CN115896063A - 高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及聚合酶技术领域，具体涉及一种高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其制备方法及应用，该突变体是在野生型Pfu DNA聚合酶的基础上，进行如下位点中的一个或多个突变，其中突变的位点为V68A、A220V、L426R、T471S、R642K，得到的单突变及多突变，其保真度相对于野生型均得到了提高，且酶活与其相差不大。

Description

高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及聚合酶技术领域，具体涉及一种高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其制备方法及应用。

背景技术

随着分子生物学的发展，越来越多的分子生物学技术得到涌现，而作为分子生物学研究中不可或缺的技术手段-聚合酶链式反应(PCR)也得到了长足的发展，其可以快速、准确的得到大量的目的基因片段，同时在医学检测、病原微生物检测、法医学鉴定等诸多领域有着广泛的应用。

DNA聚合酶作为PCR反应的核心成分，其功能决定了PCR产物的各项性能，包括特异性、保真性以及产量。Pfu DNA聚合酶是在嗜热的古核生物火球菌属内发现的，一类能在活体内进行DNA复制的酶，是迄今为止最常见的高保真DNA聚合酶，该酶既具有5’-3’的聚合酶活性，又具有3’-5’的外切核酸酶活性，其中3’-5’外切核酸酶活性在聚合反应中可纠正错误掺入的碱基，降低PCR反应的错配突变几率，保真性更高，在分子克隆和DNA测序当中运用十分广泛。

但随着DNA测序技术以及NGS建库技术的不断发展，人们也不再止步于野生型PfuDNA酶的保真性，对DNA聚合酶的保真性提出了更高的要求。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种高保真Pfu DNA聚合酶突变体，其在野生型Pfu DNA聚合酶的基础上，进行如下位点中的一个或多个突变，其中突变的位点为V68A、A220V、L426R、T471S、R642K，野生型Pfu DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，得到的单突变及多突变，其保真度相对于野生型均得到了提高，且酶活与其相差不大。

SEQ ID NO:1：MILDVDYITEEGKPVIRLFKKENGKFKIEHDRTFRPYI YALLRDDSKIEEVKKITGERHGKIVRIVDVEKVEKKFLGKPITVWKLYLEHPQDVPTIREKVREHPAVVDIFEYDIPFAKRYLIDKGLIPMEGEEELKILAFDIETLYHEGEEFGKGPIIMISYADENEAKVITWKNIDLPYVEVVSSEREMIKRFLRIIREKDPDIIVTYNGDSFDFPYLAKRAEKLGIKLTIGRDGSEPKMQRIGDMTAVEVKGRIHFDLYHVITRTINLPTYTLEAVYEAIFGKPKEKVYADEIAKAWESGENLERVAKYSMEDAKATYELGKEFLPMEIQLSRLVGQPLWDVSRSSTGNLVEWFLLRKAYERNEVAPNKPSEEEYQRRLRESYTGGFVKEPEKGLWENIVYLDFRALYPSIIITHNVSPDTLNLEGCKNYDIAPQVGHKFCKDIPGFIPSLLGHLLEERQKIKTKMKETQDPIEKILLDYRQKAIKLLANSFYGYYGYAKARWYCKECAESVTAWGRKYIELVWKELEEKFGFKVLYIDTDGLYATIPGGESEEIKKKALEFVKYINSKLPGLLELEYEGFYKRGFFVTKKRYAVIDEEGKVITRGLEIVRRDWSEIAKETQARVLETILKHGDVEEAVRIVKEVIQKLANYEIPPEKLAIYEQITRPLHEYKAIGPHVAVAKKLAAKGVKIKPGMVIGYIVLRGDGPISNRAILAEEYDPKKHKYDAEYYIENQVLPAVLRILEGFGYRKEDLRYQKTRQVGLTSWLNIKKSGTGGGGATVKFKYKGEEKEVDISKIKKVWRVGKMISFTYDEGGGKTGRGAVSEKDAPKELLQMLEKQKK。

