CN117487775B - 一种高酶活的Taq DNA聚合酶及其应用 - Google Patents
一种高酶活的Taq DNA聚合酶及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117487775B CN117487775B CN202410003086.7A CN202410003086A CN117487775B CN 117487775 B CN117487775 B CN 117487775B CN 202410003086 A CN202410003086 A CN 202410003086A CN 117487775 B CN117487775 B CN 117487775B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna polymerase
- enzyme activity
- taq
- taq dna
- high enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 title claims abstract description 41
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 39
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 36
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 33
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 28
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 12
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 abstract description 8
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 abstract description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 2
- 102220093198 rs200288250 Human genes 0.000 abstract description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 210000003811 finger Anatomy 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000003813 thumb Anatomy 0.000 description 2
- 102000000662 3'-5' exonuclease domains Human genes 0.000 description 1
- 108050008023 3'-5' exonuclease domains Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Chemical group OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于PCR的高酶活的Taq DNA聚合酶及其应用。实验结果显示，通过在野生型Taq DNA酶氨基酸序列中引入A77V、A77V/A109K、A77V/A109K/P527G、A77V/A109K/H621L突变位点，使得其聚合酶活性相较于野生型得以显著提高。将含有本发明的高酶活的Taq DNA聚合酶的聚合酶试剂应用于扩增DNA样本可以更好地满足科学研究和实际应用的需求。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于PCR的高酶活的Taq DNA聚合酶及其应用。
背景技术
Taq DNA聚合酶是一种耐热聚合酶，最初从嗜热菌Thermus aquaticus中分离出来。它是分子生物学中的重要工具，广泛应用于PCR技术等领域。Taq DNA聚合酶全长由832个氨基酸残基组成，分子量为94 kDa，主要包括三个主要结构域。位于N端第1-291位氨基酸构成了5’-3’核酸外切酶活性结构域，可应用于TaqMan探针的水解；第292-423位氨基酸构成了3’-5’核酸外切酶结构域，但该结构域没有活性；第424-832位氨基酸构成了5’-3’聚合酶活性结构域，该结构域的三维立体结构如同人的右手，可分为拇指区、手指区和手掌区。其中拇指区负责维持DNA聚合酶与引物-模板复合物的紧密结合，进一步有助于DNA聚合酶的延伸；手指区负责结合dNTPs；手掌区是二价金属离子结合的活性区域，负责调节结合的dNTPs与引物3’-OH端发生反应时周围的化学环境，从而介导和催化反应的进行。
PCR(聚合酶链式反应）是一种用于放大扩增特定的DNA（或RNA）片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。利用DNA在高温时变性会变成单链，低温时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
随着技术不断革新，对PCR反应的速度、灵敏度、特异性和多重扩增能力也有了更高的要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种高酶活的Taq DNA聚合酶及其应用。
在第一方面，本发明提供了一种高酶活的Taq DNA聚合酶。
