CN115896063A - 高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其制备方法及应用 - Google Patents

高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115896063A
CN115896063A CN202211668170.8A CN202211668170A CN115896063A CN 115896063 A CN115896063 A CN 115896063A CN 202211668170 A CN202211668170 A CN 202211668170A CN 115896063 A CN115896063 A CN 115896063A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna polymerase
pfu dna
fidelity
polymerase mutant
fidelity pfu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211668170.8A
Other languages
English (en)
Inventor
邓汉卿
向正威
陆青
燕东平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mona Wuhan Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Mona Wuhan Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mona Wuhan Biotechnology Co ltd filed Critical Mona Wuhan Biotechnology Co ltd
Priority to CN202211668170.8A priority Critical patent/CN115896063A/zh
Publication of CN115896063A publication Critical patent/CN115896063A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及聚合酶技术领域,具体涉及一种高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其制备方法及应用,该突变体是在野生型Pfu DNA聚合酶的基础上,进行如下位点中的一个或多个突变,其中突变的位点为V68A、A220V、L426R、T471S、R642K,得到的单突变及多突变,其保真度相对于野生型均得到了提高,且酶活与其相差不大。

Description

高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及聚合酶技术领域,具体涉及一种高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其制备方法及应用。
背景技术
随着分子生物学的发展,越来越多的分子生物学技术得到涌现,而作为分子生物学研究中不可或缺的技术手段-聚合酶链式反应(PCR)也得到了长足的发展,其可以快速、准确的得到大量的目的基因片段,同时在医学检测、病原微生物检测、法医学鉴定等诸多领域有着广泛的应用。
DNA聚合酶作为PCR反应的核心成分,其功能决定了PCR产物的各项性能,包括特异性、保真性以及产量。Pfu DNA聚合酶是在嗜热的古核生物火球菌属内发现的,一类能在活体内进行DNA复制的酶,是迄今为止最常见的高保真DNA聚合酶,该酶既具有5’-3’的聚合酶活性,又具有3’-5’的外切核酸酶活性,其中3’-5’外切核酸酶活性在聚合反应中可纠正错误掺入的碱基,降低PCR反应的错配突变几率,保真性更高,在分子克隆和DNA测序当中运用十分广泛。
但随着DNA测序技术以及NGS建库技术的不断发展,人们也不再止步于野生型PfuDNA酶的保真性,对DNA聚合酶的保真性提出了更高的要求。
发明内容
基于此,本发明的目的之一在于提供一种高保真Pfu DNA聚合酶突变体,其在野生型Pfu DNA聚合酶的基础上,进行如下位点中的一个或多个突变,其中突变的位点为V68A、A220V、L426R、T471S、R642K,野生型Pfu DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,得到的单突变及多突变,其保真度相对于野生型均得到了提高,且酶活与其相差不大。
SEQ ID NO:1:MILDVDYITEEGKPVIRLFKKENGKFKIEHDRTFRPYI YALLRDDSKIEEVKKITGERHGKIVRIVDVEKVEKKFLGKPITVWKLYLEHPQDVPTIREKVREHPAVVDIFEYDIPFAKRYLIDKGLIPMEGEEELKILAFDIETLYHEGEEFGKGPIIMISYADENEAKVITWKNIDLPYVEVVSSEREMIKRFLRIIREKDPDIIVTYNGDSFDFPYLAKRAEKLGIKLTIGRDGSEPKMQRIGDMTAVEVKGRIHFDLYHVITRTINLPTYTLEAVYEAIFGKPKEKVYADEIAKAWESGENLERVAKYSMEDAKATYELGKEFLPMEIQLSRLVGQPLWDVSRSSTGNLVEWFLLRKAYERNEVAPNKPSEEEYQRRLRESYTGGFVKEPEKGLWENIVYLDFRALYPSIIITHNVSPDTLNLEGCKNYDIAPQVGHKFCKDIPGFIPSLLGHLLEERQKIKTKMKETQDPIEKILLDYRQKAIKLLANSFYGYYGYAKARWYCKECAESVTAWGRKYIELVWKELEEKFGFKVLYIDTDGLYATIPGGESEEIKKKALEFVKYINSKLPGLLELEYEGFYKRGFFVTKKRYAVIDEEGKVITRGLEIVRRDWSEIAKETQARVLETILKHGDVEEAVRIVKEVIQKLANYEIPPEKLAIYEQITRPLHEYKAIGPHVAVAKKLAAKGVKIKPGMVIGYIVLRGDGPISNRAILAEEYDPKKHKYDAEYYIENQVLPAVLRILEGFGYRKEDLRYQKTRQVGLTSWLNIKKSGTGGGGATVKFKYKGEEKEVDISKIKKVWRVGKMISFTYDEGGGKTGRGAVSEKDAPKELLQMLEKQKK。
优选的,其在野生型Pfu DNA聚合酶的基础上,进行如下五个位点的突变,其中五个突变位点为V68A、A220V、L426R、T471S、R642K,氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,该突变型酶的保真效果最佳。
SEQ ID NO:2:MILDVDYITEEGKPVIRLFKKENGKFKIEHDRTFRPYI YALLRDDSKIEEVKKITGERHGKIVRIVDAEKVEKKFLGKPITVWKLYLEHPQDVPTIREKVREHPAVVDIFEYDIPFAKRYLIDKGLIPMEGEEELKILAFDIETLYHEGEEFGKGPIIMISYADENEAKVITWKNIDLPYVEVVSSEREMIKRFLRIIREKDPDIIVTYNGDSFDFPYLVKRAEKLGIKLTIGRDGSEPKMQRIGDMTAVEVKGRIHFDLYHVITRTINLPTYTLEAVYEAIFGKPKEKVYADEIAKAWESGENLERVAKYSMEDAKATYELGKEFLPMEIQLSRLVGQPLWDVSRSSTGNLVEWFLLRKAYERNEVAPNKPSEEEYQRRLRESYTGGFVKEPEKGLWENIVYLDFRALYPSIIITHNVSPDTLNREGCKNYDIAPQVGHKFCKDIPGFIPSLLGHLLEERQKIKTKMKESQDPIEKILLDYRQKAIKLLANSFYGYYGYAKARWYCKECAESVTAWGRKYIELVWKELEEKFGFKVLYIDTDGLYATIPGGESEEIKKKALEFVKYINSKLPGLLELEYEGFYKRGFFVTKKRYAVIDEEGKVITRGLEIVRRDWSEIAKETQARVLETILKHGDVEEAVKIVKEVIQKLANYEIPPEKLAIYEQITRPLHEYKAIGPHVAVAKKLAAKGVKIKPGMVIGYIVLRGDGPISNRAILAEEYDPKKHKYDAEYYIENQVLPAVLRILEGFGYRKEDLRYQKTRQVGLTSWLNIKKSGTGGGGATVKFKYKGEEKEVDISKIKKVWRVGKMISFTYDEGGGKTGRGAVSEKDAPKELLQMLEKQKK。
本发明的目的之二在于保护编码上述高保真Pfu DNA聚合酶突变体的核苷酸。其中,五突变的核苷酸的序列如SEQ ID NO:3所示。该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列,能显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。
