CN118086243A - 一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用，其氨基酸的序列如SEQ ID NO:4，其核苷酸的序列如SEQ ID NO:8，具有热启动功能和耐抑制物优势，同时具有热稳定性好、比活力高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用，属于PCR技术领域。
背景技术
PCR技术由Kary Mullis于1988年首创，是一种应用十分广泛的体外扩增DNA技术。自问世以来，已扩展到各个领域。在临床疾病诊断发挥了重大作用。PCR反应主要依赖于DNA聚合酶，最初使用的DNA的酶是来源于大肠杆菌聚合酶的Klenow片段，此酶不耐热，每扩增一个反应需要开盖添加一次酶，极不方便。
1969年在美国黄石国家森林公园火山温泉中分离得到一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)YT-1，它耐受高温，适宜生长在70℃-75℃极富含矿物质的环境中。1976年，A.Chien从中分离纯化到了耐热的Taq DNA聚合酶(简称，Taq酶)。这种酶非常适合PCR技术，可使PCR过程实现自动连续循环，大大提高PCR的效率。
1992年，Higuchi等人开发了实时PCR(qPCR)。这种增强的PCR方法通过荧光染料或荧光共振能量转移探针实时检测反应过程中形成的产物量。实时PCR使反应中DNA的起始量和整个过程中DNA的产生量实现可视化。与一般的培养方法相比，实时PCR的检测方法在速度、特异性、灵敏度等多方面具有明显的优势，现已大规模应用于检测市场。
实时PCR非常依赖Taq DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶的性能很大部分决定检测试剂的性能好坏。野生型Taq DNA聚合酶在结构上的缺陷，使其在许多应用领域受到限制。一种本身具有热启动功能、耐抑制物的Taq酶非常具有临床应用价值。具有热启动功能的TaqDNA聚合酶在低温下不具有酶活，可以减少非特异扩增，能提升裸酶的检测灵敏度，另一方面也能减少抗体的使用，甚至不需要使用抗体，而耐受抑制物的Taq DNA聚合酶在检测成分复杂的血液样本时可以提升检出率。
现有的一些突变Taq DNA聚合酶具有以上热启动功能、耐抑制物优势，但是，在进一步实验过程中发现此突变Taq DNA聚合酶具有37℃热稳定性差、酶比活力低等关键性缺陷，导致无法应用于临床检测。
发明内容
本发明提供了一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用，可以有效解决上述问题。
本发明是这样实现的：
一种Taq DNA聚合酶突变体，其氨基酸的序列如SEQ ID NO:4。
在一些实施例中，所述的Taq DNA聚合酶突变体的核苷酸的序列如SEQ ID NO:8所示。
在一些实施例中，所述的Taq DNA聚合酶突变体为野生型Taq DNA聚合酶发生R536N、I707L、E708Q位点突变而成。
一种核酸，包括上述的Taq DNA聚合酶突变体的核苷酸序列。
一种表达载体，其能表达上述的Taq DNA聚合酶突变体。
一种重组细胞，其包括上述的表达载体。
一种qPCR反应试剂，其包括上述的重组Taq DNA聚合酶突变体。
一种试剂盒，包括上述的重组Taq DNA聚合酶突变体或上述的核酸。
一种PCR方法，将如上述的Taq DNA聚合酶突变体应用于PCR。
在一些实施例中，所述的PCR方法为qPCR。
本发明的有益效果是：
本发明提供一种Taq DNA聚合酶的突变体，具有热启动功能和耐抑制物优势，同时具有37℃热稳定性、比活力高的特点，有利于Taq DNA的大规模的临床应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例提供的Taq DNA聚合酶酶活标准曲线图。
图2为本发明实施例提供的4个Taq DNA聚合酶突变体的热启动功能验证。
图3为本发明实施例提供的4个Taq DNA聚合酶突变体在15％全血样品PCR的核酸电泳图。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供一种Taq DNA聚合酶突变体，其氨基酸的序列如SEQ ID NO:4，为野生型Taq DNA聚合酶发生R536N(对应的核苷酸突变为CGG-ATT)、I707L(对应的核苷酸突变为ATT-CTT)、E708Q(对应的核苷酸突变为GAG-CAG)位点突变而成。该Taq DNA聚合酶突变体具有热启动功能、耐抑制物优势，同时具体较高的热稳定性及酶的比活力。其中，野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸如SEQ ID NO:5所示。
在一些实施例中，所述的Taq DNA聚合酶突变体的核苷酸的序列如SEQ ID NO:8所示。
一种核酸，包括上述的Taq DNA聚合酶突变体的核苷酸序列。
一种表达载体，其能表达上述的Taq DNA聚合酶突变体。该表达载体为将Taq DNA聚合酶突变体的核苷酸序列插入质粒载体或病毒载体中而成。