本发明所要求保护的高酶活的Taq DNA酶具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。与野生型Taq DNA酶的氨基酸序列相比，将第77位丙氨酸突变为缬氨酸。
本发明所要求保护的高酶活的Taq DNA酶具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。与野生型Taq DNA酶的氨基酸序列相比，将第77位丙氨酸突变为缬氨酸，第109位丙氨酸突变为赖氨酸。
本发明所要求保护的高酶活的Taq DNA酶具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。与野生型Taq DNA酶的氨基酸序列相比，将第77位丙氨酸突变为缬氨酸，第109位丙氨酸突变为赖氨酸，第527位脯氨酸突变为甘氨酸。
本发明所要求保护的高酶活的Taq DNA酶具有如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列。与野生型Taq DNA酶的氨基酸序列相比，将第77位丙氨酸突变为缬氨酸，第109位丙氨酸突变为赖氨酸，第621位组氨酸突变为亮氨酸。
进一步地，所述野生型的Taq DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
在第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码如第一方面所述的高酶活的Taq DNA聚合酶。
在第三方面，本发明提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有如第二方面所述的核酸分子。所述重组表达载体可以选自pBR322质粒、pUC系列质粒或pET系列质粒。
进一步地，所述重组表达载体可以选自pET-28a(+)。
在第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如第二方面所述的核酸分子或如第三方面所述的重组表达载体。
所述宿主细胞可以选自酵母、细菌或真菌。进一步地，所述宿主细胞可以选自大肠杆菌。
进一步地，所述大肠杆菌可以选自大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌Rosetta或大肠杆菌OrigamiB(DE3)。
在第五方面，本发明提供了一种聚合酶试剂，所述聚合酶试剂中含有如第一方面所述的高酶活的Taq DNA聚合酶。
在第六方面，本发明提供了制备如第一方面所述高酶活的Taq DNA酶的方法，其制备步骤包括：在适宜的培养基中培养如第四方面所述的宿主细胞诱导表达，并分离纯化得到所述高酶活的Taq DNA聚合酶。
在第七方面，本发明提供了如第一方面所述的高酶活的Taq DNA聚合酶或如第五方面所述的聚合酶试剂在扩增DNA样本中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种高酶活的Taq DNA聚合酶。实验结果显示，通过在野生型TaqDNA酶氨基酸序列中引入A77V、A77V/A109K、A77V/A109K/P527G、A77V/A109K/H621L突变位点，使得其聚合酶活性得以显著提高。将含有本发明的高酶活的Taq DNA聚合酶的聚合酶试剂应用于扩增DNA样本可以更好地满足科学研究和实际应用的需求。
附图说明
图1为实施例6中以2U/μL的浓度进行酶活测定的结果；
图2为实施例6中以5U/μL的浓度进行酶活测定的结果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中实施例所涉及的野生型Taq DNA 聚合酶的核苷酸序列和氨基酸序列获取自Genbank J04639.1。以野生型Taq DNA聚合酶的核苷酸序列为模板设计引物。本发明涉及的突变引物如下：
A77V-F：5’ GGCAACTCGTCCTCATCAAGG 3’
A77V-R：5’ CCTTGATGAGGACGAGTTGCC 3’
A109K-F：5’ CCTGGGGCTGAAGCGCCTCGAGGTCC 3’
A109K-R：5’ GGACCTCGAGGCGCTTCAGCCCCATT 3’
P527G-F：5’ CCGCGAGGCCCACGGCATCGTGGAG 3’
P527G-R：5’ CGCCACGATGCCGTGGGCCTCGCGG 3’
H621L-F：5’ GTGCTGGCCCTCCTCTCCGGC 3’
H621L-R：5’ GCCGGAGAGGAGGGCCAGCAC 3’。
实施例1 构建重组宿主细胞
在质粒pET-28a(+)的BamH I和Sal I位点插入野生型Taq DNA聚合酶的核苷酸序列，得到重组表达载体pET-Taq；
利用全质粒PCR技术，将重组表达载体pET-Taq作为模板，以设计的突变引物A77V-F和A77V-R进行定点突变，PCR扩增获得含有突变基因的重组表达载体pET-Taq-A77V；
将重组表达载体pET-Taq-A77V用Dpn I酶在37℃水浴条件下处理1h，再将其转入E.coli BL21(DE3)的感受态细胞中，得到重组宿主细胞，涂布于含卡那霉素(40μg/mL)的LB固体培养基上，提取质粒并测序。
其中，PCR扩增反应条件：98℃预变性45s；变性-退火-延伸循环32次，其中变性98℃ 15s，65℃退火20s，74℃延伸45s，4℃保温，反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测，筛选阳性克隆。
实施例2 构建重组宿主细胞
在质粒pET-28a(+)的BamH I和Sal I位点插入野生型Taq DNA聚合酶的核苷酸序列，得到重组表达载体pET-Taq；
