JP2021023199A - 新規ｄｎａポリメラーゼ変異体 - Google Patents

Abstract

【課題】新規なＤＮＡポリメラーゼ変異体の提供。【解決手段】バクテリオファージ由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼにおいて、特定のアミノ酸配列の５番目、７４番目、１４２番目、１５４番目、１８５番目、１８７番目、２３７番目、２８６番目、２９５番目、３６５番目、３８１番目、３８９番目、４２１番目、５１５番目、５２１番目、５５２番目および５６７番目の少なくとも１つの位置に相当する位置にアミノ酸変異を有する、ＤＮＡポリメラーゼ変異体または該変異体と実質的に同一のＤＮＡポリメラーゼ変異体。【選択図】なし

Description

本発明は、新規なＤＮＡポリメラーゼ変異体に関する。

ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡを鋳型として４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を基質として鋳型ＤＮＡの塩基配列に従ってＤＮＡ鎖の重合を触媒する酵素である。バクテリオファージ由来のＤＮＡポリメラーゼのうちｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージｐｈｉ２９由来のＤＮＡポリメラーゼであり、ＤＮＡ増幅に広く用いられている。この酵素は、ランダムオリゴＤＮＡのマルチプライミングを伴うローリングサークル型複製によってＤＮＡを指数増幅することが知られている。ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼは重合活性に加えて鎖置換活性を併せ持つため、他の酵素を必要とせず、等温下でこの指数増幅を達成することができる。ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼは高いプロセッシヴィティを有し、一度のＤＮＡへの結合で７０ｋｂ以上を合成し、また、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、忠実度が高く、増幅バイアスも小さいことが知られている。このような特性から、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを使った指数増幅は、着床前のヒト受精卵や、がん細胞、難培養微生物のシングルセルシーケンス、シングルセルトランスクリプトームといった微小量のゲノムシーケンス解析のためのゲノム増幅の主要な方法として利用されてきた（非特許文献１）。

Lasken and McLean, Nat Rev Genet. 15(9): 577-84 (2014) Ghadessy et al., Proc Natl Acad Sci USA, 98(8): 4552-7 (2001)

本発明者らは今般、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼに進化工学的手法を適用したところ、核酸増幅活性を示すｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼのクローンを複数見出した。本発明者らはまた、これらのクローンのアミノ酸配列を特定し、核酸増幅活性を示す１７種の非同義置換を見出した。本発明者らはまた、１７種の非同義置換のうち、特に高い核酸増幅活性を示す２種の非同義置換を有するｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体では、４時間の反応条件で野生型ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼと比較して２００倍もの核酸増幅活性を有することを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。

すなわち本発明は、新規なＤＮＡポリメラーゼ変異体を提供することを目的とする。

本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］バクテリオファージ由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の５番目（Ｍ５）、７４番目（Ｎ７４）、１４２番目（Ｄ１４２）、１５４番目（Ｋ１５４）、１８５番目（Ｍ１８５）、１８７番目（Ａ１８７）、２３７番目（Ｋ２３７）、２８６番目（Ｒ２８６）、２９５番目（Ｙ２９５）、３６５番目（Ｔ３６５）、３８１番目（Ｌ３８１）、３８９番目（Ａ３８９）、４２１番目（Ｐ４２１）、５１５番目（Ｐ５１５）、５２１番目（Ｉ５２１）、５５２番目（Ｋ５５２）および５６７番目（Ｄ５６７）からなる群から選択される少なくとも１つの位置に相当する位置にアミノ酸変異を有する、ＤＮＡポリメラーゼ変異体または該変異体と実質的に同一のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
［２］野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較して増強された核酸増幅活性を示す、上記［１］に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
［３］バクテリオファージがバクテリオファージｐｈｉ２９である、上記［１］または［２］に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
［４］野生型ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号２のアミノ酸配列を有するものである、上記［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
［５］アミノ酸変異の位置が、配列番号１のアミノ酸配列の１４２番目（Ｄ１４２）、１５４番目（Ｋ１５４）、１８５番目（Ｍ１８５）、１８７番目（Ａ１８７）、２８６番目（Ｒ２８６）、２９５番目（Ｙ２９５）、３８１番目（Ｌ３８１）、４２１番目（Ｐ４２１）、５１５番目（Ｐ５１５）、５５２番目（Ｋ５５２）および５６７番目（Ｄ５６７）からなる群から選択される少なくとも１つの位置に相当する位置を少なくとも含むものである、上記［１］〜［４］のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
［６］アミノ酸変異の位置が、配列番号１のアミノ酸配列の５５２番目（Ｋ５５２）および５６７番目（Ｄ５６７）のいずれかまたは両方に相当する位置を少なくとも含むものである、上記［１］〜［５］のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
［７］アミノ酸変異が、置換である、上記［１］〜［６］のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
［８］アミノ酸変異が、(1)〜(17)からなる群から選択される少なくとも１つである、上記［１］〜［７］のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体：
(1)配列番号１のアミノ酸配列の５番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のスレオニンへの置換、
(2)配列番号１のアミノ酸配列の７４番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のセリンへの置換、
(3)配列番号１のアミノ酸配列の１４２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のグリシンへの置換、
(4)配列番号１のアミノ酸配列の１５４番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のグルタミン酸への置換、
(5)配列番号１のアミノ酸配列の１８５番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のイソロイシンへの置換、
(6)配列番号１のアミノ酸配列の１８７番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のスレオニンへの置換、
(7)配列番号１のアミノ酸配列の２３７番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のアルギニンへの置換、
(8)配列番号１のアミノ酸配列の２８６番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のリシンへの置換、
(9)配列番号１のアミノ酸配列の２９５番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のヒスチジンへの置換、
(10)配列番号１のアミノ酸配列の３６５番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のメチオニンへの置換、
(11)配列番号１のアミノ酸配列の３８１番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のグルタミンへの置換、
(12)配列番号１のアミノ酸配列の３８９番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のスレオニンへの置換、
(13)配列番号１のアミノ酸配列の４２１番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のスレオニンへの置換、
(14)配列番号１のアミノ酸配列の５１５番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のセリンへの置換、
(15)配列番号１のアミノ酸配列の５２１番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のスレオニンへの置換、
(16)配列番号１のアミノ酸配列の５５２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のスレオニンへの置換、および
(17)配列番号１のアミノ酸配列の５６７番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のアスパラギンへの置換。
［８−１］下記のいずれかのアミノ酸置換変異の組み合わせを少なくとも有する、上記［８］に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体：
前記(1)、(4)および(6)の組み合わせ、
前記(4)、(6)、(10)、(13)および(15)の組み合わせ、
前記(3)、(5)、(8)、(9)および(12)の組み合わせ、
前記(4)、(6)および(7)の組み合わせ、
前記(2)、(16)および(17)の組み合わせ、および
前記(16)および(17)の組み合わせ。
［９］野生型ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列を有するものであり、かつ、配列番号１のアミノ酸配列において、下記(101)〜(117)の少なくとも１つのアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体である、上記［１］〜［８］のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体：
(101)配列番号１のアミノ酸配列の５番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ｍ５Ｔ）、
(102)配列番号１のアミノ酸配列の７４番目のアミノ酸のセリンへの置換（Ｎ７４Ｓ）、
(103)配列番号１のアミノ酸配列の１４２番目のアミノ酸のグリシンへの置換（Ｄ１４２Ｇ）、
(104)配列番号１のアミノ酸配列の１５４番目のアミノ酸のグルタミン酸への置換（Ｋ１５４Ｅ）、
(105)配列番号１のアミノ酸配列の１８５番目のアミノ酸のイソロイシンへの置換（Ｍ１８５Ｉ）、
(106)配列番号１のアミノ酸配列の１８７番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ａ１８７Ｔ）、
(107)配列番号１のアミノ酸配列の２３７番目のアミノ酸のアルギニンへの置換（Ｋ２３７Ｒ）、
(108)配列番号１のアミノ酸配列の２８６番目のアミノ酸のリシンへの置換（Ｒ２８６Ｋ）、
(109)配列番号１のアミノ酸配列の２９５番目のアミノ酸のヒスチジンへの置換（Ｙ２９５Ｈ）、
(110)配列番号１のアミノ酸配列の３６５番目のアミノ酸のメチオニンへの置換（Ｔ３６５Ｍ）、
(111)配列番号１のアミノ酸配列の３８１番目のアミノ酸のグルタミンへの置換（Ｌ３８１Ｑ）、
(112)配列番号１のアミノ酸配列の３８９番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ａ３８９Ｔ）、
(113)配列番号１のアミノ酸配列の４２１番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ｐ４２１Ｔ）、
(114)配列番号１のアミノ酸配列の５１５番目のアミノ酸のセリンへの置換（Ｐ５１５Ｓ）、
(115)配列番号１のアミノ酸配列の５２１番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ｉ５２１Ｔ）、
(116)配列番号１のアミノ酸配列の５５２番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ｋ５５２Ｔ）、および
(117)配列番号１のアミノ酸配列の５６７番目のアミノ酸のアスパラギンへの置換（Ｄ５６７Ｎ）。
［９−１］下記のいずれかのアミノ酸置換変異の組み合わせを少なくとも有する、上記［９］に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体：
前記(101)、(104)および(106)の組み合わせ、
前記(104)、(106)、(110)、(113)および(115)の組み合わせ、
前記(103)、(105)、(108)、(109)および(112)の組み合わせ、
前記(104)、(106)および(107)の組み合わせ、
前記(102)、(116)および(117)の組み合わせ、および
前記(116)および(117)の組み合わせ。
［１０］野生型ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列を有するものであり、かつ、配列番号２のアミノ酸配列において、下記(201)〜(217)の少なくとも１つのアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体である、上記［１］〜［８］のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体：
(201)配列番号２のアミノ酸配列の８番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ｍ８Ｔ）、
(202)配列番号２のアミノ酸配列の７７番目のアミノ酸のセリンへの置換（Ｎ７７Ｓ）、
(203)配列番号２のアミノ酸配列の１４５番目のアミノ酸のグリシンへの置換（Ｄ１４５Ｇ）、
(204)配列番号２のアミノ酸配列の１５７番目のアミノ酸のグルタミン酸への置換（Ｋ１５７Ｅ）、
(205)配列番号２のアミノ酸配列の１８８番目のアミノ酸のイソロイシンへの置換（Ｍ１８８Ｉ）、
(206)配列番号２のアミノ酸配列の１９０番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ａ１９０Ｔ）、
(207)配列番号２のアミノ酸配列の２４０番目のアミノ酸のアルギニンへの置換（Ｋ２４０Ｒ）、
(208)配列番号２のアミノ酸配列の２８９番目のアミノ酸のリシンへの置換（Ｒ２８９Ｋ）、
(209)配列番号２のアミノ酸配列の２９８番目のアミノ酸のヒスチジンへの置換（Ｙ２９８Ｈ）、
(210)配列番号２のアミノ酸配列の３６８番目のアミノ酸のメチオニンへの置換（Ｔ３６８Ｍ）、
(211)配列番号２のアミノ酸配列の３８４番目のアミノ酸のグルタミンへの置換（Ｌ３８４Ｑ）、
(212)配列番号２のアミノ酸配列の３９２番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ａ３９２Ｔ）、
(213)配列番号２のアミノ酸配列の４２４番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ｐ４２４Ｔ）、
(214)配列番号２のアミノ酸配列の５１８番目のアミノ酸のセリンへの置換（Ｐ５１８Ｓ）、
(215)配列番号２のアミノ酸配列の５２４番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ｉ５２４Ｔ）、
(216)配列番号２のアミノ酸配列の５５５番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ｋ５５５Ｔ）、および
(217)配列番号２のアミノ酸配列の５７０番目のアミノ酸のアスパラギンへの置換（Ｄ５７０Ｎ）。
［１０−１］下記のいずれかのアミノ酸置換変異の組み合わせを少なくとも有する、上記［１０］に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体：
前記(201)、(204)および(206)の組み合わせ、
前記(204)、(206)、(210)、(213)および(215)の組み合わせ、
前記(203)、(205)、(208)、(209)および(212)の組み合わせ、
前記(204)、(206)および(207)の組み合わせ、
前記(202)、(216)および(217)の組み合わせ、および
前記(216)および(217)の組み合わせ。
［１１］前記ＤＮＡポリメラーゼ変異体と実質的に同一のＤＮＡポリメラーゼ変異体が、下記（i）〜（v）からなる群から選択されるタンパク質からなるものである、上記［１］〜［１０］のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体：
（i）ＤＮＡポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、核酸増幅活性を示すタンパク質、
（ii）ＤＮＡポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、核酸増幅活性を示すタンパク質、
（iii）ＤＮＡポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列をコードする塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、核酸増幅活性を示すタンパク質、
（iv）ＤＮＡポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列をコードする塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、核酸増幅活性を示すタンパク質、および
（v）ＤＮＡポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、核酸増幅活性を示すタンパク質。
［１２］上記［１］〜［１１］のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードする、ポリヌクレオチド。
［１３］上記［１２］に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、組換えＤＮＡまたは組換えベクター。
［１４］上記［１３］に記載の組換えＤＮＡまたは組換えベクターを保有する細胞。
［１５］上記［１］〜［１１］のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含んでなる、核酸増幅用試薬。
［１６］上記［１５］に記載の核酸増幅用試薬を含んでなる、核酸増幅用キット。

