CN114107300B - 基于CRISPR-Cas技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性点突变的crRNA - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性点突变的crRNA，本发明以MDR‑TB利福平耐药性点突变(rpoBL378D)为检测靶位点，设计并合成靶向该目的序列的crRNA；构建基于CRISPR/Cas的MDR‑TB利福平耐药性点突变检测手段，通过联合等温扩增技术和荧光报告子检测手段，实现快速、简便、低廉、高特异性、高灵敏度和可视化的核酸检测优势。本发明旨在开发结核病耐药性点突变检测平台，为TB的预防和治疗提供帮助，具有推广应用的价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR-Cas核酸检测技术，及其靶向结核分枝杆菌利福平耐药性基因rpoB点突变的crRNA设计合成及纯化。
背景技术
结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis,MTB)感染机体所引起的重大传染性疾病。耐药性TB特别是多药耐药性TB的出现为TB的预防和治疗带来了挑战。快速、简便、高灵敏和高特异性的核酸检测手段成为TB治疗的重中之重。
近年来，精确、灵敏的核酸检测技术不断发展，成为WHO公认的病原菌检测标准。多聚酶链式反应(PCR)、Xpert MTB/RIF、DNA测序技术及线性探针实验等等，因为高的精确性、特异性或灵敏度而被广泛应用于病原菌检测。但是需要精密仪器和专业人员、费用昂贵或耗时等因素限制了这些技术在特定区域的使用。等温扩增技术的应用降低了PCR仪器需求限制，该技术包括重组酶聚合酶扩增技术(RPA)、环介导等温扩增技术(LAMP)等类型。但是，在后续基因的验证方面仍然需要复杂的设备或繁琐的操作步骤。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述仪器及专业操作人员需求、费用、耗时等问题，实现快速、便捷、高灵敏和高特异性等目的，本发明提供一种基于 CRISPR-Cas12a核酸检测技术以检测结核分枝杆菌利福平耐药性点突变。本发明通过设计并合成靶向耐药性突变点双链DNA(dsDNA)序列的crRNA而达到检测目的。当crRNA和双链DNA(dsDNA)发生碱基互补配对时，Cas12a“正式裂解”和“反式裂解”活性均被激活，而“反式裂解”活性可以裂解非靶向单链DNA(ssDNA)。基于Cas12a所呈现的“反式裂解”活性，设计一种ssDNA FAM-BHQ1或FAM-Biotin报告子，实现简便、快速、低廉、高灵敏、高特异性和可视化的核酸检测。利用CRISPR/Cas核酸检测技术的优势，实现结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB点突变的检测，为TB的诊断和治疗提供帮助。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明包括以下步骤：
S1：引物合成：以利福平耐药性基因rpoB(L378D)为靶向检测突变点，利用CRIPSOR网站(http://crispor.tefor.net/)设计crRNA。首先合成crRNA的转录模板DNA，模板链5’端添加T7启动子 5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGG，非模板链5’端添加骨架序列 5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3’，序列由北京Ruibiotech公司合成并插入Topo载体(如图1所示)；
S2：crRNA转录：40μL转录体系包括20μL NTP Buffer Mix、1μg的 crRNA-Topo载体、4μL的T7 RNA聚合酶Mix，无RNase水定容，37℃恒温孵育16h；
S3：crRNA纯化：利用Monarch RNA纯化试剂盒(T2040，NEB)对体外转录的crRNAs进行纯化。
所述步骤S1引物合成具体包括以下步骤：
S1.1将合成crRNA的转录模板DNA，DNA一端添加T7启动子序列 5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGG’和
骨架序列5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3’，序列两端插入Hind III 和BamH I粘性末端；
S1.2：引物退火：crRNA转录模板DNA进行100℃热变性，室温退火形成双链，稀释该双链DNA至10μM备用；