优选的，其在野生型Pfu DNA聚合酶的基础上，进行如下五个位点的突变，其中五个突变位点为V68A、A220V、L426R、T471S、R642K，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，该突变型酶的保真效果最佳。

SEQ ID NO:2：MILDVDYITEEGKPVIRLFKKENGKFKIEHDRTFRPYI YALLRDDSKIEEVKKITGERHGKIVRIVDAEKVEKKFLGKPITVWKLYLEHPQDVPTIREKVREHPAVVDIFEYDIPFAKRYLIDKGLIPMEGEEELKILAFDIETLYHEGEEFGKGPIIMISYADENEAKVITWKNIDLPYVEVVSSEREMIKRFLRIIREKDPDIIVTYNGDSFDFPYLVKRAEKLGIKLTIGRDGSEPKMQRIGDMTAVEVKGRIHFDLYHVITRTINLPTYTLEAVYEAIFGKPKEKVYADEIAKAWESGENLERVAKYSMEDAKATYELGKEFLPMEIQLSRLVGQPLWDVSRSSTGNLVEWFLLRKAYERNEVAPNKPSEEEYQRRLRESYTGGFVKEPEKGLWENIVYLDFRALYPSIIITHNVSPDTLNREGCKNYDIAPQVGHKFCKDIPGFIPSLLGHLLEERQKIKTKMKESQDPIEKILLDYRQKAIKLLANSFYGYYGYAKARWYCKECAESVTAWGRKYIELVWKELEEKFGFKVLYIDTDGLYATIPGGESEEIKKKALEFVKYINSKLPGLLELEYEGFYKRGFFVTKKRYAVIDEEGKVITRGLEIVRRDWSEIAKETQARVLETILKHGDVEEAVKIVKEVIQKLANYEIPPEKLAIYEQITRPLHEYKAIGPHVAVAKKLAAKGVKIKPGMVIGYIVLRGDGPISNRAILAEEYDPKKHKYDAEYYIENQVLPAVLRILEGFGYRKEDLRYQKTRQVGLTSWLNIKKSGTGGGGATVKFKYKGEEKEVDISKIKKVWRVGKMISFTYDEGGGKTGRGAVSEKDAPKELLQMLEKQKK。

本发明的目的之二在于保护编码上述高保真Pfu DNA聚合酶突变体的核苷酸。其中，五突变的核苷酸的序列如SEQ ID NO:3所示。该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列，能显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。