本発明によれば、新規なＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供されるとともに、該ＤＮＡポリメラーゼ変異体を含む核酸増幅試薬と、該核酸増幅試薬を含むキットが提供される。

図１は、ＴＴｃＤＲシステムを用いるｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ選択実験の概要を示す図である。ＴＴｃＤＲシステムでは、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子をエンコードした環状ＤＮＡと、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと大腸菌の再構成無細胞翻訳系を組み合わせることで、環状ＤＮＡにエンコードされた複製酵素の転写と翻訳を通してＤＮＡが増幅する。なお、ＴＴｃＤＲシステムでは、おそらくＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって産生されたＲＮＡがプライマーとして使用されたことにより、ＤＮＡ複製がＤＮＡプライマーなしで開始すると考えられる。進化サイクルにおいて、ＤＮＡ増幅パフォーマンスの高いｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体が現れた場合、そのポリメラーゼは自身がコードされたＤＮＡをより多く増やすことにより集団内における頻度を増加させることが予想された。 図２は、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ選択実験においけるＤＮＡ増幅量の変化を示す図である。Ｍ１、Ｍ２、Ｔ１、Ｔ２系列では、Ｃｒｅリコンビナーゼ量も示した。実線は産物ＤＮＡ量、破線はＣｒｅリコンビナーゼ量を示す。白い矢尻が指すラウンドを、例２におけるｂｕｌｋ（Ｃｒｅリコンビナーゼ非添加条件）でのＴＴｃＤＲ反応のＤＮＡ増幅量測定実験に使用した（図３参照）。 図３は、選択実験におけるＤＮＡ集団のエマルション外でのＴＴｃＤＲ反応によるＤＮＡ増幅量を示す図である。灰色の矢尻が指すＤＮＡ集団からクローンＤＮＡを単離して、例３におけるｂｕｌｋ（Ｃｒｅリコンビナーゼ非添加条件）でのＴＴｃＤＲ反応のＤＮＡ増幅量測定実験に使用した（図４参照）。矢尻横の数字は、図４の単離ＤＮＡの由来となったＤＮＡプール番号を示す。エラーバーは、標準偏差（ｎ＝３）を示す。 図４は、単離したｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼＤＮＡのＴＴｃＤＲ反応におけるＤＮＡ増幅量を示す図である。ｂｕｌｋ（Ｃｒｅリコンビナーゼ非添加条件）でのＴＴｃＤＲ反応によるＤＮＡ増幅量を示す。図中の数字は、単離ＤＮＡの由来となった図３中のＤＮＡプールの番号を示す。 図５は、単離したｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼによるｐＵＣ１９ ＤＮＡ増幅量を示す図である。例３（図４参照）において、高いＤＮＡ増幅能を示した２０クローンのｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを翻訳させ、翻訳させた酵素によるｐＵＣ１９ ＤＮＡの増幅量を定量した。横軸に示した番号は、図４のクローン番号を示す。エラーバーは、標準偏差（ｎ＝３）を示す。 図６は、非同義置換を有するクローンにおけるアミノ酸置換のリストを示す図である。１７個の非同義置換について、アミノ酸置換とその位置および６４個のクローンに現れる頻度を示す。 図７は、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体によるＤＮＡ増幅活性を示す図である。野生型ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼにおいて１アミノ酸残基のみを置換した１７種のｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いて、各ＤＮＡ増幅時間（０時間および８時間）におけるＤＮＡ増幅量を定量した。エラーバーは、標準偏差（ｎ＝３）を示す。 図８は、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体の各変異体の翻訳量を示す図である。エラーバーは、標準偏差（ｎ＝３）を示す。 図９は、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体によるＤＮＡ増幅活性を示す図である。野生型ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼにおいてクローン５６番に含まれる３種の置換のうちの２置換を組み合わせたｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いて、各ＤＮＡ増幅時間（０時間および８時間）におけるＤＮＡ増幅量を定量した。エラーバーは、標準偏差（ｎ＝３）を示す。 図１０は、Ｋ５５２Ｔ／Ｄ５６７Ｎ変異体と野生型ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼについてＤＮＡ増幅のタイムコースを示す図である。 図１１は、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体（ロングバージョン）によるＤＮＡ増幅活性を示す図である。ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼタンパク質のＮ末端にＭＫＨ残基が付加されたロングバージョンのｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いてＤＮＡ増幅量を定量した。

発明の具体的説明

本発明において「バクテリオファージ」は、細菌を宿主として感染するウイルスをいい、例えば、バクテリオファージｐｈｉ２９、Ｔ４、Ｔ７、Ｑβが挙げられる。

本発明において「野生型ＤＮＡポリメラーゼ」とは、人為的に変異が導入されていないＤＮＡポリメラーゼをいう。野生型ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、バクテリオファージｐｈｉ２９、Ｔ４およびＴ７に由来する野生型ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、野生型Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよび野生型Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。

上記野生型ＤＮＡポリメラーゼのうちバクテリオファージｐｈｉ２９由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼは、３０℃付近において活性を有し、５’→３’ＤＮＡポリメラーゼ活性、鎖置換活性および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性によるプルーフリーディング（校正）活性を有する酵素である。バクテリオファージｐｈｉ２９由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼとしては、配列番号１を有するアミノ酸配列からなるＤＮＡポリメラーゼや、配列番号２を有するアミノ酸配列からなるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。

本発明において、分子中に含まれるアミノ酸の表記法は、本分野の慣例に従い、野生型のアミノ酸の一文字表記とその番号により表す。例えば、５５２番目のＬｙｓであれば「Ｋ５５２」と表記する。また、変異については、野生型のアミノ酸の一文字表記、その番号および変異後のアミノ酸の一文字表記により表す。例えば、５５２番目のＬｙｓがＴｈｒに置換された変異は「Ｋ５５２Ｔ」と表記する。また、複数箇所に置換を有する場合は、置換変異の間を「／」で区切ってそれぞれの置換を併記して示す。例えば、５５２番目のＬｙｓをＴｈｒに置換し、かつ、５６７番目のＡｓｐをＡｓｎに置換した変異体は、「Ｋ５５２Ｔ／Ｄ５６７Ｎ」と表記する。

本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の５番目（Ｍ５）、７４番目（Ｎ７４）、１４２番目（Ｄ１４２）、１５４番目（Ｋ１５４）、１８５番目（Ｍ１８５）、１８７番目（Ａ１８７）、２３７番目（Ｋ２３７）、２８６番目（Ｒ２８６）、２９５番目（Ｙ２９５）、３６５番目（Ｔ３６５）、３８１番目（Ｌ３８１）、３８９番目（Ａ３８９）、４２１番目（Ｐ４２１）、５１５番目（Ｐ５１５）、５２１番目（Ｉ５２１）、５５２番目（Ｋ５５２）および５６７番目（Ｄ５６７）からなる群から選択される少なくとも１つの位置に相当する位置にアミノ酸変異を有する。以下、上記のアミノ酸変異を「本発明のアミノ酸変異」ということがあり、上記アミノ酸変異の位置を「本発明のアミノ酸変異の位置」ということがある。

本発明のアミノ酸変異の位置は、ＤＮＡポリメラーゼ変異体の核酸増幅活性の観点から、配列番号１のアミノ酸配列の１４２番目（Ｄ１４２）、１８５番目（Ｍ１８５）、１８７番目（Ａ１８７）、３８１番目（Ｌ３８１）、４２１番目（Ｐ４２１）、５５２番目（Ｋ５５２）および５６７番目（Ｄ５６７）の位置に相当する位置とすることができ、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列の１８７番目（Ａ１８７）、３８１番目（Ｌ３８１）、４２１番目（Ｐ４２１）、５５２番目（Ｋ５５２）および５６７番目（Ｄ５６７）の位置に相当する位置であり、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列の５５２番目（Ｋ５５２）および５６７番目（Ｄ５６７）の位置に相当する位置であり、特に好ましくは配列番号１のアミノ酸配列の５５２番目（Ｋ５５２）の位置に相当する位置である。

本発明のアミノ酸変異の位置は、後記実施例に示す選択実験において変異がクローンに現れる頻度の観点から、配列番号１のアミノ酸配列の１５４番目（Ｋ１５４）、１８７番目（Ａ１８７）、２８６番目（Ｒ２８６）、２９５番目（Ｙ２９５）、３８１番目（Ｌ３８１）および５１５番目（Ｐ５１５）の位置に相当する位置とすることができ、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列の１５４番目（Ｋ１５４）および１８７番目（Ａ１８７）の位置に相当する位置である。