一种重组细胞，其包括上述的表达载体。该重组细胞为将上述表达载体转染感受态细胞而成，该重组细胞可以表达上述Taq DNA聚合酶突变体蛋白。
一种PCR反应试剂，其包括上述的重组Taq DNA聚合酶突变体。
一种试剂盒，包括上述的重组Taq DNA聚合酶突变体或上述的核酸。
一种PCR方法，将如上述的Taq DNA聚合酶突变体应用于PCR。在一些实施例中，所述的PCR方法为qPCR。在一些实施例中，qPCR反应的反应体系为50μL，其中，上游引物和下游引物各0.125μL，1％BSA1BSAμL，10×PCR buffer 5μL，Taq DNA聚合酶突变体0.5μL，目标样本5μL，纯化水38.25μL。
实施例1
1、Taq DNA聚合酶的基因的获取、合成及载体构建
在NCBI上查找到野生Taq DNA聚合酶(下文称Taq1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，在文献Mutants of Taq DNA polymerasere sistant to PCR inhibitor sallowDNAamplification from whole bloodand crude soil samples中查到突变Taq DNA聚合酶Taq22(下文称Taq2)的氨基酸序列SEQ ID NO:2)(E626K、I707L、E708Q突变)，并对其进行进行氨基酸突变，送上海生工生物合成获得突变Taq DNA聚合酶(下文称Taq3)的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)(I707L、E708Q突变)与突变Taq DNA聚合酶(下文称Taq4)的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)(R536N、I707L、E708Q)，上海生工生物公司根据Taq1-4的氨基酸序列合成对应的核苷酸序列(SEQ ID NO:5-8)两个基因5’端与3’端分别带有Nde I和Xho I酶切位点，并构建到pET-28a载体(购于生物风)上。
2、Taq DNA聚合酶重组菌的构建及表达
将四种带有Taq DNA聚合酶基因的载体转化进大肠杆菌BL21(DE3)菌株(购于上海生工生物)，并涂布于LB平板，过夜培养，挑取单菌落。接种于10mL LB液体培养基中，加Kan抗生素至终浓度1mM，37℃，250rpm培养过夜，次日按1:100的比例转接于200mL LB培养基中，加Kan抗生素至终浓度1mM，37℃，250rpm培养至OD值为0.6-0.8，加入终浓度为0.01mM/L-0.2mM/L的异丙基硫代半乳糖苷，并在25℃诱导表达6-8h。
3、Taq DNA聚合酶的纯化
(1)4℃，8000rpm离心10min，收集四种发酵液菌体，四种重组Taq DNA聚合酶的纯化方案一致；
(2)按照菌体与BufferA(Tirs-HCl 20mM，氯化钠500mM，咪唑，10mM，调pH至7.4)质量比为1：10混合，冰浴超声破碎，破碎条件：功率300W，超声3S，暂停8S，破碎15min；
(3)4℃，12000rpm离心30min，收集上清，用0.22μm过滤膜过滤上清，上样至Ni层析柱；
(4)用BufferB(Tirs-HCl 20mM，氯化钠500mM，咪唑，20mM，调pH至7.4)洗杂蛋白；
(5)用BufferC(Tirs-HCl 20mM，氯化钠500mM，咪唑，200mM，调pH至7.4)洗脱蛋白；
(6)将纯化的四种重组Taq DNA聚合酶超滤换液、浓缩，保存到储存Buffer(Tris-HCl(pH 8.0)20mM，KCl 100mM，DTT 1mM，Tween20 0.5％，NP40 0.5％，glycerol 50％(v/v)。
实施例2Taq DNA聚合酶的酶活检测
取发夹型寡核苷酸
TAGCGAAGGATGTGAACCTAATCCCTGCTCCCGCGGCCGATCTGCCGGCCGCGG(SEQ ID NO:9)，稀释至100μmol/L。
配制10×Taq buffer：250mmol/L Tris-HCl，50mmol/L(NH4)·SO4，500mmol/LKCl，1％(体积比)Tritonx-100，pH8.8(25℃)，25mmol/L MgCl2，25mmol/L dNTP。
按照下表1配方配制，所有操作在冰上进行，每个实验均有三个重复：
表1
| 反应液组分 | 用量(μL) |
| 10×Taq buffer | 2.5 |
| PicoGreen | 0.5 |
| 发夹型寡核苷酸 | 0.1 |
| Taq酶 | 0.5 |
| 纯化水 | 21.4 |
| 总计 | 25 |
在荧光定量PCR仪上设置温度程序：
扩增温度为72℃；扩增时间为16s；120个循环；荧光采集通道；FAM。按照以上温度分别预热荧光定量PCR仪半小时，将加入反应液的PCR八联管置于荧光定量PCR仪，开始聚合反应，反应结束后，根据荧光定量PCR数据，计算第20cycles的荧光值与初始值的差异。