S1.3：pET28a质粒酶切反应：BamH I、Hind III、10X QuickCut Buffer、pET28a、灭菌水在37℃条件下反应30min，而后在90℃条件下反应10min；
S1.4：2％琼脂糖凝胶电泳检测；
S1.5：使用胶回收试剂盒回收pET28a酶切片段；
S1.6：连接反应：T4 DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液、pET28a胶回收片段、crRNA转录模板、灭菌水在16℃反应1h；
S1.7：转化：将上述步骤S6中的反应液10μL全部加至50μL感受态细胞中，冰上放置30min；42℃热激90s，冰上放置3-5min；PCR管中加入600μL 新鲜的LB培养液，混合均匀，取200μL涂布于含100μg/mL卡那霉素的LB固体平板；37℃倒置培养12-14h；挑取单克隆加入10mL新鲜的含100μg/mL卡那霉素的LB液体于培养基中，37℃、200rpm培养14-16h；取700μL菌液测序。
进一步，所述步骤S3中：BamH I为3μL、Hind III为3μL、10X QuickCut Buffer为5μL、pET28a为10μL、灭菌水为29μL，终体积为50μL。
进一步，所述步骤S6中：T4 DNA连接酶为0.5μL、T4 DNA连接酶缓冲液为1μL、pET28a胶回收片段为1μL、crRNA转录模板为1μL、灭菌水为6.5 μL。
优选的，所述pET28a的含量为100ng/μL。所述pET28a胶回收片段含量为50ng/μL。所述crRNA转录模板含量为10μM，在进行DETECTR检测时具有特异性和敏感性。
本发明的有益效果在于：
本发明基于CRISPR-Cas核酸检测技术，以MDR-TB利福平耐药性点突变(rpoBL378D)为检测靶位点，设计并合成靶向该目的序列的crRNA。通过构建基于CRISPR/Cas的MDR-TB耐药性点突变检测手段，联合等温扩增技术和荧光报告子检测手段，实现快速、简便、低廉、高特异性、高灵敏度和可视化的核酸检测优势。本发明旨在开发结核病耐药性点突变检测平台，为TB的诊断和治疗提供帮助，具有推广应用的价值。
附图说明
图1是靶向rpoB(L378D)突变点的crRNA合成模板设计
图2是野生型和突变型rpoB基因序列及靶向rpoB(L378D)突变点的crRNA 序列图；
图3是LbCas12a靶基因裂解实验结果图；
图3中：1和2号反应体系添加野生型rpoB非靶基因，3和4号反应体系添加突变型rpoB靶基因；
图4是基于Cas12a的检测体系；
图4中：(a)：ssDNA FAM-BHQ1荧光报告子检测实验结果图；(b)：ssDNA FAM-Biotin报告子的纸层析检测结果图；
图4(a)中：3号反应体系添加靶基因rpoB(L378D)，7号孔添加非靶基因野生型rpoB。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明：
1目的基因合成及crRNA设计：
1.1目的基因及靶位点载体的制备
根据生物信息学分析及相关文献查阅，确定利福平耐药基因rpoBL378D为本发明的检测靶位点。野生型rpoB基因片段(757bp)由北京Ruibiotech公司合成，并构建到Topo载体上。
1.2rpoB L378号密码子点突变基因载体的制备
根据Takara点突变试剂盒使用说明，对rpoBL378号密码子(CTG>CGG) 进行突变实验，详细步骤如下：
1.2.1点突变载体基因的获得
(1)设计合成输入突变碱基的引物和对应的PCR扩增引物，两端引物的5’端必须相邻接，引物长度约25bp左右；
(2)配制如下的PCR反应体系，总体积50μL：
(3)PCR反应条件：
(4)PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测；
(5)胶回收目的片段；
1.2.2末端平滑化及5’端磷酸化反应
(1)反应体系：
(2)反应条件：37℃，10min；70℃，10min。
1.2.3连接反应
(1)取上述反应液5μL，加至新的200μL的PCR管中；
(2)加入5μL Ligation Solution I，混合均匀；
(3)16℃反应1h，反应液可冻存于-20℃备用。
1.2.4转化
将上述(3)中的反应液(10μL)全部加至50μL感受态细胞中，冰上放置 30min；42℃热激90s，立即放置冰上3-5min；PCR管中加入600μL新鲜的 LB培养液(无抗生素)，混合均匀，取200μL涂布于LB固体平板(含100μg/mL 氨苄青霉素钠(Amp))；37℃倒置培养14-16h；挑取单克隆加至10mL新鲜的 LB液体培养基(含100μg/mL Amp)中，37℃、200rpm培养14-16h；取700μL 菌液送至北京Ruibiotech公司测序。
1.2.5基因模板质粒的制备
依据Takara质粒提取试剂盒的说明书的要求制备测序正确的菌液并提取质粒，用Nanodrop仪器测定获得模板质量的浓度。