本発明のアミノ酸変異の位置はまた、ＤＮＡポリメラーゼ変異体の核酸増幅活性と、後記実施例に示す選択実験において変異がクローンに現れる頻度の観点から、配列番号１のアミノ酸配列の１４２番目（Ｄ１４２）、１５４番目（Ｋ１５４）、１８５番目（Ｍ１８５）、１８７番目（Ａ１８７）、２８６番目（Ｒ２８６）、２９５番目（Ｙ２９５）、３８１番目（Ｌ３８１）、４２１番目（Ｐ４２１）、５１５番目（Ｐ５１５）、５５２番目（Ｋ５５２）および５６７番目（Ｄ５６７）の位置に相当する位置とすることができ、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列の１８７番目（Ａ１８７）および３８１番目（Ｌ３８１）の位置に相当する位置である。

本発明のアミノ酸変異の位置の好ましい組み合わせとしては、
５番目（Ｍ５）の位置に相当する位置、１５４番目（Ｋ１５４）の位置に相当する位置および１８７番目（Ａ１８７）の位置に相当する位置の組み合わせ、
１５４番目（Ｋ１５４）の位置に相当する位置、１８７番目（Ａ１８７）の位置に相当する位置、３６５番目（Ｔ３６５）の位置に相当する位置、４２１番目（Ｐ４２１）の位置に相当する位置および５２１番目（Ｉ５２１）の位置に相当する位置の組み合わせ、
１４２番目（Ｄ１４２）の位置に相当する位置、１８５番目（Ｍ１８５）の位置に相当する位置、２８６番目（Ｒ２８６）の位置に相当する位置、２９５番目（Ｙ２９５）の位置に相当する位置および３８９番目（Ａ３８９）の位置に相当する位置の組み合わせ、
１５４番目（Ｋ１５４）の位置に相当する位置、１８７番目（Ａ１８７）の位置に相当する位置および２３７番目（Ｋ２３７）の位置に相当する位置の組み合わせ、
７４番目（Ｎ７４）の位置に相当する位置、５５２番目（Ｋ５５２）の位置に相当する位置および５６７番目（Ｄ５６７）の位置に相当する位置の組み合わせ、および
５５２番目（Ｋ５５２）の位置に相当する位置および５６７番目（Ｄ５６７）の位置に相当する位置の組み合わせ
が挙げられる。

本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体（後述するＤＮＡポリメラーゼ変異体ＡおよびＤＮＡポリメラーゼ変異体Ｂを含む）においては、本発明のアミノ酸変異の個数は、特に限定されるものではないが、その下限値を１個、２個、３個とすることができ、その上限値を１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個とすることができる。これらの下限値および上限値はそれぞれ任意に組み合わせることができ、本発明のアミノ酸変異の個数は、例えば、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、２〜７個、２〜６個、２〜５個、２〜４個、２〜３個、３〜７個、３〜６個、３〜５個、３〜４個、１個、２個または３個とすることができる。

本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体（後述するＤＮＡポリメラーゼ変異体ＡおよびＤＮＡポリメラーゼ変異体Ｂを含む）においてはまた、本発明のアミノ酸変異は、置換、欠失、付加および挿入のいずれかとすることができ、アミノ酸変異が複数個ある場合には各アミノ酸変異は同一または異なっていてもよく置換、欠失、付加および挿入のいずれかとすることができる。ここで、アミノ酸の置換は、アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が別の種類のアミノ酸残基に置き換えられることを意味する。またアミノ酸の欠失は、アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が削除されることを意味する。またアミノ酸の挿入としては、例えば、アミノ酸配列の内部への挿入が挙げられ、アミノ酸の付加としては、例えば、アミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端への付加が挙げられる。本発明のアミノ酸変異は、好ましくは置換であり、置換の個数は、特に限定されるものではないが、その下限値を１個、２個、３個とすることができ、その上限値を１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個とすることができる。これらの下限値および上限値はそれぞれ任意に組み合わせることができ、本発明のアミノ酸変異の個数は、例えば、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、２〜７個、２〜６個、２〜５個、２〜４個、２〜３個、３〜７個、３〜６個、３〜５個、３〜４個、１個、２個または３個とすることができる。

本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体の好ましい態様においては、バクテリオファージ由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼにおいて、本発明のアミノ酸変異として、前記(1)〜(17)の少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ）のアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供される。

本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体のより好ましい態様においては、バクテリオファージ由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼにおいて、本発明のアミノ酸変異として、前記(3)、(4)、(5)、(6)、(8)、(9)、(11)、(13)、(14)、(16)および(17)の少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ）のアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供される。本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体のさらに好ましい態様においては、バクテリオファージ由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼにおいて、本発明のアミノ酸変異として、前記(3)、(5)、(6)、(11)、(13)、(16)および(17)の少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ）のアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供され、さらに一層好ましくはバクテリオファージ由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼにおいて、本発明のアミノ酸変異として、前記(6)、(11)、(13)、(16)および(17)の少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ）のアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供される。本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体のさらに好ましい態様においてはまた、バクテリオファージ由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼにおいて、本発明のアミノ酸変異として、前記(4)、(6)、(8)、(9)、(11)および(14)の少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ）のアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供され、さらに一層好ましくはバクテリオファージ由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼにおいて、本発明のアミノ酸変異として、前記(4)および(6)のいずれかまたは両方のアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供される。本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体の特に好ましい態様においては、バクテリオファージ由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼにおいて、本発明のアミノ酸変異として、前記(6)および(11)のいずれかまたは両方のアミノ酸置換変異を少なくとも有するＤＮＡポリメラーゼ変異体、前記(16)および(17)のいずれかまたは両方のアミノ酸置換変異を少なくとも有するＤＮＡポリメラーゼ変異体、前記(6)のアミノ酸置換変異を少なくとも有するＤＮＡポリメラーゼ変異体および前記(16)のアミノ酸置換変異を少なくとも有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供される。

本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体のより好ましい態様においてはまた、バクテリオファージ由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼにおいて、本発明のアミノ酸変異として、以下のアミノ酸置換変異の組み合わせを少なくとも有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供される：
前記(1)、(4)および(6)の組み合わせ、
前記(4)、(6)、(10)、(13)および(15)の組み合わせ、
前記(3)、(5)、(8)、(9)および(12)の組み合わせ、
前記(4)、(6)および(7)の組み合わせ、
前記(2)、(16)および(17)の組み合わせ、および
前記(16)および(17)の組み合わせ。

本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、バクテリオファージ由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼにおいて、本発明のアミノ酸変異の位置に相当する位置にアミノ酸変異を有するものである。「本発明のアミノ酸変異の位置に相当する位置にアミノ酸変異を有する」とは、バクテリオファージ由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎなどの相同性検索ソフトウエアにより整列（アライメント）させたときに、配列番号１のアミノ酸配列の特定位置に対応する位置にアミノ酸変異を有することを意味する。例えば、バクテリオファージ由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１のアミノ酸配列を有する場合には、配列番号１のアミノ酸配列の１番目の位置が、該野生型ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１）のアミノ酸配列の１番目の位置と対応する。また、バクテリオファージ由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼが配列番号２のアミノ酸配列を有する場合には、配列番号１のアミノ酸配列の１番目の位置が、該野生型ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２）のアミノ酸配列の４番目の位置と対応する。

従って、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体の一態様としては、バクテリオファージ由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼが配列番号１のアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体（本明細書において「ＤＮＡポリメラーゼ変異体Ａ」ということがある）が挙げられ、具体的には、配列番号１のアミノ酸配列の５番目（Ｍ５）、７４番目（Ｎ７４）、１４２番目（Ｄ１４２）、１５４番目（Ｋ１５４）、１８５番目（Ｍ１８５）、１８７番目（Ａ１８７）、２３７番目（Ｋ２３７）、２８６番目（Ｒ２８６）、２９５番目（Ｙ２９５）、３６５番目（Ｔ３６５）、３８１番目（Ｌ３８１）、３８９番目（Ａ３８９）、４２１番目（Ｐ４２１）、５１５番目（Ｐ５１５）、５２１番目（Ｉ５２１）、５５２番目（Ｋ５５２）および５６７番目（Ｄ５６７）からなる群から選択される少なくとも１つの位置にアミノ酸変異（好ましくは置換）を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が挙げられる。

ＤＮＡポリメラーゼ変異体Ａにおけるアミノ酸変異の位置は、ＤＮＡポリメラーゼ変異体の核酸増幅活性の観点から、配列番号１のアミノ酸配列の１４２番目（Ｄ１４２）、１８５番目（Ｍ１８５）、１８７番目（Ａ１８７）、３８１番目（Ｌ３８１）、４２１番目（Ｐ４２１）、５５２番目（Ｋ５５２）および５６７番目（Ｄ５６７）の位置とすることができ、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列の１８７番目（Ａ１８７）、３８１番目（Ｌ３８１）、４２１番目（Ｐ４２１）、５５２番目（Ｋ５５２）および５６７番目（Ｄ５６７）の位置であり、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列の５５２番目（Ｋ５５２）および５６７番目（Ｄ５６７）の位置であり、特に好ましくは配列番号１のアミノ酸配列の５５２番目（Ｋ５５２）の位置である。

ＤＮＡポリメラーゼ変異体Ａにおけるアミノ酸変異の位置は、後記実施例に示す選択実験において変異がクローンに現れる頻度の観点から、配列番号１のアミノ酸配列の１５４番目（Ｋ１５４）、１８７番目（Ａ１８７）、２８６番目（Ｒ２８６）、２９５番目（Ｙ２９５）、３８１番目（Ｌ３８１）および５１５番目（Ｐ５１５）の位置とすることができ、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列の１５４番目（Ｋ１５４）および１８７番目（Ａ１８７）の位置である。

ＤＮＡポリメラーゼ変異体Ａにおけるアミノ酸変異の位置はまた、ＤＮＡポリメラーゼ変異体の核酸増幅活性と、後記実施例に示す選択実験において変異がクローンに現れる頻度の観点から、配列番号１のアミノ酸配列の１４２番目（Ｄ１４２）、１５４番目（Ｋ１５４）、１８５番目（Ｍ１８５）、１８７番目（Ａ１８７）、２８６番目（Ｒ２８６）、２９５番目（Ｙ２９５）、３８１番目（Ｌ３８１）、４２１番目（Ｐ４２１）、５１５番目（Ｐ５１５）、５５２番目（Ｋ５５２）および５６７番目（Ｄ５６７）の位置とすることができ、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列の１８７番目（Ａ１８７）および３８１番目（Ｌ３８１）の位置である。

ＤＮＡポリメラーゼ変異体Ａにおけるアミノ酸変異の位置の好ましい組み合わせとしては、
５番目（Ｍ５）、１５４番目（Ｋ１５４）および１８７番目（Ａ１８７）の組み合わせ、
１５４番目（Ｋ１５４）、１８７番目（Ａ１８７）、３６５番目（Ｔ３６５）、４２１番目（Ｐ４２１）および５２１番目（Ｉ５２１）の組み合わせ、
１４２番目（Ｄ１４２）、１８５番目（Ｍ１８５）、２８６番目（Ｒ２８６）、２９５番目（Ｙ２９５）および３８９番目（Ａ３８９）の組み合わせ、
１５４番目（Ｋ１５４）、１８７番目（Ａ１８７）および２３７番目（Ｋ２３７）の組み合わせ、
７４番目（Ｎ７４）、５５２番目（Ｋ５５２）および５６７番目（Ｄ５６７）の組み合わせ、および
５５２番目（Ｋ５５２）および５６７番目（Ｄ５６７）の組み合わせ
が挙げられる。