以TAKARA的Taq酶0.025、0.05、0.075、0.1、0.2、0.3、0.4U/μL作酶活标准曲线。将不同的Taq DNA聚合酶稀释到同一浓度检测的数据代入标准曲线计算不同突变体的酶活。结果如图1，TAKARA的Taq酶标准曲线，从图上看Taq酶标准的R2在0.99以上，此方法测定Taq酶活较为准确，将4个Taq DNA聚合酶荧光值代入标准曲线，计算4个Taq DNA聚合酶酶活，并计算比酶活，结果如表2，从表2上看，Taq1与Taq3的比活力相当，Taq2的比活力下降较大，同等酶活需要更多的酶量，由此可见E626K的突变会导致比酶活大幅下降，Taq4的比活力约为Taq1酶1.4倍，R536N的突变会小幅提升比酶活。
表2
实施例3qPCR试剂检测Taq DNA聚合酶热启动功能
合成引物HBV-L，序列为CAATCACTCACCAACCTCCTG
(SEQ ID NO:10)，引物HBV-R，序列为CGGGCAACATACCTTGATAA(SEQ ID NO:11)，探针HBV-P，序列为5’-FAM-CCAATTTGTCCTGGTTATCG(BHQ)-3’(SEQ ID NO:12)，稀释至100μmol/L。样本为HBV阳性血清，采用购置于天根生化科技的血清/血浆游离DNA提取试剂盒(货号DP339)提取样本DNA，根据HBV的qPCR试剂测定样本DNA的拷贝数，制备5×106-101copies/5μL的样本。
配制10×PCR buffer：250mmol/L Tris-HCl，50mmol/L(NH4)·SO4，500mmol/LKCl，1％(体积比)Tritonx-100，pH8.8(25℃)，40mmol/L MgCl2，25mmol/L dNTP，1mmol/LEDTA·2Na。
实验分成四组，分别为Taq1、Taq2、Taq3、Taq4酶组。
按照以下表3配方配制
表3
在荧光定量PCR仪上设置温度程序如表4所示：
表4
结果如图2所示，Taq2-4均有较好的热启动功能，在低浓度样本下均能起线，且PCR线性正常，Taq1在低浓度样本下，线性荧光值很低，在50copies下甚至检测不出来，具有热启动功能的酶检测灵敏度更高。
实施例4Taq DNA聚合酶耐抑制物实验
合成引物pCDNA3.1-F，序列为CTAGAGAACCCACTGCTTAC(SEQ ID NO:13)，引物pCDNA3.1-R，序列为AGAACTCCAGCATGAGATCC(SEQ ID NO:14)，稀释至10μmol/L。PCR的目的序列2263bp，将载体pCDNA3.1质粒加入到含15％的全血的样本中，组成目标样本。按照以下表5配方配制。
表5
| 反应液组分 | 用量(μL) |
| pCDNA3.1-F | 0.125 |
| pCDNA3.1-R | 0.125 |
| BSA(1％) | 1 |
| 10×PCR buffer | 5 |
| Taq酶 | 0.5 |
| 目标样本 | 5 |
| 纯化水 | 38.25 |
| 总计 | 50 |
在PCR仪上设置温度程序如表6所示：
表6
称取1.0g琼脂粉加入100mL TAE配制1.0％电泳胶。取以上PCR管，加6μL的Loadingbuffer，混匀离心取20μL上样至电泳胶。在120V下电泳30min，观察电泳条带并拍照。结果如图3所示，在15％的全血样本中，Taq2-4均能PCR出目的条带，Taq1的孔位无目的条带，Taq2-4有更高的抑制物能力。
实施例5Taq DNA聚合酶的热稳定性实验
将4种Taq DNA聚合酶分别在37度热加速1、3、5、7、14天，各取酶量2U，稀释10倍，检测酶活，酶活检测方法同上。结果如表7所示：Taq1与Taq4的热稳定性均较好，37℃热加速14天，酶活保持80％以上，Taq2酶37℃热加速3天保持80％酶活，Taq3酶37℃热加速1天，只剩不到80％的酶活了，单独的I707L、E708Q会严重影响Taq DNA聚合酶的热稳定性，在此基础上R536N有一定提高热稳定功能。
表7
Taq1氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSA KE*
Taq2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDKNLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWLQKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSA KE*
Taq3氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWLQKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSA KE*
Taq4氨基酸序列(SEQ ID NO:4)：
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYNELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWLQKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSA KE*