1.3crRNA的制备
1.3.1crRNA设计原则：
(1)crRNA序列不能与等温扩增(RPA)引物序列重叠；
(2)CRISPR/LbCas12a核酸检测实验中，crRNA长度为28-35bp；
(3)为避免形成自身激活的RNA二级结构，将间隔序列(Spacers)与5’骨架序列连接形成完整的crRNA；
(4)当LbCas12a靶向dsDNA时，crRNA必须置于PAM(5'TTTV)；
(5)检测突变点必须位于crRNA 3’端，距离crRNA3’端0-10bp以内(如图2所示)。
2crRNA设计与表达载体的构建
2.1crRNA序列的设计与合成
由北京Ruibiotech公司合成crRNA的转录模板DNA，DNA一端添加T7启动子序列(5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3’)，另一端添加crRNA骨架序列(5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3’)(如图1所示)，序列两端插入Hind III和BamH I粘性末端，合成对应基因的序列。
2.2crRNA表达载体的构建
(1)引物退火
crRNA转录模板DNA进行100℃热变性5min，1min降低3℃的速度降至室温，获得退火后的双链，稀释该双链DNA至10μM备用。
(2)pET28a质粒酶切反应
1)反应体系：
2)反应条件：37℃，30min；90℃，10min。
(3)2％琼脂糖凝胶电泳检测
(4)胶回收pET28a酶切片段
(5)连接反应
1)反应体系：
2)反应条件：16℃反应1h。
(6)转化
同步骤1.2.4，区别在于所用的抗生素为卡那霉素。
(7)双酶切验证
酶切体系：
反应条件：37℃反应30min。反应结果用1％琼脂糖凝胶电泳和测序验证。 crRNA_pET28a重组质粒送北京睿博兴科生物技术有限公司测序。
2.3crRNA转录
反应体系(根据NEB公司HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis kit)：
反应条件：37℃反应过夜(约16h)。
2.4crRNA纯化
每20μL样品中，添加50μL Agencourt RNAClean XP磁珠和45μL异丙醇。通过上下吹打5次进行混合，然后在室温下孵育5min。置于磁力架上5min，弃上清液。然后向微珠中加入100μL 85％的乙醇清洗30s，然后弃乙醇溶液。重复洗涤一次。将磁珠在室温下风干5min，加入25μL无RNA酶的超纯水，室温下孵育5min，使用磁力架，使珠子与洗脱的crRNA样品分离。获得纯化的crRNA，使用Nanodrop测定crRNA的浓度。
3crRNA识别特异性评价
LbCas12a裂解实验：如图3所示，在研究LbCas12a靶向裂解活性的四个反应体系中，只有当rpoB(L378D)靶基因存在时，LbCas12a才表现出裂解目的基因片段的生物活性(“正式裂解”活性)。
4DETECTR检测
如图4(a)所示，ssDNA FAM-BHQ1荧光报告子检测实验共设计了7个反应体系，只有LbCas12a、crRNA_rpoBL378D及rpoBL378D都存在时，LbCas12a 的“反式裂解”活性才被活化，后者通过裂解非靶序列的ssDNA FAM-BHQ1荧光报告子序列而使检测结果可视化。图4(b)展示了ssDNAFAM-Biotin报告子的纸层析检测结果，进一步证实了LbCas12a能够有效检测核酸序列中单碱基突变。
CRISPR/Cas核酸检测技术的发展，为开发简便、快速、高灵敏和高特异性的核酸检测方法带来了希望。CRISPR/Cas12a核酸检测技术通过crRNA精准地识别双链DNA(dsDNA)靶序列，激活Cas12a蛋白的“反式裂解”活性。基于 Cas蛋白的“反式裂解”活性，我们设计了荧光或纸层析试纸条检测的报告子 (/56-FAM/NNNNNN/3BHQ1/或/56-FAM/NNNNNN/3Biotin/)，再联合等温扩增技术，实现快速、简便、低廉、高特异性、高灵敏度和可视化的核酸检测优势。目前，基于Cas12a的DETECTR(DNAEndonuclease-Targeted CRISPR TransReporter)核酸检测体系研究最多、最成熟，并且已经成功应用于SARS-CoV-2、 ZIKA、Dengue、HBV、HIV等病毒检测。本研究利用基于CRISPR-Cas12a核酸检测技术，旨在开发结核病耐药性点突变检测平台，为TB的预防和治疗提供帮助。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 宁夏医科大学
<120> 1、一种基于CRISPR-Cas技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性点突变的crRNA