SEQ ID NO:3:ATGATCCTGGACGTTGACTACATCACCGAAGAAGG TAAACCGGTTATCCGTCTGTTCAAAAAAGAAAACGGTAAATTCAAAATCGAACACGACCGTACCTTCCGTCCGTACATCTACGCGCTGCTGCGTGACGACTCTAAAATCGAAGAAGTTAAAAAAATCACCGGTGAACGTCACGGTAAAATCGTTCGTATCGTTGACGCGGAAAAAGTTGAAAAAAAATTCCTGGGTAAACCGATCACCGTTTGGAAACTGTACCTGGAACACCCGCAGGACGTTCCGACCATCCGTGAAAAAGTTCGTGAACACCCGGCGGTTGTTGACATCTTCGAATACGACATCCCGTTCGCGAAACGTTACCTGATCGACAAAGGTCTGATCCCGATGGAAGGTGAAGAAGAACTGAAAATCCTGGCGTTCGACATCGAAACCCTGTACCACGAAGGTGAAGAATTCGGTAAAGGTCCGATCATCATGATCTCTTACGCGGACGAAAACGAAGCGAAAGTTATCACCTGGAAAAACATCGACCTGCCGTACGTTGAAGTTGTTTCTTCTGAACGTGAAATGATCAAACGTTTCCTGCGTATCATCCGTGAAAAAGACCCGGACATCATCGTTACCTACAACGGTGACTCTTTCGACTTCCCGTACCTGGTTAAACGTGCGGAAAAACTGGGTATCAAACTGACCATCGGTCGTGACGGTTCTGAACCGAAAATGCAGCGTATCGGTGACATGACCGCGGTTGAAGTTAAAGGTCGTATCCACTTCGACCTGTACCACGTTATCACCCGTACCATCAACCTGCCGACCTACACCCTGGAAGCGGTTTACGAAGCGATCTTCGGTAAACCGAAAGAAAAAGTTTACGCGGACGAAATCGCGAAAGCGTGGGAATCTGGTGAAAACCTGGAACGTGTTGCGAAATACTCTATGGAAGACGCGAAAGCGACCTACGAACTGGGTAAAGAATTCCTGCCGATGGAAATCCAGCTGTCTCGTCTGGTTGGTCAGCCGCTGTGGGACGTTTCTCGTTCTTCTACCGGTAACCTGGTTGAATGGTTCCTGCTGCGTAAAGCGTACGAACGTAACGAAGTTGCGCCGAACAAACCGTCTGAAGAAGAATACCAGCGTCGTCTGCGTGAATCTTACACCGGTGGTTTCGTTAAAGAACCGGAAAAAGGTCTGTGGGAAAACATCGTTTACCTGGACTTCCGTGCGCTGTACCCGTCTATCATCATCACCCACAACGTTTCTCCGGACACCCTGAACCGTGAAGGTTGCAAAAACTACGACATCGCGCCGCAGGTTGGTCACAAATTCTGCAAAGACATCCCGGGTTTCATCCCGTCTCTGCTGGGTCACCTGCTGGAAGAACGTCAGAAAATCAAAACCAAAATGAAAGAATCTCAGGACCCGATCGAAAAAATCCTGCTGGACTACCGTCAGAAAGCGATCAAACTGCTGGCGAACTCTTTCTACGGTTACTACGGTTACGCGAAAGCGCGTTGGTACTGCAAAGAATGCGCGGAATCTGTTACCGCGTGGGGTCGTAAATACATCGAACTGGTTTGGAAAGAACTGGAAGAAAAATTCGGTTTCAAAGTTCTGTACATCGACACCGACGGTCTGTACGCGACCATCCCGGGTGGTGAATCTGAAGAAATCAAAAAAAAAGCGCTGGAATTCGTTAAATACATCAACTCTAAACTGCCGGGTCTGCTGGAACTGGAATACGAAGGTTTCTACAAACGTGGTTTCTTCGTTACCAAAAAACGTTACGCGGTTATCGACGAAGAAGGTAAAGTTATCACCCGTGGTCTGGAAATCGTTCGTCGTGACTGGTCTGAAATCGCGAAAGAAACCCAGGCGCGTGTTCTGGAAACCATCCTGAAACACGGTGACGTTGAAGAAGCGGTTAAAATCGTTAAAGAAGTTATCCAGAAACTGGCGAACTACGAAATCCCGCCGGAAAAACTGGCGATCTACGAACAGATCACCCGTCCGCTGCACGAATACAAAGCGATCGGTCCGCACGTTGCGGTTGCGAAAAAACTGGCGGCGAAAGGTGTTAAAATCAAACCGGGTATGGTTATCGGTTACATCGTTCTGCGTGGTGACGGTCCGATCTCTAACCGTGCGATCCTGGCGGAAGAATACGACCCGAAAAAACACAAATACGACGCGGAATACTACATCGAAAACCAGGTTCTGCCGGCGGTTCTGCGTATCCTGGAAGGTTTCGGTTACCGTAAAGAAGACCTGCGTTACCAGAAAACCCGTCAGGTTGGTCTGACCTCTTGGCTGAACATCAAAAAATCTGGTACCGGTGGTGGTGGTGCGACCGTTAAATTCAAATACAAAGGTGAAGAAAAAGAAGTTGACATCTCTAAAATCAAAAAAGTTTGGCGTGTTGGTAAAATGATCTCTTTCACCTACGACGAAGGTGGTGGTAAAACCGGTCGTGGTGCGGTTTCTGAAAAAGACGCGCCGAAAGAACTGCTGCAGATGCTGGAAAAACAGAAAAAATGA。