Taq1基因序列(SEQ ID NO:5)
ATGAGGGGGATGCTGCCCCTCTTTGAGCCCAAGGGCCGGGTCCTCCTGGTGGACGGCCACCACCTGGCCTACCGCACCTTCCACGCCCTGAAGGGCCTCACCACCAGCCGGGGGGAGCCGGTGCAGGCGGTCTACGGCTTCGCCAAGAGCCTCCTCAAGGCCCTCAAGGAGGACGGGGACGCGGTGATCGTGGTCTTTGACGCCAAGGCCCCCTCCTTCCGCCACGAGGCCTACGGGGGGTACAAGGCGGGCCGGGCCCCCACGCCGGAGGACTTTCCCCGGCAACTCGCCCTCATCAAGGAGCTGGTGGACCTCCTGGGGCTGGCGCGCCTCGAGGTCCCGGGCTACGAGGCGGACGACGTCCTGGCCAGCCTGGCCAAGAAGGCGGAAAAGGAGGGCTACGAGGTCCGCATCCTCACCGCCGACAAAGACCTTTACCAGCTCCTTTCCGACCGCATCCACGTCCTCCACCCCGAGGGGTACCTCATCACCCCGGCCTGGCTTTGGGAAAAGTACGGCCTGAGGCCCGACCAGTGGGCCGACTACCGGGCCCTGACCGGGGACGAGTCCGACAACCTTCCCGGGGTCAAGGGCATCGGGGAGAAGACGGCGAGGAAGCTTCTGGAGGAGTGGGGGAGCCTGGAAGCCCTCCTCAAGAACCTGGACCGGCTGAAGCCCGCCATCCGGGAGAAGATCCTGGCCCACATGGACGATCTGAAGCTCTCCTGGGACCTGGCCAAGGTGCGCACCGACCTGCCCCTGGAGGTGGACTTCGCCAAAAGGCGGGAGCCCGACCGGGAGAGGCTTAGGGCCTTTCTGGAGAGGCTTGAGTTTGGCAGCCTCCTCCACGAGTTCGGCCTTCTGGAAAGCCCCAAGGCCCTGGAGGAGGCCCCCTGGCCCCCGCCGGAAGGGGCCTTCGTGGGCTTTGTGCTTTCCCGCAAGGAGCCCATGTGGGCCGATCTTCTGGCCCTGGCCGCCGCCAGGGGGGGCCGGGTCCACCGGGCCCCCGAGCCTTATAAAGCCCTCAGGGACCTGAA
GGAGGCGCGGGGGCTTCTCGCCAAAGACCTGAGCGTTCTGGCCCTGAGGGAAGGCCT
TGGCCTCCCGCCCGGCGACGACCCCATGCTCCTCGCCTACCTCCTGGACCCTTCCAACA
CCACCCCCGAGGGGGTGGCCCGGCGCTACGGCGGGGAGTGGACGGAGGAGGCGGGG
GAGCGGGCCGCCCTTTCCGAGAGGCTCTTCGCCAACCTGTGGGGGAGGCTTGAGGGG
GAGGAGAGGCTCCTTTGGCTTTACCGGGAGGTGGAGAGGCCCCTTTCCGCTGTCCTGG
CCCACATGGAGGCCACGGGGGTGCGCCTGGACGTGGCCTATCTCAGGGCCTTGTCCCT
GGAGGTGGCCGAGGAGATCGCCCGCCTCGAGGCCGAGGTCTTCCGCCTGGCCGGCCA
CCCCTTCAACCTCAACTCCCGGGACCAGCTGGAAAGGGTCCTCTTTGACGAGCTAGGG
CTTCCCGCCATCGGCAAGACGGAGAAGACCGGCAAGCGCTCCACCAGCGCCGCCGTC
CTGGAGGCCCTCCGCGAGGCCCACCCCATCGTGGAGAAGATCCTGCAGTACCGGGAGC
TCACCAAGCTGAAGAGCACCTACATTGACCCCTTGCCGGACCTCATCCACCCCAGGAC
GGGCCGCCTCCACACCCGCTTCAACCAGACGGCCACGGCCACGGGCAGGCTAAGTAG
CTCCGATCCCAACCTCCAGAACATCCCCGTCCGCACCCCGCTTGGGCAGAGGATCCGC
CGGGCCTTCATCGCCGAGGAGGGGTGGCTATTGGTGGCCCTGGACTATAGCCAGATAGA
GCTCAGGGTGCTGGCCCACCTCTCCGGCGACGAGAACCTGATCCGGGTCTTCCAGGAG
GGGCGGGACATCCACACGGAGACCGCCAGCTGGATGTTCGGCGTCCCCCGGGAGGCC
GTGGACCCCCTGATGCGCCGGGCGGCCAAGACCATCAACTTCGGGGTCCTCTACGGCA
TGTCGGCCCACCGCCTCTCCCAGGAGCTAGCCATCCCTTACGAGGAGGCCCAGGCCTT
CATTGAGCGCTACTTTCAGAGCTTCCCCAAGGTGCGGGCCTGGATTGAGAAGACCCTG