利用全质粒PCR技术，将重组表达载体pET-Taq作为模板，以设计的突变引物A77V-F和A77V-R进行定点突变，PCR扩增获得含有突变基因的重组表达载体pET-Taq-A77V；然后将表达载体pET-Taq-A77V作为模板，以设计的突变引物A109K-F和A109K-R再次进行定点突变，PCR扩增获得含有突变基因的重组表达载体pET-Taq-A77V/A109K；
将重组表达载体pET-Taq-A77V/A109K用Dpn I酶在37℃水浴条件下处理1h，再将其转入E.coli BL21(DE3)的感受态细胞中，得到重组宿主细胞，涂布于含卡那霉素(40μg/mL)的LB固体培养基上，提取质粒并测序。
其中，PCR扩增反应条件：98℃预变性45s；变性-退火-延伸循环32次，其中变性98℃ 15s，65℃退火20s，74℃延伸45s，4℃保温，反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测，筛选阳性克隆。
实施例3 构建重组宿主细胞
在质粒pET-28a(+)的BamH I和Sal I位点插入野生型Taq DNA聚合酶的核苷酸序列，得到重组表达载体pET-Taq；
利用全质粒PCR技术，将重组表达载体pET-Taq作为模板，以设计的突变引物A77V-F和A77V-R进行定点突变，PCR扩增获得含有突变基因的重组表达载体pET-Taq-A77V；再将表达载体pET-Taq-A77V作为模板，以设计的突变引物A109K-F和A109K-R再次进行定点突变，PCR扩增获得含有突变基因的重组表达载体pET-Taq-A77V/A109K；然后将表达载体pET-Taq-A77V/A109K作为模板，以设计的突变引物P527G-F和P527G-R再次进行定点突变，PCR扩增获得含有突变基因的重组表达载体pET-Taq-A77V/A109K/P527G；
将重组表达载体pET-Taq-A77V/A109K/P527G用Dpn I酶在37℃水浴条件下处理1h，再将其转入E.coli BL21(DE3)的感受态细胞中，得到重组宿主细胞，涂布于含卡那霉素(40μg/mL)的LB固体培养基上，提取质粒并测序。
其中，PCR扩增反应条件：98℃预变性45s；变性-退火-延伸循环32次，其中变性98℃ 15s，65℃退火20s，74℃延伸45s，4℃保温，反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测，筛选阳性克隆。
实施例4 构建重组宿主细胞
在质粒pET-28a(+)的BamH I和Sal I位点插入野生型Taq DNA聚合酶的核苷酸序列，得到重组表达载体pET-Taq；
利用全质粒PCR技术，将重组表达载体pET-Taq作为模板，以设计的突变引物A77V-F和A77V-R进行定点突变，PCR扩增获得含有突变基因的重组表达载体pET-Taq-A77V；再将表达载体pET-Taq-A77V作为模板，以设计的突变引物A109K-F和A109K-R再次进行定点突变，PCR扩增获得含有突变基因的重组表达载体pET-Taq-A77V/A109K；然后将表达载体pET-Taq-A77V/A109K作为模板，以设计的突变引物H621L-F和H621L-R再次进行定点突变，PCR扩增获得含有突变基因的重组表达载体pET-Taq-A77V/A109K/H621L；
将重组表达载体pET-Taq-A77V/A109K/H621L用Dpn I酶在37℃水浴条件下处理1h，再将其转入E.coli BL21(DE3)的感受态细胞中，得到重组宿主细胞，涂布于含卡那霉素(40μg/mL)的LB固体培养基上，提取质粒并测序。
其中，PCR扩增反应条件：98℃预变性45s；变性-退火-延伸循环32次，其中变性98℃ 15s，65℃退火20s，74℃延伸45s，4℃保温，反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测，筛选阳性克隆。
实施例5 重组蛋白的表达
将实施例1-4获得的重组宿主细胞在含有卡那霉素抗性的固体培养基平板上划线，37℃过夜培养，挑取单个菌落接种至8-10ml LB液体培养基中，37℃过夜培养，得到种子液；然后按1-2%（v/v）的比例放大接种于LB液体培养基中，在37℃、100-200rpm的条件下培养至OD值达到0.7时，加入0.6-1mM的IPTG进行诱导表达，并置于18℃的条件下过夜培养。将得到的菌液6000rpm离心10min后弃掉上清，取细胞沉淀洗涤3次，将洗涤后的细胞沉淀用TBS缓冲液重悬，然后转入高压均质机中进行破碎，收集破碎后的细胞在4℃、12000rpm条件下离心10min，取上清弃掉沉淀，所得上清液即为粗酶液。
将粗酶液通过1mL的Ni亲和柱纯化（Ni亲和柱已预先用上样缓冲液平衡），将粗酶液上柱，收集流出液，用洗脱液冲洗柱子3次，收集洗脱液，将流出与3次洗脱液合并，得到纯化后的高酶活的Taq DNA聚合酶。
将上述纯化后的Taq DNA聚合酶进行SDS-PAGE分析检测，结果表明所述高酶活的Taq DNA聚合酶与野生型Taq DNA聚合酶的条带一致。
实施例6 酶活测定
由于Taqman探针法荧光定量PCR信号的产生与Taq DNA聚合酶的5′~3′DNA外切活性直接相关，因此，本发明采用Taqman探针法将实施例5制备得到的纯化后的高酶活的TaqDNA聚合酶与野生型Taq DNA聚合酶的酶活进行比较。试验方法参考“Taq DNA聚合酶5′~3′外切活性对荧光定量PCR的影响，蒋析文等，分子诊断与治疗杂志，2020年2月，第12卷，第2期”进行。
将经实施例1-4制备得到的纯化后的高酶活的Taq DNA聚合酶与野生型的Taq DNA聚合酶进行标定，然后采用荧光定量PCR方法在平行试验条件下，以2U/μL或5U/μL的浓度进行酶活测定。探针5′端标记FAM荧光，3′端标记BQH1淬灭基团。5’-3’DNA外切酶活性检测底物为：Sub：ATGCTGGTTAAGCTGCCGTAGTCATGCAGTACGTCCGTACGTCA；