本发明的目的之三在于保护能够表达上述高保真Pfu DNA聚合酶的重组表达载体、工程细胞。
本发明的目的之四在于保护上述Pfu DNA聚合酶突变体、重组表达载体、工程细胞在制备分子检测试剂盒中的应用。
本发明的目的之五在于保护上述高保真Pfu DNA聚合酶突变体的制备方法,包括以下步骤:
人工合成上述高保真Pfu DNA聚合酶突变体的核苷酸序列,并将其连接到表达载体中获得重组表达载体,将所述重组表达载体转化到宿主细胞中得到基因工程菌,诱导表达、收集菌体、分离纯化即得。
优选的,所述表达载体为pET28a。
优选的,所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
具体的,分离纯化的方法如下:将收集的菌体裂解破碎并沉淀得到粗酶样品,粗酶样品再依次经过Ni亲和层析、阳离子交换层析和透析处理后即得。
优选的,Ni亲和层析洗脱液为:10~20mM Tris-HCl,50~1000mM NaCl,0~500mM咪唑和5%~15%甘油。
优选的,阳离子交换层析缓冲液为:10~20mM Tris-HCl,0.1~0.2mM EDTA,1~2mM DTT和0~1000mM NaCl,5%~15%甘油。
优选的,透析处理时所用的透析缓冲液为:10~20mM Tris-HCl,100~200mMNaCl,0.1~0.2mM EDTA,1~2mM DTT和50%甘油。
优选的,收集的菌体裂解破碎并沉淀得到粗酶样品的方法如下:用裂解缓冲液重悬菌体,并采用细胞高压破碎仪进行破碎,收集上清,上清经PEI处理和硫酸铵沉淀并复溶,得粗酶样品。
优选的,裂解缓冲液为:10~20mM Tris-HCl,50~250mM NaCl,5~15mM咪唑和5%~15%甘油。
本发明通过对C末端融合了双链DNA结合蛋白的野生型Pfu DNA的多位点氨基酸进行突变改造,得到了多个酶活性好、保真度高的突变型Pfu DNA聚合酶,适用于DNA测序技术以及NGS建库技术等。
通过对含有突变型Pfu DNA聚合酶核酸序列的重组工程菌进行诱导培养,裂解菌体经PEI处理和硫酸铵沉淀并复溶后得到粗产物,采用Ni亲和层析、CM阳离子交换层析和透析相结合的纯化方法,得到纯度达到95%的突变型Pfu DNA聚合酶,满足各场景对聚合酶的纯度要求。
附图说明
图1为本发明实施例2中涉及到的pET 28a-Pfu DNA聚合酶重组表达载体的图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明,以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例,仅用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下,所获得的其他所有实施例,都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中,若无特殊说明,所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品;在本发明实施例中,若未具体指明,所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
对如SEQ ID NO:1所示的C末端融合了双链DNA结合蛋白的野生型Pfu DNA的氨基酸序列进行突变改造,筛选得到了16个突变体,其中7个单突变体、6个双突变体、4个三突变体和1个五突变体,该16个突变体在保证性上均有不同程度的改善,其中五突变体保真性最高,突变位点为V68A,A220V,L426R,T471S,R642K,氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,各突变体的突变具体信息如下表1:
表1各突变体的突变信息
Figure BDA0004015353700000081
实施例2
本实施例以五突变为例,提供上述突变型Pfu DNA聚合酶的制备方法,包括以下步骤:
(1)重组工程菌株的构建
人工合成编码五突变突变型Pfu DNA聚合酶的DNA分子,其碱基序列如SEQ ID NO:3所示,该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列,能够显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。
采用基因工程技术,将SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列克隆到带有His标签的pET28a载体的NcoⅠ和HindⅢ酶切位点中,如图1所示,构建得到含有突变型Pfu DNA聚合酶基因的表达载体,测序验证后将重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,得到重组工程菌,并于-80℃环境中保存在30%甘油中备用。
