CN106103712B - 一种高效基因克隆方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了DNA分子克隆的方法和成份。本发明的方法包括通过使用基于切刻内切酶的引物设计方法制备带有粘性末端的DNA片段，和将DNA片段与克隆载体连接，其中所述DNA片段和所述载体片段带有互补的粘性末端。本方法高效，可用于克隆大小为12Kb的DNA片段。本发明还公开了多DNA片段的一步定向连接方法和商业化基因克隆试剂盒。

Description

一种高效基因克隆方法及其应用

技术领域：

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种基于切刻内切酶的高效基因克隆方法及其应用。

背景技术：

PCR作为分子生物学的一项基本技术，是目前体外DNA扩增最常用的方法。PCR扩增产物的克隆是对其进行测序、载体的构建、体外转录、体外翻译、生物体内基因表达和功能分析等多种用途的必经之路。目前存在多种克隆DNA片段的方法，最常用的是TA克隆(Holton，T.A.et al.1991.Nucleic Acids Research.19(5)：1156)。该方法中载体DNA 3’端突出1个“T”碱基，与插入的PCR扩增产物3’端突出的1个“A”碱基形成了碱基互补配对，再经T4 DNA连接酶的连接作用完成TA克隆的过程。

但是，传统的TA克隆方法存在一些缺点：1)单个突出的T或A碱基悬挂不稳定，常常在回收或反复冻融时丢失；2)所有种类的T载体与PCR产物通过TA二氢键连接，而粘性末端只有一个碱基，因此，TA连接的键能较弱；3)DNA片段的连接是分子碰撞的过程，实际上是概率事件，因此连接效率不能达到最佳；4)当连接长度大于5 Kb的PCR产物时效率较低(Szatylowicz and Sadlej-Sosnowska，2010.J.Chem.Inf.Model.50(12)，2151-61)；6)在面对需要定向克隆PCR产物时(如Gateway反应)，一般的TA克隆载体也无法进行单一性方向的连接，需要在连接转化后再挑选连接方向正确的克隆(Peijun et al.2010.Curr IssuesMolBiol.12，11-16)。

目前存在的其它DNA片段克隆方法(Champoux.2001.Annu Rev Biochem.70，369-413；Cheo et al.2004.Genome Res.14，2111-20；van den Ent and Lo^..we.2006.JBiochem Biophys Methods.67，67-74)也存在连接效率低、步骤复杂、DNA片段不能定向连接等问题，因此需要一个高效的并能克服上述问题的克隆方法。

发明概述

本发明公开了基因克隆的方法。

在一个实施方案中，公开了一种基因克隆方法，其包括的步骤为，制备带有粘性末端的DNA片段；将所述DNA片段与带有的粘性末端的克隆载体连接，其中所述DNA片段的粘性末端与所述克隆载体的粘性末端互补；和将连接产物转化感受态细胞。

所述带有粘性末端的DNA片段通过以下步骤获得：1)使用一对特异的引物扩增目的DNA片段，其中一对引物中至少一个引物由5’端的额外碱基和与目的DNA片段末端互补的碱基序列组成，额外碱基包括切刻内切酶识别位点或者包括5’端至少一个保护碱基和与之相连的切刻内切酶识别位点；2)使用所述引物中识别位点对应的切刻内切酶酶切扩增的DNA片段；3)变性去除被切刻下的单链结构。0～10个保护碱基A、G、C或T以任意方式排布添加在引物的5’末端。所述DNA片段可以是一个末端为粘性末端，另一个末端为平末端；也可以是两个末端均为粘性末端。所述引物对可以带有相同的限制性内切酶识别位点，也可以是带有不同的限制性内切酶的识别位点。

切刻内切酶选自Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI或Nt.CviPII。在一个实施方案中，切刻内切酶是Nb.BbvCI。

克隆载体是线性的，带有一个或者两个粘性末端，线性克隆载体通过酶切初始载体或者按照如下的步骤制备：

1)制备两端为II型限制性内切酶识别位点的间隔子序列；

2)将1)中制备的间隔子序列添加到初始载体的克隆位点上，制备前克隆载体；

和

3)使用间隔子识别位点对应的II型限制性内切酶酶切前克隆载体。

在某些方面，间隔子序列的长度至少为300bp。

间隔子序列两端的II型限制性内切酶识别序列可以不同，也可以相同。间隔子可以是选择标记，例如ccdB基因。

初始载体选自PBR322载体、PUC载体、PGEM载体、pBluescript载体、pMD19-T载体、pMD18-T载体、pMD19-T Simple载体或者pMD18-T Simple载体。在一个实施例中，克隆载体是pMD19GW-Adv.BstX-BstXI。

本发明中基因克隆方法可用于克隆长度大于12Kb的DNA片段。

在另一个实施例中，公开了将多个DNA片段一步定向克隆到载体中的方法。在本方法中，首先获得带有预先设计的可变粘性末端的多DNA片段，所述带有可变粘性末端的DNA片段通过使用一对特异的引物扩增目的DNA片段，使用所述引物中识别位点对应的切刻内切酶酶切扩增的DNA片段，并去除酶切的单链结构的小片段获得。每一个引物针对特定目的片段进行扩增，引物对中的每一引物由5’端的额外碱基和与特定目的DNA片段末端互补的碱基序列组成，其中额外碱基包括切刻内切酶识别位点或者包括至少一个保护碱基和与之相连的一个切刻内切酶识别位点。可变粘性末端通过改变切刻内切酶识别位点和/或通过改变添加在引物5’端保护碱基的个数和排列方式产生。连接反应时，DNA片段之间和克隆载体根据碱基互补配对原则依赖粘性末端碱基配对定向连接，最后将连接产物转化感受态细胞。

为了创造粘性末端，0～10个保护碱基A、G、C或T以任意方式排列添加在5’末端。切刻内切酶选自Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI或Nt.CviPII。在一个实施例中，切刻内切酶是Nb.BbvCI。

