-05 | 2009-03-27 | 오스트리안 리서치 센터 게엠베하-에알씨 | 병원균의 확인 |
| WO2009039549A2 (de) * | 2007-09-27 | 2009-04-02 | Herbert Wiesinger-Mayr | Verfahren zur bestimmung von mikroorganismen |
-
2020
- 2020-08-11 KR KR1020200100646A patent/KR102336532B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
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|---|
| David I Walker et al., Water Res., 2017, 126, PP.101-110* * |
| GENBANK ACCESSION NO. CP056278, LS991346, CP041733, JQ885556, MT669825 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN113265351A (zh) * | 2021-05-11 | 2021-08-17 | 昆明理工大学 | 一株乳杆菌w8172及其应用 |
| CN113265351B (zh) * | 2021-05-11 | 2022-05-06 | 昆明理工大学 | 一株乳杆菌w8172及其应用 |
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