CN113684202A - 一种安全无毒的高通量无缝构建质粒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种安全无毒的高通量无缝构建质粒的方法，属于遗传工程领域。本发明通过优化组装溶液成分，排除现有方法中存在有毒试剂二硫苏糖醇，以及DNA聚合酶、DNA连接酶、NAD等较昂贵的试剂。由于不需要DNA纯化操作，使得该方法适用于基于96孔PCR板或96孔酶标板等的高通量操作平台。同时，太极组装4个片段构建质粒时，拥有95％以上的阳性率，在高通量构建质粒实验中，可以省略菌落PCR验证步骤，进一步简化高通量质粒构建流程。

Description

一种安全无毒的高通量无缝构建质粒的方法

技术领域

本发明涉及一种安全无毒的高通量无缝构建质粒的方法，属于遗传工程领域。

背景技术

快捷简便的无缝构建质粒是分子生物学的基础，随着分子生物学研究对大量数据的需求，高通量无缝构建质粒技术平台成为推动领域进步的关键。自发现第一个限制性内切酶，开发出基于酶切连接的质粒构建方法以来，随着技术的不断发展，目前形成了三种主流的质粒构建方法，包括吉布森组装(Gibson assembly)、金门组装(Golden gateassembly)和酿酒酵母体内组装。基于IIS型限制性内切核酸酶的金门组装可用于组装包含重复序列的多个片段。基于内源性重组酶的酿酒酵母组装方法适用于组装多个大片段。然而，金门组装需要酶切、连接、纯化等过程，操作复杂，且成本高。酿酒酵母体内组装由于需要涉及酿酒酵母特有的转化方法，且其生长较慢，不适于高通量构建质粒。2009年报道的吉布森组装组装方法，因其简便性和高效性成为常规基因克隆中使用最广泛的方法(DOI:10.1038/nmeth.1318)。

吉布森组装方法由T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶，以及Tris-HCl、镁离子、PEG8000 和DTT(二硫苏糖醇)组成。镁离子、Tris-HCl和PEG8000提供了酶反应条件，DTT作为强还原剂提供还原环境。首先由T5核酸外切酶将双链DNA切割获得3’端单链末端，之后DNA聚合酶修复不同片段间 3’端单链末端的缺口，最后由DNA连接酶进行连接。其中，T5核酸外切酶是吉布森组装方法的核心，且基于该酶的3’端单链末端退火构建质粒提供了极高的阳性率(大于90％)，所有基于T5核酸外切酶优化的方法均拥有约90％以上的阳性率。由于吉布森组装方法的高效性和简便性，2009年之后，有许多进一步的研究。2014年，有研究发现去除成本最高的DNA连接酶后并不会影响吉布森组装效率，被命名为Hot Fusion，使得成本大幅下降约90％，但是该方法反应液需要dNTP、NAD等，导致配置过程较复杂，并且需要添加有毒试剂DTT(《Hot Fusion:An Efficient Method to Clone Multiple DNAFragments as Well as Inverted Repeats without Ligase》)。此外，在公开号为CN107760706A的专利《DNA外切酶的应用及无缝克隆的方法》中所采用的组装方法，以及在公开号为CN 108841901A《一种依赖T5核酸外切酶和PEG8000 完成DNA组装的试剂盒及其应用》中命名为TEDA的组装方法，均是在Hot Fusion的基础上，进一步去除DNA聚合酶而成的组装方法。然而2016年有研究文献表明，在去除DNA聚合酶的情况下，会导致两个DNA片段的组装效率显著降低约70％(《Seamless Insert-Plasmid Assembly at High Efficiencyand Low Cost》)。本专利的结果进一步表明，当组装4个DNA片段时，若去除DNA聚合酶，会导致组装效率下降约90％(图2)。因此，DNA聚合酶是基于T5核酸外切酶组装方法中不可去除的关键成分。

目前，吉布森组装方法和Hot Fusion方法，由于含有DNA聚合酶而拥有较高的组装效率，但是成本较高，且配置过程复杂；TEDA组装方法和专利公开号CN 107760706A中提及的组装方法，由于不含有 DNA聚合酶而拥有较低成本，但是组装效率较低，因此，基于T5核酸外切酶的组装方法尚存在成本和组装效率难以统一的问题。其次，以上4种组装方法的反应溶液中均需要加入DTT，DTT价格较高，且刺激性气味和毒性存在生物安全隐患。第三，以上4种组装方法均需要纯化DNA片段以除去酶或引物等物质 (测定DNA浓度前需要进行DNA纯化)，纯化过程不仅增加了成本，且需要离心等步骤，难以满足高通量自动化平台自动化构建质粒的需求。第四，以上4种组装方法均需要调节各片段浓度在合适范围内才能获得高组装效率，额外需要价格较高的核酸定量仪，且需要繁琐的计算浓度和移液操作，不利于满足高通量构建质粒的要求。而目前还未有可以有效解决上述四个问题的方法，给高通量构建质粒都造成了时间和资源上的浪费。

发明内容

为了解决现有质粒构建方法的四个限制，本发明的目的是在吉布森组装方法的基础上，提供一种基于 T5核酸外切酶的安全无毒的高通量无缝质粒构建方法(命名为太极组装，Tai Chi assembly)，其不含毒性物质DTT、不需要DNA纯化过程，低成本、高效率，且适用于高通量无缝构建质粒。首先，现有研究已经表明DNA聚合酶是提高组装效率的关键，但是也导致较高的成本和复杂的反应溶液。为此，本发明提出一种借用PCR反应体系中的DNA聚合酶，以修复T5核酸外切酶产生缺口的新颖思路，不仅避免了反应溶液中加入DNA聚合酶带来的高成本和复杂的配置过程，还可以省略DNA纯化过程，进一步降低成本和简化操作过程。其次，为了去除反应液中有毒的DTT，通过优化不同配方，不仅实现目前最高的多组装效率，且实现将复杂的吉布森反应系统简化至仅需要T5核酸外切酶、氯化镁、PEG和Tris-HCl，4种成分，而目前最简化的吉本森优化系统TEDA仍需要至少5种成分(含有毒性成分DTT)。太极组装不需要优化片段添加量和添加比例，即可实现高效组装效率，显著降低了操作难度。由于不需要DNA纯化操作，使得该方法适用于基于96孔PCR板或96孔酶标板等的高通量操作平台，并且本专利优化了适用于太极组装的高通量质粒构建方案(图8)。