SEQ ID NO:3：ATGATCCTGGACGTTGACTACATCACCGAAGAAGG TAAACCGGTTATCCGTCTGTTCAAAAAAGAAAACGGTAAATTCAAAATCGAACACGACCGTACCTTCCGTCCGTACATCTACGCGCTGCTGCGTGACGACTCTAAAATCGAAGAAGTTAAAAAAATCACCGGTGAACGTCACGGTAAAATCGTTCGTATCGTTGACGCGGAAAAAGTTGAAAAAAAATTCCTGGGTAAACCGATCACCGTTTGGAAACTGTACCTGGAACACCCGCAGGACGTTCCGACCATCCGTGAAAAAGTTCGTGAACACCCGGCGGTTGTTGACATCTTCGAATACGACATCCCGTTCGCGAAACGTTACCTGATCGACAAAGGTCTGATCCCGATGGAAGGTGAAGAAGAACTGAAAATCCTGGCGTTCGACATCGAAACCCTGTACCACGAAGGTGAAGAATTCGGTAAAGGTCCGATCATCATGATCTCTTACGCGGACGAAAACGAAGCGAAAGTTATCACCTGGAAAAACATCGACCTGCCGTACGTTGAAGTTGTTTCTTCTGAACGTGAAATGATCAAACGTTTCCTGCGTATCATCCGTGAAAAAGACCCGGACATCATCGTTACCTACAACGGTGACTCTTTCGACTTCCCGTACCTGGTTAAACGTGCGGAAAAACTGGGTATCAAACTGACCATCGGTCGTGACGGTTCTGAACCGAAAATGCAGCGTATCGGTGACATGACCGCGGTTGAAGTTAAAGGTCGTATCCACTTCGACCTGTACCACGTTATCACCCGTACCATCAACCTGCCGACCTACACCCTGGAAGCGGTTTACGAAGCGATCTTCGGTAAACCGAAAGAAAAAGTTTACGCGGACGAAATCGCGAAAGCGTGGGAATCTGGTGAAAACCTGGAACGTGTTGCGAAATACTCTATGGAAGACGCGAAAGCGACCTACGAACTGGGTAAAGAATTCCTGCCGATGGAAATCCAGCTGTCTCGTCTGGTTGGTCAGCCGCTGTGGGACGTTTCTCGTTCTTCTACCGGTAACCTGGTTGAATGGTTCCTGCTGCGTAAAGCGTACGAACGTAACGAAGTTGCGCCGAACAAACCGTCTGAAGAAGAATACCAGCGTCGTCTGCGTGAATCTTACACCGGTGGTTTCGTTAAAGAACCGGAAAAAGGTCTGTGGGAAAACATCGTTTACCTGGACTTCCGTGCGCTGTACCCGTCTATCATCATCACCCACAACGTTTCTCCGGACACCCTGAACCGTGAAGGTTGCAAAAACTACGACATCGCGCCGCAGGTTGGTCACAAATTCTGCAAAGACATCCCGGGTTTCATCCCGTCTCTGCTGGGTCACCTGCTGGAAGAACGTCAGAAAATCAAAACCAAAATGAAAGAATCTCAGGACCCGATCGAAAAAATCCTGCTGGACTACCGTCAGAAAGCGATCAAACTGCTGGCGAACTCTTTCTACGGTTACTACGGTTACGCGAAAGCGCGTTGGTACTGCAAAGAATGCGCGGAATCTGTTACCGCGTGGGGTCGTAAATACATCGAACTGGTTTGGAAAGAACTGGAAGAAAAATTCGGTTTCAAAGTTCTGTACATCGACACCGACGGTCTGTACGCGACCATCCCGGGTGGTGAATCTGAAGAAATCAAAAAAAAAGCGCTGGAATTCGTTAAATACATCAACTCTAAACTGCCGGGTCTGCTGGAACTGGAATACGAAGGTTTCTACAAACGTGGTTTCTTCGTTACCAAAAAACGTTACGCGGTTATCGACGAAGAAGGTAAAGTTATCACCCGTGGTCTGGAAATCGTTCGTCGTGACTGGTCTGAAATCGCGAAAGAAACCCAGGCGCGTGTTCTGGAAACCATCCTGAAACACGGTGACGTTGAAGAAGCGGTTAAAATCGTTAAAGAAGTTATCCAGAAACTGGCGAACTACGAAATCCCGCCGGAAAAACTGGCGATCTACGAACAGATCACCCGTCCGCTGCACGAATACAAAGCGATCGGTCCGCACGTTGCGGTTGCGAAAAAACTGGCGGCGAAAGGTGTTAAAATCAAACCGGGTATGGTTATCGGTTACATCGTTCTGCGTGGTGACGGTCCGATCTCTAACCGTGCGATCCTGGCGGAAGAATACGACCCGAAAAAACACAAATACGACGCGGAATACTACATCGAAAACCAGGTTCTGCCGGCGGTTCTGCGTATCCTGGAAGGTTTCGGTTACCGTAAAGAAGACCTGCGTTACCAGAAAACCCGTCAGGTTGGTCTGACCTCTTGGCTGAACATCAAAAAATCTGGTACCGGTGGTGGTGGTGCGACCGTTAAATTCAAATACAAAGGTGAAGAAAAAGAAGTTGACATCTCTAAAATCAAAAAAGTTTGGCGTGTTGGTAAAATGATCTCTTTCACCTACGACGAAGGTGGTGGTAAAACCGGTCGTGGTGCGGTTTCTGAAAAAGACGCGCCGAAAGAACTGCTGCAGATGCTGGAAAAACAGAAAAAATGA。