克隆载体是线性化并带有一个或者两个粘性末端，线性克隆载体通过酶切初始载体或者按照如下的步骤制备：

1)制备两端为II型限制性内切酶识别位点的间隔子序列；

2)将1)中制备的间隔子序列添加到初始载体的克隆位点上，制备前克隆载体；和

3)使用间隔子识别位点对应的II型限制性内切酶酶切前克隆载体。

在某些实施例中，间隔子序列的长度至少为300bp。

间隔子序列两端的II型限制性内切酶识别序列可以不同，也可以相同。间隔子可以是选择标记，例如ccdB基因。

初始载体选自PBR322载体、PUC载体、PGEM载体、pBluescript载体、pMD19-T载体、pMD18-T载体、pMD19-T Simple载体或者pMD18-T Simple载体。在一个实施例中，克隆载体是pMD19GW-Adv.BstX-BstXI。

多DNA片段一步定向克隆方法可用于构建包括RNAi载体在内的载体。

附图说明和序列表

根据以下的发明详述和附图及序列表，可以更全面地理解本发明，以下的发明详述和附图及序列表形成本申请的一部分。

序列描述以及关联的序列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825中所列出的管理专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则。序列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三字母码，如遵照IUPAC-IUBMB标准所定义的，该标准在Nucleic AcidsRes.13：3021-3030(1985)以及在Biochemical J.219(No.2)：345-373(1984)中有所描述，这两篇文献以引用的方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中列出的规则。

SEQ ID NO：1是编码ccdB蛋白的间隔子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2是扩增间隔序列的上游引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：3是扩增间隔序列的下游引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：4是中花11号水稻3号染色体上包含位于LOC_Os03g08010.1位置EF1α基因的基因组核苷酸序列。

SEQ ID NO：5是引物NK-3的核苷酸序列。

SEQ ID NO：6是引物NK-4的核苷酸序列。

SEQ ID NO：7是引物NK-5的核苷酸序列。

SEQ ID NO：8是引物NK-6的核苷酸序列。

SEQ ID NO：9是引物NK-7的核苷酸序列。

SEQ ID NO：10是引物NK-8的核苷酸序列。

SEQ ID NO：11是引物NK-9的核苷酸序列。

SEQ ID NO：12是引物NK-10的核苷酸序列。

SEQ ID NO：13是引物NK-11的核苷酸序列。

SEQ ID NO：14是引物NK-12的核苷酸序列。

SEQ ID NO：15是引物NK-k的核苷酸序列。

SEQ ID NO：16是引物check9/11的核苷酸序列。

SEQ ID NO：17是引物check5/7的核苷酸序列。

SEQ ID NO：18是引物check3的核苷酸序列。

SEQ ID NO：19是引物ADVANCEDM13F的核苷酸序列。

SEQ ID NO：20是引物Nb.DsRed-1的核苷酸序列。

SEQ ID NO：21是引物Nb.DsRed-2的核苷酸序列。

SEQ ID NO：22是引物Nb.HYG-1的核苷酸序列。

SEQ ID NO：23是引物Nb.HYG-2的核苷酸序列。

SEQ ID NO：24是引物Nb.GUS-1的核苷酸序列。

SEQ ID NO：25是引物Nb.GUS-2的核苷酸序列。

SEQ ID NO：26是引物DsRed-reverse的核苷酸序列。

SEQ ID NO：27是引物DsRed-forward的核苷酸序列。

SEQ ID NO：28是引物GUS-reverse的核苷酸序列。

SEQ ID NO：29是引物GUS-forward的核苷酸序列。

SEQ ID NO：30是引物HYG-reverse的核苷酸序列。

SEQ ID NO：31是引物HYG-forward的核苷酸序列。

SEQ ID NO：32是引物M13R的核苷酸序列。

SEQ ID NO：33是引物FRiGUS-1的核苷酸序列。

SEQ ID NO：34是引物FRiGUS-2的核苷酸序列。

SEQ ID NO：35是引物RRiGUS-1的核苷酸序列。

SEQ ID NO：36是引物RRiGUS-2的核苷酸序列。

SEQ ID NO：37是引物Intron-F的核苷酸序列。

SEQ ID NO：38是引物Intron-R的核苷酸序列。

SEQ ID NO：39是引物Reverse Intron的核苷酸序列。

SEQ ID NO：40是引物Forward Intron的核苷酸序列。

附图说明：

图1是pMD19GW-Adv.BstX载体的结构示意图。ColE1 ori表示大肠杆菌的复制起始位点，Amp^r表示氨苄青霉素抗性基因。

图2是实施例6和7中PCR扩增的三个DNA片段的粘性末端结构示意图。

图3是多DNA片段通过粘性末端互补配对完成在克隆载体中的定向连接。

详细描述

本发明公开了一种高效基因克隆方法，本方法通过产生带有粘性末端的DNA片段，并使DNA片段与带有互补粘性末端的克隆载体连接，使得DNA片段按照预定的方向连入克隆载体。本方法的优点包括但不限于：(1)PCR产物与克隆载体高效连接；(2)克隆连接大于12Kb的DNA片段；(3)一步完成多DNA片段的连接；(4)无需考虑DNA片段内部的切刻内切酶识别位点；和(5)降低成本，提高效率。

应该理解，本发明中的描述是可变的，并不局限于特定的实施方式。同时也应该理解，本文中的术语仅是为了描述特定实施方式，而不是用于限制。如本文所用的并在所附权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类植物。“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。

如果没有特殊说明，本文中的所有序列均是5’到3’方向。本文中详述的数字范围包括定义该数字范围的两端的数字，且包括界定范围内的任意整数或者非整数部分。除另有说明外，本文中所使用的所有的技术和科学术语，与本领域中普通的技术人员目前的理解具有相同的含义。本发明中，下列术语将按照下列定义使用。本文中列出的每篇参考文献的公开内容的全文以引文方式并入本文。

下面的定义将有助于理解本发明。

“碱基”和“核苷酸”本发明中可互换使用，指单字母表示的核苷酸，“A”、“C”、“G”分别表示DNA或者RNA中的腺嘌呤核苷酸或者脱氧腺嘌呤核苷酸，胞嘧啶核苷酸或者脱氧胞嘧啶核苷酸，鸟嘌呤核苷酸或者脱氧鸟嘌呤核苷酸，“T”指脱氧尿嘧啶核苷酸。