本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体Ａの好ましい態様においては、配列番号１のアミノ酸配列において、前記(101)〜(117)の少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ）のアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供される。

本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体Ａのより好ましい態様においては、配列番号１のアミノ酸配列において、前記(103)、(104)、(105)、(106)、(108)、(109)、(111)、(113)、(114)、(116)および(117)の少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ）のアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供される。本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体Ａのさらに好ましい態様においては、配列番号１のアミノ酸配列において、前記(103)、(105)、(106)、(111)、(113)、(116)および(117)の少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ）のアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供され、さらに一層好ましくは配列番号１のアミノ酸配列において、前記(106)、(111)、(113)、(116)および(117)の少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ）のアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供される。本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体Ａのさらに好ましい態様においてはまた、配列番号１のアミノ酸配列において、前記(104)、(106)、(108)、(109)、(111)および(114)の少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ）のアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供され、さらに一層好ましくは配列番号１のアミノ酸配列において、前記(104)および(106)のいずれかまたは両方のアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供される。本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体Ａの特に好ましい態様においては、配列番号１のアミノ酸配列において、前記(106)および(111)のいずれかまたは両方のアミノ酸置換変異を少なくとも有するＤＮＡポリメラーゼ変異体、前記(116)および(117)のいずれかまたは両方のアミノ酸置換変異を少なくとも有するＤＮＡポリメラーゼ変異体、前記(106)のアミノ酸置換変異を少なくとも有するＤＮＡポリメラーゼ変異体および前記(116)のアミノ酸置換変異を少なくとも有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供される。

本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体Ａのより好ましい態様においてはまた、バクテリオファージ由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼにおいて、本発明のアミノ酸変異として、以下のアミノ酸置換変異の組み合わせを少なくとも有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供される：
前記(101)、(104)および(106)の組み合わせ、
前記(104)、(106)、(110)、(113)および(115)の組み合わせ、
前記(103)、(105)、(108)、(109)および(112)の組み合わせ、
前記(104)、(106)および(107)の組み合わせ、
前記(102)、(116)および(117)の組み合わせ、および
前記(116)および(117)の組み合わせ。

本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体の別の態様としては、バクテリオファージ由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼが配列番号２のアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体（本明細書において「ＤＮＡポリメラーゼ変異体Ｂ」ということがある）が挙げられ、具体的には、配列番号２のアミノ酸配列の８番目（Ｍ８）、７７番目（Ｎ７７）、１４５番目（Ｄ１４５）、１５７番目（Ｋ１５７）、１８８番目（Ｍ１８８）、１９０番目（Ａ１９０）、２４０番目（Ｋ２４０）、２８９番目（Ｒ２８９）、２９８番目（Ｙ２９８）、３６８番目（Ｔ３６８）、３８４番目（Ｌ３８４）、３９２番目（Ａ３９２）、４２４番目（Ｐ４２４）、５１８番目（Ｐ５１８）、５２４番目（Ｉ５２４）、５５５番目（Ｋ５５５）および５７０番目（Ｄ５７０）からなる群から選択される少なくとも１つの位置にアミノ酸変異（好ましくは置換）を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が挙げられる。

ＤＮＡポリメラーゼ変異体Ｂにおけるアミノ酸変異の位置は、ＤＮＡポリメラーゼ変異体の核酸増幅活性の観点から、配列番号２のアミノ酸配列の１４５番目（Ｄ１４５）、１８８番目（Ｍ１８８）、１９０番目（Ａ１９０）、３８４番目（Ｌ３８４）、４２４番目（Ｐ４２４）、５５５番目（Ｋ５５５）および５７０番目（Ｄ５７０）の位置とすることができ、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列の１９０番目（Ａ１９０）、３８４番目（Ｌ３８４）、４２４番目（Ｐ４２４）、５５５番目（Ｋ５５５）および５７０番目（Ｄ５７０）の位置であり、より好ましくは配列番号２のアミノ酸配列の５５５番目（Ｋ５５５）および５７０番目（Ｄ５７０）の位置であり、特に好ましくは配列番号２のアミノ酸配列の５５５番目（Ｋ５５５）の位置である。

ＤＮＡポリメラーゼ変異体Ｂにおけるアミノ酸変異の位置は、後記実施例に示す選択実験において変異がクローンに現れる頻度の観点から、配列番号２のアミノ酸配列の１５７番目（Ｋ１５７）、１９０番目（Ａ１９０）、２８９番目（Ｒ２８９）、２９８番目（Ｙ２９８）、３８４番目（Ｌ３８４）および５１８番目（Ｐ５１８）の位置とすることができ、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列の１５７番目（Ｋ１５７）および１９０番目（Ａ１９０）の位置である。

ＤＮＡポリメラーゼ変異体Ｂにおけるアミノ酸変異の位置はまた、ＤＮＡポリメラーゼ変異体の核酸増幅活性と、後記実施例に示す選択実験において変異がクローンに現れる頻度の観点から、配列番号２のアミノ酸配列の１４５番目（Ｄ１４５）、１５７番目（Ｋ１５７）、１８８番目（Ｍ１８８）、１９０番目（Ａ１９０）、２８９番目（Ｒ２８９）、２９８番目（Ｙ２９８）、３８４番目（Ｌ３８４）、４２４番目（Ｐ４２４）、５１８番目（Ｐ５１８）、５５５番目（Ｋ５５５）および５７０番目（Ｄ５７０）の位置とすることができ、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列の１９０番目（Ａ１９０）および３８４番目（Ｌ３８４）の位置である。

ＤＮＡポリメラーゼ変異体Ａにおけるアミノ酸変異の位置の好ましい組み合わせとしては、
８番目（Ｍ８）、１５７番目（Ｋ１５７）および１９０番目（Ａ１９０）の組み合わせ、
１５７番目（Ｋ１５７）、１９０番目（Ａ１９０）、３６８番目（Ｔ３６８）、４２４番目（Ｐ４２４）および５２４番目（Ｉ５２４）の組み合わせ、
１４５番目（Ｄ１４５）、１８８番目（Ｍ１８８）、２８９番目（Ｒ２８９）、２９８番目（Ｙ２９８）および３９２番目（Ａ３９２）の組み合わせ、
１５７番目（Ｋ１５７）、１９０番目（Ａ１９０）および２４０番目（Ｋ２４０）の組み合わせ、
７７番目（Ｎ７７）、５５５番目（Ｋ５５５）および５７０番目（Ｄ５７０）の組み合わせ、および
５５５番目（Ｋ５５５）および５７０番目（Ｄ５７０）の組み合わせ
が挙げられる。

本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体Ｂの好ましい態様においては、配列番号２のアミノ酸配列において、前記(201)〜(217)の少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ）のアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供される。

本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体Ｂのより好ましい態様においては、配列番号２のアミノ酸配列において、前記(203)、(204)、(205)、(206)、(208)、(209)、(211)、(214)、(213)、(216)および(217)の少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ）のアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供される。本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体Ｂのさらに好ましい態様においては、配列番号２のアミノ酸配列において、前記(203)、(205)、(206)、 (211)、(213)、(216)および(217)の少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ）のアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供され、さらに一層好ましくは配列番号２のアミノ酸配列において、前記(206)、(211)、(213)、(216)および(217)の少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ）のアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供される。本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体Ｂのさらに好ましい態様においてはまた、配列番号２のアミノ酸配列において、前記(204)、(206)、(208)、(209)、(211)および(214)の少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つまたは少なくとも３つ）のアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供され、さらに一層好ましくは配列番号２のアミノ酸配列において、前記(204)および(206)のいずれかまたは両方のアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供される。本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体Ｂの特に好ましい態様においては、配列番号２のアミノ酸配列において、前記(206)および(211)のいずれかまたは両方のアミノ酸置換変異を少なくとも有するＤＮＡポリメラーゼ変異体、前記(216)および(217)のいずれかまたは両方のアミノ酸置換変異を少なくとも有するＤＮＡポリメラーゼ変異体、前記(206)のアミノ酸置換変異を少なくとも有するＤＮＡポリメラーゼ変異体および前記(216)のアミノ酸置換変異を少なくとも有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供される。

本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体Ｂのより好ましい態様においてはまた、バクテリオファージ由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼにおいて、本発明のアミノ酸変異として、以下のアミノ酸置換変異の組み合わせを少なくとも有するＤＮＡポリメラーゼ変異体が提供される：
前記(201)、(204)および(206)の組み合わせ、
前記(204)、(206)、(210)、(213)および(215)の組み合わせ、
前記(203)、(205)、(208)、(209)および(212)の組み合わせ、
前記(204)、(206)および(207)の組み合わせ、
前記(202)、(216)および(217)の組み合わせ、および
前記(216)および(217)の組み合わせ。

本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、核酸増幅活性を有するものであり、好ましくは野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較して増強された核酸増幅活性を有するものであり、より好ましくは野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較して２倍以上、３倍以上または４倍以上の増強された核酸増幅活性を有するものである。ここで、「核酸増幅活性」とは、ＤＮＡを鋳型として４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を基質として鋳型ＤＮＡの塩基配列に従ってＤＮＡ鎖の重合を触媒する活性をいう。従って、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、鋳型ＤＮＡが少量であっても効率的に核酸を増幅することができる。すなわち本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較して、より少量のＤＮＡポリメラーゼ酵素量で、野生型ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合と同レベルで核酸を増幅することができる。核酸増幅活性の測定は公知の手法を用いることができ、例えば、定量的ＰＣＲにより測定することができ、市販のキットを用いて測定してもよい。

本発明においては、本発明のアミノ酸変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体と実質的に同一のＤＮＡポリメラーゼ変異体も本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体に含まれる。この実質的に同一の変異体は前記（i）〜（v）からなる群から選択されるタンパク質である。前記(i)〜(v)におけるアミノ酸配列の改変は、本発明のアミノ酸変異の位置以外の位置に生ずるものとすることができる。

前記（i）において、「同一性」は「相同性」を含む意味で用いられる。ここで「同一性」は、例えば、比較する配列同士を適切に整列（アライメント）させたときの同一性の程度であり、前記配列間のアミノ酸の正確な一致の出現率（％）を意味する。同一性については、例えば、配列におけるギャップの存在およびアミノ酸の性質が考慮される（Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730（1983））。前記アライメントは、例えば、任意のアルゴリズムの利用により行うことができ、具体的に、ＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool)（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990））、ＦＡＳＴＡ（Peasron et al., Methods in Enzymology 183:63-69 (1990）)、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Meth. Enzym., 164, 765 (1988））などの相同性検索ソフトウエアを使用することができる。また、同一性の算出は、例えば、前記のような公知の相同性検索プログラムを用いて行うことができ、例えば、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）において、デフォルトのパラメーターを用いることによって算出することができる。