本发明的目的之三在于保护能够表达上述高保真Pfu DNA聚合酶的重组表达载体、工程细胞。

本发明的目的之四在于保护上述Pfu DNA聚合酶突变体、重组表达载体、工程细胞在制备分子检测试剂盒中的应用。

本发明的目的之五在于保护上述高保真Pfu DNA聚合酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

人工合成上述高保真Pfu DNA聚合酶突变体的核苷酸序列，并将其连接到表达载体中获得重组表达载体，将所述重组表达载体转化到宿主细胞中得到基因工程菌，诱导表达、收集菌体、分离纯化即得。

优选的，所述表达载体为pET28a。

优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

具体的，分离纯化的方法如下：将收集的菌体裂解破碎并沉淀得到粗酶样品，粗酶样品再依次经过Ni亲和层析、阳离子交换层析和透析处理后即得。

优选的，Ni亲和层析洗脱液为：10～20mM Tris-HCl，50～1000mM NaCl，0～500mM咪唑和5％～15％甘油。

优选的，阳离子交换层析缓冲液为：10～20mM Tris-HCl，0.1～0.2mM EDTA，1～2mM DTT和0～1000mM NaCl，5％～15％甘油。

优选的，透析处理时所用的透析缓冲液为：10～20mM Tris-HCl，100～200mMNaCl，0.1～0.2mM EDTA，1～2mM DTT和50％甘油。

优选的，收集的菌体裂解破碎并沉淀得到粗酶样品的方法如下：用裂解缓冲液重悬菌体，并采用细胞高压破碎仪进行破碎，收集上清，上清经PEI处理和硫酸铵沉淀并复溶，得粗酶样品。

优选的，裂解缓冲液为：10～20mM Tris-HCl，50～250mM NaCl，5～15mM咪唑和5％～15％甘油。

本发明通过对C末端融合了双链DNA结合蛋白的野生型Pfu DNA的多位点氨基酸进行突变改造，得到了多个酶活性好、保真度高的突变型Pfu DNA聚合酶，适用于DNA测序技术以及NGS建库技术等。

通过对含有突变型Pfu DNA聚合酶核酸序列的重组工程菌进行诱导培养，裂解菌体经PEI处理和硫酸铵沉淀并复溶后得到粗产物，采用Ni亲和层析、CM阳离子交换层析和透析相结合的纯化方法，得到纯度达到95％的突变型Pfu DNA聚合酶，满足各场景对聚合酶的纯度要求。

附图说明

图1为本发明实施例2中涉及到的pET 28a-Pfu DNA聚合酶重组表达载体的图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

以下各实施例，仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

对如SEQ ID NO:1所示的C末端融合了双链DNA结合蛋白的野生型Pfu DNA的氨基酸序列进行突变改造，筛选得到了16个突变体，其中7个单突变体、6个双突变体、4个三突变体和1个五突变体，该16个突变体在保证性上均有不同程度的改善，其中五突变体保真性最高，突变位点为V68A，A220V，L426R，T471S，R642K，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，各突变体的突变具体信息如下表1：

表1各突变体的突变信息

实施例2

本实施例以五突变为例，提供上述突变型Pfu DNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤:

(1)重组工程菌株的构建

人工合成编码五突变突变型Pfu DNA聚合酶的DNA分子，其碱基序列如SEQ ID NO:3所示，该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列，能够显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。

采用基因工程技术，将SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列克隆到带有His标签的pET28a载体的NcoⅠ和HindⅢ酶切位点中，如图1所示，构建得到含有突变型Pfu DNA聚合酶基因的表达载体，测序验证后将重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组工程菌，并于-80℃环境中保存在30％甘油中备用。