Probe：FAM-CAGCTTAACCAGCAT-BQH1。
活性测定反应体系：酶样品1.0μL，反应缓冲液（10X）2.5μL，Sub（10pmol/μL）0.25μL，Probe（10pmol/μL）0.5μL,无菌水补至25μL。
反应条件：95℃ 10min，（95℃ 10s，55℃ 30s并读取荧光）X40个循环。
以荧光强度为纵坐标，PCR循环次数为横坐标得到的实验结果如图1和图2所示。图1中以2U/μL的浓度进行酶活测定，图2中以5U/μL的浓度进行酶活测定。由图1和图2可以清楚地发现，本发明的高酶活的Taq DNA聚合酶无论是在低浓度还是高浓度情况下，相比于野生型Taq DNA聚合酶，酶活均有显著提高。
以上仅为本发明的具体实施例，并不限制本发明的保护范围。在不脱离本发明的技术构思的前提下，对本领域的技术人员来说，本发明的实施方式可以有多种更改和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等均应包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种高酶活的Taq DNA聚合酶，其特征在于，所述高酶活的Taq DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示。
2.一种核酸分子，其特征在于，其编码如权利要求1所述的高酶活的Taq DNA聚合酶。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有如权利要求2所述的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pET-28a(+)。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求2所述的核酸分子或权利要求3-4任一项所述的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌Rosetta或大肠杆菌OrigamiB(DE3)。
8.一种聚合酶试剂，其特征在于，所述聚合酶试剂中含有如权利要求1所述的高酶活的Taq DNA聚合酶。
9.一种制备如权利要求1所述的高酶活的Taq DNA聚合酶的方法，其特征在于，其包括：在培养基中培养权利要求5-7任一项所述的宿主细胞诱导表达，并分离纯化得到所述高酶活的Taq DNA聚合酶。
10.如权利要求1所述的高酶活的Taq DNA聚合酶或如权利要求8所述的聚合酶试剂在扩增DNA样本中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410003086.7A CN117487775B (zh) | 2024-01-02 | 2024-01-02 | 一种高酶活的Taq DNA聚合酶及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410003086.7A CN117487775B (zh) | 2024-01-02 | 2024-01-02 | 一种高酶活的Taq DNA聚合酶及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117487775A CN117487775A (zh) | 2024-02-02 |
| CN117487775B true CN117487775B (zh) | 2024-03-22 |
Family
ID=89683373
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410003086.7A Active CN117487775B (zh) | 2024-01-02 | 2024-01-02 | 一种高酶活的Taq DNA聚合酶及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117487775B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110747183A (zh) * | 2019-10-29 | 2020-02-04 | 南京诺唯赞生物科技有限公司 | 一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用 |
| CN111996179A (zh) * | 2020-08-21 | 2020-11-27 | 成都汇瑞新元生物科技有限责任公司 | 一种dna聚合酶及其在pcr检测中的应用 |
| JP2021023199A (ja) * | 2019-08-05 | 2021-02-22 | 国立大学法人 東京大学 | 新規ｄｎａポリメラーゼ変異体 |
| CN114934030A (zh) * | 2021-03-25 | 2022-08-23 | 山东大学 | 高特异性Taq DNA聚合酶变体及其在基因组编辑和/或基因突变检测应用 |
| CN115873823A (zh) * | 2020-10-07 | 2023-03-31 | 武汉爱博泰克生物科技有限公司 | 用于探针法qPCR的Taq DNA聚合酶突变体 |
-
2024
- 2024-01-02 CN CN202410003086.7A patent/CN117487775B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021023199A (ja) * | 2019-08-05 | 2021-02-22 | 国立大学法人 東京大学 | 新規ｄｎａポリメラーゼ変異体 |