“变性”也叫DNA熔解，是指通过氢键断裂使得双链DNA展开并分成单链的过程。

一个“DNA片段”指一段DNA。

“设计的方向”指相对于另外一个DNA片段和组装载体的所期望的DNA片段的连接方向。通过改变nicking box中切刻内切酶识别位点之间的间隔碱基的数目和排列方式可以预设DNA片段等的排列方向，并在线性载体或者DNA片段的末端产生突出的核苷酸。一条DNA片段的突出部分与另一条DNA片段或者线性载体互补，并通过氢键配对，确保多DNA片段按照设计的方向连接。

“质粒”是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体外的脱氧核糖分子，大部分的质粒是环状构型。

“质粒载体”是指通常含有复制起始位点、抗性筛选标记，多克隆位点的人工改造质粒。现存的质粒载体经过本发明中克隆方法的改造可产生带有粘性末端的载体。初始载体可以选自PBR322、PUC系列、PGEM系列、pBluescript(简称pBS)、pMD19-T载体、pMD18-T载体、pMD19-T Simple载体、pMD18-T Simple载体等。

“引物对”由一个上游引物和一个下游引物组成，用于扩增目的DNA片段或者验证目的DNA片段是否插入目的质粒中。

“保护碱基”指引物5’端与切刻内切酶识别位点相连的碱基，可以是A、T、C或G，酶切后，形成粘性末端的一部分。

“识别序列”、“识别位点”、和“酶切位点”可以互换使用，均指限制性内切酶、切刻内切酶或者归位内切酶识别的核苷酸序列。

限制性内切酶是指一类能够识别并切割双链DNA分子中的某些特定核苷酸序列的核酸水解酶。II型限制性内切酶为最常用的限制性内切酶，其特点为能够识别和切割4-8个碱基对的核苷酸序列，且大多数识别序列具有回文结构，没有甲基化修饰酶功能。II型限制性内切酶的切割方式有三种，(1)切割产生5’突出末端，(2)切割产生3’突出末端，和(3)切割产生平末端。任意II型限制性内切酶可以用于本文中描述的载体的构建方法中。

“选择标记”是指当表达量足够高时可以对选择剂产生抗性的任意标记。选择标记和相应的选择剂包括，但不限于，除草剂抗性基因和除草剂、抗生素抗性基因和抗生素、化学抑制基因和相应的化学试剂。

多种试剂可以赋予除草剂抗性，包括氨基酸合成抑制剂、光合作用抑制剂、脂质抑制剂、生长调节剂、细胞膜扰乱剂、色素抑制剂、幼苗生长抑制剂。这些试剂包括，但不限于，咪唑啉酮、磺脲类药物、三唑并嘧啶类、草甘膦、稀禾定、精恶唑禾草灵、草铵膦、草丁膦、三嗪、溴苯腈等(Holt(1993)Ann Rev Plant Physiol Plan t Mol Biol44：203-229；和Mikiet al.(2004)J Biotechnol 107：193-232)。选择标记包括赋予除草剂抗性的序列，还包括，但不限于编码草丁膦乙酰转移酶(PAT)赋予草铵膦抗性的bar基因(Thompson et al.(1987)EMBO J 6：2519-2523)，赋予草甘膦抗性的草甘膦氧化还原酶(GOX)、草甘膦N-乙酰转移酶(GAT)和5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)(Barry et al.(1992)inBiosynthesis and Molecular Regulation of Amino Acids in Plan ts，B.K.Singh etal.(Eds)pp.139-145；Kishore et al.(1992)Weed Tech 6：626-634；Castle(2004)Science304：1151-1154；Zhou et al.(1995)Plant Cell Rep 15：159-163；WO97/04103；WO02/36782和WO03/092360)。其它的筛选标记包括赋予甲氨蝶呤(methotrexate)抗性的二氢叶酸还原酶(DHFR)(例如，Dhir et al.(1994)Improvements of Cereal Quality byGenetic Engineering，R.J.Henry(ed)，Plenum Press，New York和Hauptmann et al.(1988)Plant Physiol86：602-606)，和对咪唑啉酮(imidiazolinones)和/或磺脲类(sulfonylureas)如咪唑乙烟酸(imazethapyr)和/或氯磺隆(chlorsulfuron)产生抗性的乙酰羟酸合酶(AHAS或ALS)突变序列(例如Zu et al.(2000)Nat Biotechnol 18：555-558；美国专利6,444,875和6,660,910；Sathasivan et al.(1991)Plant Physiol 97：1044-1050；Ott et al.(1996)J Mol Biol 263：359-368；和Fang et al.(1992)Plant Mol Biol18：1185-1187)。

细菌抗药基因包括，但不限于，赋予卡那霉素、巴龙霉素、新霉素和G418抗性的新霉素磷酸转移酶(npt11)，赋予潮霉素B抗性的潮霉素磷酸转移酶(hph)(Bowen(1993)Markers for Plan t Gene Transfer，Transgenic Plants，Vol.1，Engineering andUtilization；Everett et al.(1987)Bio/Technology5：1201-1204：Bidney et al.(1992)Plant Mol Biol18：301-313；和W097/05829)。

另外，化学抗性基因还包括赋予4-甲基色氨酸(4-mT)抗性的色氨酸脱羧酶(Goodijn et al.(1993)Plant Mol Biol 22：907-912)和赋予溴苯腈抗性的溴苯腈水解酶。选择标记可以为氰酰胺水解酶(Cah)，例如，Greiner et al.(1991)Proc Natl AcadSci USA 88：4260-4264；和Weeks et al.(2000)Crop Sci 40：1749-1754。氰酰胺水解酶将氰胺转化成脲，从而赋予氰胺抗性。任何形式或者衍氰胺可以用作选择剂，包括，但不限于，氰胺化钙(