前記（i）における同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上である。

前記（ii）において、「アミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加された」とは、例えば、部位突然変異誘発法などの公知の方法により生じる程度の数のアミノ酸、または、天然に生じる程度の数のアミノ酸が、欠失、置換、挿入および／または付加によって改変されたことを意味する。前記置換などにより改変されるアミノ酸の個数は、例えば、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個である。前記アミノ酸配列において、前記改変は、例えば、連続して生じてもよいし、不連続に生じてもよい。

前記（ii）におけるアミノ酸の挿入としては、例えば、アミノ酸配列の内部への挿入が挙げられる。さらに、前記（ii）におけるアミノ酸の付加は、例えば、アミノ酸配列のＮ末端もしくはＣ末端への付加であっても、Ｎ末端およびＣ末端の両末端への付加であってもよい。

前記（ii）におけるアミノ酸の置換は、アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が別の種類のアミノ酸残基に置き換えられることを意味する。前記（ii）におけるアミノ酸の置換は、例えば、保存的置換であってもよい。「保存的置換」は、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１個または複数個のアミノ酸を、別のアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体に置換することを意味する。保存的置換において、置換されるアミノ酸と置換後のアミノ酸とは、例えば、性質および／または機能が類似していることが好ましい。具体的には、疎水性および親水性の指標、極性、電荷などの化学的性質、あるいは二次構造などの物理的性質が類似していることが好ましい。このように、性質および／または機能が類似するアミノ酸またはアミノ酸誘導体は、当該技術分野において公知である。例えば、非極性アミノ酸（疎水性アミノ酸）としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性アミノ酸（中性アミノ酸）は、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷を有するアミノ酸（塩基性アミノ）酸は、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられ、負電荷を有するアミノ酸（酸性アミノ酸）は、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。

前記（iii）、（iv）および（v）において、「アミノ酸配列をコードする塩基配列」とは、特定のアミノ酸配列が与えられることによって、遺伝暗号（すなわち、コドン）に基づいて特定することができる。前記（iii）、（iv）および（v）における「アミノ酸配列をコードする塩基配列」としては、例えば、配列番号２１〜３７の塩基配列（前記(101)〜(117)のアミノ酸変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドにそれぞれ対応する）が挙げられる。

前記（iii）、（iv）および（v）において、「塩基配列によりコードされるアミノ酸配列」および「ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列」は、特定の塩基配列または特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドが与えられることによって、遺伝暗号（すなわち、コドン）に基づいて特定することができる。

前記（iii）において、「同一性」は「相同性」を含む意味で用いられる。ここで、「同一性」は、前記（i）において述べたのと同様に、比較する配列同士を適切に整列（アライメント）させたときの同一性の程度であり、前記配列間の塩基の正確な一致の出現率（％）を意味する。同一性については、例えば、配列におけるギャップの存在および塩基の性質が考慮される（Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730 (1983））。前記アライメントは、例えば、任意のアルゴリズムの利用により行うことができ、例えば、前述した、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎなどの相同性検索ソフトウエアが使用することができる。また、同一性の算出は、例えば、前記のような公知の相同性検索プログラムを用いて行うことができ、例えば、前記相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）において、デフォルトのパラメーターを用いることによって算出することができる。

前記（iii）における同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上である。

前記（iv）において、「塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された」は、例えば、部位突然変異誘発法などの公知の方法により生じる程度の数の塩基（ヌクレオチド）、または、天然に生じる程度の数の塩基が、欠失、置換、挿入および／または付加によって改変されたことを意味する。前記置換などにより改変される塩基の個数は、例えば、１〜５０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜６個、１〜数個、１〜３個、１〜２個または１個である。前記欠失、挿入および／または付加される塩基は、例えば、連続する３つの塩基からなるコドンが好ましく、コドンの数は、例えば、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個または１個である。前記塩基配列において、前記改変は、連続して生じてもよいし、不連続に生じてもよい。

また、前記（iv）における塩基の挿入としては、例えば、塩基配列の内部への挿入が挙げられる。さらに、前記（iv）における塩基の付加は、例えば、塩基配列の５’末端もしくは３’末端への付加であっても、５’末端および３’末端の両末端への付加であってもよい。

前記（v）において、「ハイブリダイズする」とは、あるポリヌクレオチドが標的となるポリヌクレオチドと相補的なそれぞれの塩基同士の水素結合により二本鎖を形成することをいう。「ハイブリダイズ」は、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出することができる。ハイブリダイゼーションアッセイとしては、例えば、サザンハイブリダイゼーションアッセイ、コロニーハイブリダイゼーションアッセイなどの公知の方法が挙げられる。

前記（v）において、「ハイブリダイズ」あるいは「ハイブリダイゼーション」は、ストリンジェントな条件下で実施することができ、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイゼーション反応を行った後、洗浄緩衝液で洗浄することにより実施することができる。ここで「ストリンジェントな条件」は、ある塩基配列とその相補鎖との二重鎖のＴｍ（℃）および必要な塩濃度などに依存して決定することができ、アミノ酸配列をコードする塩基配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)参照）。ストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーションに通常用いられる適切な緩衝液（例えば、ＳＳＣ溶液）中で、塩基配列によって決定されるＴｍよりわずかに低い温度（例えば、Ｔｍよりも０〜５℃低い温度あるいはＴｍよりも０〜２℃低い温度）においてハイブリダイゼーション反応を実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件としてはまた、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄を高濃度低塩濃度溶液で実施することが挙げられる。

本発明によれば、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドが提供される。「ＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列を元に、遺伝暗号（すなわち、コドン）に基づいて特定することができる。本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２１〜３７のいずれかに記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明において「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、さらには、これらの修飾体や人工核酸が含まれるが、好ましくはＤＮＡである。また、ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび化学合成ＤＮＡが含まれる。

本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドは、使用する宿主において発現可能かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするコドンで構成されたものであれば特に限定されることなく、使用する宿主において発現可能にするため、あるいは、発現量を増加させるためにコドンの最適化を行ってもよい。コドン最適化は、本分野において通常使用されている公知の方法によって行うことができる。

本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡに関する。本発明の組換えＤＮＡは、例えば、組換えベクターの形態で提供することができる。本発明において「組換えベクター」は、それに挿入されたポリヌクレオチドを細胞または微生物などのターゲット内へと輸送することができる核酸分子をいう。

本発明の組換えベクターは、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドと作動可能に連結された発現調節配列とを含むことが好ましく、このような態様の組換えベクターを発現ベクターとして用いることができる。

本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを挿入することができる発現ベクターは、宿主に応じて選択することができ、本分野において通常使用されている発現ベクターであれば、特に限定はない。例えば、宿主細胞において自立複製が可能なベクターや宿主染色体に組み込まれ得るベクターを発現ベクターとして使用することができる。

本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを挿入する発現ベクターとしては、例えば、ｐＥＴ、ｐＢＡＤが挙げられる。本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、これら発現系を使用して製造してもよい。

本発明の発現ベクターに連結できるプロモーターは宿主に応じて選択することができ、本分野において通常使用されているプロモーターであれば、特に限定はない。例えば、大腸菌ではｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターのような大腸菌やファージなどに由来するプロモーターやそれらの改変体をプロモーターとして使用することができる。

本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を発現するベクターで形質転換する細胞（宿主）としては、本分野において通常使用されている宿主であれば、特に限定は無い。例えば細菌（大腸菌、枯草菌など）、酵母、糸状菌、昆虫細胞、真核細胞が使用できる。本発明の発現ベクターを有する宿主細胞の培養と本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体の回収は公知の方法に従って実施することができる。得られたＤＮＡポリメラーゼ変異体は後述のように核酸増幅用試薬や核酸増幅用キットとして用いることができる。

本発明によれば、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含んでなる、核酸増幅用試薬と、該試薬を含む核酸増幅用キットが提供される。本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体は野生型のＤＮＡポリメラーゼと同等かそれ以上の核酸増幅活性を有することから、微量ＤＮＡを増幅することが可能である。特に、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体のうち特定のアミノ酸変異を有する変異体は、野生型ＤＮＡポリメラーゼの活性に対して約３０倍の核酸増幅活性を有していることから、これまで困難であったＤＮＡや微生物組成の検出や分析を可能にするものである。すなわち、本発明によるＤＮＡポリメラーゼの増幅パフォーマンスの改良は、より高感度なゲノム解析を可能にし、幅広い応用が期待される。従って、本発明の核酸増幅用試薬およびキットは、これまで困難であった被験対象の血液サンプル中の癌細胞由来のＤＮＡの検出や、腸内および自然環境下の微生物の組成解析に用いることができる。

以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

例１：油中水滴型エマルションに封入した無細胞翻訳系を使ったＤＮＡのイン・ビトロ選択実験
（１）方法
ア ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ環状ＤＮＡの調製
鋳型となるｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ環状ＤＮＡ（プラスミドＤＮＡ）を、ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡社製、以下同様）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ（Ｔａｋａｒａ社製）、プライマー１（５’−ＣＧＧＡＧＡＴＣＴＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’、配列番号４７）およびプライマー２（５’−ＡＣＧＡＧＡＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧ−３’、配列番号４８）を用いるＰＣＲにより増幅した。なお、鋳型ＤＮＡは、メチル化またはα−Ｓ ｄＣＴＰを用いる二通りのラベリング方法によってＰＣＲ標識した。並行してＣｒｅリコンビナーゼ耐性のｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの構築も目指していたため（sakatani et al., Sci Rep., 8(1):13089 (2018)）、Ｃｒｅリコンビナーゼ濃度条件を三段階（非添加：０ｍＵ／μＬ、低濃度：３７．５ｍＵ／μＬ、高濃度：１５０ｍＵ／μＬ）に設定した。つまり、ラベリングの方法と、Ｃｒｅリコンビナーゼの濃度によって、次の６系列の進化系列を用意して選択実験を行なった。すなわち、メチル化標識かつＣｒｅリコンビナーゼ非添加（Ｍ０系列）、メチル化標識かつＣｒｅリコンビナーゼ低濃度（Ｍ１系列）、メチル化標識かつＣｒｅリコンビナーゼ高濃度（Ｍ２系列）、α−Ｓ ｄＣＴＰ標識かつＣｒｅリコンビナーゼ非添加（Ｔ０系列）、α−Ｓ ｄＣＴＰ標識かつＣｒｅリコンビナーゼ低濃度（Ｔ１系列）、α−Ｓ ｄＣＴＰ標識かつＣｒｅリコンビナーゼ高濃度（Ｔ２系列）とした。