(2)重组工程菌株的诱导培养
将构建的重组工程菌在带有50μg/mL卡那霉素的LB平板进行三区划线,倒置于37℃培养箱过夜活化培养,挑取1个单菌落接种至10mL已加入50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体一级种子液,37℃培养4~5h,待菌液OD600值在0.5~1之间时,按照接种比1:100接种至500mL已加入抗性的LB液体发酵培养基中,37℃扩大培养4~5h,待菌液OD600值在0.6~0.8之间时,加入终浓度0.5mM IPTG诱导剂,25℃过夜诱导16h后收集菌体,将菌液在7500g、4℃下离心15min后,倒掉上清,收集菌体即为完成表达后的菌体。
(3)突变型Pfu DNA聚合酶的前处理
将收集到的菌体按质量体积1:10的比例加入裂解缓冲液进行重悬,采用细胞高压破碎仪对重悬液进行破碎,破碎压力为900bar,4℃破碎循环4次,水浴锅提前打开,将裂解液75℃水浴20min后,在4℃下以35000g离心30min,收集上清,向上清中缓慢加入终浓度0.1%的PEI试剂,边加边搅拌,冰上静置30min后12000g、4℃离心10min,取上清缓慢加入终浓度30%硫酸铵,边加边搅拌,冰上静置60min后,4℃、20000g离心30min,收集沉淀并加入一定量裂解缓冲液复溶沉淀,得到粗酶样品。
其中,裂解缓冲液为:20mM Tris-HCl,250mM NaCl,5mM咪唑,5%甘油,pH8.0,25℃。
(4)突变型Pfu DNA聚合酶的纯化
将粗酶样品使用0.45μm滤膜过滤后进行Ni亲和层析,缓慢上样汇研生物Ni FF(IMAC)后,先使用50mM咪唑洗脱去除杂蛋白,然后使用300mM咪唑洗脱出目的蛋白,然后向Ni柱洗脱液中加入低盐缓冲液,将溶液电导稀释至5mS/cm后上样苏州纳微科技UniGel30CM柱,随后用50mM~1000mM的NaCl梯度洗脱纳微UniGel 30CM 10个体积,分管收集洗脱液,经SDS-PAGE凝胶电泳分析后,收集含有Pfu DNA聚合酶的洗脱液;将含有Pfu DNA聚合酶的洗脱液在透析缓冲液中透析,用的透析袋大小为30KDa,洗脱液与透析缓冲液的体积比为1:100,透析条件为4℃、200rpm下透析16h,补加0.1% NP-40和0.5mM PMSF聚合酶(购自默克sigma aldrich试剂公司),最后将原酶液放置于-20℃保存备用。
其中,Ni亲和层析时,去除杂蛋白所用的洗脱液为:20mM Tris-HCl,250mM NaCl,50mM咪唑,5%甘油,pH8.0,25℃。
洗脱目的蛋白所用的洗脱液为:20mM Tris-HCl,250mM NaCl,300mM咪唑5%甘油,pH8.0,25℃。
低盐缓冲液为:20mM Tris-HCl,1mM DTT,0.1mM EDTA,5%甘油,pH8.0,25℃。
阳离子交换层析时所用的洗脱液为:20mM Tris-HCl,0.1mM EDTA,1mM DTT和50mM~1000mM NaCl,5%甘油;
透析缓冲液为:20mM Tris-HCl,200mM NaCl,1mM DTT,0.1mM EDTA,50%甘油,pH8.0。
实施例3突变型Pfu DNA聚合酶酶活的测试
突变型Pfu DNA聚合酶酶活测试参考国家标准进行,将透析后的原酶进行梯度稀释,然后加入带有发卡结构的底物T2以及反应辅料进行扩增,得到相应的荧光曲线,并根据Lamda DNA的标准曲线进行酶活计算,结果如下表2所示:
表2野生型和突变型Pfu DNA聚合酶酶活测试结果
Figure BDA0004015353700000101
Figure BDA0004015353700000111
由表2可知,在V68A,A220V,L426R,T471S,R642K五个位点发生单突变或多突变,聚合酶的酶活并不会发生显著下降,相反有的还有很大的提高。
实施例4突变型Pfu DNA聚合酶保真性的测试
基于lacZ的蓝白斑筛选对聚合酶的保真性进行测试,具体方案如下:首先以质粒pUC19为模板,通过引物对lacZ-BF/BR扩增得到pUC 19-lacZ骨架,然后使用不同突变型Pfu-DNA聚合酶扩增lacZ片段,扩增引物为lacZ-F/R,最后通过无缝克隆将片段lacZ和骨架pUC19-lacZ连接起来,转入TOP10感受态细胞,孵育后涂布于含有相应的抗性蓝白斑筛选平皿,计算白斑与蓝斑的数量,然后按照如下公式进行计算:
Figure BDA0004015353700000112
其中,F表示蓝斑(Lac+)比例;500是lacZ基因中显性突变位点估值(参考文献:Thefidefity of Taq polymerase catalyzing PCR is improved by an N-terminaldeletion.Gene,112(1992)29-35);E表示在每个碱基整合过程中聚合酶错误率;m表示PCR实际循环数,根据最后一个循环发生的错误相对WT为隐性,因而采用m-1。