(SKW，Trotberg Germany))和单氰胺(

(SKW))(美国专利6,096,947和6,268,547)。氰酰胺水解酶的多核苷酸和/或多肽变体仍保留氰酰胺水解酶活性，一个氰酰胺水解酶生物活性变体仍保留将氰胺转变为脲的活性。这种活性的测试方法包括测定表达氰酰胺水解酶植物对氰胺的抗性，另外的测试包括氰酰胺水解酶比色法测试(Weekset al.(2000)Crop Sci40：1749-1754；和美国专利6,268,547)。

选择标记也可以是ccdB基因(Bernard，P.1995.Gene 162：159-160；Bernard，P.etal.1994.Gene 148：71-74；Marcil，R.A.，et al.1996.NIH Res.8：62)。ccdB是致死基因，靶标为DNA解旋酶，ccdB阳性选择标记通过杀死没有克隆DNA的细胞降低背景，只有含有重组DNA的细胞能够形成活性的克隆。

“间隔子”是一段DNA片段。

术语“粘性末端”指核酸链的突出部分，可以自由的与其它的DNA片段、组装载体的粘性末端进行碱基配对。

“目的DNA片段”指感兴趣的DNA片段，可以扩增、提取并连接到克隆载体上。

基于切刻内切酶和引物设计方法的DNA克隆方法

切刻内切酶

切刻内切酶是NEB公司(NEW ENGLAND BioLabs Inc.)开发出的一类特殊的限制性内切酶，它仅切割双链DNA底物的一条链，不会切断DNA分子。切刻作用产生的3’-羟基及5’-磷酸基，可以进行许多其他反应的第一步：DNA的合成置换、链置换扩增、外切降解等。NEB公司开发的切刻内切酶包括Nb.BbvCI、Nt.BbvCI Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII。这些切刻内切酶的来源和酶切位点可查询NEB公司的网站或者产品说明书，下面举例说明切刻内切酶及其的酶切位点：

Nb.BbvCI来源于重组大肠杆菌(E.coli)菌株，包含有从短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)(L.Ge)克隆的BbvCI基因{Ra+：Rb(E177G)}。识别序列如下：箭头处为切刻位置

Nt.BbvCI来源于重组大肠杆菌(E.coli)菌株，包含有从短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)(L.Ge)克隆的BbvCI基因{Ra(K169E)：Rb+}。识别序列如下：箭头处为切刻位置

引物设计方法

本发明公开了基于切刻内切酶的引物设计方法，本方法是根据互补配对的原则设计引物，在上游引物和下游引物的5’末端分别加上一段额外序列，该额外序列(5’到3’方向)由几个保护碱基和切刻内切酶识别的序列组成，保护碱基为0～10个以任意方式排列A、C、G或T。通过改变额外序列中保护碱基的个数和排列方式和/或切刻内切酶识别位点，DNA片段能够以预计的方向与克隆载体连接。正如下面讨论的，该特点可用于多DNA片段的一步定向连接。

产生带有粘性末端的DNA片段

本发明公开了产生带有粘性末端DNA片段的方法，具体步骤为：(1)根据上述引物设计方法设计引物；(2)PCR扩增获得目的DNA片段；(3)使用步骤(1)引物序列中切刻内切酶序列对应的切刻内切酶进行酶切步骤(2)获得的DNA片段，并去除酶切后的单链结构。酶切后的单链结构通过65℃变性5min去除。由于切刻内切酶只在双链DNA的一条单链上产生小缺口，因此实际操作中不用担心PCR产物内部所含有的相同切刻位点而造成DNA双链的断裂。引物中的保护碱基在酶切后形成DNA片段的粘性末端。

克隆载体的制备

本发明还公开了制备线性克隆载体的方法，该线性克隆载体用于本发明的克隆方法中。本发明中描述的克隆载体带有粘性末端，该粘性末端与上述的DNA片段的粘性末端互补。所述线性克隆载体通过酶切初始载体获得，或者通过以下步骤制备：1)获得在末端带有II型限制性内切酶识别位点的间隔子；2)将间隔子导入初始载体的克隆位点，获得前克隆载体；3)使用间隔子中限制性内切酶的识别序列对应的限制性内切酶酶切前克隆载体获得克隆载体。

本发明中的间隔子便于将限制性内切酶酶切的克隆载体与初始载体分开。间隔子是任意长度的DNA片段，且不形成不正常的二级结构，间隔子的长度可以至少为100bp，200bp或者300bp，间隔子的长度最好至少为300bp。间隔子为但不限于ccdB基因(Bernard，P.1995.Gene 162：159-160；Bernard，P.et al.1994.Gene 148：71-74；Marcil，R.A.，etal.1996.NIH Rws.8：62)or DSRed(Matz，M.V.et al.1999.Nat Biotechnol 17：969-973)。

用于构建克隆载体的初始载体选自PBR322载体、PUC系列载体、PGEM系列载体、pBluescript载体、pMD19-T载体、pMD18-T载体、pMD19-T Simple载体、pMD18-T Simple载体或者其它本领域技术人员知晓的常用克隆载体。

用于构建克隆载体限制性内切酶为常规II型限制性内切酶或者切刻内切酶。任何情况下，可以预见，间隔子包括位于两端的相同限制性内切酶识别位点或者两端为不同限制性内切酶位点。

在一个实施例中，克隆载体是pMD19GW-Adv.BstX-BstXI，该克隆载体的构建方法详见实施例2到4。

基因克隆方法及其应用

本发明公开的高效基因克隆方法包括以下步骤：(1)根据引物设计方法设计引物；(2)使用本发明描述的方法获得带有粘性末端的DNA片段；(3)将步骤(2)中获得的带有粘性末端的DNA片段与克隆载体连接，其中克隆载体的粘性末端与DNA片段的粘性末端互补；和(4)将连接产物转化感受态细胞。

本发明的克隆方法效率高，可用于构建包括RNAi的载体在内的载体，或者克隆长度大于12Kb的DNA片段。

多DNA片段与克隆载体的一步连接

使用本发明描述的方法，通过改变特定DNA片段引物中保护碱基的个数和排列方式和/或切刻内切酶识别序列可以实现多DNA片段定向连接(按照设计的方向)。PCR扩增和切刻内切酶酶切后，DNA片段具有互补但又不同的粘性末端，使得多DNA片段相对于另一DNA片段或者载体能够定向连接(图3)。本流程提供了另一优点：多DNA片段可以经过一步反应连接到克隆载体上。

试剂盒

本发明公开的基因克隆方法中的元件可以用于组装基因克隆试剂盒，用于高效克隆长度在12Kb以上的DNA片段，并完成多DNA片段一步定向连接。

基因克隆试剂盒包括实施例4中的线性pMD19GW-Adv.BstX-BstXI载体、切刻内切酶反应缓冲液、切刻内切酶Nb.BbvCI和连接酶。

具体实施方式：

下面用实施例进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。应该理解，本文的实施方案只是举例说明，本领域的技术人员对试剂或参数的修改涵盖于所附权利要求书的范围内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例均以将切刻内切酶Nb.BbvCI的识别序列添加在扩增片段的引物中，并使用II型限制性内切酶BstXI构建配套克隆载体为例进行说明。

实施例1、基于切刻内切酶Nb.BbvCI识别序列的PCR引物设计和粘性末端的产生

设计的引物用于通过PCR反应扩增DNA片段。在设计引物时，额外序列添加在引物的基因特异部分5’末端，例如，两个保护碱基(

内)和切刻内切酶Nb.BbvCI识别序列(“______”内)添加在每条引物的基因特异部分，具体方式如下：

采用常规的PCR方法扩增目的DNA片段，PCR反应的产物经过柱回收(E.Z.N.A.Cycle Pure Kit，OMEGA Bio-tek)后用切刻内切酶Nb.BbvCI处理，并经过65℃热变性5min移除末端切刻下的单链结构，便会在产物末端产生如下四碱基粘性末端。

5′-TGAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTCAGCGG-3′

3′-GACGACTCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGAGT-5′

实施例2、间隔子的制备

间隔子序列如SEQ ID NO：1所示，编码ccdB蛋白。设计如下引物，以pMD19GW-delete载体为模板进行扩增，pMD19GW-delete载体没有ccdA基因。

Spacer-F：CCAGCCGCTTGGAGATCCGGCTTACTAAAAGCCAGATAACAGT(SEQ ID NO：2)

Spacer-R：CCATCTGCTTGGCTCGACGGAGCCTGACATTTATATTCCCCAGAACATCAGGTTA(SEQID NO：3)

(“_______”内为BstXI识别序列)

以本室所存克隆菌pMD19GW-delete(5μl菌液)作模板进行PCR扩增获取间隔子。PCR反应体系和循环状况如表1和表2所示：

表1.PCR反应混合液

表2.PCR扩增循环程序为：

扩增的PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳后，经切胶回收，便获得间隔子DNA产物。

实施例3、前克隆载体pMD19GW-Adv.BstX的制备

将实施例2中制备好的DNA间隔子序列，与载体pMD19T(Simple)建立如下10μL连接反应体系：含有0.5μL T₄DNA连接酶(NEB)，1×T₄DNA连接酶反应缓冲液，大约300ng间隔子PCR产物，0.5μL pMD19T(40ng/μL)，灭菌蒸馏水补足至10μL，16℃连接3小时。将连接产物采用热激转化法转化大肠杆菌感受态细胞，涂布含Amp的LB平板培养基上，37℃过夜培养。随机挑取3个克隆，进行PCR验证，并将阳性菌落逐一测序，提取测序正确的阳性菌落中的质粒，获得前克隆载体质粒pMD19GW-Adv.BstX(如图1)。

实施例4、克隆载体pMD19GW-Adv.BstX-BstXI的制备

如图1所示，前克隆载体pMD19GW-Adv.BstX上带有BstXI限制性内切酶酶切位点，分别位于克隆位点两侧(间隔子序列中也包含一个BstXI限制性内切酶酶切位点)，用BstXI酶切前克隆载体pMD19GW-Adv.BstX，得到从小到大依次为131bp、324bp、2923bp的三种核酸片段。

酶切反应体系如下：50μL酶切体系中含1μL BstXI(NEB)，5μL NEB缓冲液3，1.5μg质粒，灭菌蒸馏水补足至50μL，37℃酶切过夜后，1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收大片段。切胶回收的大片段即是相应的克隆载体pMD19GW-Adv.BstX-BstXI。

实施例5.克隆载体pMD19GW-Adv.BstX-BstXI的克隆效率的分析

为测试本发明克隆载体与扩增PCR产物的连接效率，本实施例选择中花11(ZH11)水稻的基因组DNA为模板，扩增水稻的不同长度DNA片段。选择real-time PCR常用内参基因延伸因子EF1α(Elongation factor 1α)基因，该基因位于中花11水稻基因组3号染色体上，位点为LOC_Os03g08010.1，以该位点为中心，开始向上下游位置延伸，选择的核酸序列如SEQ ID NO：4所示。用KOD-FX(TOYOBO)高保真聚合酶进行PCR扩增(见表4PCR反应混合液和表5和表6PCR扩增循环程序)，引物如表3所示，“______”下划线标记的碱基为切刻内切酶：Nb.BbvCI识别序列，

内为保护碱基。

表3.PCR扩增使用的引物

表4.PCR反应混合液

表5.12Kb以上片段的PCR扩增循环程序

表6.12Kb以下片段的PCR扩增循环程序

PCR扩增引物组合方式以及产物片段的长度如表7所示，扩增片段的GC％达60％～80％。

表7.PCR扩增反应使用的引物对组合，扩增片段在SEQ ID NO：4序列中起始位点及 扩增片段长度

引物对组合	扩增片段的起始位点	扩增片段的长度(bp)
			NK-5&NK-k	1000-12769	11788
NK-3&NK-4	100-6095	6014
			NK-5&NK-6	1000-5799	4818
NK-7&NK-8	1000-3999	3018
			NK-9&NK10	3400-5099	1718
NK-11&NK-12	3400-3999	618

Nb.BbvCI切刻内切酶酶切过柱回收的PCR产物。其中NK-5&NK-k的扩增产物NK-5/k中包含三处Nb.BbvCI识别位点。酶切体系如下：50μL酶切体系中含1μL Nb.BbvCI切刻内切酶(NEB)，5μL NEB缓冲液2，20μL过柱回收PCR产物，灭菌蒸馏水补足至50μL。37℃酶切过夜后，1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的片段。

