CN107893103A - 重组酶聚合酶扩增中重组酶和蛋白浓度比及活性定量法 - Google Patents

Abstract

本发明提供可用于重组酶聚合酶扩增中重组酶和蛋白浓度比及活性定量方法，包括：1)检测UvsX是否有链置换能力；2)计算RPA反应中所需要的UvsX和UvsY基本活性；和3)用RPA做两种酶的比例检测。具有优良的实用价值。本发明操作方便、时间较短、检测结果准确、需要的仪器较为普遍、成本显著降低。

Description

重组酶聚合酶扩增中重组酶和蛋白浓度比及活性定量法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及重组酶及蛋白酶活性检测方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是在生物学中最基本的实验方法，应用于科研、检测、医学实验室等各项领域。常规PCR需要贵重仪器，并且扩增过程对温度要求较高，故现在衍生出恒温核酸扩增技术，大有取代PCR的趋势。而重组酶聚合酶扩增法(RPA)是目前最先进的常温核酸扩增技术，RPA以T4噬菌体DNA复制机理为蓝本，利用重组酶UvsX及其辅助蛋白UvsY，与单链结合蛋白gp32在DNA双链上发生链置换反应，再通过DNA聚合酶进行延伸。因此，在RPA方法中，UvsX及UvsY是十分关键的两个蛋白，其活性的检测对该系统的重要性不言而喻，而这两个蛋白在RPA反应中的比例，直接决定了RPA反应的效率。目前技术中，检测这两个蛋白活性的方法很少，主要通过同位素标记法和薄层色谱法(TLC)进行活性检测。而同位素标记法，过程繁琐，还需要专业仪器辅助，对于实验室条件的要求很高，成本过高，无法做到广泛使用；TLC法对于样品的处理操作繁琐，对实验人员的技术要求较高，对使用范围有很大的局限性。并且目前产品中，没有厂商对于这两种蛋白进行过活性定义，这对需要使用RPA的实验来说，增加了许多不必要的不确定性。

为了解决检测UvsX和UvsY活性过程繁琐、成本过高且难以制定反应比例的问题，本发明者发明了一种检测方法，以达到对实验人员的技术要求不高、过程简单、需要的仪器较为普遍、成本显著降低的目的。

发明内容

本发明提供一种用于重组酶聚合酶扩增中重组酶和蛋白浓度比及活性定量方法，该方法包括以下步骤：

1)检测UvsX是否有链置换能力

将100μg/μl—200μg/μl UvsX加入反应缓冲液中，再加入10—100μg/μl λDNA模板缓冲溶液，混匀，37℃孵育10分钟后进行电泳凝胶成像试验，然后加入1-9mM ATP，继续孵育20分钟后再进行电泳凝胶成像试验；

2)计算RPA反应中所需要的UvsX和UvsY基本活性

a.在两块酶标板上分别以梯度浓度加上100—200μg/μl UvsX和10—100μg/μlUvsY，在各孔中加入0.5μM—100μM底物ATP，常温下反应1h后在酶标仪上读数并绘制酶浓度曲线；

b.从两份酶浓度曲线图得出UvsX和UvsY生成ADP的关系曲线，并得出两者之比；

3)用RPA做两种酶的比例检测，看该比例是否可行。

上述用RPA做两种酶的比例检测中，不同浓度比在RPA反应中使用同一反应时间，检测其在体系中的效率。

首先，本发明根据UvsX的如下作用机理来检测UvsX在RPA中是否有链置换能力。在链置换反应中，UvsX解旋DNA模板，从而结合到单链上，通过促进ATP水解反应，UvsX从单链上脱落，使得单链结合蛋白gp32结合到单链上。利用UvsX能与单链结合的性质，在不加单链接和蛋白的情况下，使用电泳凝胶成像技术观察ATP水解完成后UvsX是否从单链上脱落，从而检测UvsX在RPA反应中是否起到应有作用。

其中，λDNA浓度范围为10—100μg/μl，UvsX浓度范围为100μg/μl—200μg/μl，ATP浓度范围为1-9mM。

然后，对于RPA反应中两种蛋白所需要的基本活性进行计算。

UvsX重组酶可以促进ATP的水解反应，而UvsY在UvsX存在的情况下，可在原基础上更促进ATP的水解，当UvsX到达一定浓度时，开始使ATP水解，导致ADP浓度上升。使用的ADP FI Assay试剂盒检测生成的ADP量，从而得到酶浓度曲线。基于RPA反应组分中的UvsX和UvsY的浓度及UvsX链置换反应的效果，得出RPA反应中所需要的UvsX和UvsY最基本的酶活。

其中，检测ADP时所用的底物ATP浓度范围为0.5μM—100μM，UvsX重组蛋白酶浓度范围为100—200μg/μl，UvsY蛋白酶浓度为10—100μg/μl。

本发明方法中使用的反应缓冲液包含20mM Tris-Ac、100mM KAc、10mM MgAc和1mMDTT。

本发明方法中,λDNA模板缓冲溶液的制备方法为：将浓度100μg/μl的1000bpλDNA加入10μl反应缓冲液，在金属加热器中95℃孵育3分钟后置于冰浴中备用。

本发明方法中，RPA中UvsX的使用浓度在100-200μg/μl，UvsY的使用浓度在10-100μg/μl，选取该区间内的浓度，设置浓度梯度：10μg/μl为一个梯度，使用的ADP FI Assay试剂盒，使用酶标板使UvsX和底物ATP反应水解生成ADP，然后用酶标仪检测ADP的生成量，得到酶浓度曲线。再用UvsX和ATP的混合物作为底物，加入UvsY水解生成ADP，检测其生成量，得到UvsY的酶浓度曲线。记录下酶的使用量，再用RPA进行试验，看目标片段是否扩增，来确定酶活范围及两个酶的最佳比例。

本发明方法中，RPA中的反应体系包括：

上述所述引物A和引物B分别为

序列表中的SEQ ID NO.1(ACTB-f)：

CATGGCTTTATTTGTTTTTTTTGTTTTG

序列表中的SEQ ID NO.2(ACTB-r)：

TATTAAAAAAACAACAATGTGCAATCAAAG。

本发明方法中，UvsX在RPA中的酶活力基本范围：1min内，常温下1μg的UvsX能使ATP水解产生0.03-1.8μM的ADP。

UvsY在RPA中的酶活力基本范围：1min内，常温下1μg的UvsY能使有UvsX存在的ATP水解产生0.03-1.5μM的ADP。

在上述酶活范围内进行的RPA反应效果最佳，UvsX及UvsY比例范围在1:0.1-4:1之间效果最佳。

本发明解决了检测UvsX和UvsY活性过程繁琐、成本过高且难以制定反应比例的问题，达到操作方便、时间较短、检测结果准确、需要的仪器较为普遍、成本显著降低的效果。

附图的简要说明

图1为UvsX结合单链检测凝胶成像图。其中，条带A为未加UvsX的混合物，条带B为加了UvsX的混合物。

图2为UvsX链置换检测凝胶成像图。

图3为UvsX与ATP反应的酶浓度曲线(时间—ADP生成量)。

图4为UvsY与ATP反应的酶浓度曲线(时间—ADP生成量)。

图5为在3:1比例下RPA实验凝胶成像图。

图6为UvsX与ATP反应的酶浓度曲线(时间—ADP生成量)。

图7为UvsY与ATP反应的酶浓度曲线(时间—ADP生成量)。

图8为在4:1比例下RPA实验凝胶成像图。

图9为在10:1比例下RPA实验凝胶成像图。

具体实施方式

下面结合实施例与附图，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明有任何限制。

实施例1：检测UvsX链置换性质

1)使用1000bpλDNA，浓度100μg/μl，取1μl入10μl反应Buffer(20mM Tris-Ac、100mM KAc、10mM MgAc、1mM DTT)，混匀。准备两管混合物。

2)将混合物放入金属加热器，95摄氏度孵育3分钟，立即将混合物转移入冰浴，放置10分钟，再将10μl的100μg/μl的uvsX加入其中一管混合物中，37摄氏度孵育10分钟，随后进行电泳凝胶成像实验(见图1)。条带A为未加UvsX的混合物，条带B为加了UvsX的混合物，条带B明显比条带A粗，表明UvsX已经结合于单链结合。

3)在两管混合物中加入3mM的ATP，常温放置30分钟，再进行电泳凝胶成像试验(见图2)，条带A和B无明显变化，证明UvsX已经脱离单链。

实施例2：UvsX和UvsY酶浓度曲线的绘制

1)使用Bellbrooklabs的ADP检测试剂盒。使用2μl的100μM的ATP，根据试剂盒给出的公式：y＝0.93x+0.7确定加入的荧光缓冲液量为34.9ug/ml，将缓冲液稀释至该浓度备用。

2)将1μl的UvsX(梯度：100、110、120、130、150μg/μl)与2μl ATP缓冲液混合，并加入7μl反应缓冲液，加入酶标板中再与10μl荧光缓冲液混合，常温下反应1h，放入酶标仪读数并绘制酶浓度曲线(图3)。

3)将1μl的UvsX(浓度120μg/μl)与2μl ATP缓冲液混匀，再加入1μl UvsY(梯度：10、20、30、40μg/μl)并加入7μl反应缓冲液，加入酶标板中再与10μl荧光缓冲液混合，常温下反应1h，放入酶标仪读数并绘制酶浓度曲线(图4)。

4)根据两份酶浓度曲线图，得出UvsX和UvsY生成ADP的关系曲线，并得出比例为3:1时ADP生成量最高。

实施例3：UvsX和UvsY酶的比例检测

用RPA作UvsX和UvsY酶的比例检测。使用的反应体系包括：

模板：正常人类基因组DNA，目标片段：内参基因Beta Actin(170bp左右片段)

Beta Actin片段(SEQ ID NO.3)：

CATGGCTTTATTTGTTTTTTTTGTTTTGTTTTGGTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTTGACTCAGGATTTAAAAACTGGAACGGTGAAGGTGACAGCAGTCGGTTGGAGCGAGCATCCCCCAAAGTTCACAATGTGGCCGAGGACTTTGATTGCACATTGTTGTTTTTTTAATA

引物：ACTB-f：CATGGCTTTATTTGTTTTTTTTGTTTT(SEQ ID NO.1)

ACTB-r：TATTAAAAAAACAACAATGTGCAATCAAAG(SEQ ID NO.2)

将反应物混匀，放入金属加热器孵育20分钟，电泳凝胶成像实验观察条带在170bp左右(图5)，证明在测试出两种蛋白的酶活下设置的比例可行。

实施例4：不同梯度UvsX和UvsY酶浓度曲线的绘制

1)使用Bellbrooklabs的ADP检测试剂盒。使用2μl的500μM的ATP，根据试剂盒给出的公式：y＝0.93x+0.7确定加入的荧光缓冲液量为34.9μg/ml，将缓冲液稀释至该浓度备用。

2)将1μl的UvsX(梯度：160、170、180、190、200μg/μl)与2μl ATP缓冲液混合，并加入7μl反应缓冲液，加入酶标板中再与10μl荧光缓冲液混合，常温下反应1h，放入酶标仪读数并绘制酶浓度曲线(图6)。

5)将1μl的UvsX(浓度200μg/μl)与2μl ATP缓冲液混匀，再加入1μl UvsY(梯度：30、40、50、60、70μg/μl)并加入7μl反应缓冲液，加入酶标板中再与10μl荧光缓冲液混合，常温下反应1h，放入酶标仪读数并绘制酶浓度曲线(图7)。

6)根据两份酶浓度曲线图，得出UvsX和UvsY生成ADP的关系曲线，并得出比例为4:1时ADP生成量最高。

实施例5：UvsX和UvsY酶的比例检测

用RPA作UvsX和UvsY酶的比例检测。使用的反应体系包括：

模板：正常人类基因组DNA，目标片段：内参基因Beta Actin(170bp左右片段)

Beta Actin片段(SEQ ID NO.3)：

CATGGCTTTATTTGTTTTTTTTGTTTTGTTTTGGTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTTGACTCAGGATTTAAAAACTGGAACGGTGAAGGTGACAGCAGTCGGTTGGAGCGAGCATCCCCCAAAGTTCACAATGTGGCCGAGGACTTTGATTGCACATTGTTGTTTTTTTAATA

引物：ACTB-f：CATGGCTTTATTTGTTTTTTTTGTTTT(SEQ ID NO.1)

ACTB-r：TATTAAAAAAACAACAATGTGCAATCAAAG(SEQ ID NO.2)

将反应物混匀，放入金属加热器孵育20分钟，电泳凝胶成像实验观察条带在170bp左右(图5)，浓度比为4:1时的条带亮度比3:1是略暗一些，需要更长的扩增时间，但证明了在测试出两种蛋白的酶活下设置的比例可行。

实施例6：不可行浓度的检测

将上述两个实施例中的酶反应浓度曲线综合，测试UvsX和UvsY浓度比为10:1的可行性。

用RPA作UvsX和UvsY酶的比例检测。使用的反应体系包括：

模板：正常人类基因组DNA，目标片段：内参基因Beta Actin(170bp左右片段)

Beta Actin片段(SEQ ID NO.3)：

CATGGCTTTATTTGTTTTTTTTGTTTTGTTTTGGTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTTGACTCAGGATTTAAAAACTGGAACGGTGAAGGTGACAGCAGTCGGTTGGAGCGAGCATCCCCCAAAGTTCACAATGTGGCCGAGGACTTTGATTGCACATTGTTGTTTTTTTAATA

引物：ACTB-f：CATGGCTTTATTTGTTTTTTTTGTTTT(SEQ ID NO.1)

ACTB-r：TATTAAAAAAACAACAATGTGCAATCAAAG(SEQ ID NO.2)

将反应物混匀，放入金属加热器孵育20分钟，电泳凝胶成像实验观察无条带生成(图9)，说明该浓度比不可行。

序列表

<110> 默禾医疗科技（上海）有限公司

<120> 重组酶聚合酶扩增中重组酶和蛋白浓度比及活性定量法

<141> 2017-11-28

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

catggcttta tttgtttttt ttgttttg 28

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tattaaaaaa acaacaatgt gcaatcaaag 30

<210> 3

<211> 171

<212> DNA

<213> β-Actin

<400> 3

catggcttta tttgtttttt ttgttttgtt ttggtttttt tttttttttt ggcttgactc 60

aggatttaaa aactggaacg gtgaaggtga cagcagtcgg ttggagcgag catcccccaa 120

agttcacaat gtggccgagg actttgattg cacattgttg tttttttaat a 171

Claims (8)

1.一种用于重组酶聚合酶扩增中重组酶和蛋白浓度比及活性定量方法，其特征在于包括以下步骤：

1)检测UvsX是否有链置换能力

将100μg/μl—200μg/μl UvsX加入反应缓冲液中，再加入10—100μg/μlλDNA模板缓冲溶液，混匀，37℃孵育10分钟后进行电泳凝胶成像试验，然后加入1-9mM ATP，继续孵育20分钟后再进行电泳凝胶成像试验；

2)计算RPA反应中所需要的UvsX和UvsY基本活性

a.在两块酶标板上分别以梯度浓度加上100—200μg/μl UvsX和10—100μg/μl UvsY，在各孔中加入0.5μM—100μM底物ATP，常温下反应1h后在酶标仪上读数并绘制酶浓度曲线；

b.从两份酶浓度曲线图得出UvsX和UvsY生成ADP的关系曲线，并得出两者之比；

3)用RPA做两种酶的比例检测。

2.如权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述反应缓冲液包含20mM Tris-Ac、100mMKAc、10mM MgAc和1mM DTT。

3.如权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述λDNA模板缓冲溶液的制备方法为：将浓度100μg/μl的1000bpλDNA加入10μl反应缓冲液，在金属加热器中95℃孵育3分钟后置于冰浴中备用。

4.如权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述梯度浓度以1-10μg/μl为一个梯度。

5.如权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述RPA中的反应体系包括：

6.如权利要求5所述的方法，其特征还在于：所述引物A和引物B分别为序列表中SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。

7.如权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述用RPA做两种酶的比例检测在同一反应时间内进行。

8.如权利要求1所述的方法，其特征还在于：用RPA测得UvsX和UvsY比例在1:0.1-4:1之间。