<130> 2021.11.11
<141> 2021-11-30
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
gaaattaata cgactcacta taggg 25
Claims (5)
1.一种基于CRISPR-Cas技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性点突变的crRNA的制备方法，其特征在于，所述crRNA的序列为：5`-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAUCCGCUCGCCGACCGUACGCAGGCG-3`，所述crRNA的制备方法包括以下步骤：
S1：引物合成：以利福平耐药性基因rpoB为靶向检测突变点设计crRNA；首先合成crRNA的转录模板DNA，模板链5’端添加T7启动子5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGG，非模板链5’端添加骨架序列5’-TAATTTCTACTAAGTGTAGAT-3’，序列合成并插入Topo载体；所述引物合成包括以下步骤：
S1.1合成crRNA的转录模板DNA，其中模板链5’端添加T7启动子5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGG，非模板链5’端添加骨架序列5’-TAATTTCTACTAAGTGTAGAT-3’，序列两端插入Hind III和BamH I粘性末端；
S1.2：引物退火：crRNA转录模板DNA进行100 ℃热变性5 min，1 min降低3 ℃的速度降至室温，获得退火后的双链，稀释该双链DNA至10 μM备用；
S1.3：pET28a质粒酶切反应：BamH I、Hind III、10X QuickCut Buffer、pET28a、灭菌水在37 ℃条件下反应30 min，而后在90 ℃条件下反应10 min；
S1.4：2%琼脂糖凝胶电泳检测；
S1.5：使用胶回收试剂盒回收pET28a酶切片段；
S1.6：连接反应： T4 DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液、pET28a胶回收片段、crRNA转录模板、灭菌水在16 ℃反应1 h；
S1.7：转化：将上述步骤S6中的反应液10 μL全部加至50 μL感受态细胞中，冰上放置30min；42 ℃热激90 s，冰上放置3-5 min；PCR管中加入600 μL新鲜的LB培养液，混合均匀，取200 μL涂布于含100 μg/mL卡那霉素的LB固体平板；37 ℃倒置培养12-14 h；挑取单克隆加入10 mL新鲜的含100 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃、200 r.p.m.培养14-16 h；取700 μL菌液测序；
所述步骤S1.3中：BamH I为3 μL、Hind III为3 μL、10 X QuickCut Buffer为5 μL、pET28a为10 μL、灭菌水为29 μL，终体积为 50 μL；
S2：crRNA转录：40 μL转录体系包括20 μL NTP Buffer Mix、1 μg的crRNA-Topo载体、4μL的T7 RNA聚合酶Mix，无RNase水定容，37 ℃恒温孵育16h；
S3：crRNA纯化：利用Monarch RNA纯化试剂盒,对体外转录的crRNAs进行纯化。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性点突变的crRNA的制备方法，其特征在于：所述步骤S1.6中：T4 DNA连接酶为0.5 μL、T4 DNA连接酶缓冲液为1 μL、pET28a胶回收片段为1 μL、crRNA转录模板为1 μL、灭菌水为6.5 μL。
3.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性点突变的crRNA的制备方法，其特征在于：所述pET28a的含量为100 ng/μL。
4.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性点突变的crRNA的制备方法，其特征在于：所述pET28a胶回收片段含量为50 ng/μL。
5.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas技术检测结核分枝杆菌利福平耐药性点突变的crRNA的制备方法，其特征在于：所述crRNA转录模板含量为10 μM，在进行DETECTR检测时具有特异性和敏感性。
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