将PCR扩增的片段与实施例4中构建的克隆载体连接，建立如下连接体系：20μL连接体系中含有0.5μL T₄DNA连接酶(NEB)，1×T₄DNA连接酶反应缓冲液，大约300ng切刻内切酶处理后的PCR产物，0.5μL pMD19GW-Adv.BstX-BstXI克隆载体(40ng/μL)，灭菌蒸馏水补足至20μL。16℃连接3小时，将连接产物采用热激转化法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含Amp的LB平板培养基上，37℃过夜培养，LB筛选平板上长出数百的菌落。

每个转化皿随机挑取10个克隆，进行菌落PCR检测，引物序列见表8，检测引物对方式和产生的扩增长度如表9。

表8.菌落PCR验证的引物对

表9.菌落PCR的验证引物组合与扩增结果

质粒名称	验证引物对组合	扩增片段的长度(bp)
			GW-Adv.B-NK5/K<sub>2</sub>	ADVANCED M13F&check5/7	596
GW-Adv.B-NK3/4	ADVANCED M13F&check3	465
			GW-Adv.B-NK5/6	ADVANCED M13F&check5/7	596
GW-Adv.B-NK7/8	ADVANCED M13F&check5/7	596
			GW-Adv.B-NK9/10	ADVANCED M13F&check9/11	416
GW-Adv.B-NK11/12	ADVANCED M13F&check9/11	416

琼脂糖凝胶电泳检测结果所明，每个平板上随机选择的10个克隆能够扩增出表9中引物对组合的可获得目的条带，该实验表明采用将切刻内切酶酶切位点引入扩增片段的引物中获得PCR扩增核酸片段能够与本发明构建的克隆载体高效连接，转化后AMP平板上长出的菌落的阳性率很高。

为进一步确认PCR产物与pMD19GW-Adv.BstX-BstXI克隆载体的正确连接，采用限制性内切酶酶切分析验证阳性转化子。每个平板上各挑两个PCR检测为阳性结果的菌落摇菌培养并抽提质粒分别进行限制性酶切分析，选用限制性内切酶的原则为酶切位点必须是在载体骨架上以及克隆片段上至少各包含有一处，采用酶切的体系详见NEB产品说明，酶切分析方式如下表10。

表10.限制性内切酶分析时选择的限制性内切酶及酶切后核酸片段的长度

凝胶电泳结果表明，PCR验证为阳性的菌落提取的质粒在相应的限制性内切酶酶切后均能获得目的片段。这些结果进一步表明扩增的DNA片段与克隆载体的连接正确率为100％。使用本发明中介绍的引物设计方法及配套的克隆载体，PCR产物的定向连接效率非常高，且本实施例中的克隆载体成功克隆的PCR产物最大长度达12Kb。

实施例6、基于切刻内切酶Nb.BbvCI的高效率多片段连接方法

本实施例进行的实验表明，通过改变添加在引物末端的保护碱基的长度和排列方式产生不同的粘性末端完成多DNA片段可以一步定向连接。在这些试验中，5’端设计有额外序列的引物(表11所示)用于扩增三个目的DNA片段。

表11.多DNA片段连接中目的DNA片段的引物

(“______”标记的碱基为Nb.BbvCI识别序列，“NNNN…”为基因特异序列，

内为保护碱基，L/R分别指上下游引物)，相互连接的基因片段的突出连接末端碱基互补，以保证多DNA片段能够按照预期的设计连接。

使用上述引物进行PCR扩增实验，扩增产物经过柱回收后，采用Nb.BbvCI切刻内切酶消化处理，电泳，切胶回收。反应产物DNA片段#1、#2和#3的粘性末端分子结构如图2所示。DNA片段#1、#2和#3与实施例4中pMD196W-Adv.BstX-BstXI克隆载体进行连接(载体与片段间的粘性末端结构如图3所示)，即可方便地实现多片段间的定向高效连接。

本实验室保存的质粒pCAMBIA 1301-DsRed带有的DsRed基因表达盒[DNA片段#1]、GUS基因表达盒[DNA片段#2]、HYG潮霉素抗性基因表达盒[DNA片段#3]等，以pCAMBIA 1301-DsRed质粒为扩增模板，设计表12中的引物序列，并保证相互连接的基因片段的突出连接末端碱基互补，扩增DNA片段#1、#2和#3，“______”下划线标记的碱基为Nb.BbvCI识别序列，

内为保护碱基。

目的基因DsRed基因表达盒[DNA片段#1]、GUS基因表达盒[DNA片段#2]、HYG潮霉素抗性基因表达盒[DNA片段#3]的扩增片段长度分别为1921bp、1834bp、1739bp。

表12.pCAMBIA 1301-DsRed中DsRed、GUS和HYG的引物

表13.PCR反应体系为：

PCR扩增循环程序为：

采用表13的PCR反应混合物和循环条件进行PCR反应，Nb.BbvCI切刻内切酶酶切PCR过柱回收产物，酶切体系如下：50μL酶切体系中含1μL Nb.BbvCI切刻内切酶(NEB)，5μLNEB缓冲液2，20μL过柱回收PCR产物，灭菌蒸馏水补足至50μL。37℃酶切过夜后，1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收目的片段。

PCR扩增片段与实施例4构建的克隆载体建立连接体系：20μL连接体系中含有0.5μL T₄DNA连接酶(NEB)，1×T₄DNA连接酶反应缓冲液，切刻内切酶处理后的每个PCR产物(大约300ng)，0.5μL pMD19GW-Adv.BstX-BstXI克隆载体(40ng/μL)，灭菌蒸馏水补足至20μL，16℃连接3h。将连接产物GW-Adv.B-DsRed*GUS*HYG采用热激转化法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布Amp的LB平板培养基上，37℃过夜培养。LB选择平板上长出上百个菌落。PCR用于验证氨苄培养基上长出的菌落，所用的引物组合为前一个DNA片段的下游引物和后一个连接DNA片段的上游引物，引物如表14所示。