lacZ-BF:CATTAATTGCGTTGCGCTCACTG(SEQ ID NO:4);
lacZ-BR:CGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTC(SEQ ID NO:5);
lacZ-F:CACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGC(SEQ ID NO:6);
lacZ-R:GAGCGCAACGCAATTAATGTGAGT(SEQ ID NO:7)。
使用qPCR估计lacZ引物扩增效率,将pUC19质粒进行10倍梯度稀释,从0.01ng开始,进行qPCR,将Ct值与稀释倍数作图,得到斜率P,计算扩增效率K=10^(-1/P),根据实验中lacZ引物在各反应体系中扩增效率,计算LacZ PCR扩增倍数m,2^m=K^30,最后公式计算出错误率E。具体的结果如下表3所示:
表3各Pfu DNA聚合酶突变体相关计算数据
Figure BDA0004015353700000121
Figure BDA0004015353700000131
由上表3可以看出,在V68A,A220V,L426R,T471S,R642K五个位点发生单突变或多突变,聚合酶的保真度均会得到提高,其中,尤以五突变的效果最佳。
在此有必要指出的是,以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明,并不是对本发明的技术方案的进一步的限制,本发明的方法仅为较佳的实施方案,并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高保真Pfu DNA聚合酶突变体,其特征在于,在野生型Pfu DNA聚合酶的基础上,进行如下位点中的一个或多个突变,其中突变的位点为V68A、A220V、L426R、T471S、R642K,野生型Pfu DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体,其特征在于,在野生型Pfu DNA聚合酶的基础上,进行如下五个位点的突变,其中五个突变位点为V68A、A220V、L426R、T471S、R642K,氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
3.编码权利要求2所述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体的核苷酸。
4.能够表达权利要求1所述的高保真Pfu DNA聚合酶的重组表达载体、工程细胞。
5.权利要求1所述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体、权利要求4所述的重组表达载体、工程细胞在制备分子检测试剂盒中的应用。
6.权利要求1所述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
人工合成权利要求1所述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体的核苷酸序列,将其连接到表达载体中获得重组表达载体,将所述重组表达载体转化到宿主细胞中得到基因工程菌,诱导表达、收集菌体、分离纯化即得。
7.根据权利要求6所述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体的制备方法,其特征在于,所述表达载体为pET28a。
8.根据权利要求6所述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体的制备方法,其特征在于,所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
9.根据权利要求6所述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体的制备方法,其特征在于,分离纯化的方法如下:
将收集的菌体裂解破碎并沉淀得到粗酶样品,粗酶样品再依次经过Ni亲和层析、阳离子交换层析和透析处理后即得。
10.根据权利要求6或9所述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体的制备方法,其特征在于,收集的菌体裂解破碎并沉淀得到粗酶样品的方法如下:
用裂解缓冲液重悬菌体,并采用细胞高压破碎仪进行破碎,收集上清,上清经PEI处理和硫酸铵沉淀并复溶,得粗酶样品。