(2)重组工程菌株的诱导培养

将构建的重组工程菌在带有50μg/mL卡那霉素的LB平板进行三区划线，倒置于37℃培养箱过夜活化培养，挑取1个单菌落接种至10mL已加入50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体一级种子液，37℃培养4～5h，待菌液OD₆₀₀值在0.5～1之间时，按照接种比1:100接种至500mL已加入抗性的LB液体发酵培养基中，37℃扩大培养4～5h，待菌液OD₆₀₀值在0.6～0.8之间时，加入终浓度0.5mM IPTG诱导剂，25℃过夜诱导16h后收集菌体，将菌液在7500g、4℃下离心15min后，倒掉上清，收集菌体即为完成表达后的菌体。

(3)突变型Pfu DNA聚合酶的前处理

将收集到的菌体按质量体积1:10的比例加入裂解缓冲液进行重悬，采用细胞高压破碎仪对重悬液进行破碎，破碎压力为900bar，4℃破碎循环4次，水浴锅提前打开，将裂解液75℃水浴20min后，在4℃下以35000g离心30min，收集上清，向上清中缓慢加入终浓度0.1％的PEI试剂，边加边搅拌，冰上静置30min后12000g、4℃离心10min，取上清缓慢加入终浓度30％硫酸铵，边加边搅拌，冰上静置60min后，4℃、20000g离心30min，收集沉淀并加入一定量裂解缓冲液复溶沉淀，得到粗酶样品。

其中，裂解缓冲液为：20mM Tris-HCl，250mM NaCl，5mM咪唑，5％甘油，pH8.0，25℃。

(4)突变型Pfu DNA聚合酶的纯化

将粗酶样品使用0.45μm滤膜过滤后进行Ni亲和层析，缓慢上样汇研生物Ni FF(IMAC)后，先使用50mM咪唑洗脱去除杂蛋白，然后使用300mM咪唑洗脱出目的蛋白，然后向Ni柱洗脱液中加入低盐缓冲液，将溶液电导稀释至5mS/cm后上样苏州纳微科技UniGel30CM柱，随后用50mM～1000mM的NaCl梯度洗脱纳微UniGel 30CM 10个体积，分管收集洗脱液，经SDS-PAGE凝胶电泳分析后，收集含有Pfu DNA聚合酶的洗脱液；将含有Pfu DNA聚合酶的洗脱液在透析缓冲液中透析，用的透析袋大小为30KDa，洗脱液与透析缓冲液的体积比为1:100，透析条件为4℃、200rpm下透析16h，补加0.1％ NP-40和0.5mM PMSF聚合酶(购自默克sigma aldrich试剂公司)，最后将原酶液放置于-20℃保存备用。

其中，Ni亲和层析时，去除杂蛋白所用的洗脱液为：20mM Tris-HCl，250mM NaCl，50mM咪唑，5％甘油，pH8.0，25℃。

洗脱目的蛋白所用的洗脱液为：20mM Tris-HCl，250mM NaCl，300mM咪唑5％甘油，pH8.0，25℃。

低盐缓冲液为：20mM Tris-HCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，5％甘油，pH8.0，25℃。

阳离子交换层析时所用的洗脱液为：20mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，1mM DTT和50mM～1000mM NaCl，5％甘油；

透析缓冲液为：20mM Tris-HCl，200mM NaCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，50％甘油，pH8.0。

实施例3突变型Pfu DNA聚合酶酶活的测试

突变型Pfu DNA聚合酶酶活测试参考国家标准进行，将透析后的原酶进行梯度稀释，然后加入带有发卡结构的底物T2以及反应辅料进行扩增，得到相应的荧光曲线，并根据Lamda DNA的标准曲线进行酶活计算，结果如下表2所示：

表2野生型和突变型Pfu DNA聚合酶酶活测试结果

由表2可知，在V68A，A220V，L426R，T471S，R642K五个位点发生单突变或多突变，聚合酶的酶活并不会发生显著下降，相反有的还有很大的提高。

实施例4突变型Pfu DNA聚合酶保真性的测试

基于lacZ的蓝白斑筛选对聚合酶的保真性进行测试，具体方案如下：首先以质粒pUC19为模板，通过引物对lacZ-BF/BR扩增得到pUC 19-lacZ骨架，然后使用不同突变型Pfu-DNA聚合酶扩增lacZ片段，扩增引物为lacZ-F/R，最后通过无缝克隆将片段lacZ和骨架pUC19-lacZ连接起来，转入TOP10感受态细胞，孵育后涂布于含有相应的抗性蓝白斑筛选平皿，计算白斑与蓝斑的数量，然后按照如下公式进行计算：

其中，F表示蓝斑(Lac+)比例；500是lacZ基因中显性突变位点估值(参考文献：Thefidefity of Taq polymerase catalyzing PCR is improved by an N-terminaldeletion.Gene,112(1992)29-35)；E表示在每个碱基整合过程中聚合酶错误率；m表示PCR实际循环数，根据最后一个循环发生的错误相对WT为隐性，因而采用m-1。

lacZ-BF：CATTAATTGCGTTGCGCTCACTG(SEQ ID NO:4)；

lacZ-BR：CGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTC(SEQ ID NO:5)；

lacZ-F：CACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGC(SEQ ID NO:6)；

lacZ-R：GAGCGCAACGCAATTAATGTGAGT(SEQ ID NO:7)。

使用qPCR估计lacZ引物扩增效率，将pUC19质粒进行10倍梯度稀释，从0.01ng开始，进行qPCR，将Ct值与稀释倍数作图，得到斜率P，计算扩增效率K＝10^(-1/P)，根据实验中lacZ引物在各反应体系中扩增效率，计算LacZ PCR扩增倍数m，2^m＝K^30，最后公式计算出错误率E。具体的结果如下表3所示：

表3各Pfu DNA聚合酶突变体相关计算数据

由上表3可以看出，在V68A，A220V，L426R，T471S，R642K五个位点发生单突变或多突变，聚合酶的保真度均会得到提高，其中，尤以五突变的效果最佳。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高保真Pfu DNA聚合酶突变体，其特征在于，在野生型Pfu DNA聚合酶的基础上，进行如下位点中的一个或多个突变，其中突变的位点为V68A、A220V、L426R、T471S、R642K，野生型Pfu DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体，其特征在于，在野生型Pfu DNA聚合酶的基础上，进行如下五个位点的突变，其中五个突变位点为V68A、A220V、L426R、T471S、R642K，氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

3.编码权利要求2所述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体的核苷酸。

4.能够表达权利要求1所述的高保真Pfu DNA聚合酶的重组表达载体、工程细胞。

5.权利要求1所述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体、权利要求4所述的重组表达载体、工程细胞在制备分子检测试剂盒中的应用。

6.权利要求1所述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

人工合成权利要求1所述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体的核苷酸序列，将其连接到表达载体中获得重组表达载体，将所述重组表达载体转化到宿主细胞中得到基因工程菌，诱导表达、收集菌体、分离纯化即得。

7.根据权利要求6所述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体的制备方法，其特征在于，所述表达载体为pET28a。

8.根据权利要求6所述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

9.根据权利要求6所述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体的制备方法，其特征在于，分离纯化的方法如下：

将收集的菌体裂解破碎并沉淀得到粗酶样品，粗酶样品再依次经过Ni亲和层析、阳离子交换层析和透析处理后即得。

10.根据权利要求6或9所述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体的制备方法，其特征在于，收集的菌体裂解破碎并沉淀得到粗酶样品的方法如下：

用裂解缓冲液重悬菌体，并采用细胞高压破碎仪进行破碎，收集上清，上清经PEI处理和硫酸铵沉淀并复溶，得粗酶样品。

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