表14.菌落PCR验证的引物

期望的扩增片段的长度为：使用引物对ADVANCED M13F和DsRed-reverse能够扩增出261bp大小条带；使用引物对DsRed-forward和GUS-reverse能够扩增278bp大小条带；使用引物对GUS-forward和HYG-reverse能够扩增616bp大小条带；使用引物对HYG-forward和M13R能够扩增441bp大小条带。随机选择的10个菌落产生期望大小的扩增片段，通过菌落PCR和凝胶电泳表明，三个DNA片段已经按照预先设计的方向正确连接，且转化效率很高。本发明的引物设计方法，和本发明构建的克隆载体能够保证多DNA片段高效定向的连接到克隆载体pMD19GW-Adv.BstX-BstXI上。

为进一步确认PCR产物与pMD19GW-Adv.BstX-BstXI克隆载体连接方式的正确性，采用限制内切酶酶切法进行验证。每个平板上各挑两个PCR检测为阳性结果的菌落摇菌培养并抽提质粒分别进行限制性酶切分析。选用限制性内切酶的原则为该酶切位点必须是在载体骨架上以及克隆片段上分别至少包含有一处，采用酶切的体系详见NEB产品说明，酶切分析方式如表15。

表15.多片段的质粒限制性内切酶分析选择的限制性内切酶及酶切后的核酸片段长度

电泳结果表明，多DNA片段连接后构建的质粒GW-Adv.B-DsRed*GUS*HYG在被XHoI、BglII和PstI三种限制性内切酶酶切后能够产生如表15所示的不同长度的核酸片段，证明三个DNA片段是按照预定的连接顺序连接到克隆载体上。

本实施例的实验结果表明，基于这套方法和载体，通过改变PCR引物保护碱基长度及排列分布，使后续步骤产生的粘性末端可以使多组扩增片段按照预计的连接顺序定向连接，并最终装载到配套克隆载体上，且随机选择的10个菌落PCR验证为阳性，其中两个菌落在进一步的酶切分析验证中也是阳性，该方法被证明具有较高的连接效率，且多DNA片段能够实现100％的预计方向的连接。

实施例7.基于切刻内切酶Nb.BbvCI的RNAi载体的一步构建方法

以构建一个RNAi GUS基因的结构为例来进行本实验。扩增模板为本实验室保存质粒pUCCRNAi和pCAMBIA 1301。pUCCRNAi上的扩增目的区为来自番茄(solanumlycopericum)的赤霉素20-氧化酶(gibberellin 20-oxidase)基因的第二个内含子(2^ndIntron)，pCAMBIA1301的扩增目的区是GUS基因的第二个外显子(exon)上的一段区域，表16中的引物设计方法已在前面描述(“______”下划线标记的碱基为Nb.BbvCI识别序列，

内为保护碱基)，序列如表16.F-GUS正义链为DNA片段#1、赤霉素20-氧化酶基因的第二个内含子为DNA片段#2、R-GUS反义链为DNA片段#3。扩增片段长度分别为250bp、215bp、250bp。

表16.F-GUS、赤霉素20-氧化酶2nd内含子和GUS反义链的引物

表17.PCR反应体系为：

PCR扩增循环程序为：

参照表17进行PCR，Nb.BbvCI切刻内切酶酶切PCR过柱回收产物，酶切体系如下：50μL酶切体系中含1μL Nb.BbvCI切刻内切酶(NEB)，5μL NEB缓冲液2，20μL过柱回收PCR产物，灭菌蒸馏水补足至50μL。37℃酶切过夜后，1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的片段。

PCR扩增片段与实施例4构建的克隆载体连接，建立连接体系：20μL连接体系中含有0.5μL T₄DNA连接酶(NEB)，1×T₄DNA连接酶反应缓冲液，大约300ng切刻内切酶处理后的每个PCR产物，0.5μL pMD19GW-Adv.BstX-BstXI克隆载体(40ng/μL)，灭菌蒸馏水补足至20μL，16℃连接过夜。将连接产物GW-RiGUS采用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布Amp的LB平板培养基上，37℃过夜培养。筛选平板上长出上百个菌落，采用菌落PCR验证平板上的阳性克隆。随机挑取平板上10个克隆，进行菌落PCR检测，使用M13F&Reverse Intron、M13R&Foward Intron引物检测(表18)：

表18.菌落PCR验证的引物

PCR用于验证Amp培养基上长出的克隆，用于验证的引物组合包括前一个连接片段的下游引物和后一个连接片段的上游引物。扩增片段的期望长度分别为499bp(引物对为ADVANCED M13F&Reverse Intron)、659bp(引物对为Foward Intron&M13R)，凝胶电泳检测结果表明，10个克隆中8个能够产生期望的499bp扩增片段，10个能够产生659bp扩增片段，因此至少80％的验证菌落中带有按照预设方向连接的基因片段。

为进一步确认DNA片段与pMD19GW-Adv.BstX-BstXI克隆载体连接方式的正确性，采用限制内切酶酶切法进行验证。每个平板上各挑两个PCR检测为阳性结果的菌落摇菌培养并抽提质粒分别进行限制性酶切分析。选用限制性内切酶的原则为酶切位点必须是在载体骨架上以及克隆片段上至少包含有一处，采用酶切的体系详见NEB产品说明，酶切分析方式及结果如下表19。

表19.RNAi载体的限制性内切酶验证选择的限制性内切酶及其酶切后的核酸片段的长度

电泳检测结果表明构建的RNAi质粒GW-RiGUS经过限制性内切酶EcoRI和PstI酶切后产生表19所示长度的核酸片段，证明三个DNA片段是按照预定的连接顺序连接到克隆载体上。

筛选培养基上长出的上百个菌落中，随机选择10个菌落进行PCR沿着验证，其中的8个菌落被验证为阳性，从8个阳性菌落中选择两个进行酶切分析验证也是阳性，本发明的方法被证明具有高效连接效率，多DNA片段相互连接且与线性克隆载体正确连接效率至少为80％，结果表明采用本发明的引物设计和基因克隆方法能够定向构建RNAi构建体。