イ 選択実験
ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼのローリングサークル型複製を使った転写・翻訳と共役したＤＮＡ複製（transcription and translation-coupled DNA replication、本明細書において単に「ＴＴｃＤＲ」ということがある）システム（図１参照、Sakatani Y et al., Sci Rep. 5: 10404(2015)）を用いて、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの選択実験を行なった。最初に、水滴の直径が１〜６μｍの油中水滴型エマルションに、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼをコードした環状ＤＮＡと大腸菌の再構成型無細胞翻訳系およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを封入した。具体的には、上記アで調製した標識環状ＤＮＡ（０．０１ｎＭ）と条件によりＣｒｅリコンビナーゼとを含有するＴＴｃＤＲ混合物（１０μｌ）を、ホモジナイザーを使用して１ｍｌの緩衝液飽和油中で激しく混合して、油中水滴型エマルションを調製した（Bansho, Y. et al., Chem Biol, 19:478-487 (2012)）。次いで、０．４２Ｕ／μｌのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）、０．１Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、０．６ｍＭのｄＮＴＰおよび１０．５ｍＭの酢酸マグネシウムを用いた以外は、Sakatani Y et al., Sci Rep. 5: 10404(2015)と同様にして、再構成無細胞翻訳系を調製した。ＴＴｃＤＲシステムのタンパク質成分は、Kazuta Y et al., J Biosci Bioeng., 118:554-557(2014)に従って調製した。なお、ＴＴｃＤＲシステムではＤＮＡプライマーを使用しなかった。環状ＤＮＡは、１００個の水滴当たり平均１個以下含まれるようにした。次いで、ＴＴｃＤＲ反応を起こすために３０℃で１６時間インキュベートした。次いで、元のＤＮＡを標準として用いて、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によってＤＮＡ濃度を測定した。具体的には、下記ウの記載に従って、ＤＮＡ濃度を測定した。次いで、エマルションを２０，０００×ｇで５分間遠心分離して水滴を集め、液滴をジエチルエーテルで洗浄して油を除去した（Tawfik DS et al., Nat Biotechnol., 16:652-656 (1998)）。回収した水相を２ｍＭのヨウ素溶液と混合し、３７℃で５分間インキュベートして、α−Ｓ ｄＣＴＰまたはメチル化標識した鋳型ＤＮＡを特異的に分解することでエマルションから産物ＤＮＡを選択的に回収した。次いで、産物ＤＮＡに１０ｍＭジチオトレイトールを添加し、残りのＤＮＡをＫＯＤ ＦＸポリメラーゼおよびプライマー１および２を用いてＰＣＲ増幅した。次いで、ＰＣＲ産物をＤＮＡカラム（ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＰＣＲ ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて精製し、１％アガロースゲルおよびＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）による電気泳動を用いたサイズ選択に供した。例１〜例６における全てのＤＮＡ精製手順は該カラムを用いて実施された。次いで、０．１２ｍＭのα−Ｓ ｄＣＴＰを添加して、抽出されたＤＮＡ断片を次のラウンドの鋳型ＤＮＡとして標識することを除いて、上記ＰＣＲ増幅と同様にして再度ＰＣＲ増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を精製後、ＤＮＡを０．５Ｕ／μｌのＢｇｌＩＩ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて３７℃で１時間消化し、さらに精製した。精製ＤＮＡ（０．７１ｎＭ）を１．７５Ｕ／μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて１６℃で１時間自己連結させて環状ＤＮＡを生成した。次いで、精製後、次のラウンドのＴＴｃＤＲ反応に用いた。このサイクルにおいて突然変異は、ＰＣＲ酵素またはｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの複製エラーによって生じる（ＰＣＲ酵素（ＫＯＤ ＦＸポリメラーゼ）に関するのメーカーの説明と、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼに関する報告（Ｅｓｔｅｂａｎ，１９９３）によると、各ラウンドで１ラウンドに１ＤＮＡあたり平均で２つの突然変異が導入される）。なお、例１〜例６において各酵素（ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅインヒビター、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼなど）の活性（ｕｎｉｔ）の定義については製造元の指示に従った。

ウ ＤＮＡ増幅量の変化
上記の進化サイクルを３５〜５７回繰り返しながら、選択実験の進化サイクルのラウンドにおけるＴＴｃＤＲ反応の産物ＤＮＡ量を測定した。ＤＮＡ濃度の測定は、元のＤＮＡを標準として用いて、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって測定した。各ＴＴｃＤＲ反応後、反応混合物を１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で１００倍に希釈し、さらにプライマー３（５’−ＡＧＧＧＴＡＴＧＧＧＣＧＴＡＴＧＧＴＴＡＴＡＴＧ−３’、配列番号４９）およびプライマー４（５’−ＴＧＴＣＣＣＡＴＧＣＧＡＧＡＴＡＴＧＡＴＣＧ−３、配列番号５０）を含むｑＰＣＲ溶液（ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ、ＴａＫａＲａ社製）で５倍希釈した。Ｍｘ３００５Ｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いてＤＮＡ蛍光をリアルタイムでモニターした。

エ Ｃｒｅリコンビナーゼ量の変化
液滴中のＣｒｅリコンビナーゼ濃度は、前のラウンドの平均ＤＮＡ複製速度に基づいて決定した。具体的には、Ｃｒｅリコンビナーゼ濃度が低濃度条件の場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ非添加と比べて、ＤＮＡ複製量が２分の１に低下するようなＣｒｅリコンビナーゼ濃度を予想して設定した。Ｃｒｅリコンビナーゼ濃度が高濃度条件の場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ非添加と比べて、ＤＮＡ複製量が４分の１に低下するようなＣｒｅリコンビナーゼ濃度を予想して設定した。ただし、Ｃｒｅリコンビナーゼ濃度は前のラウンドのＤＮＡ複製量から予想したため、必ずしも予想通りのＤＮＡ複製量にはなっていない。ここで、平均ＤＮＡ複製速度が前のラウンドの平均ＤＮＡ複製速度より大きいまたは小さいとき、Ｃｒｅリコンビナーゼ濃度はそれぞれ増加または減少する。したがって、Ｃｒｅリコンビナーゼに対する耐性を獲得した変異型ＤＮＡが進化サイクルの間に出現して集団を支配する場合、液滴中のＣｒｅリコンビナーゼ濃度は増加することが予測される。

（２）結果
結果は、図２に示す通りであった。３５〜５７回（ラウンド）の進化サイクルを繰り返し、各ラウンドにおける産物ＤＮＡ量とＣｒｅリコンビナーゼ濃度をプロットした。第０ラウンドでは元の環状ＤＮＡはほとんど複製せず、第１ラウンドでは０．００１〜０．０１ｎＭ程度であった。一方、ラウンド数が進むにつれて、ＤＮＡ量は数回の変動を伴って徐々に増加し、Ｍ０条件（メチル化標識かつＣｒｅリコンビナーゼ非添加）における第３５ラウンドでは０．３ｎＭに増加し、６条件において、元のＤＮＡ量と比較して、１０〜３０倍に増幅されたことが確認された。Ｃｒｅリコンビナーゼを添加した各条件（Ｍ１、Ｍ２、Ｔ１およびＴ２条件）においては、添加したＣｒｅリコンビナーゼ濃度が増加したことから、環状ＤＮＡがＣｒｅリコンビナーゼに対してある程度の耐性を獲得したことが示された。

例２：ＤＮＡ集団のエマルション外におけるＴＴｃＤＲ反応によるＤＮＡ増幅量
（１） 方法
選択実験によってＤＮＡ集団の平均のＤＮＡ増幅能力の増大がエマルションの外でも現れるかどうかを確かめるために、例１で実施した６系列の選択実験から数ラウンドずつをピックアップして、ＤＮＡ集団のｂｕｌｋ（Ｃｒｅリコンビナーゼ非添加条件）でのＴＴｃＤＲ反応によるＤＮＡ増幅量を調べた。具体的には、例１（図２参照）のＭ０系列の第２６および３７ラウンド、Ｍ１系列の第２１、３７および４８ラウンド、Ｍ２系列の第２２および３５ラウンド、Ｔ０系列の第２７、３６、４５および５５ラウンド、Ｔ１系列の第２１、３５、４９および５３ラウンド、Ｔ２系列の第２１、３３、４６および５４ラウンドからＤＮＡをピックアップした。そして、各ラウンドのＤＮＡ（０．５６ｎｇ／μＬ）を用いてＴＴｃＤＲ反応を３０℃で１６時間行い、例１（１）ウに記載の方法に従って、増幅したＤＮＡ濃度を測定した。対照として、野生型ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの環状ＤＮＡを用いた。

（２）結果
結果は、図３に示す通りであった。第０ラウンドの野生型ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（対照）のＤＮＡ増幅は１５倍程度であった。一方、全系列でラウンドを経るにつれてＤＮＡ増幅量が大きくなり、第３７ラウンドでは、初期濃度の４０倍以上に増幅するようになることが確認された。この選択実験によってｂｕｌｋ（Ｃｒｅリコンビナーゼ非添加条件）においても、ＤＮＡ集団の平均のＤＮＡ増幅能力が増大したことが確認された。

例３：単離したＤＮＡのＴＴｃＤＲ反応によるＤＮＡ増幅量
（１）方法
例２で実施したＤＮＡ増幅実験においてＤＮＡ増幅能力の高かったＤＮＡ集団（図３の灰色の矢尻）を８個選択して、各ＤＮＡ集団から８クローンずつ（合計で６４クローン）作製し、各クローンのｂｕｌｋ（Ｃｒｅリコンビナーゼ非添加条件）におけるＴＴｃＤＲ反応によるＤＮＡ増幅量を測定した。また、６４クローンについてシーケンス解析を行った。

（２）結果
結果は、図４に示す通りであった。全６４クローンの内の４８クローンが野生型より高いＤＮＡ増幅量を示し、最大で野生型の６倍ほどのＤＮＡ増幅量であった。全６４クローンについて、シーケンス解析したところ、全てのクローンで非同義置換（遺伝子ＤＮＡのコード配列に生じる塩基置換のうち、アミノ酸に変異を生じるもの）が確認された。全ての非同義置換は１０８種類で、平均の非同義置換数は１クローンにつき５．２個であった。

例４：単離したｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼＤＮＡによるｐＵＣ１９ ＤＮＡ増幅能
（１）ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼによるｐＵＣ１９ＤＮＡ増幅量
ア 方法
例３で同定したクローンにおける１０８の非同義置換から、ＤＮＡ増幅に有用な非同義置換を探した。ＴＴｃＤＲ反応では、配列に依存したＤＮＡの増幅のされやすさもＤＮＡ増幅量に影響することがある。このため、あらかじめ翻訳させておいたｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて、同一の鋳型ＤＮＡ（ｐＵＣ１９）に対するＤＮＡ増幅量を測定した。まず、全６４クローンのうち頻度が５以上の１３変異を網羅できるように、野生型より２倍以上活性の高いクローンを２０個選んだ。この２０クローン（ｌｉｎｅａｒ ＤＮＡ）をＰＵＲＥ ｆｒｅｘ２．０（ジーンフロンティア社製）と混合して３０℃で４時間インキュベートして、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ酵素を翻訳させた。なお、翻訳量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し、同程度であることを担保した。次いで、反応後の翻訳溶液を、ｐＵＣ１９を含む複製溶液で１００倍希釈し、３０℃で８時間インキュベートして、ポリメラーゼのＤＮＡ増幅活性を評価した。複製溶液の組成は、プラスミドｐＵＣ１９（０．１ｎｇ／μｌ）、ｄＮＴＰ（各０．６ｍＭ、ＮＥＢ）、酢酸マグネシウム（１０．５ｍＭ、和光）、ランダムヘキサマー（５μＭ、ファスマック）、酵母無機ピロリン酸分解酵素（０．６ｍＭ、ＮＥＢ）、グルタミン酸カリウム（７０ｍＭ、和光）、スペルミジン（０．３７５ｍＭ、ナカライ）、ジチオトレイオール（６ｍＭ、ナカライ）、ＡＴＰ（０．３７５ｍＭ、ＧＥヘルスケア）、ＧＴＰ（０．２５ｍＭ、ＧＥヘルスケア）、ＣＴＰ（０．１２５ｍＭ、ＧＥヘルスケア）、ＵＴＰ（０．１２５ｍＭ、ＧＥヘルスケア）、クレアチンリン酸（２５ｍＭ、ナカライ）、大腸菌転移ＲＮＡミックス（０．５１８μｇ／μｌ、ロシュ）、１０−フォルミルテトラヒドロ葉酸（１０ｎｇ／μｌ）、システイン（０．３ｍＭ、和光）、チロシン（０．３ｍＭ、和光）、その他の１８アミノ酸（０．３６ｍＭ、和光）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（１００ｍＭ、ｐＨ７．６、Ｓｉｇｍａ）、ストレプトマイシン（３０ｎｇ／μｌ）であった。次いで、上記インキュベート前後の複製溶液を１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で１０，０００倍希釈し、下記の方法でＤＮＡ濃度を測定した。ＤＮＡ濃度は、既知濃度のｐＵＣ１９を標準試料とした定量的ＰＣＲで測定した。具体的には、１ｍＭのＥＤＴＡで希釈した複製溶液を、プライマー５（５’−ＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧ−３’、配列番号５１）とプライマー６（５’−ＣＧＣＡＡＣＧＣＡＡＴＴＡＡＴＧＴＧＡＧ−３’、配列番号５２）を含んだｑＰＣＲ溶液（ＴＢ ｇｒｅｅｎ、タカラ社製）で５倍希釈した。ＤＮＡからの蛍光は、ＭＸ３００５Ｐ（アジレント社製）を用いてリアルタイムに測定した。ｐＵＣ１９で作成した０．００１ｎＭ〜１０００ｎＭ間の１０倍刻みの標準試料による蛍光と比較し、目的の試料のＤＮＡ濃度を決定した。

イ 結果
結果は、図５に示す通りであった。非同義置換を有する２０個のクローンのうち９個のクローンにおいて、野生型ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの２倍以上のＤＮＡ増幅活性を示すことが確認された。最大の活性を示した非同義置換を有するクローン（クローン５６番）は、野生型の１０倍以上のＤＮＡ増幅活性を示すことが確認された。

（２）非同義置換を有するクローンにおけるアミノ酸置換
ア 方法
上記（１）において選択した非同義置換を有する２０個のクローンから野生型の３倍以上の活性を示した６個のクローンを選択し（図５中の白い矢印）、これらのクローンに含まれている１５個の非同義置換について、単一の置換のみを持つ変異体（ｉｓｏｌａｔｅ）を作製した。また、全６４クローンのうち２０クローン以上に現れた６個の非同義置換であって、この１５個の非同義置換変異に含まれていない２個の非同義置換変異についてもｉｓｏｌａｔｅを作成した。

イ 結果
結果は、図６に示す通りであった。１７種の非同義置換が同定され、これらは、配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの５位のメチオニンがスレオニンに置換される変異（Ｍ５Ｔ）、７４位のアスパラギンがセリンに置換される変異（Ｎ７４Ｓ）、１４２位のアスパラギン酸がグリシンに置換される変異（Ｄ１４２Ｇ）、１５４位のリシンがグルタミン酸に置換される変異（Ｋ１５４Ｅ）、１８５位のメチオニンがイソロイシンに置換される変異（Ｍ１８５Ｉ）、１８７位のアラニンがスレオニンに置換される変異（Ａ１８７Ｔ）、２３７位のリシンがアルギニンに置換される変異（Ｋ２３７Ｒ）、２８６位のアルギニンがリシンに置換される変異（Ｒ２８６Ｋ）、２９５位のチロシンがヒスチジンに置換される変異（Ｙ２９５Ｈ）、３６５位のスレオニンがメチオニンに置換される変異（Ｔ３６５Ｍ）、３８１位のロイシンがグルタミンに置換される変異（Ｌ３８１Ｑ）、３８９位のアラニンがスレオニンに置換される変異（Ａ３８９Ｔ）、４２１位のプロリンがスレオニンに置換される変異（Ｐ４２１Ｔ）、５１５位のプロリンがセリンに置換される変異（Ｐ５１５Ｓ）、５２１位のイソロイシンがスレオニンに置換される変異（Ｉ５２１Ｔ）、５５２位のリシンがスレオニンに置換される変異（Ｋ５５２Ｔ）および５６７位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換される変異（Ｄ５６７Ｎ）であった。野生型ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）において、上記の変異のうち１つの変異を有するｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列（１７種）を配列番号３〜１９（配列番号３〜１９は順に前記(101)〜(117)のアミノ酸置換変異に対応）に、これらのｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド配列（１７種）を配列番号２１〜３７（配列番号２１〜３７は順に配列番号３〜１９のアミノ酸配列に対応）に示す。

例５：ＤＮＡ増幅パフォーマンスを向上させる変異
（１）野生型のｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼにおいて１アミノ酸残基のみを置換させた１７種の変異体ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅活性
ア 方法
例４（２）で同定された合計１７種の非同義置換のｉｓｏｌａｔｅについて、複製溶液中でのインキュベート時間を８時間とした以外は例４（１）アに記載の方法に従って、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体酵素を翻訳させて、該酵素によるｐＵＣ１９ ＤＮＡ増幅量を測定した。７種の非同義置換の各変異体の翻訳量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ像のバンド強度をもとにして定量した。

イ 結果
結果は、図７および図８に示す通りであった。図７の結果から、７種の非同義置換（Ｄ１４２Ｇ、Ｍ１８５Ｉ、Ａ１８７Ｔ、Ｌ３８１Ｑ、Ｐ４２１Ｔ、Ｋ５５２Ｔ、Ｄ５６７Ｎ）では、野生型ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの２倍以上のＤＮＡ増幅量を示すことが確認され、５種の非同義置換（Ａ１８７Ｔ、Ｌ３８１Ｑ、Ｐ４２１Ｔ、Ｋ５５２Ｔ、Ｄ５６７Ｎ）では、野生型ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの３倍以上のＤＮＡ増幅量を示すことが確認された。ＤＮＡ増幅活性が最も高い変異であるＫ５５２Ｔは、野生型の約４倍のＤＮＡ増幅能を示した。なお、図８の結果から、上記７種のｉｓｏｌａｔｅ間で翻訳量に有意な差は見られないことが確認された。

（２）クローン５６番に含まれる３種の非同義置換のうちの２種の置換を組み合わせたｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体によるＤＮＡ増幅活性
ア 方法
上記（１）で野生型の１０倍の活性を示したクローン５６番（図７参照）は、Ｋ５５２Ｔを含む３種の置換（Ｎ７４Ｓ、Ｋ５５２Ｔ、Ｄ５６７Ｎ）のみを含むクローンである。そこで、該３種の置換のうち、２種の置換を併せもつ３通りのｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体ＤＮＡ、すなわち、Ｎ７４ＳおよびＫ５５２Ｔ変異を有する変異体（以下、単に「Ｎ７４Ｓ／Ｋ５５２Ｔ変異体」ということがある）、Ｎ７４ＳおよびＤ５６７Ｎ変異を有する変異体（以下、単に「Ｎ７４Ｓ／Ｄ５６７Ｎ変異体」ということがある）、Ｋ５５２ＴおよびＤ５６７Ｎ変異を有する変異体（以下、単に「Ｋ５５２Ｔ／Ｄ５６７Ｎ変異体」ということがある）を作成し、この３通りの変異型について、上記（１）アに記載の方法に従って、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体酵素を翻訳させて、該酵素によるｐＵＣ１９ ＤＮＡ増幅量を測定した。

イ 結果
結果は、図９に示す通りであった。図９の結果から、Ｎ７４Ｓ／Ｋ５５２Ｔ変異体およびＮ７４Ｓ／Ｄ５６７Ｎ変異体によるＤＮＡ増幅量は、Ｋ５５２Ｔ変異体およびＤ５６７Ｓ変異体と大きく変わらなかった。一方、Ｋ５５２Ｔ／Ｄ５６７Ｎ変異体では、野生型ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの３０倍以上の活性を示すことが確認された。以上の結果から、例４（１）イにおいてクローン５６番が示した野生型ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの１０倍のＤＮＡ増幅活性は、Ｋ５５２ＴおよびＤ５６７Ｎの２置換によるものであることが示唆された。野生型ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）において、Ｎ７４Ｓ／Ｋ５５２Ｔ変異体、Ｎ７４Ｓ／Ｄ５６７Ｎ変異体およびＫ５５２Ｔ／Ｄ５６７Ｎ変異体のｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列（３種）を配列番号３８〜４０に、これらのｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド配列（３種）を配列番号４１〜４３（配列番号４１〜４３は順に配列番号３８〜４０に示すアミノ酸配列に対応）に示す。

（３）Ｋ５５２Ｔ／Ｄ５６７ＮのＤＮＡ増幅のタイムコース
ア 方法
上記（２）アで作製したＫ５５２Ｔ／Ｄ５６７Ｎ変異体について、３０℃でインキュベートしながらタイムサンプリングした以外は例４（１）アに記載の方法に従って、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体酵素を翻訳させて、該酵素によるｐＵＣ１９ ＤＮＡ増幅のタイムコースを測定した。

イ 結果
野生型ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ酵素はＤＮＡ増幅開始から４時間の時点において、ＤＮＡをほとんど増幅しなかった。一方、Ｋ５５２Ｔ／Ｄ５６７Ｎ変異体はＤＮＡ増幅開始から４時間の時点においてＤＮＡを約２００倍に増幅することが確認された。これらの結果から、Ｋ５５２Ｔ／Ｄ５６７Ｎ変異体は、短時間でＤＮＡを増幅することができるｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ酵素であることが示された。

（４）ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ変異体タンパク質のＮ末端側へのアミノ酸付加による影響
野生型ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼには、タンパク質のＮ末端のアミノ酸配列により２種類が存在する。すなわち、例１〜例５（３）で用いた配列番号１のアミノ酸配列を有するｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（以下、単に「ショートバージョン」ということがある）と、ショートバージョンのＮ末端に３つのアミノ酸残基（メチオニン、リシン、ヒスチジン）をさらに有する配列番号２のアミノ酸配列を有するｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（以下、単に「ロングバージョン」ということがある）である。例５で示された、非同義置換を有するｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（ショートバージョン）のＤＮＡ増幅活性の向上が、非同義置換を有するロングバージョンのｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼにおいても維持されているか検討した。