本发明提供了一种构建质粒的方法，所述方法将DNA片段加入含有镁离子、PEG8000、核酸外切酶和Tris-HCl的反应体系中，反应后即得到重组质粒。

在一种实施方式中，所述DNA片段为利用高保真酶扩增得到，将扩增得到的含有DNA片段的PCR 产物以体积比5％～50％的量添加至反应体系中。

在一种实施方式中，PCR产物添加量优选为20％。

在一种实施方式中，所述反应体系中氯化镁浓度为0.2～4.0g/L；氯化镁浓度优选为4.0g/L。

在一种实施方式中，所述反应体系中PEG8000的浓度为0～80g/L；PEG8000的浓度优选为40g/L。

在一种实施方式中，所述核酸外切酶包括但不限于T5核酸外切酶，所述T5的浓度为0.01～0.5μL/mL；所述T5的浓度优选为0.15μL/L。

在一种实施方式中，所述Tris-HCl的pH为7.0～8.0，Tris-HCl的浓度为1M；浓度为40～140mL/L；优选的，Tris-HCl的pH为7.0、7.5或8.0，浓度为80mL/L。

在一种实施方式中，在30～48℃下反应10～60min。

在一种实施方式中，所述DNA片段的数量不少于2个，任意两个DNA片段的体积比为1:(1～10)。

在一种实施方式中，PCR产物之间含有重叠序列，每个重叠序列的长度不少于8个碱基，GC含量为 10％～50％。

在一种实施方式中，将氯化镁、PCEG8000、T5核酸外切酶和Tris-HCl按需要配置成2×、3×、4×等不同母液。

在一种实施方式中，将构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌中，即得到含有重组质粒的重组大肠杆菌。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括但不局限于JM109、JM110、MG1655、Top10、BL21、BL21和 DH5α。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有PEG8000、氯化镁、T5核酸外切酶和Tris-HCl。

在一种实施方式中，所述PEG8000的工作浓度为0～80g/L，所述氯化镁的工作浓度为0.2～4.0g/L，所述T5核酸外切酶的工作浓度为0.01～0.5μL/mL，所述Tris-HCl的工作浓度为40～140mL/L。

在一种实施方式中，所述PEG8000的工作浓度优选为40g/L，所述氯化镁的工作浓度优选为4.0g/L，所述T5核酸外切酶的工作浓度优选为0.15μL/L，所述Tris-HCl的工作浓度优选为80mL/L。

在一种实施方式中，所述Tris-HCl的pH为7.0、7.5或8.0。

本发明提供了所述方法在高通量筛选中的应用。

本发明提供了所述试剂盒在高通量筛选中的应用。

本发明的有益效果：

1、太极组装反应溶液不需要添加具有刺激性气味的有毒物质DTT，避免了安全隐患；

2、太极组装不需要DNA片段纯化，简化了操作过程和降低了成本，是目前最简便、成本最低的质粒构建方法；

3、太极组装的阳性率与目前所报道的方法一致，但组装效率略高于吉布森组装，远高于其他吉布森简化的方法；

4、太极组装可以实现一次性组装12个片段；

5、太极组装可实现基于96孔PCR板和96浅孔板的高通量构建质粒；

6、太极组装不需要调节各片段的添加比例即可获得高组装效率，省去了DNA浓度测定和摩尔浓度计算等繁琐过程。

附图说明

图1为太极组装示意图。

图2为太极组装和目前类似方法的效率对比图。

图3为不同组分对4个片段组装效率的影响图。

图4为太极组装反应条件优化图。

图5为不同PCR酶扩增的产物对组装效率的影响图；(A)中的PCR酶是ApexHF HSDNA Polymerase FS Master Mix，(B)中的PCR酶是2×Super Pfx MasterMix。

图6为95个不同太极组装配方的优化对组装效率的影响。

图7为不同宿主、不同片段数量、不同重叠序列对太极组装效率的影响图；。

图8为适合高通量平台的太极组装操作流程图。

具体实施方式

本发明使用的菌株E.coli JM109、E.coli JM110、E.coli MG1655、E.coli Top10、E.coli BL21、E.coli DH5α均为商业化菌株。

1M Tris-HCl(pH7.5)、MgCl₂·6H₂O、100mM dNTP、PEG8000、DTT、100mM NAD均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

Taq DNA ligase(40U/μL)、T5 exonuclease(10U/μL)、Phusion polymerase(2U/μL)均购自NEB(北京)有限公司。

PCR酶ApexHF HS DNA Polymerase FS Master Mix(艾科瑞，AG12202，中国)；PCR酶2×Super Pfx MasterMix(康为，CW2965，中国)。PCR酶PrimeSTAR Max DNAPolymerase(Takara，R045B，日本)，实施例中除特殊说明外，所有PCR片段均使用PrimeSTAR Max DNAPolymerase扩增获得。

表1本发明中的质粒

表2不同GC含量和长度验证试验所用同源重叠序列

表3 2～12个片段验证试验所用重叠序列

表4太极组装95个不同配方配置明细

实施例1优化太极组装溶液成分浓度

1、本实施例中初始的太极组装反应溶液配制：

①在15mL试管中，加入1.0g MgCl₂·6H₂O，稀释至10mL，得到MgCl₂·6H₂O溶液；在15mL管中加入1.0g DTT，稀释至10mL，得到DTT溶液；

②在50mL管中加入1.5g PEG8000、0.5mL MgCl₂·6H₂O溶液和2.5mL Tris-HCl(1M，pH7.5)，加水补足至12.5mL，60℃溶解，冰浴冷却后加入0.5mL DTT溶液。摇匀后，分装到4.0mL/5.0mL EP管中，获得组装缓冲液，-20℃保存；

③在4.0mL组装缓冲液中，加入1.6μL T5，摇匀后，分装到10μL/PCR管中，-20℃保存(2×Tai Chi Mix)。

2、太极组装无缝克隆过程：

①以序列1～4(核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～4所示，各个接头处的重叠序列见表3)，4个DNA 片段组装成一个质粒的为研究对象，在Tai Chi Mix(10μL/PCR管)中，加入总共4μL的未纯化的DNA 混合片段和6μL水(核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示，4个片段的体积比例为1：1：1：1)，摇匀；

②PCR仪中，在40℃下反应60分钟；

③冰浴5分钟后，转化大肠杆菌DH5α，将转化液涂布于LB培养基，培养12～14h。

3、阳性率的检测：

通过设计特异性引物进行菌落PCR，计算阳性率。

4、不同反应条件对太极组装效率的影响

(1)按照上述方式，在其余成分不变的条件下，将2×Tai Chi Mix中氯化镁的浓度调节为0～12.0g/L，验证Mg²⁺对太极组装效率的影响。

结果如图3A所示，结果表明Mg²⁺对组装效率影响显著，最佳浓度为8.0g/L。

(2)按照上述方式，在其余成分不变的条件下，将2×Tai Chi Mix中PEG8000的浓度分别设置为0～200 g/L，验证PEG8000浓度对太极组装效率的影响。

结果如图3B所示，结果表明PEG8000对组装效率影响显著，最佳浓度为20g/L。

(3)按照上述方式，在其余成分不变的条件下，将2×Tai Chi Mix中DTT的浓度调节为0～16.0g/L，验证有毒试剂DTT对太极组装效率的影响。

结果如图3C所示，表明DTT不利于太极组装，不添加DTT时，单克隆菌落数为3404个，而添加了DTT 之后，在浓度为16.0g/L时单克隆菌落数最多，仅为2100。由此可见，不添加时效率显著高于添加任意浓度 50％以上。

(4)按照上述方式，在其余成分不变的条件下，将2×Tai Chi Mix中T5核酸外切酶的浓度替换为0～2.0 μL/mL验证T5核酸外切酶对太极组装效率的影响。

结果如图3D所示，浓度在0.05μL～1.0μL范围内均有较高效率，最佳浓度为0.3μL/L。

(5)按照上述方式，在其余成分不变的条件下，将Tris-HCl 7.5替换为Tris-HCl7.0，并且将2×Tai Chi Mix中Tris-HCl 7.0的浓度分别设置为0～500mL/L，验证Tris-HCl7.0对太极组装效率的影响。

结果如图3F所示，结果表明最佳浓度为160mL/L(图3F)。

(6)按照上述方式，在其余成分不变的条件下，将Tris-HCl 7.5浓度分别设置为0～500mL/L，验证Tris- HCl 7.5对太极组装效率的影响。

结果如图3G所示，最佳浓度为200mL/L。

(7)按照上述方式，在其余成分不变的条件下，将将Tris-HCl 7.5替换为Tris-HCl8.0，并且将Tris-HCl 8.0的浓度分别设置为0～500mL/L，验证Tris-HCl 8.0对太极组装效率的影响，

结果如图3H所示，最佳浓度为160mL/L。

实施例2不同反应温度、反应时间和DNA片段添加量对太极组装效率的影响

1、本实施例中初始的太极组装反应溶液配制：

①在15mL试管中，加入1.0g MgCl₂·6H₂O，稀释至10mL，得到MgCl₂·6H₂O溶液；在15mL管中加入1.0g DTT，稀释至10mL，得到DTT溶液；

②在50mL管中加入1.5g PEG8000、0.5mL MgCl₂·6H₂O溶液和2.5mL Tris-HCl(1M，pH7.5)，加水补足至12.5mL，60℃溶解，冰浴冷却后加入0.5mL DTT溶液。摇匀后，分装到4.0mL/5.0mL EP管中，获得组装缓冲液，-20℃保存；

③在4.0mL组装缓冲液中，加入1.6μL T5，摇匀后，分装到10μL/PCR管中，-20℃保存(2×Tai Chi Mix)。

2、太极组装无缝克隆过程：

①以4个片段组装为例(核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～4所示，各个接头处的重叠序列见表3)， 4个DNA片段组装成一个质粒的为研究对象，在Tai Chi Mix(10μL/PCR管)中，加入总共4μL的未纯化的DNA混合片段和6μL水(4个片段的体积比例为1:1:1:1)，摇匀；

②PCR仪中，在40℃下反应60分钟；

③冰浴5分钟后，转化大肠杆菌DH5α，将转化液涂布于LB培养基，培养12～14h。

3、阳性率的检测：

通过设计特异性引物进行菌落PCR，计算阳性率。

4、不同反应条件对太极组装效率的影响

(1)按照上述的方式，将反应温度设置为30～50℃，2℃为一个梯度，验证反应温度对太极组装效率的影响。

结果如图4A所示，结果表明在30～48℃时，均有较高的组装效率，最佳温度为40℃。

(2)按照上述的方式，将反应时间设置为10～60min，验证反应时间对太极组装效率的影响。

结果如图4B所示，表明在10～60分钟时，均有较高的组装效率，最佳反应时间为60分钟。

(3)按照上述的方式，将PCR产物的添加比例(体积比)设置为5％～50％(PCR产物比均按1:1:1:1来算)，验证总DNA片段添加量(v/v)对太极组装效率的影响。其中PCR程序为：98℃预变性3分钟，98℃变性10秒，55℃退火15秒，72℃延伸1分钟，72℃后延伸5分钟，16℃降温10分钟。

结果如图4C所示，结果表明在添加量为5％～50％时，均有较高的组装效率，最佳添加量为20％。

(4)按照上述的方式，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示的4个片段按照不同的体积比添加，验证不同片段浓度对太极组装效率的影响，结果表明在片段比例在1～10倍之间时，均有较高的组装效率(图4D、 4E和4F)。

实施例3不同商业化PCR预混酶对太极组装效率的影响

1、本实施例中初始的太极组装反应溶液配制：

①在15mL试管中，加入1.0g MgCl₂·6H₂O，稀释至10mL，得到MgCl₂·6H₂O溶液。在15mL管中加入1.0g DTT，稀释至10mL，得到DTT溶液；

②在50mL管中加入1.5g PEG8000、0.5mL MgCl₂·6H₂O溶液和2.5mL Tris-HCl(1M，pH7.5)，加水补足至12.5mL，60℃溶解，冰浴冷却后加入0.5mL DTT溶液。摇匀后，分装到4.0mL/5.0mL EP管中，获得组装缓冲液，-20℃保存；

③在4.0mL组装缓冲液中，加入1.6μL T5，摇匀后，分装到10μL/PCR管中，-20℃保存(2×Tai Chi Mix)。

2、太极组装无缝克隆过程：

①以序列1～序列4(各个接头处的重叠序列见附表3)，4个DNA片段组装成一个质粒的为研究对象，在Tai Chi Mix(10μL/PCR管)中，加入总共4μL的未纯化的DNA混合片段和6μL水(核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示，4个片段的体积比例为1：1：1：1)，摇匀；

②PCR仪中，在40℃下反应60分钟；

③冰浴5分钟后，转化大肠杆菌DH5α，将转化液涂布于LB培养基，培养12～14h。

3、阳性率的检测：

通过设计特异性引物进行菌落PCR，计算阳性率。

4、利用不同PCR预混酶扩增片段并用于太极组装中

(1)按照上述方式，以4个片段组装为试验对对象(4个片段采用SEQ ID NO.1～4，重叠序列见表3)，验证使用PCR酶ApexHF HS DNA Polymerase FS Master Mix(艾科瑞，AG12202，中国)获得的PCR产物对太极组装效率的影响，其中PCR程序为：94℃预变性1分钟，98℃变性10秒，55℃退火15秒，72℃延伸1分钟，72℃后延伸5分钟，16℃降温10分钟。

结果表明PCR产物在组装反应液中添加量为5％～50％时，均有较高的组装效率，最佳添加量为20％(图 5A)。

(2)以4个片段组装为试验对对象(序列详细信息见SEQ ID NO.1～4)，验证使用2×Super Pfx MasterMix (康为，CW2965，中国)获得的PCR产物对太极组装效率的影响，其中PCR程序为：98℃预变性3分钟， 98℃变性10秒，55℃退火15秒，72℃延伸1分钟，72℃后延伸5分钟，16℃降温10分钟。

结果表明PCR产物在组装反应液中添加量为5％～50％时，均有较高的组装效率，最佳添加量为15％(图 5B)。

实施例4太极组装反应液不同试剂复合优化对组装效率的影响

以4个片段组装为试验对对象(4个片段采用SEQ ID NO.1～4，重叠序列见表3)，验证太极反应液中氯化镁、PEG8000、Tris-HCl和核酸外切酶等试剂不同浓度复配，共95个配方对太极组装效率的影响(太极组装不同配方和组装过程见表5)，结果表明当组装4个片段时，100号、93号、92号、12号、95号和85号配方，均可以获得约3000个以上的阳性克隆菌落，实现高效组装效率(图6)。

6个片段组装为试验对对象(序列详细信息见附录序列1～6，重叠序列见表3的A1、A2、A5、A7、A8)，进一步选取不同太极组装配方中效率较高的，12、36、50、60、87、85、86、92、93、95、100号配方，验证对多片段组装效率的影响，结果表明，组装6个片段时，12号、85号拥有高于20％的阳性率，可实现有效组装(图4H)。

7个片段组装为试验对对象(序列详细信息见附录序列1～7，重叠序列见表3的A1、A2、A5、A7、A9、 A10)，进一步选取不同太极组装配方中效率较高的，12、36、50、60、87、85、86、92、93、95、100号配方，验证对多片段组装效率的影响，结果表明，组装7个片段时，36号、85号和12号拥有高于20％的阳性率，可实现有效组装(图4I)。因此，当组装多个片段时，不含有毒试剂DTT的85号配方是最优太极组装配方。

实施例5同源重叠序列长度和GC含量对太极组装效率的影响

1、本实施例中初始的太极组装反应溶液配制：

①在15mL试管中，加入1.0g MgCl₂·6H₂O，稀释至10mL，得到MgCl₂·6H₂O溶液。

②在50mL管中加入0.5g PEG8000、1.0mL MgCl₂·6H₂O溶液和2.5mL Tris-HCl(1M，pH7.5)，加水补足至12.5mL，60℃溶解。摇匀后，分装到4.0mL/5.0mL EP管中，获得组装缓冲液，-20℃保存；

③在4.0mL组装缓冲液中，加入1.2μL T5，摇匀后，分装到10μL/PCR管中，-20℃保存。

2、太极组装无缝克隆过程：

①在Tai Chi Mix(10μL/PCR管)中，加入总共4μL的未纯化的DNA混合片段和6μL水，摇匀；

②PCR仪中，在40℃下反应60分钟；

③冰浴5分钟后，转化大肠杆菌DH5α，将转化液涂布于LB培养基，培养12～14h。

3、阳性率的检测：

通过设计特异性引物进行菌落PCR，计算阳性率。

以2个片段组装为试验对对象(核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示，在SEQ IDNO.1两端分别添加相同碱基数的重叠序列1和重叠序列2，如添加L6的重叠序列1和重叠序列2，相应的，SEQ ID NO.2两端分别添加L6的重叠序列1和重叠序列2，一共设计L8、L10、L12、L14、L16、L18、L20、L22、L24、L26、L32 共11个低GC含量(10％)的同源重叠序列实验组，M8、M10、M12、M14、M16、M18、M20、M22、M24、 M26、M38共11个中等GC含量(50％)的同源重叠序列实验组，和H8、H10、H12、H14、H16、H18、H20、 H22、H24共9个高GC含量(80％)的同源重叠序列实验组，重叠序列详细信息见表2)，按照上述方法进行操作，验证同源重叠序列不同长度和GC含量对太极组装效率的影响。

结果表明6bp以上的同源重叠序列即可实现片段组装，高GC含量(80％)不利于太极组装效率，在低 GC含量(10％)和中等GC含量(50％)的条件下，12bp以上的同源序列可实现高效率的组装(图7A和7B)。

实施例6测试不同宿主对太极组装效率的影响

按照实施例4的方法进行操作，以4个片段组装为试验对对象(4个片段采用SEQ IDNO.1～4，重叠序列见表3的A1、A2、A3和A4)，验证不同大肠杆菌宿主JM109、JM110、MG1655、Top10、BL21和DH5α对太极组装效率的影响，结果表明大肠杆菌Top10拥有最高的组装效率(图7C)。

实施例7测试太极组装对于多片段组装能力

以4～12个片段组装为试验对对象，序列分别如SEQ ID NO.1～12所示，验证太极组装对于多片段的组装能力。

(1)本实施例中太极组装反应溶液配制：

①在15mL试管中，加入1.0g MgCl₂·6H₂O，稀释至10mL，得到MgCl₂·6H₂O溶液。

②在50mL管中加入0.5g PEG8000、1.0mL MgCl₂·6H₂O溶液和2.5mL Tris-HCl(1M，pH7.5)，加水补足至12.5mL，60℃溶解。摇匀后，分装到4.0mL/5.0mL EP管中，获得组装缓冲液，-20℃保存；

③在4.0mL组装缓冲液中，加入1.2μL T5，摇匀后，分装到10μL/PCR管中，-20℃保存。

(2)太极组装无缝克隆过程：

1.在10μL反应液中加入总共4μL的片段和6μL的水，混匀。

2.PCR仪中，40℃，60分钟。

3.冰浴5分钟后，转化大肠杆菌DH5α。

4个片段组装时采用SEQ ID NO.1～4(重叠序列见表3，SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2片段通过非特异性引物添加额外序列的方式在接头处均添加用于太极组装的重叠序列A1，同理，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3 的重叠序列为A2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的重叠序列为A3，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.1的重叠序列为A4)；

5个片段组装时采用SEQ ID NO.1～5、6个片段组装时采用SEQ ID NO.1～6、7个片段组装时采用SEQ ID NO.1～7、8个片段组装时采用SEQ ID NO.1～8、9个片段组装时采用SEQ ID NO.1～9、10个片段组装时采用 SEQ ID NO.1～10、11个片段组装时采用SEQ IDNO.1～11、12个片段组装时采用SEQ ID NO.1～12(所用重叠序列见表3，与4个片段组装所使用的重叠序列同理，片段之间选择对应的重叠序列)。

结果表明，太极组装可实现4～7个片段的高效率组装，并且最多可以实现12个片段的有效组装(图7D)。

实施例8测试太极组装用于高通量构建质粒

(1)本实施例中太极组装反应溶液配制：

①在15mL试管中，加入1.0g MgCl₂·6H₂O，稀释至10mL，得到MgCl₂·6H₂O溶液。

②在50mL管中加入0.5g PEG8000、1.0mL MgCl₂·6H₂O溶液和2.5mL Tris-HCl(1M，pH7.5)，加水补足至12.5mL，60℃溶解。摇匀后，分装到4.0mL/5.0mL EP管中，获得组装缓冲液，-20℃保存；

③在4.0mL组装缓冲液中，加入1.2μL T5，摇匀后，分装到10μL/PCR管中，-20℃保存。

(2)太极组装无缝克隆过程：

1.在10μL反应液中加入总共4μL的片段和6μL的水，混匀。

2.PCR仪中，40℃，60分钟。

3.冰浴5分钟后，转化大肠杆菌DH5α。

96孔PCR板转化流程：

(1)加入8μL的太极反应液，加入2μL的DNA片段，40℃，保温60分钟，随后冰浴5分钟；

(2)加入50μL的大肠杆菌感受态细胞，冰浴30分钟；

(3)热击90秒，冰浴5分钟后；

(4)加入140μL的LB，37℃培养1小时，涂布抗性平板。

96孔酶标板转化流程：

(1)加入32μL的太极反应液，加入8μL的DNA片段，40℃，保温60分钟，随后冰浴5分钟；

(2)加入60μL的大肠杆菌感受态细胞，冰浴30分钟；

(3)热击90秒，冰浴5分钟后；

(4)加入100μL的LB，37℃培养1小时，涂布抗性平板。

结果表明，96孔PCR板或96孔酶标板高通量转化流程，用于4个片段组装时可获得约100个以上的阳性克隆菌落，当组装5个片段时可获得约50个以上的阳性克隆菌落，从而实现高通量的高效率构建质粒(图 8A、8B、8C和8D)。

对比例1：吉布森组装、Hot Fusion、TEDA和太极组装成本对比

基于T5核酸外切酶的质粒构建方法，其主要成本是T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶，其次是DNA片段的纯化过程和反应液中的NAD、dNTP和DTT成本。在不考虑引物合成和PCR酶这两个不可避免的成本的情况下，以5个片段组装为例：

吉布森组装由T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶，以及Tris-HCl、镁离子、PEG8000和DTT 组成，试剂最多导致最高的制备成本，实验室自购试剂配置成本约50元/个反应(其中5个片段DNA纯化成本为10元，使用赛默飞DNA纯化试剂盒)。Hot Fusion由于去除了吉布森反应中最昂贵的成分DNA 连接酶，使得在不降低组装效率的情况下将成本降至约15元/反应(其中5个片段DNA纯化成本为10元)。 TEDA组装进一步在Hot Fusion的基础上，去除了较高成本的DNA聚合酶，以及去除了反应液中的NAD、 dNTP成分，使得成本降低至约10.06元/反应(其中5个片段DNA纯化成本为10元)。以上三种方法均需要纯化DNA片段，导致较高的构建成本，而太极组装由于需要PCR反应体系中的DNA聚合酶，因此去除了DNA片段的纯化过程，使得成本降低至0.06元/反应。

对比例2：吉布森组装、Hot Fusion、TEDA和太极组装效率对比

所用4种组装方法反应液和组装步骤见表5。以4个片段组装为例，吉布森组装(T5+Phusion+Taq) 和Hot Fusion(T5+Phusion)的组装方法，由于体系中含有DNA聚合酶，因此组装效率较高，均可以获得约3000个以上的克隆菌落。为了鉴定DNA聚合酶对组装效率的影响，将Hot Fusion中的DNA聚合酶的添加量降低至三分之一，以及不添加。结果表明，当DNA聚合酶降低至三分之一时，组装效率显著降低约90％，当不添加DNA聚合酶时，导致组装效率降低约95％，因此表明吉布森组装中DNA聚合酶是组装效率的关键(图2)。TEDA组装由于不含有DNA聚合酶，相比于吉布森组装，效率降低约99％。太极组装通过使用不纯化的DNA片段，以借用PCR体系中的DNA聚合酶，使得组装效率不会因缺失DNA聚合酶而降低，反而使得组装效率是吉布森的约1.5倍(图2)。

表5不同组装方法溶液配制及步骤

对比例3：构建多个质粒时不同组装方法操作流程对比

随着分子生物学的不断发展，同时构建多个质粒成为日益增多的需求。以同时构建10个分别由5个片段组成的质粒为例，吉布森组装、Hot Fusion和TEDA组装方法所需基本操作流程为：DNA片段纯化 (1小时)、DNA片段浓度测定和摩尔量计算(0.5小时)、多片段组装构建(1.5小时，包括加样0.5小时和保温反应1小时)、转化大肠杆菌(2小时)，共计约5小时。太极组装所需基本流程为：多片段组装(1.25 小时，包括加样0.25小时和保温反应1小时)、转化大肠杆菌(2小时)，共计3.25小时，可节约35％的时间。特别的，纯化片段、测定浓度、计算摩尔量和调整添加片段体积等过程，操作繁琐，约占整个构建质粒工作量的50％以上。若应用于高通量的自动化操作平台构建质粒，多余的操作过程会大幅提高设计难度和构建成本。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种安全无毒的高通量无缝构建质粒的方法

<130> BAA210931A

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4221

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgtacctcag aacgtaagag tgaccatggt gactaagtgt ctattgcaga ataacttgtc 60

agactgccgg gaaatcccgg cagtcttttt tccattttca cgtcacgcgt ccatggagat 120

ctttgtctgc aactgaaaag tttatacctt acctggaaca aatggttgaa acatacgagg 180

ctaatatcgg cttattagga atagtccctg tactaataaa atcaggtgga tcagttgatc 240

agtatatttt ggacgaagct cggaaagaat ttggagatga cttgcttaat tccacaatta 300

aattaaggga aagaataaag cgatttgatg ttcaaggaat cacggaagaa gatactcatg 360

ataaagaagc tctaaaacta ttcaataacc ttacaatgga attgatcgaa agggtggaag 420

gttaatggta cgaaaattag gggatctacc tagaaagcca caaggcgata ggtcaagctt 480

aaagaaccct tacatggatc ttacagattc tgaaagtaaa gaaacaacag aggttaaaca 540

aacagaacca aaaagaaaaa aagcattgtt gaaaacaatg aaagttgatg tttcaatcca 600

taataagatt aaatcgctgc acgaaattct ggcagcatcc gaagggaatt catattactt 660

agaggatact attgagagag ctattgataa gatggttgag acattacctg agagccaaaa 720

aactttttat gaatatgaat taaaaaaaag aaccaacaaa ggctgagaca gactccaaac 780

gagtctgttt ttttaaaaaa aatattagga gcattgaata tatattagag aattaagaaa 840

gacatgggaa taaaaatatt ttaaatccag taaaaatatg ataagattat ttcagaatat 900

gaagaactct gtttgttttt gatgaaaaaa caaacaaaaa aaatccacct aacggaatct 960

caatttaact aacagcggcc aaactgagaa gttaaatttg agaaggggaa aaggcggatt 1020

tatacttgta tttaactatc tccattttaa cattttatta aaccccatac aagtgaaaat 1080

cctcttttac actgttcctt taggtgatcg cggagggaca ttatgagtga agtaaaccta 1140

aaaggaaata cagatgaatt agtgtattat cgacagcaaa ccactggaaa taaaatcgcc 1200

aggaagagaa tcaaaaaagg gaaagaagaa gtttattatg ttgctgaaac ggaagagaag 1260

atatggacag aagagcaaat aaaaaacttt tctttagaca aatttggtac gcatatacct 1320

tacatagaag gtcattatac aatcttaaat aattacttct ttgatttttg gggctatttt 1380

ttaggtgctg aaggaattgc gctctatgct cacctaactc gttatgcata cggcagcaaa 1440

gacttttgct ttcctagtct acaaacaatc gctaaaaaaa tggacaagac tcctgttaca 1500

gttagaggct acttgaaact gcttgaaagg tacggtttta tttggaaggt aaacgtccgt 1560

aataaaacca aggataacac agaggaatcc ccgattttta agattagacg taaggttcct 1620

ttgctttcag aagaactttt aaatggaaac cctaatattg aaattccaga tgacgaggaa 1680

gcacatgtaa agaaggcttt aaaaaaggaa aaagagggtc ttccaaaggt tttgaaaaaa 1740

gagcacgatg aatttgttaa aaaaatgatg gatgagtcag aaacaattaa tattccagag 1800

gccttacaat atgacacaat gtatgaagat atactcagta aaggagaaat tcgaaaagaa 1860

atcaaaaaac aaatacctaa tcctacaaca tcttttgaga gtatatcaat gacaactgaa 1920

gaggaaaaag tcgacagtac tttaaaaagc gaaatgcaaa atcgtgtctc taagccttct 1980

tttgatacct ggtttaaaaa cactaagatc aaaattgaaa ataaaaattg tttattactt 2040

gtaccgagtg aatttgcatt tgaatggatt aagaaaagat atttagaaac aattaaaaca 2100

gtccttgaag aagctggata tgttttcgaa aaaatcgaac taagaaaagt gcaataaact 2160

gctgaagtat ttcagcagtt ttttttattt agaaatagtg aaaaaaatat aatcagggag 2220

gtatcaatat ttaatgagta ctgatttaaa tttatttaga ctggaattaa taattaacac 2280

gtagactaat taaaatttaa tgagggataa agaggataca aaaatattaa tttcaatccc 2340

tattaaattt taacaagggg gggattaaaa tttaattaga ggtttatcca caagaaaaga 2400

ccctaataaa atttttacta gggttataac actgattaat ttcttaatgg gggagggatt 2460

aaaatttaat gacaaagaaa acaatctttt aagaaaagct tttaaaagat aataataaaa 2520

agagctttgc gattaagcaa aactctttac tttttcattg acattatcaa attcatcgat 2580

ttcaaattgt tgttgtatca taaagttaat tctgttttgc acaacctttt caggaatata 2640

aaacacatct gaggcttgtt ttataaactc agggtcgcta aagtcaatgt aacgtagcat 2700

atgatatggt atagcttcca cccaagttag cctttctgct tcttctgaat gtttttcata 2760

tacttccatg ggtatctcta aatgattttc ctcatgtagc aaggtatgag caaaaagttt 2820

atggaattga tagttcctct ctttttcttc aactttttta tctaaaacaa acactttaac 2880

atctgagtca atgtaagcat aagatgtttt tccagtcata atttcaatcc caaatctttt 2940

agacagaaat tctggacgta aatcttttgg tgaaagaatt tttttatgta gcaatatatc 3000

cgatacagca ccttctaaaa gcgttggtga atagggcatt ttacctatct cctctcattt 3060

tgtggaataa aaatagtcat attcgtccat ctacctatcc tattatcgaa cagttgaact 3120

ttttaatcaa ggatcagtcc tttttttcat tattcttaaa ctgtgctctt aactttaaca 3180

actcgatttg tttttccaga tctcgagggt aactagcctc gccgatcccg caagaggccc 3240

ggcagtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 3300

aaatacagag cgcctccttg acactgaatt tagcatgtga tataattaac ttacccaatt 3360

aaaggaggaa ggatccaatg agccatattc aacgggaaac gtcttgctct aggccgcgat 3420

taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtataaatg ggctcgcgat aatgtcgggc 3480

aatcaggtgc gacaatctat cgattgtatg ggaagcccga tgcgccagag ttgtttctga 3540

aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga gatggtcaga ctaaactggc 3600

tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca agcattttat ccgtactcct gatgatgcat 3660

ggttactcac cactgcgatc cctgggaaaa cagcattcca ggtattagaa gaatatcctg 3720

attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct gcgccggttg cattcgattc 3780

ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg tctcgctcag gcgcaatcac 3840

gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga cgagcgtaat ggctggcctg 3900

ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataaac ttttgccatt ctcaccggat tcagtcgtca 3960

ctcatggtga tttctcactt gataacctta tttttgacga ggggaaatta ataggttgta 4020

ttgatgttgg acgagtcgga atcgcagacc gataccagga tcttgccatc ctatggaact 4080

gcctcggtga gttttctcct tcattacaga aacggctttt tcaaaaatat ggtattgata 4140

atcctgatat gaataaattg cagtttcatt tgatgctcga tgagtttttc taactgtcag 4200

accaagttta ctcatatata c 4221

<210> 2

<211> 860

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcaacgcaat taatgtaagt tagctcactc attaggcacc gggatctcga ccgatgccct 60

tgagagcctt caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact aacatgagaa 120

ttacaactta tatcgtatgg ggctgacttc aggtgctaca tttgaagaga taaattgcac 180

tgaaatctag aaatatttta tctgattaat aagatgatct tcttgagatc gttttggtct 240

gcgcgtaatc tcttgctctg aaaacgaaaa aaccgccttg cagggcggtt tttcgaaggt 300

tctctgagct accaactctt tgaaccgagg taactggctt ggaggagcgc agtcaccaaa 360

acttgtcctt tcagtttagc cttaaccggc gcatgacttc aagactaact cctctaaatc 420

aattaccagt ggctgctgcc agtggtgctt ttgcatgtct ttccgggttg gactcaagac 480

gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg actgaacggg gggttcgtgc atacagtcca 540

gcttggagcg aactgcctac ccggaactga gtgtcaggcg tggaatgaga caaacgcggc 600

cataacagcg gaatgacacc ggtaaaccga aaggcaggaa caggagagcg cacgagggag 660

ccgccagggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac cactgatttg 720

agcgtcagat ttcgtgatgc ttgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac ggctttgccg 780

cggccctctc acttccctgt taagtatctt cctggcatct tccaggaaat ctccgccccg 840

ttcgtaagcc atttccgctc 860

<210> 3

<211> 956

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaaaaccgac tgtaaaaagt acagtcggca ttatctcata tttattacaa aacgcctgcg 60

caataacgca ggcgttctgt gacattaact tatttcttag tcatgactag actagatcgt 120

gtctcgacag gtcttgagga atcatagaat ttttaattta aattttattt gacaaaaatg 180

ggctcgtgtt gtataatcta agctagtgta tttaaaggag gtgataaaaa tggtttctga 240

actgatcaaa gaaaacatgc acatgaaact gtacatggaa ggtaccgtta acaaccacca 300

cttcaaatgc acctctgaag gtgaaggtaa accgtacgaa ggtacccaga ccatgcgtat 360

caaagctgtt gaaggtggtc cgctgccgtt cgcttttgac atcctggcta cctctttcat 420

gtacggttct aaaaccttca tcaaccacac ccagggtatc ccggactttt tcaaacagtc 480

tttcccggaa ggtttcacct gggaacgtgt taccacctac gaagacggtg gtgttctgac 540

cgctacccag gacacctctc tgcaagacgg ttgcctgatc tacaacgtta aaatccgtgg 600

tgttaacttc ccgtctaacg gtccggttat gcagaaaaaa accctgggtt gggaagcttc 660

taccgaaacc ctgtacccgg ctgacggtgg tctggaaggt cgtgctgaca tggctctgaa 720

actggttggt ggtggtcacc tgatctgcaa cctgaaaacc acctaccgtt ctaaaaaacc 780

ggctaaaaac ctgaaaatgc cgggtgttta ctacgttgac cgtcgtctgg aacgtatcaa 840

agaagctgac aaagaaacct acgttgaaca gcacgaagtt gctgttgctc gttactgcga 900

cctgccgtct aaactgggtc accgttaaga ctgagtcatg ctcagagtga cgtgct 956

<210> 4

<211> 743

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaaggaggtg aaatgtacac atgggccgta aaggtgaaga actgttcacc ggcgttgttc 60

cgatcctgat cgaactggat ggtgatgtta acggtcataa attcttcgtt cgtggtgaag 120

gcgaaggtga tgcgaccatc ggtaaactga gcctgaaatt catctgcacc accggcaaac 180

tgccggttcc gtggccgacc ctggttacca ccctgaccta cggcgttcag tgcttctctc 240

gttacccgga tcacatgaaa cgtcacgatt tcttcaaaag cgcgatgccg gaaggttatg 300

ttcaggaacg taccatctac ttcaaagatg atggcaccta caaaacccgt gcggaagtta 360

aattcgaagg tgataccctg gttaaccgta tcgaactgaa aggcatcgat ttcaaagaag 420

atggtaacat cctgggccac aaactggaat acaacttcaa ctcgcacaag gtttacatca 480

ctgcggataa gcagaataac ggtattaaag ccaactttac tattcgtcat aatgttgagg 540

acggtagcgt tcaactggct gaccactacc agcagaacac tcccattggt gacggcccgg 600

tcgatctgcc ggatgatcac tatctgtcta cccagaccat cctgtctaaa gatctgaacg 660

gtaccgatgt tacttctgaa aaacgtgatc acatggttct gctggaatat gttaccgctg 720

cgggtattac cgatgcttct taa 743

<210> 5

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgagccata tcttcgacgc atctgtactg gctccacata ttcctagtaa ccttcctgat 60

aatttcaagg tgagaccact ggcaaaggat gatttttcga agggatatgt cgacctgctg 120

tcacaattga cgtcagttgg aaaccttgac caagaagcat ttgagaaacg atttgaggcg 180

atgagaacaa gcgtaccgaa ttatcacatc gtagtaattg aggattccaa cagccagaaa 240

gtggtggcgt ctgctagttt ggttgttgaa atgaaattca ttcatggggc cggatcaagg 300

ggtcgtgttg aagatgttgt cgtcgataca gaaatgcgcc ggcaaaaatt aggtgccgtg 360

cttttaaaaa ctttggtgtc acttggcaaa tctttaggcg tctacaaaat aagcctcgaa 420

tgcgtcccgg aattactccc gttctattcc caatttggct ttcaggatga ctgtaatttt 480

atgacccagc gcttttaa 498

<210> 6

<211> 547

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgggcaaaa acttacaagc tctggcccag ctttataaaa atgccctgct taacgatgtg 60

cttccgtttt gggaaaatca ttcattagat agcgaaggcg gatattttac atgcctggat 120

agacagggca aagtctacga tacagataaa tttatctggc ttcaaaaccg ccaggtttgg 180

acattttcta tgctttgtaa ccagctggaa aaaagagaaa actggctgaa aatcgctcgc 240

aatggagcca aatttctggc acaacatggc agagatgatg aaggaaactg gtattttgct 300

ttaacacgcg gcggagaacc gctggttcaa ccgtataata tttttagcga ttgctttgca 360

gcgatggcct tttctcagta tgcattagcg tcaggagaag aatgggcaaa agatgttgct 420

atgcaagcct ataataacgt gctgagacgc aaagataacc cgaaaggcaa atacacaaaa 480

acatatccgg gaacaagacc gatgaaagct ttagccgttc cgatgattct ggcgaacctg 540

acacttg 547

<210> 7

<211> 617

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aaatggaatg gttactgccg caagaaacac tggaaaatgt gcttgctgcc acagtccagg 60

aagttatggg cgattttctt gatcaagaac agggattaat gtatgaaaac gtcgctccgg 120

atggctcaca tatcgattgc tttgaaggac gcctgattaa tccgggccat ggaatcgaag 180

cgatgtggtt tattatggat atcgctagac gcaaaaacga tagcaaaaca atcaaccagg 240

cggttgatgt tgtgttaaat atcctgaact ttgcttggga taacgaatac ggcggacttt 300

actactttat ggatgcagcg ggccatccgc cgcaacagct ggaatgggat caaaaacttt 360

ggtgggtgca tcttgaaagc ttagtcgcac tggcgatggg ctatagatta acaggacgcg 420

atgcatgttg ggcgtggtat caaaaaatgc atgattattc ttggcagcat tttgcagatc 480

cggaatatgg cgaatggttt ggatatctta acagacgcgg cgaagtgctt ctgaacctga 540

aaggcggaaa atggaaagga tgctttcatg tcccgagagc catgtatctg tgttggcaac 600

agtttgaagc actttca 617

<210> 8

<211> 541

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgcaaaaca acaacgaatt taaaatcggc aacagatcag tcggatataa tcatgaaccg 60