实施例8.基因克隆试剂盒

本发明公开的基因克隆方法中的元件组成了基因克隆试剂盒。基因克隆试剂盒可用于高效克隆长度大于12Kb的DNA片段，并完成多DNA片段定向一步连接。

基因克隆试剂盒包括实施例4中描述的线性克隆载体pMD19GW-Adv.BstX-BstXI、切刻内切酶缓冲液、切刻内切酶Nb.BbvCI和连接酶。

Claims (32)

1.一种DNA片段克隆方法，所述方法包括：

a.获得带有粘性末端的DNA片段，其中所述DNA片段通过以下的步骤获得：

Ⅰ.使用一对引物扩增目的DNA片段，其中每一个引物由5’端额外碱基和一段与目的DNA片段特异互补的碱基组成，所述的额外碱基包括切刻内切酶识别位点和至少两个保护碱基；

Ⅱ.使用所述引物中切刻内切酶识别位点对应的切刻内切酶酶切步骤Ⅰ扩增的DNA片段；和

Ⅲ.变性去除酶切的单链结构；

b.将a中获得的DNA片段与克隆载体连接，所述克隆载体带有与所述DNA片段粘性末端互补的粘性末端，所述克隆载体由以下步骤获得：

Ⅰ.制备两端带有Ⅱ型限制性内切酶识别位点的间隔子序列；

Ⅱ.将Ⅰ中制备的间隔子序列添加到初始载体的克隆位点上，制备前克隆载体；和

Ⅲ.使用间隔子识别位点对应的Ⅱ型限制性内切酶酶切前克隆载体；和

c.将步骤b中的连接产物转化感受态细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，所述保护碱基的个数为2～10个，所述保护碱基添加在所述引物的5’末端。

3.根据权利要求1所述的方法，所述保护碱基为任意方式排列的A、G、C或T。

4.根据权利要求1所述的方法，所述的获得的DNA片段一端为粘性末端，另一端为平末端。

5.根据权利要求1所述的方法，所述获得的DNA片段两端均为粘性末端。

6.根据权利要求1所述的方法，所述一对引物对带有相同的切刻内切酶识别位点。

7.根据权利要求1所述的方法，所述一对引物对带有不同的切刻内切酶识别位点。

8.根据权利要求1所述的方法，所述切刻内切酶选自Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI或 Nt.CviPII。

9.根据权利要求8所述的方法，所述切刻内切酶是Nb.BbvCI。

10.根据权利要求1所述的方法，所述变性步骤包括65℃孵育5 min。

11. 根据权利要求1所述的方法，所述间隔子序列的长度至少为300 bp。

12.根据权利要求11所述的方法，所述间隔子是选择标记。

13.根据权利要求12所述的方法，所述选择标记是ccdB。

14.根据权利要求1所述的方法，所述间隔子序列两端的Ⅱ型限制性内切酶识别位点不同。

15.根据权利要求1所述的方法，所述间隔子序列两端的限制性内切酶的识别位点相同。

16.根据权利要求1所述的方法，初始载体选自PBR322载体、 PUC载体、PGEM载体、pBluescript载体、pMD19-T载体、pMD18-T载体、pMD19-T Simple载体或者pMD18-T Simple载体。

17.根据权利要求1所述的方法，所述的DNA片段长度大于12 Kb。

18.一种将多DNA片段一步定向克隆到载体中的方法，所述方法包括如下的步骤：

a.获得带有可变粘性末端的DNA片段，其中所述DNA片段通过以下的步骤获得：

Ⅰ.使用一对特异的引物扩增目的DNA片段，其中每一个引物带有5’端额外碱基和一段与目的DNA片段特异互补的碱基，所述的额外碱基包括切刻内切酶识别位点和至少两个保护碱基；

Ⅱ.使用与所述引物中识别位点对应的切刻内切酶酶切步骤Ⅰ扩增的DNA片段；和

Ⅲ.变性去除酶切单链结构；

其中，所述DNA片段的可变粘性末端通过改变添加在引物5’端保护碱基的个数和排列方式和/或通过改变切刻内切酶识别位点产生；

b.进行连接反应，使所述多个DNA片段相互连接并与克隆载体依赖粘性末端碱基配对定向连接，所述克隆载体通过以下步骤获得：

Ⅰ.制备两端带有Ⅱ型限制性内切酶识别位点的间隔子序列；

Ⅱ.将Ⅰ中制备的间隔子序列添加到初始载体的克隆位点上，制备前克隆载体；和

Ⅲ.使用间隔子序列中识别位点对应的Ⅱ型限制性内切酶酶切前克隆载体；

c.将步骤b中的连接产物转化感受态细胞。

19.根据权利要求18所述的方法，所述保护碱基的个数是2～10个。

20.根据权利要求18所述的方法，所述保护碱基是以任意方式排列的A、G、C或者T。

21.根据权利要求18所述的方法，每个目的DNA片段特异的引物带有相同的内切酶识别位点。

22.根据权利要求18所述的方法，每个目的DNA片段特异的引物带有不同的内切酶识别位点。

23.根据权利要求18所述的方法，所述切刻内切酶选自Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.BbvCI、Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI或Nt.CviPII。

24.根据权利要求23所述的方法，所述切刻内切酶是Nb.BbvCI。

25.根据权利要求18所述的方法，所述变性步骤包括65℃孵育5 min。

26.根据权利要求18所述的方法，所述间隔子序列的长度至少为300 bp。

27.根据权利要求26所述的方法，所述间隔子序列是选择标记。

28.根据权利要求27所述的方法，所述选择标记是ccdB。

29.根据权利要求18所述的方法，所述间隔子序列两端的为不同的Ⅱ型限制性内切酶识别位点。

30.根据权利要求18所述的方法，所述间隔子序列两端为相同的Ⅱ型限制性内切酶的识别位点。

31.根据权利要求18所述的方法，所述初始载体选自PBR322载体、 PUC载体、PGEM载体、pBluescript载体、pMD19-T载体、pMD18-T载体、pMD19-T Simple载体或者pMD18-T Simple载体。

32.根据权利要求18所述的方法，所述方法用于构建RNAi载体。

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