ア 方法
ＭＫＨをＮ末端に付加させたｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２０に示すＤＮＡを含むプラスミドを鋳型に用い、プライマー７（５’−ＡＴＧＡＡＧＣＡＴＡＴＧＣＣＧＡＧＡＡＡＧＡＴＧＴＡＴＡＧＴＴＧ−３’、配列番号５３）とプライマー８（５’−ＣＧＧＣＡＴＡＴＧＣＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧ−３’、配列番号５４）を用いたＰＣＲ反応により構築した。プラスミド全長を増幅し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社）を用いた組み換えにより末端を結合させた。ＭＫＨ−野生型（すなわち、ロングバージョンのｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ）は、野生型のｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち、ショートバージョンのｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ）（アミノ酸配列を配列番号１に、ポリヌクレオチド配列を配列番号２０に示す）の先頭にアミノ酸配列ＭＫＨ、および核酸配列ＡＴＧＡＡＧＣＡＴを追加したものである。ロングバージョンの全アミノ酸配列を配列番号２に、全ポリヌクレオチド配列を配列番号４４に示す。ＭＫＨ−変異導入は、ＭＫＨ−野生型においてアミノ酸変異Ｎ７４Ｓ、Ｋ５５２ＴおよびＤ５６７Ｎを含む配列である。全アミノ酸配列を配列番号４５に、全ポリヌクレオチド配列を配列番号４６に示す。例４（１）アに記載の方法に従って、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ酵素を翻訳させて、該酵素によるｐＵＣ１９ ＤＮＡ増幅量を測定した。

イ 結果
非同義置換を有するロングバージョンのｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号４５）では、野生型ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの約２５倍のＤＮＡ増幅活性を示すことが確認された。従って、例５で示された非同義置換は、ロングバージョンのｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼにおいても、ショートバージョンのｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼと同程度にＤＮＡ増幅活性を増強することが示された。

Claims (16)

1. バクテリオファージ由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の５番目（Ｍ５）、７４番目（Ｎ７４）、１４２番目（Ｄ１４２）、１５４番目（Ｋ１５４）、１８５番目（Ｍ１８５）、１８７番目（Ａ１８７）、２３７番目（Ｋ２３７）、２８６番目（Ｒ２８６）、２９５番目（Ｙ２９５）、３６５番目（Ｔ３６５）、３８１番目（Ｌ３８１）、３８９番目（Ａ３８９）、４２１番目（Ｐ４２１）、５１５番目（Ｐ５１５）、５２１番目（Ｉ５２１）、５５２番目（Ｋ５５２）および５６７番目（Ｄ５６７）からなる群から選択される少なくとも１つの位置に相当する位置にアミノ酸変異を有する、ＤＮＡポリメラーゼ変異体または該変異体と実質的に同一のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
2. 野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較して増強された核酸増幅活性を示す、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
3. バクテリオファージがバクテリオファージｐｈｉ２９である、請求項１または２に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
4. 野生型ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号２のアミノ酸配列を有するものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
5. アミノ酸変異の位置が、配列番号１のアミノ酸配列の１４２番目（Ｄ１４２）、１５４番目（Ｋ１５４）、１８５番目（Ｍ１８５）、１８７番目（Ａ１８７）、２８６番目（Ｒ２８６）、２９５番目（Ｙ２９５）、３８１番目（Ｌ３８１）、４２１番目（Ｐ４２１）、５１５番目（Ｐ５１５）、５５２番目（Ｋ５５２）および５６７番目（Ｄ５６７）からなる群から選択される少なくとも１つの位置に相当する位置を少なくとも含むものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
6. アミノ酸変異の位置が、配列番号１のアミノ酸配列の５５２番目（Ｋ５５２）および５６７番目（Ｄ５６７）のいずれかまたは両方に相当する位置を少なくとも含むものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
7. アミノ酸変異が、置換である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。
8. アミノ酸変異が、(1)〜(17)からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体：
   (1)配列番号１のアミノ酸配列の５番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のスレオニンへの置換、
   (2)配列番号１のアミノ酸配列の７４番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のセリンへの置換、
   (3)配列番号１のアミノ酸配列の１４２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のグリシンへの置換、
   (4)配列番号１のアミノ酸配列の１５４番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のグルタミン酸への置換、
   (5)配列番号１のアミノ酸配列の１８５番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のイソロイシンへの置換、
   (6)配列番号１のアミノ酸配列の１８７番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のスレオニンへの置換、
   (7)配列番号１のアミノ酸配列の２３７番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のアルギニンへの置換、
   (8)配列番号１のアミノ酸配列の２８６番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のリシンへの置換、
   (9)配列番号１のアミノ酸配列の２９５番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のヒスチジンへの置換、
   (10)配列番号１のアミノ酸配列の３６５番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のメチオニンへの置換、
   (11)配列番号１のアミノ酸配列の３８１番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のグルタミンへの置換、
   (12)配列番号１のアミノ酸配列の３８９番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のスレオニンへの置換、
   (13)配列番号１のアミノ酸配列の４２１番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のスレオニンへの置換、
   (14)配列番号１のアミノ酸配列の５１５番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のセリンへの置換、
   (15)配列番号１のアミノ酸配列の５２１番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のスレオニンへの置換、
   (16)配列番号１のアミノ酸配列の５５２番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のスレオニンへの置換、および
   (17)配列番号１のアミノ酸配列の５６７番目のアミノ酸に相当するアミノ酸のアスパラギンへの置換。
9. 野生型ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号１のアミノ酸配列を有するものであり、かつ、配列番号１のアミノ酸配列において、下記(101)〜(117)の少なくとも１つのアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体：
   (101)配列番号１のアミノ酸配列の５番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ｍ５Ｔ）、
   (102)配列番号１のアミノ酸配列の７４番目のアミノ酸のセリンへの置換（Ｎ７４Ｓ）、
   (103)配列番号１のアミノ酸配列の１４２番目のアミノ酸のグリシンへの置換（Ｄ１４２Ｇ）、
   (104)配列番号１のアミノ酸配列の１５４番目のアミノ酸のグルタミン酸への置換（Ｋ１５４Ｅ）、
   (105)配列番号１のアミノ酸配列の１８５番目のアミノ酸のイソロイシンへの置換（Ｍ１８５Ｉ）、
   (106)配列番号１のアミノ酸配列の１８７番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ａ１８７Ｔ）、
   (107)配列番号１のアミノ酸配列の２３７番目のアミノ酸のアルギニンへの置換（Ｋ２３７Ｒ）、
   (108)配列番号１のアミノ酸配列の２８６番目のアミノ酸のリシンへの置換（Ｒ２８６Ｋ）、
   (109)配列番号１のアミノ酸配列の２９５番目のアミノ酸のヒスチジンへの置換（Ｙ２９５Ｈ）、
   (110)配列番号１のアミノ酸配列の３６５番目のアミノ酸のメチオニンへの置換（Ｔ３６５Ｍ）、
   (111)配列番号１のアミノ酸配列の３８１番目のアミノ酸のグルタミンへの置換（Ｌ３８１Ｑ）、
   (112)配列番号１のアミノ酸配列の３８９番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ａ３８９Ｔ）、
   (113)配列番号１のアミノ酸配列の４２１番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ｐ４２１Ｔ）、
   (114)配列番号１のアミノ酸配列の５１５番目のアミノ酸のセリンへの置換（Ｐ５１５Ｓ）、
   (115)配列番号１のアミノ酸配列の５２１番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ｉ５２１Ｔ）、
   (116)配列番号１のアミノ酸配列の５５２番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ｋ５５２Ｔ）、および
   (117)配列番号１のアミノ酸配列の５６７番目のアミノ酸のアスパラギンへの置換（Ｄ５６７Ｎ）。
10. 野生型ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列を有するものであり、かつ、配列番号２のアミノ酸配列において、下記(201)〜(217)の少なくとも１つのアミノ酸置換変異を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体：
    (201)配列番号２のアミノ酸配列の８番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ｍ８Ｔ）、
    (202)配列番号２のアミノ酸配列の７７番目のアミノ酸のセリンへの置換（Ｎ７７Ｓ）、
    (203)配列番号２のアミノ酸配列の１４５番目のアミノ酸のグリシンへの置換（Ｄ１４５Ｇ）、
    (204)配列番号２のアミノ酸配列の１５７番目のアミノ酸のグルタミン酸への置換（Ｋ１５７Ｅ）、
    (205)配列番号２のアミノ酸配列の１８８番目のアミノ酸のイソロイシンへの置換（Ｍ１８８Ｉ）、
    (206)配列番号２のアミノ酸配列の１９０番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ａ１９０Ｔ）、
    (207)配列番号２のアミノ酸配列の２４０番目のアミノ酸のアルギニンへの置換（Ｋ２４０Ｒ）、
    (208)配列番号２のアミノ酸配列の２８９番目のアミノ酸のリシンへの置換（Ｒ２８９Ｋ）、
    (209)配列番号２のアミノ酸配列の２９８番目のアミノ酸のヒスチジンへの置換（Ｙ２９８Ｈ）、
    (210)配列番号２のアミノ酸配列の３６８番目のアミノ酸のメチオニンへの置換（Ｔ３６８Ｍ）、
    (211)配列番号２のアミノ酸配列の３８４番目のアミノ酸のグルタミンへの置換（Ｌ３８４Ｑ）、
    (212)配列番号２のアミノ酸配列の３９２番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ａ３９２Ｔ）、
    (213)配列番号２のアミノ酸配列の４２４番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ｐ４２４Ｔ）、
    (214)配列番号２のアミノ酸配列の５１８番目のアミノ酸のセリンへの置換（Ｐ５１８Ｓ）、
    (215)配列番号２のアミノ酸配列の５２４番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ｉ５２４Ｔ）、
    (216)配列番号２のアミノ酸配列の５５５番目のアミノ酸のスレオニンへの置換（Ｋ５５５Ｔ）、および
    (217)配列番号２のアミノ酸配列の５７０番目のアミノ酸のアスパラギンへの置換（Ｄ５７０Ｎ）。
11. 前記ＤＮＡポリメラーゼ変異体と実質的に同一のＤＮＡポリメラーゼ変異体が、下記（i）〜（v）からなる群から選択されるタンパク質からなるものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体：
    （i）ＤＮＡポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、核酸増幅活性を示すタンパク質、
    （ii）ＤＮＡポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、核酸増幅活性を示すタンパク質、
    （iii）ＤＮＡポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列をコードする塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、核酸増幅活性を示すタンパク質、
    （iv）ＤＮＡポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列をコードする塩基配列において、１または複数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、核酸増幅活性を示すタンパク質、および
    （v）ＤＮＡポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、核酸増幅活性を示すタンパク質。
12. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードする、ポリヌクレオチド。
13. 請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、組換えＤＮＡまたは組換えベクター。
14. 請求項１３に記載の組換えＤＮＡまたは組換えベクターを保有する細胞。
15. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含んでなる、核酸増幅用試薬。
16. 請求項１５に記載の核酸増幅用試薬を含んでなる、核酸増幅用キット。
    
    

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