GAGGAGGGCAGGAGGCGGGGGTACGTGGAGACCCTCTTCGGCCGCCGCCGCTACGTG
CCAGACCTAGAGGCCCGGGTGAAGAGCGTGCGGGAGGCGGCCGAGCGCATGGCCTTC
AACATGCCCGTCCAGGGCACCGCCGCCGACCTCATGAAGCTGGCTATGGTGAAGCTCT
TCCCCAGGCTGGAGGAAATGGGGGCCAGGATGCTCCTTCAGGTCCACGACGAGCTGGT
CCTCGAGGCCCCAAAAGAGAGGGCGGAGGCCGTGGCCCGGCTGGCCAAGGAGGTCAT
GGAGGGGGTGTATCCCCTGGCCGTGCCCCTGGAGGTGGAGGTGGGGATAGGGGAGGACTGGCTCTCCGCC AAGGAGTGA
Taq2基因序列(SEQ ID NO:6)：
ATGAGGGGGATGCTGCCCCTCTTTGAGCCCAAGGGCCGGGTCCTCCTGGTGGACGGCC
ACCACCTGGCCTACCGCACCTTCCACGCCCTGAAGGGCCTCACCACCAGCCGGGGGGA
GCCGGTGCAGGCGGTCTACGGCTTCGCCAAGAGCCTCCTCAAGGCCCTCAAGGAGGA
CGGGGACGCGGTGATCGTGGTCTTTGACGCCAAGGCCCCCTCCTTCCGCCACGAGGCC
TACGGGGGGTACAAGGCGGGCCGGGCCCCCACGCCGGAGGACTTTCCCCGGCAACTC
GCCCTCATCAAGGAGCTGGTGGACCTCCTGGGGCTGGCGCGCCTCGAGGTCCCGGGCT
ACGAGGCGGACGACGTCCTGGCCAGCCTGGCCAAGAAGGCGGAAAAGGAGGGCTAC
GAGGTCCGCATCCTCACCGCCGACAAAGACCTTTACCAGCTCCTTTCCGACCGCATCCACGTCCTCCACCCCGAGGGGTACCTCATCACCCCGGCCTGGCTTTGGGAAAAGTACGGCCTGAGGCCCGACCAGTGGGCCGACTACCGGGCCCTGACCGGGGACGAGTCCGACAACCTTCCCGGGGTCAAGGGCATCGGGGAGAAGACGGCGAGGAAGCTTCTGGAGGAGTGGGGGAGCCTGGAAGCCCTCCTCAAGAACCTGGACCGGCTGAAGCCCGCCATCCGGGAGAAGATCCTGGCCCACATGGACGATCTGAAGCTCTCCTGGGACCTGGCCAAGGTGCGCACCGACCTGCCCCTGGAGGTGGACTTCGCCAAAAGGCGGGAGCCCGACCGGGAGAGGCTTAGGGCCTTTCTGGAGAGGCTTGAGTTTGGCAGCCTCCTCCACGAGTTCGGCCTTCTGGAAAGCCCCAAGGCCCTGGAGGAGGCCCCCTGGCCCCCGCCGGAAGGGGCCTTCGTGGGCTTTGTGCTTTCCCGCAAGGAGCCCATGTGGGCCGATCTTCTGGCCCTGGCCGCCGCCAGGGGGGGCCGGGTCCACCGGGCCCCCGAGCCTTATAAAGCCCTCAGGGACCTGAAGGAGGCGCGGGGGCTTCTCGCCAAAGACCTGAGCGTTCTGGCCCTGAGGGAAGGCCTTGGCCTCCCGCCCGGCGACGACCCCATGCTCCTCGCCTACCTCCTGGACCCTTCCAACACCACCCCCGAGGGGGTGGCCCGGCGCTACGGCGGGGAGTGGACGGAGGAGGCGGGGGAGCGGGCCGCCCTTTCCGAGAGGCTCTTCGCCAACCTGTGGGGGAGGCTTGAGGGGGAGGAGAGGCTCCTTTGGCTTTACCGGGAGGTGGAGAGGCCCCTTTCCGCTGTCCTGGCCCACATGGAGGCCACGGGGGTGCGCCTGGACGTGGCCTATCTCAGGGCCTTGTCCCTGGAGGTGGCCGAGGAGATCGCCCGCCTCGAGGCCGAGGTCTTCCGCCTGGCCGGCCACCCCTTCAACCTCAACTCCCGGGACCAGCTGGAAAGGGTCCTCTTTGACGAGCTAGGGCTTCCCGCCATCGGCAAGACGGAGAAGACCGGCAAGCGCTCCACCAGCGCCGCCGTCCTGGAGGCCCTCCGCGAGGCCCACCCCATCGTGGAGAAGATCCTGCAGTACCGGGAGCTCACCAAGCTGAAGAGCACCTACATTGACCCCTTGCCGGACCTCATCCACCCCAGGACGGGCCGCCTCCACACCCGCTTCAACCAGACGGCCACGGCCACGGGCAGGCTAAGTAGCTCCGATCCCAACCTCCAGAACATCCCCGTCCGCACCCCGCTTGGGCAGAGGATCCGCCGGGCCTTCATCGCCGAGGAGGGGTGGCTATTGGTGGCCCTGGACTATAGCCAGATAGAGCTCAGGGTGCTGGCCCACCTCTCCGGCGACAAGAACCTGATCCGGGTCTTCCAGGAGGGGCGGGACATCCACACGGAGACCGCCAGCTGGATGTTCGGCGTCCCCCGGGAGGCCGTGGACCCCCTGATGCGCCGGGCGGCCAAGACCATCAACTTCGGGGTCCTCTACGGCATGTCGGCCCACCGCCTCTCCCAGGAGCTAGCCATCCCTTACGAGGAGGCCCAGGCCTTCATTGAGCGCTACTTTCAGAGCTTCCCCAAGGTGCGGGCCTGGCTTCAGAAGACCCTGGAGGAGGGCAGGAGGCGGGGGTACGTGGAGACCCTCTTCGGCCGCCGCCGCTACGTGCCAGACCTAGAGGCCCGGGTGAAGAGCGTGCGGGAGGCGGCCGAGCGCATGGCCTTCAACATGCCCGTCCAGGGCACCGCCGCCGACCTCATGAAGCTGGCTATGGTGAAGCTCTTCCCCAGGCTGGAGGAAATGGGGGCCAGGATGCTCCTTCAGGTCCACGACGAGCTGGTCCTCGAGGCCCCAAAAGAGAGGGCGGAGGCCGTGGCCCGGCTGGCCAAGGAGGTCATGGAGGGGGTGTATCCCCTGGCCGTGCCCCTGGAGGTGGAGGTGGGGATAGGGGAGGA
CTGGCTCTCCGCC AAGGAGTGA
Taq3基因序列(SEQ ID NO:7)
ATGAGGGGGATGCTGCCCCTCTTTGAGCCCAAGGGCCGGGTCCTCCTGGTGGACGGCC
ACCACCTGGCCTACCGCACCTTCCACGCCCTGAAGGGCCTCACCACCAGCCGGGGGGA
GCCGGTGCAGGCGGTCTACGGCTTCGCCAAGAGCCTCCTCAAGGCCCTCAAGGAGGA
CGGGGACGCGGTGATCGTGGTCTTTGACGCCAAGGCCCCCTCCTTCCGCCACGAGGCC
TACGGGGGGTACAAGGCGGGCCGGGCCCCCACGCCGGAGGACTTTCCCCGGCAACTC
GCCCTCATCAAGGAGCTGGTGGACCTCCTGGGGCTGGCGCGCCTCGAGGTCCCGGGCT
ACGAGGCGGACGACGTCCTGGCCAGCCTGGCCAAGAAGGCGGAAAAGGAGGGCTAC
GAGGTCCGCATCCTCACCGCCGACAAAGACCTTTACCAGCTCCTTTCCGACCGCATCCA
CGTCCTCCACCCCGAGGGGTACCTCATCACCCCGGCCTGGCTTTGGGAAAAGTACGGC
CTGAGGCCCGACCAGTGGGCCGACTACCGGGCCCTGACCGGGGACGAGTCCGACAAC
CTTCCCGGGGTCAAGGGCATCGGGGAGAAGACGGCGAGGAAGCTTCTGGAGGAGTGG
GGGAGCCTGGAAGCCCTCCTCAAGAACCTGGACCGGCTGAAGCCCGCCATCCGGGAG
AAGATCCTGGCCCACATGGACGATCTGAAGCTCTCCTGGGACCTGGCCAAGGTGCGCA
CCGACCTGCCCCTGGAGGTGGACTTCGCCAAAAGGCGGGAGCCCGACCGGGAGAGGC
TTAGGGCCTTTCTGGAGAGGCTTGAGTTTGGCAGCCTCCTCCACGAGTTCGGCCTTCTG
GAAAGCCCCAAGGCCCTGGAGGAGGCCCCCTGGCCCCCGCCGGAAGGGGCCTTCGTG
GGCTTTGTGCTTTCCCGCAAGGAGCCCATGTGGGCCGATCTTCTGGCCCTGGCCGCCGC
CAGGGGGGGCCGGGTCCACCGGGCCCCCGAGCCTTATAAAGCCCTCAGGGACCTGAA
GGAGGCGCGGGGGCTTCTCGCCAAAGACCTGAGCGTTCTGGCCCTGAGGGAAGGCCT
TGGCCTCCCGCCCGGCGACGACCCCATGCTCCTCGCCTACCTCCTGGACCCTTCCAACA
CCACCCCCGAGGGGGTGGCCCGGCGCTACGGCGGGGAGTGGACGGAGGAGGCGGGG
GAGCGGGCCGCCCTTTCCGAGAGGCTCTTCGCCAACCTGTGGGGGAGGCTTGAGGGG
GAGGAGAGGCTCCTTTGGCTTTACCGGGAGGTGGAGAGGCCCCTTTCCGCTGTCCTGG
CCCACATGGAGGCCACGGGGGTGCGCCTGGACGTGGCCTATCTCAGGGCCTTGTCCCT
GGAGGTGGCCGAGGAGATCGCCCGCCTCGAGGCCGAGGTCTTCCGCCTGGCCGGCCA
CCCCTTCAACCTCAACTCCCGGGACCAGCTGGAAAGGGTCCTCTTTGACGAGCTAGGG