| CN110747183A (zh) * | 2019-10-29 | 2020-02-04 | 南京诺唯赞生物科技有限公司 | 一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用 |
| CN111996179A (zh) * | 2020-08-21 | 2020-11-27 | 成都汇瑞新元生物科技有限责任公司 | 一种dna聚合酶及其在pcr检测中的应用 |
| CN115873823A (zh) * | 2020-10-07 | 2023-03-31 | 武汉爱博泰克生物科技有限公司 | 用于探针法qPCR的Taq DNA聚合酶突变体 |
| CN116042565A (zh) * | 2020-10-07 | 2023-05-02 | 武汉爱博泰克生物科技有限公司 | 用于探针法qPCR的Taq DNA聚合酶突变体 |
| CN114934030A (zh) * | 2021-03-25 | 2022-08-23 | 山东大学 | 高特异性Taq DNA聚合酶变体及其在基因组编辑和/或基因突变检测应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Lawyer,F.C. 等.UniProtKB/Swiss-Prot: P19821.1P19821.1.《Genbank》.2023,feature、origin部分. * |
| Mutant Taq DNA polymerases with improved elongation ability as a useful reagent for genetic engineering;Takeshi Yamagami 等;《Front Microbiol》;20140903;第5卷(第461期);摘要 * |
| 不同DNA聚合酶突变体与野生型检测性能的比较分析;孙梅 等;《分子诊断与治疗杂志》;20221231;第14卷(第2期);摘要，第197-200页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117487775A (zh) | 2024-02-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106755424B (zh) | 一种基于crispr的大肠杆菌st131系菌株检测引物、试剂盒及检测方法 | |
| EP0702728B1 (en) | Magnetic cycle reaction | |
| KR20110102467A (ko) | 내열성 ｄｎａ 폴리머라제를 포함하는 효소 조제물 및 그 제조 방법, 및 검출 대상생물의 검출 방법 | |
| CN108070577B (zh) | 一种抗血清干扰TaqDNA聚合酶及其制备和应用 | |
| US9212352B2 (en) | Polypeptides having nucleic acid binding activity | |
| Oscorbin et al. | Large fragment of DNA polymerase I from Geobacillus sp. 777: cloning and comparison with DNA polymerases I in practical applications | |
| Abeldenov et al. | Cloning, expression and purification of recombinant analog of Taq DNA polymerase | |
| CN117487775B (zh) | 一种高酶活的Taq DNA聚合酶及其应用 | |
| KR102596402B1 (ko) | HbA1c 디히드로게나아제 | |
| JP4355830B2 (ja) | 新規ｄｎａ複製因子 | |
| Puitika et al. | A taxon-specific oligonucleotide primer set for PCR-based detection of soil ciliate | |
| CN112175980B (zh) | 通过定点突变提高聚合酶大片段活性的方法及应用 | |
| CN116064462A (zh) | 一种Taq DNA聚合酶突变体及其制备方法 | |
| CN109943549B (zh) | 一种超高速扩增型Taq DNA聚合酶 | |
| CN114829593B (zh) | 嵌合dna聚合酶及其应用 | |
| KR20120058214A (ko) | 나노아케움 이퀴탄스 ｄｎａ 중합효소의 단백질 트랜스 스플라이싱을 기반으로 한 핫?스타트 ｐｃｒ 수행방법 | |
| CN111433373B (zh) | Dna聚合酶 | |
| WO2023082266A1 (zh) | 嵌合dna聚合酶及其应用 | |
| CN112251423B (zh) | 一种m-mlv逆转录酶体及其应用 | |
| WO2024092768A1 (zh) | 一种热稳定逆转录酶及其应用 | |
| CN115094047B (zh) | 一种直扩型Bst DNA聚合酶及其制备方法与应用 | |
| JP7107345B2 (ja) | Ｐｃｒ方法 | |
| CN118086243A (zh) | 一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用 | |
| WO2024009873A1 (ja) | 逆転写活性を有する核酸ポリメラーゼ | |
| CN117070492A (zh) | 融合双链DNA结合蛋白Sto7dm的Taq DNA聚合酶及其制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |