CN102206634A

CN102206634A - Dna分子克隆快速连接载体的构建方法及其涉及的dna分子

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Publication number: CN102206634A
Application number: CN2011100702439A
Authority: CN
Inventors: 李万波
Original assignee: BEIJING KANGLAIXING BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: BEIJING KANGLAIXING BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2011-03-23
Filing date: 2011-03-23
Publication date: 2011-10-05

Abstract

本发明公开了一种DNA分子克隆快速连接载体构建方法及其涉及的DNA分子，该方法包括：人工合成一种可与质粒DNA一起永久扩增的具有发夹结构的DNA分子，该分子还包括DNA切刻内切酶识别序列和痘苗病毒拓扑异构酶Ib的识别序列；将所述DNA分子构建到部分消除了拓扑异构酶Ib以别序列和DNA切刻内切酶识别序列的载体的克隆区；用DNA切刻内切酶和痘苗病毒拓扑异构酶Ib对所得载体DNA分别进行处理后，制备成可快速连接载体。本发明适用于所有克隆载体和表达载体的构建，整个过程操作简单，快速，所制备的载体适合于任意来源的DNA分子的克隆，外源DNA分子可直接插入到载体中，简化了操作步骤，降低了成本，提高了工作效率。

Description

DNA分子克隆快速连接载体的构建方法及其涉及的DNA分子

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别是涉及一种DNA分子克隆快速连接载体的构建方法及其涉及的DNA分子。

背景技术

早期的DNA分子克隆采用化学裂解方法取得DNA分子片段并连接到载体质粒，无特异性。

自从发现了DNA内切酶和发明了多聚酶链反应(PCR)技术，DNA克隆技术得到了革命性发展，大大加快了分子生物学研究的步伐。但是用PGR加内切酶、连接酶的克隆方法存在以下缺点：1)连接酶连接需要的时间长(≥4小时)；2)受载体DNA和外源DNA的限制性内切酶酶切识别序列兼容性限制；3)载体(Vector)和插入片断(Insert)DNA的分别的限制性内切酶酶解、分离、纯化需耗时0.5-2.0天。

Holton，T.A.和Graham，M.W.(1991)和Marchuk，D.等人(1991)发明了“T-Acloning”方法。该方法使载体DNA3’端凸出1个“T”碱基，插入片段DNA3’端凸出1个“A”碱基，形成一对碱基互补的粘性末端，再经T4 DNA连接酶连接完成DNA克隆。此一改进，使得DNA连接效率提高50倍以上。但该方法仍然依靠T4 DNA连接酶，连接时间≥4小时才理想，且＞2kb以上的DNA片段连接效率低。

1991-1994年间，一种不依赖DNA连接酶的重组连接法出现，但该法需要加长的PCR引物合成和其他的酶修饰步骤，未得到广泛应用。

Cheng，C.和Shuman，S.(2000)发展了另一种不依赖DNA连接酶的重组连接法。该方法利用痘苗病毒拓扑异构酶(Vaccinia topoisomerase)Ib的特异性识别位点“CCCTT”，通过切开和再连接的原理将外源DNA插入质粒载体。其基本步骤是：1)HindIII内切酶切开环状质粒，用T4 DNA连接酶连接带有痘苗病毒拓扑异构酶Ib识别位点的双链寡核苷酸接头(Linkers)；2)再用HindIII酶切消除空载体；3)纯化酶切产物；4)与另一适配寡核苷酸单链退火；4)与痘苗病毒拓扑异构酶Ib反应；5)反应产物经电泳纯化，去除切下的寡核苷酸断头和多余的酶；6)定量、加抗冻剂、分装，-20℃以下保存待用。拓扑异构酶克隆连接法速度快(5-10分钟完成连接反应)、操作简单、克隆率高。但Cheng和Shuman两人发明的载体制备方法的最大缺点是：工艺步骤繁多、不定性因素多(如，两次寡核苷酸接头退火复性、T4 DNA连接酶连接反应效率、空载体的比例、至少两次纯化)、不适于大容量制备等。

发明内容

鉴于以上缺陷，本发明的主要目的是利用痘苗病毒拓扑异构酶Ib和经改造过的载体DNA序列，提供一种一体化的、连续的、快速、稳定、便于质控的DNA分子克隆快速连接载体构建方法。

为了达到以上目的，本发明采用的技术方案如下：

首先，本发明提供了一种可以与质粒DNA一起永久扩增的具有特殊结构的DNA分子，该DNA分子包含可形成DNA发夹(hairpin)结构的DNA序列，还包含DNA切刻内切酶(Nicking Endonuclease)识别序列和所示的痘苗病毒拓扑异构酶Ib的识别位点。

所述发夹结构可以为完全和/或不完全发夹结构。

本发明还提供一种DNA分子克隆用载体，该载体包含上述具有特殊结构的DNA分子，并且所述DNA分子能够随所述DNA分子克隆用载体DNA一起复制与扩增。

本发明还提供一种DNA分子克隆快速连接载体构建方法，该方法包括如下步骤：

1)将包含有可形成DNA发夹结构的DNA序列、DNA切刻内切酶识别序列和痘苗病毒拓扑异构酶Ib的识别位点的DNA分子与载体克隆区一体化构建；

2)将步骤1)所得产物转化大肠杆菌感受态细胞；

3)挑取步骤2)所得大肠杆菌克隆，大量繁殖，扩增质粒DNA；

4)提取质粒DNA；

5)加入DNA切刻内切酶处理；

6)加入拓扑异构酶Ib处理；

7)加入灭菌甘油，分装，冻存。

所述步骤1)具体包括以下步骤：

a)人工合成一段所述包含有可形成DNA发夹结构的DNA序列、DNA切刻内切酶识别序列和痘苗病毒拓扑异构酶Ib的识别位点的DNA分子；

b)选择出发载体质粒，对以pUC/pMB1复制起始序列衍生的载体质粒，尤其是pUC rep ori区域(所述pUC rep ori区域易被拓扑异构酶Ib切断，形成不必要的异位插入)进行改造，消除相邻的拓扑异构酶Ib识别序列、DNA切刻内切酶的识别序列；

c)将步骤a)所得DNA分子连接到步骤b)所得质粒载体的克隆区；

对以pUC/pMB1复制起始序列衍生的载体，本发明列举了SEQ ID NO：8～SEQ ID NO：10三种突变序列，但不限于此序列。

上述DNA分子克隆快速连接载体构建方法中，可以免除中途或终末纯化步骤，但亦可增加中途或终末纯化步骤。

上述DNA分子克隆快速连接载体构建方法中，在无需连接任何DNA适配序列的前提下，切刻内切酶消化后，经变性-退火处理形成发卡结构，从而满足拓扑异构酶Ib以双链为底物的条件，并在预定位置切除发夹化DNA，再连接的发夹片段(“hairpinized”DNA fragments)无法形成假阳性克隆。

本发明仅依靠DNA切刻内切酶的位置调整和DNA发夹序列设置可形成：1)单碱基凸出(single-base protruding)粘性末端载体(如T-A cloning vector)；2)平端克隆载体(blunt-end cloning vector)；3)多碱基5’-凸出定向克隆载体(5-prime protruding directional cloning vector)。

上述DNA分子克隆快速连接载体构建方法，适用于包括克隆载体和表达载体在内的所有类型的载体的制备，其中表达载体包括原核表达载体、真菌表达载体、昆虫表达载体、哺乳类动物表达载体或植物表达载体。

本发明具有以下优点：

1、所述DNA分子克隆快速连接载体构建方法，整个过程操作简单，实验周期短，结果稳定，便于质控；

2、所述载体适合于任意来源的DNA分子的克隆或表达，外源基因可直接通过一步克隆法插入到载体中，大大简化了操作步骤，降低了成本，提高了工作效率；

3、用本发明方法制备的快速连接载体克隆外源DNA分子，阳性克隆率高达90％～100％，或实现“零背景”(无蓝斑)克隆。

附图说明

图1为本发明提供的一种具有特殊结构的DNA分子的一种发夹结构示意图；

图2为本发明提供的单碱基凸出粘性末端载体DNA序列示意图；

图3为本发明提供的平端克隆载体DNA序列示意图；

图4为本发明提供的多碱基5’-凸出定向克隆载体DNA序列示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案进行进一步说明，但不作对本发明的限定。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供了一种可以与质粒DNA一起永久扩增的具有特殊结构的DNA分子，该DNA分子具有以下重要特征：

1、特征之一是可形成DNA发夹(hairpin)结构，图1显示了其一种发夹结构示意图，发夹结构的长度：从5’-CCCTT-3’或5’-TCCTT-3’的3’T算起(包含3’T)为9-100个碱基对(Base-pairs)，发夹结构的数量至少1个，但可2个或大于2个，但本发明不局限于此一种，它包含所有可用于该方法的完全和不完全发夹结构，SEQ ID NO：1显示了图1发夹结构的DNA序列；

2、另一重要特征是它同时包含DNA切刻内切酶(Nicking Endonuclease)和痘苗病毒拓扑异构酶Ib的识别位点，并可被切割，SEQ ID NO：2显示了其DNA序列，此处所例举的切刻内切酶为Nt.BstNBI，但本发明不仅限于此，拓扑异构酶Ib识别位点的DNA序列此处为5’-CCCTT-3’，还包括5’-TCCTT-3’。

2)将步骤1)所得产物转化大肠杆菌感受态细胞；

3)挑取步骤2)所得大肠杆菌克隆，大量繁殖，扩增质粒DNA；

4)碱裂解法和色谱柱联合提取、纯化上述步骤所得的质粒DNA；

5)加入DNA切刻内切酶(2units/μg DNA，60μg DNA/μL)处理1-4小时；

6)70℃加热10分钟，室温放置10分钟；

7)加入拓扑异构酶Ib(酶与DNA的摩尔比为4∶1)处理30分钟至1小时；

8)加入等量灭菌甘油，分装，-20℃冻存。

所述步骤1)具体包括以下步骤：

c)将步骤a)所得DNA分子连接到步骤b)所得质粒载体的克隆区；

对以pUC/pMB1复制起始序列衍生的载体，本发明列举了SEQ ID NO：8～SEQ ID NO：10三种突变序列，但不限于此序列，pUC复制起始序列(pUC rep ori)包含有一段可被痘苗病毒拓扑异构酶Ib线性化的分布于DNA两条互补链上互为反向的相邻酶切识别位点(“DNAMAN”计算其热变性温度为53.8℃)：5’-AAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTA-3’(如SEQ ID NO：11所示，P_6-10及P_22-26为拓扑异构酶Ib识别序列)，该位点容易造成外源DNA的错误插入。去除其中1个或全部识别位点有助于获取正确克隆。但本发明用途不限于以pUC ori为复制起始的质粒，其用途还包括以p15A、pBR322 ColE1、pMB1、人工合成的、以及其它未知的大肠杆菌质粒复制起始序列的质粒。

本发明仅依靠DNA切刻内切酶的位置调整和DNA发夹序列设置可形成：1)单碱基凸出粘性末端载体，如图2所示，图中符号“/”为两个不同酶之间的切点，其DNA序列如SEQ ID NO：3所示；2)平端克隆载体，如图3所示，图中符号“/”为两个不同酶之间的切点，其DNA序列如SEQ ID NO：4所示；3)多碱基5’-凸出定向克隆载体，如图4所示，图中符号“/”为两个不同酶之间的切点，本图选择了哺乳类真核表达载体的通用核糖体结合位点5’-CACC-3’为例(但不限于该碱基序列组合)，可分别为5’-TG-3’，5’-GTG-3’，5’-GGTG-3’，其DNA序列如SEQ ID NO：5所示。植物类真核表达载体通常用核糖体结合位点为5’-AACC-3’。

实施例1.通用型快速连接克隆载体的制备及外源DNA片段的克隆

(一)载体的制备

(1)由pUC18或pUC19按上述原理构建克隆区，形成4类功能性质粒：

A.平端连接两侧不带多种DNA内切酶位点；

B.平端连接两侧带有多种DNA内切酶位点；

C.单一3’T凸出T-A克隆载体(两侧不带多种DNA内切酶位点)；

D.单一3’T凸出T-A克隆载体(两侧带有多种DNA内切酶位点)；

(2)扩增质粒并进行色谱柱纯化、电泳鉴定和定量；

(3)取适量质粒DNA加入DNA切刻内切酶(2units/μg DNA，60μg DNA/μL)消化，2小时后，70℃加热10分钟，室温放置10分钟；

(4)调整缓冲溶液浓度使其适合痘苗病毒拓扑异构酶Ib要求；

(5)加入适量痘苗病毒拓扑异构酶Ib(酶与DNA的摩尔比为4∶1)处理30分钟；

(6)加入适宜缓冲液，定量至50ng/ul；

(7)加甘油至50％浓度，分装20～50ul/管，-20℃可保存1年。

(二)最简化快速连接克隆试剂盒的组成

(1)快速连接载体；

(2)标准PCR产物DNA。

(三)外源DNA片段的克隆

1)5～10分钟克隆连接反应：

反应混合物：

上述(一)之步骤(7)制备的载体，或(二)中的快速连接载体 1ul

PCR产物或任意来源的DNA片段(20～100ng/ul) 1～4ul

离心5秒钟，轻弹混合，室温或37℃放置5～10分钟。

2)快速连接产物的大肠杆菌质粒转化：

向快速连接产物中加入30～50ul感受态菌(JM109，JM103，HB1，DH5α等均可，标准转化率≥107)，轻弹混合。冰上站立20～30分钟，热激(heat-shock，42℃，1分钟)，加入600ul LB或SOC培养液，37℃振荡培养1小时。取1/5或全部菌液铺板(含有合适抗生素的琼脂平板)，37℃温箱培养12-16小时。挑取单菌落培养。

3)重组体鉴定：

采用质粒分子量比较、PCR、酶切、DNA测序等常规方法，DNA插入片段2kb以下的阳性克隆率为90～100％。

实施例2.原核表达定向克隆载体的制备及目标表达基因的克隆

(一)载体的制备

按照本发明原理构建原核细胞(如E.coli)表达载体克隆区，包括示意序列(SEQ ID NO：11)：5’-CCCTTATGNNNNGACTCNNNGAGTCNNNGAAGGG-3’(如SEQ ID NO：12所示)。

(二)最简化快速连接克隆试剂盒的组成

(1)快速连接载体；

(2)标准PCR产物DNA；

(3)参照表达载体：含GFP表达序列的同型载体(可表达绿色荧光蛋白)。

(三)目标表达基因的克隆

1)目标表达基因PCR引物设计和PCR扩增

(1)引物设计：

基因ORF 5’引物(sense or forward primer)：5’-ATG+NNN…-3’

基因ORF 3’引物(anti-sense or reverse primer)：

5’-C+stop codon(TTA or TCA)+NNN…-3’

如终止密码为TAG，则可直接：5’-CTA+NNN…-3’；

(2)PCR扩增目标表达基因，检验PCR产物纯度，要求目标基因产物≥90％；

2)连接反应：同实施例1；

3)表达菌株感受态菌转化反应，常用BL21(DE3)或其它；

4)重组体鉴定：同实施例1；阳性克隆率为50～90％。

实施例3.哺乳类真核表达定向克隆载体的制备及目标表达基因的克隆

(一)载体的制备

按照本发明原理设计5’凸出的定向克隆区序列构建哺乳类真核表达快速连接定向克隆载体，该序列包含插入方向识别序列(CACC-ATG)、发夹序列、切刻内切酶切点序列、拓扑异构酶Ib识别序列；扩增和制备载体参照实施例1。

(二)最简化快速连接克隆试剂盒的组成

(1)快速连接载体；

(2)标准PCR产物DNA；

(3)参照表达载体：含GFP表达序列的同型载体(可在表达细胞内产生绿色荧光)。

(三)目标表达基因的克隆

1)按照本发明原理设计PCR 引物5’起始碱基序列(参考实施例2)；

2)PCR扩增目标表达基因，检验PCR产物纯度，要求目标基因产物≥90％；

3)连接反应同实施例1；

4)表达菌株感受态菌转化反应，常用同实施例1；

5)重组体鉴定：同实施例1；阳性克隆率为50～90％。

实施例4.昆虫或真菌真核表达定向克隆载体的制备及目标表达基因的克隆

(一)载体的制备

按照本发明原理设计5’凸出的定向克隆区序列构建昆虫或真菌真核表达快速连接定向克降载体，该序列包含插入方向识别序列(自行添加2-3个碱基)、发夹序列、切刻内切酶切点序列、拓扑异构酶Ib识别序列；扩增和制备载体参照实施例1。

(二)最简化快速连接克隆试剂盒的组成

(1)快速连接载体；

(2)标准PCR产物DNA；

(三)目标表达基因的克隆

1)参考实施例2，按照本发明原理设计PCR引物5’起始碱基序列(与自行添加序列相同)；

3)连接反应同实施例1；

4)表达菌株感受态菌转化反应，根据质粒选用受体菌株；

5)重组体鉴定：同实施例1；阳性克隆率为56～90％。

实施例5.植物真核表达定向克隆载体的制备及目标表达基因的克隆

(一)载体的制备

按照本发明原理设计5’凸出的定向克隆区序列构建植物快速连接定向克隆载体，该序列包含插入方向识别序列(植物核糖体结合序列通常为AACC-ATG)、发夹序列、切刻内切酶切点序列、拓扑异构酶Ib识别序列；扩增和制备载体参照实施例1。

(二)最简化快速连接克隆试剂盒的组成

(1)快速连接载体；

(2)标准PCR产物DNA；

(三)目标表达基因的克隆

1)按照本发明原理设计PCR引物5’起始碱基序列(参考实施例2)；

3)连接反应：同实施例1；

4)表达菌株感受态菌转化反应，常用同实施例1；

5)重组体鉴定：同实施例1；阳性克隆率为42～86％。

综上所述，采用本发明方法制备的快速连接载体阳性克隆率达50～100％(视插入片段大小而定)，或“零背景”克隆(无蓝斑)，具体数据见表1、表2。

表1.普通快速连接克隆载体阳性克隆率

注：阳性克隆率＝白斑÷(蓝斑+白斑)×100％；白斑是否包含插入片段以PCR方法鉴定。

表2.定向克隆载体阳性克隆率

注：以AACC为核糖体结合位点的农业基因工程载体本身都较大，尤其是以农杆菌介导的转基因载体。

Claims

1.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA序列包含可形成DNA发夹结构的DNA序列，还包含DNA切刻内切酶识别序列和痘苗病毒拓扑异构酶Ib的以别位点。

2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述发夹结构为完全和/或不完全发夹结构。

3.一种DNA分子克隆载体，其特征在于，所述载体包含权利要求1所述的DNA分子。

4.一种DNA分子克隆快速连接载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

1)权利要求1所述的DNA分子与载体克隆区的一体化构建；

2)将步骤1)所得产物转化大肠杆菌感受态细胞；

3)挑取步骤2)所得大肠杆菌克隆，大量繁殖，扩增质粒DNA；

4)提取质粒DNA；

5)加入DNA切刻内切酶处理；

6)加入拓扑异构酶Ib处理；

7)加入灭菌甘油，分装，冻存。

5.根据权利要求4所述的DNA分子克隆快速连接载体的构建方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括以下步骤：

a)人工合成一段如权利要求1所述的DNA分子；

b)选择出发载体质粒；对以pUC或pMB1复制起始序列衍生的出发载体质粒进行改造，消除相邻的拓扑异构酶Ib识别序列、DNA切刻内切酶的识别序列；

c)将步骤a)所得DNA分子连接到步骤b)所得质粒载体的克隆区。