CTTCCCGCCATCGGCAAGACGGAGAAGACCGGCAAGCGCTCCACCAGCGCCGCCGTC
CTGGAGGCCCTCCGCGAGGCCCACCCCATCGTGGAGAAGATCCTGCAGTACCGGGAGC
TCACCAAGCTGAAGAGCACCTACATTGACCCCTTGCCGGACCTCATCCACCCCAGGAC
GGGCCGCCTCCACACCCGCTTCAACCAGACGGCCACGGCCACGGGCAGGCTAAGTAG
CTCCGATCCCAACCTCCAGAACATCCCCGTCCGCACCCCGCTTGGGCAGAGGATCCGC
CGGGCCTTCATCGCCGAGGAGGGGTGGCTATTGGTGGCCCTGGACTATAGCCAGATAGA
GCTCAGGGTGCTGGCCCACCTCTCCGGCGACGAGAACCTGATCCGGGTCTTCCAGGAGGGGCGGGACATCCACACGGAGACCGCCAGCTGGATGTTCGGCGTCCCCCGGGAGGCCGTGGACCCCCTGATGCGCCGGGCGGCCAAGACCATCAACTTCGGGGTCCTCTACGGCATGTCGGCCCACCGCCTCTCCCAGGAGCTAGCCATCCCTTACGAGGAGGCCCAGGCCTTCATTGAGCGCTACTTTCAGAGCTTCCCCAAGGTGCGGGCCTGGCTTCAGAAGACCCTGGAGGAGGGCAGGAGGCGGGGGTACGTGGAGACCCTCTTCGGCCGCCGCCGCTACGTGCCAGACCTAGAGGCCCGGGTGAAGAGCGTGCGGGAGGCGGCCGAGCGCATGGCCTTCAACATGCCCGTCCAGGGCACCGCCGCCGACCTCATGAAGCTGGCTATGGTGAAGCTCTTCCCCAGGCTGGAGGAAATGGGGGCCAGGATGCTCCTTCAGGTCCACGACGAGCTGGTCCTCGAGGCCCCAAAAGAGAGGGCGGAGGCCGTGGCCCGGCTGGCCAAGGAGGTCATGGAGGGGGTGTATCCCCTGGCCGTGCCCCTGGAGGTGGAGGTGGGGATAGGGGAGGACTGGCTCTCCGCC AAGGAGTGA
Taq4基因序列(SEQ ID NO:8)
ATGAGGGGGATGCTGCCCCTCTTTGAGCCCAAGGGCCGGGTCCTCCTGGTGGACGGCCACCACCTGGCCTACCGCACCTTCCACGCCCTGAAGGGCCTCACCACCAGCCGGGGGGAGCCGGTGCAGGCGGTCTACGGCTTCGCCAAGAGCCTCCTCAAGGCCCTCAAGGAGGACGGGGACGCGGTGATCGTGGTCTTTGACGCCAAGGCCCCCTCCTTCCGCCACGAGGCCTACGGGGGGTACAAGGCGGGCCGGGCCCCCACGCCGGAGGACTTTCCCCGGCAACTCGCCCTCATCAAGGAGCTGGTGGACCTCCTGGGGCTGGCGCGCCTCGAGGTCCCGGGCTACGAGGCGGACGACGTCCTGGCCAGCCTGGCCAAGAAGGCGGAAAAGGAGGGCTACGAGGTCCGCATCCTCACCGCCGACAAAGACCTTTACCAGCTCCTTTCCGACCGCATCCACGTCCTCCACCCCGAGGGGTACCTCATCACCCCGGCCTGGCTTTGGGAAAAGTACGGCCTGAGGCCCGACCAGTGGGCCGACTACCGGGCCCTGACCGGGGACGAGTCCGACAACCTTCCCGGGGTCAAGGGCATCGGGGAGAAGACGGCGAGGAAGCTTCTGGAGGAGTGGGGGAGCCTGGAAGCCCTCCTCAAGAACCTGGACCGGCTGAAGCCCGCCATCCGGGAGAAGATCCTGGCCCACATGGACGATCTGAAGCTCTCCTGGGACCTGGCCAAGGTGCGCACCGACCTGCCCCTGGAGGTGGACTTCGCCAAAAGGCGGGAGCCCGACCGGGAGAGGCTTAGGGCCTTTCTGGAGAGGCTTGAGTTTGGCAGCCTCCTCCACGAGTTCGGCCTTCTGGAAAGCCCCAAGGCCCTGGAGGAGGCCCCCTGGCCCCCGCCGGAAGGGGCCTTCGTGGGCTTTGTGCTTTCCCGCAAGGAGCCCATGTGGGCCGATCTTCTGGCCCTGGCCGCCGCCAGGGGGGGCCGGGTCCACCGGGCCCCCGAGCCTTATAAAGCCCTCAGGGACCTGAAGGAGGCGCGGGGGCTTCTCGCCAAAGACCTGAGCGTTCTGGCCCTGAGGGAAGGCCTTGGCCTCCCGCCCGGCGACGACCCCATGCTCCTCGCCTACCTCCTGGACCCTTCCAACACCACCCCCGAGGGGGTGGCCCGGCGCTACGGCGGGGAGTGGACGGAGGAGGCGGGGGAGCGGGCCGCCCTTTCCGAGAGGCTCTTCGCCAACCTGTGGGGGAGGCTTGAGGGGGAGGAGAGGCTCCTTTGGCTTTACCGGGAGGTGGAGAGGCCCCTTTCCGCTGTCCTGGCCCACATGGAGGCCACGGGGGTGCGCCTGGACGTGGCCTATCTCAGGGCCTTGTCCCTGGAGGTGGCCGAGGAGATCGCCCGCCTCGAGGCCGAGGTCTTCCGCCTGGCCGGCCACCCCTTCAACCTCAACTCCCGGGACCAGCTGGAAAGGGTCCTCTTTGACGAGCTAGGGCTTCCCGCCATCGGCAAGACGGAGAAGACCGGCAAGCGCTCCACCAGCGCCGCCGTCCTGGAGGCCCTCCGCGAGGCCCACCCCATCGTGGAGAAGATCCTGCAGTACAATGAGCTCACCAAGCTGAAGAGCACCTACATTGACCCCTTGCCGGACCTCATCCACCCCAGGACGGGCCGCCTCCACACCCGCTTCAACCAGACGGCCACGGCCACGGGCAGGCTAAGTAGCTCCGATCCCAACCTCCAGAACATCCCCGTCCGCACCCCGCTTGGGCAGAGGATCCGCCGGGCCTTCATCGCCGAGGAGGGGTGGCTATTGGTGGCCCTGGACTATAGCCAGATAGAGCTCAGGGTGCTGGCCCACCTCTCCGGCGACGAGAACCTGATCCGGGTCTTCCAGGAGGGGCGGGACATCCACACGGAGACCGCCAGCTGGATGTTCGGCGTCCCCCGGGAGGCCGTGGACCCCCTGATGCGCCGGGCGGCCAAGACCATCAACTTCGGGGTCCTCTACGGCATGTCGGCCCACCGCCTCTCCCAGGAGCTAGCCATCCCTTACGAGGAGGCCCAGGCCTTCATTGAGCGCTACTTTCAGAGCTTCCCCAAGGTGCGGGCCTGGCTTCAGAAGACCCTGGAGGAGGGCAGGAGGCGGGGGTACGTGGAGACCCTCTTCGGCCGCCGCCGCTACGTGCCAGACCTAGAGGCCCGGGTGAAGAGCGTGCGGGAGGCGGCCGAGCGCATGGCCTTCAACATGCCCGTCCAGGGCACCGCCGCCGACCTCATGAAGCTGGCTATGGTGAAGCTCTTCCCCAGGCTGGAGGAAATGGGGGCCAGGATGCTCCTTCAGGTCCACGACGAGCTGGTCCTCGAGGCCCCAAAAGAGAGGGCGGAGGCCGTGGCCCGGCTGGCCAAGGAGGTCATGGAGGGGGTGTATCCCCTGGCCGTGCCCCTGGAGGTGGAGGTGGGGATAGGGGAGGACTGGCTCTCCGCCAAGGAGTGA
综上所述，本发明实施例设计的SEQ ID NO:1-4相对应的基因序列分别双酶切，插入pET28a质粒上，并转化进BL21(DE3)宿主菌，在25℃下分别诱导表达重组Taq DNA聚合酶，通过离心收集、超声破碎大肠杆菌再离心去除杂质得到粗酶液，采用Ni亲和挂柱及超滤浓缩获得纯化的重组Taq1、Taq2、Taq3、Taq4。最终经酶活测定、荧光定量RT-PCR反应、耐抑制物PCR及37℃热加速验证证明该制备的Taq4除了具有热启动功能、耐受抑制物能力强的优点，还具有37℃热稳定性好、酶比活力高的优势，有利于Taq DNA的大规模的临床应用。
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，其氨基酸的序列如SEQ ID NO:4。
2.根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，其核苷酸的序列如SEQID NO:8所示。
3.根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，其为野生型Taq DNA聚合酶发生R536N、I707L、E708Q位点突变而成。
4.一种核酸，其特征在于，包括权利要求1至3任一项所述的Taq DNA聚合酶突变体的核苷酸序列。
5.一种表达载体，其特征在于，其能表达权利要求1至3任一项所述的Taq DNA聚合酶突变体。
6.一种重组细胞，其特征在于，其包括权利要求5所述的表达载体。
7.一种PCR反应试剂，其特征在于，其包括权利要求1至3任一项所述的重组Taq DNA聚合酶突变体。
8.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至3任一项所述的重组Taq DNA聚合酶突变体或权利要求4所述的核酸。
9.一种PCR方法，其特征在于，将如权利要求1至3任一项所述的Taq DNA聚合酶突变体应用于PCR。
10.根据权利要求9所述的PCR方法，其特征在于，所述的PCR方法为qPCR。
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