cttattatct gcgaaattgg catcaaccat gaaggaagct taaaaacagc ctttgaaatg 120

gtcgatgcag cgtataatgc cggagcagaa gttgtgaaac atcaaacaca tatcgttgaa 180

gatgaaatgt ctgatgaagc caaacaggtg atcccgggca acgcagatgt ctcaatctac 240

gaaatcatgg aaagatgtgc gctgaacgaa gaagatgaaa tcaaactgaa agaatacgtt 300

gaaagcaaag gaatgatctt tatctctaca ccgttttcac gcgctgccgc acttagatta 360

cagcgcatgg atattccggc ctataaaatc ggctctggag aatgcaacaa ctacccgctg 420

atcaaactgg tggcaagctt tggcaaaccg atcatcctgt ctacaggaat gaactcaatc 480

gaaagcatca aaaaatcagt tgaaatcatc agagaagcgg gcgtgccgta tgctctgctt 540

c 541

<210> 9

<211> 506

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

attgtacaaa catttatccg acaccgtatg aagatgttcg cctgggcgga atgaatgatc 60

tttcagaagc ctttccggat gcaattatcg gccttagcga tcatacatta gataactatg 120

catgcctggg agcggtggct cttggcggat ctatcctgga aagacatttt acagatagaa 180

tggatcgccc gggcccggat atcgtctgtt caatgaatcc ggatacattt aaagaactga 240

aacaaggagc ccatgcactg aaacttgcga gaggcggcaa gaaagataca attatcgctg 300

gcgaaaaacc gacaaaagat tttgcgtttg ctagcgtcgt tgcggataaa gatattaaga 360

aaggcgaact gctgtctgga gataacctgt gggtcaaaag accgggcaac ggagatttta 420

gcgttaacga atacgaaaca ctttttggca aagtggcggc ttgcaatatc cgcaaaggag 480

ctcagattaa gaaaacagat atcgaa 506

<210> 10

<211> 687

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atgtctctgc ttgcgcaact tgatcagaaa attgcagcga atggcggatt aatcgtttca 60

tgccaaccgg tgccggatag cccgctggat aaaccggaaa ttgtggctgc catggcgctt 120

gcagcggaac aagcaggagc ggtggctatt agaatcgaag gcgtcgctaa cttacaggcg 180

acacgcgctg ttgtgtctgt cccgattatc ggaatcgtta aaagagatct tgaagattca 240

ccggttcgca ttacagccta tatcgaagat gtggatgcct tagcacaagc gggagctgat 300

attatcgcta ttgatggcac agatagaccg cgcccggtcc cggttgaaac attactggcc 360

agaatccatc atcatggact tttagcaatg acagattgct caacaccgga agatggctta 420

gcctgtcaga aactgggcgc agaaattatc ggaacaacac tgagcggcta tacaacaccg 480

gaaacaccgg aagaaccgga tctggcgctt gtcaaaacac tttctgatgc gggatgcaga 540

gttattgctg aaggccgcta taatacaccg gcgcaagctg ccgatgctat gagacatgga 600

gcctgggcag tgacagtcgg cagcgcaatt acacgcttag aacatatctg tcagtggtat 660

aacacagcca tgaagaaagc agttctg 687

<210> 11

<211> 550

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgaaaagaa ttttatgcat cacaggaaca cgcgcagatt ttggcaaact gaaaccgctg 60

cttgcgtata ttgaaaatca tccggatctg gaacttcatt taatcgttac aggaatgcat 120

atgatgaaaa catacggcag aacatacaaa gaagtgacac gcgaaaacta ccaacataca 180

tacctgtttt caaaccaaat tcagggcgaa ccgatgggag cagtgctggg caacacaatc 240

acatttatct ctagactttc agatgaaatc gaaccggata tggtcatgat ccatggagat 300

agacttgaag cattagcggg agcagcggtg ggcgcgttat caagccgcct ggtctgtcat 360

attgaaggcg gagaattaag cggcacagtc gatgattcta ttcgccattc aatcagcaaa 420

cttagccata tccatctggt tgctaacgaa caagccgtta caagacttgt gcagatggga 480

gaaaaacgca aacatatcca tattatcggc tcaccggatt tagatgtgat ggcttcttca 540

acactgccga 550

<210> 12

<211> 581

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gccttgaaga agtcaaagaa tattatggac tgccgtacga aaactacggc atctcaatgt 60

ttcatccggt tacaacagaa gctcatctta tgccgcaata tgctgcccag tattttaaag 120

ccctggaact ttcaggacag aacattatca gcatttatcc gaataacgat acaggcacag 180

aaagcatcct tcaagaactg ctgaaatacc agagcgataa atttatcgct tttccgtcta 240

tcagatttga atattttctg gttcttctga aacatgccaa atttatggtg ggaaatagct 300

ctgctggcat tcgcgaagcc ccgctgtatg gagtcccgag catcgatgtt ggcacaagac 360

aatctaatcg ccatatggga aaatcaatca tccatacaga ttacgaaaca aaaaacattt 420

ttgatgcaat ccaacaggcg tgctctctgg gcaaatttga agcagatgat acatttaacg 480

gcggagatac aagaacatct acagaacgct ttgcagaagt cattaataac ccggaaacat 540

ggaatgtttc agcgcagaaa agatttatcg atttaaacct g 581

Claims (10)

1.一种构建质粒的方法，其特征在于，将DNA片段加入含有镁离子、PEG8000、核酸外切酶和Tris-HCl的反应体系中，反应后即得到重组质粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA片段为利用高保真酶扩增得到，将扩增得到的含有DNA片段的PCR产物以体积比5％～50％的量添加至反应体系中。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应体系中氯化镁浓度为0.2～4.0g/L。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述反应体系中PEG8000的浓度为0～80g/L；所述核酸外切酶包括但不限于T5核酸外切酶，所述T5的浓度为0.01～0.5μL/mL；所述Tris-HCl的pH为7.0～8.0，浓度为40～140mL/L。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在30～48℃下反应10～60min。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述DNA片段的数量不少于2个，任意两个DNA片段的体积比为1:(1～10)。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR产物之间含有重叠序列，每个重叠序列的长度不少于8个碱基，GC含量为10％～80％。

8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有PEG8000、氯化镁、T5核酸外切酶和Tris-HCl。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述PEG8000的工作浓度为0～80g/L，所述氯化镁的工作浓度为0.2～4.0g/L，所述T5核酸外切酶的工作浓度为0.01～0.5μL/mL，所述Tris-HCl的工作浓度为40～140mL/L。

10.权利要求1～7所述方法，或权利要求8或9所述试剂盒在高通量筛选中的应用。

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