CN202211668170.8A 2022-12-23 2022-12-23 高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其制备方法及应用 Pending CN115896063A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211668170.8A CN115896063A (zh) 2022-12-23 2022-12-23 高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211668170.8A CN115896063A (zh) 2022-12-23 2022-12-23 高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其制备方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115896063A true CN115896063A (zh) 2023-04-04

Family

ID=86472694

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211668170.8A Pending CN115896063A (zh) 2022-12-23 2022-12-23 高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115896063A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116497003A (zh) * 2023-06-29 2023-07-28 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 一种从溶液中纯化目标蛋白的方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116497003A (zh) * 2023-06-29 2023-07-28 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 一种从溶液中纯化目标蛋白的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113136374B (zh) 一种重组突变型Tn5转座酶的制备及应用
WO2022228351A1 (zh) 一种新型高温Argonaute蛋白TpsAgo表征及应用
WO2021184766A1 (zh) 一种基因表达组件及其构建的克隆载体和应用
CN117660399A (zh) 具有高扩增活性的耐热dna聚合酶突变体
CN115896063A (zh) 高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其制备方法及应用
CN114107252B (zh) CL7蛋白质、高活性重组TET酶CL7-NgTET1、其原核表达载体及应用
EP3105254B1 (en) Hybrid proteins and uses thereof
CN114262697B (zh) 融合Bsu DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶突变体及其基因、质粒、基因工程菌
CN106754816B (zh) 一种高保真快速扩增融合酶及其制备方法
CN114807085B (zh) 一种Taq酶突变体及其应用
CN115785283B (zh) PAG-Tn5突变体及其应用
CN114230644A (zh) 一种gp32蛋白突变体、重组载体及其构建方法和应用
CN114645033B (zh) 一种三磷酸核苷水解酶及其纯化方法和应用
WO2021127848A1 (zh) 嵌合dna聚合酶及其应用
CN117187210B (zh) 一种突变型Bst DNA聚合酶大片段及其制备方法
WO2023098036A1 (zh) Taq酶突变体、其制备方法和应用
Komatsu et al. Involvement of the response regulator CtrA in the extracellular DNA production of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum
WO2022210748A1 (ja) 新規なガイドrnaとの複合体形成能を有するポリペプチド
CN115873811B (zh) 一种pbcv-1连接酶突变体、表达纯化方法及应用
US11697805B2 (en) High-fidelity polymerase with preference for gapped DNA and use thereof
CN113151213B (zh) 一种高忠实性dna聚合酶及其制备方法和pcr应用
WO2023098035A1 (zh) Taq酶突变体及其制备方法和用途
WO2015075842A1 (ja) 変異型逆転写酵素
CN114085822A (zh) 一种NGS核心酶Klenow片段的诱导纯化及质控方法
CN117431232A (zh) 重组Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination