CN116497003A

CN116497003A - 一种从溶液中纯化目标蛋白的方法

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Publication number: CN116497003A
Application number: CN202310780220.XA
Authority: CN
Inventors: 张鹏; 秦丽丽; 侯洋
Original assignee: Beijing Baipusai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Baipusai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-06-29
Filing date: 2023-06-29
Publication date: 2023-07-28
Also published as: CN117801056A

Abstract

本发明涉及蛋白纯化技术领域，具体涉及一种从溶液中纯化目标蛋白的方法。本发明提供的从溶液中纯化目标蛋白Cas9的方法至少包括以下的步骤：（a）向溶液中添加聚乙烯亚胺，收集沉淀；（b）用洗脱缓冲液进行洗涤，收集上清；（c）硫酸铵梯度沉淀。本发明的纯化方法可快速制备高纯度、聚集体形式正确、具有良好DNA切割活性的无标签Cas9蛋白；而且该纯化方法的操作过程简单、可重复性高，可投入大量生产，极大地降低了无标签Cas9蛋白的纯化成本，提高了纯化效率。

Description

一种从溶液中纯化目标蛋白的方法

技术领域

本发明涉及蛋白纯化技术领域，尤其涉及一种从溶液中纯化目标蛋白的方法。

背景技术

CRISPR/Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统，存在于大多数细菌和古生菌中。目前，基因编辑中使用最广泛的CRISPR/Cas9系统来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。该基因编辑系统主要包括Cas9蛋白和单链导RNA(single guide RNA，sgRNA)两个部分，Cas9蛋白在sgRNA的导向作用下切割靶位点DNA，并产生双链断裂，在随后细胞内修复的过程中实现DNA序列的改变，从而达到基因编辑的效果。目前Cas9蛋白的纯化大多通过添加纯化标签（例如His-tag等）的方式，例如：中国专利申请CN111893105A公开了一种Cas9蛋白的表达纯化方法，通过选择带有His6标签的Cas9蛋白外源质粒在大肠杆菌表达系统中大量表达并采用Ni²⁺金属螯合树脂进行纯化制备Cas9蛋白。中国专利申请CN114410608A公开了一种高效表达及纯化Cas9蛋白的方法，通过使用10×His标记提高融合蛋白与Ni-NTA树脂的亲和力，以有助于高盐洗去除污染的核酸，提高纯化效果。然而，带有标签的Cas9蛋白在基因治疗领域或动物体内应用过程中存在潜在风险。

随着CRISPR/Cas9技术的不断完善开发，其在基因治疗领域的应用日益增多。为了满足更多动物实验的要求并规避风险，Cas9蛋白的设计也逐渐从早期的His-tag标签蛋白转向Tag-free无标签蛋白的开发。无标签蛋白由于没有标签氨基酸，其构象更接近天然蛋白，并且具有更低的免疫原性。随着CRISPR/Cas9技术在体内基因编辑中的应用逐渐增多，无标签Cas9蛋白也逐渐成为了Cas9蛋白制备的发展趋势。通常，无标签蛋白的纯化需要组合使用多种类型、多个步骤的层析才能获得目的蛋白，如亲和层析、离子交换层析、疏水层析、多模式层析、凝胶过滤层析等，进而不可避免地导致纯化工艺过程繁琐，纯化效率低。

发明内容

本发明提供一种从溶液中纯化目标蛋白Cas9的方法。

本发明针对无标签Cas9蛋白提供一种高效的纯化方法，通过将聚乙烯亚胺（PEI）沉淀与硫酸铵梯度沉淀相结合，显著提高了Cas9蛋白的纯化效率，且由此制得的无标签Cas9蛋白聚集形式正确，构象更接近天然蛋白，并具有良好的DNA体外切割活性。

具体地，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种从溶液中纯化目标蛋白Cas9的方法，其至少包括以下的步骤：

（a）向溶液中添加聚乙烯亚胺，收集沉淀；

（b）用洗脱缓冲液进行洗涤，收集上清；

（c）硫酸铵梯度沉淀。

优选地，所述方法进一步包括至少一个层析的步骤，选自：阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水作用层析或尺寸排阻层析。

在本发明的一些实施方式中，所述从溶液中纯化目标蛋白Cas9的方法包括上述层析技术中的一种。优选疏水作用层析，且仅需一步层析处理，该纯化过程操作简单，可快速制备高纯度、聚集体形式正确、具有良好DNA切割活性的无标签Cas9蛋白，极大地提高了纯化效率。

优选地，所述目标蛋白Cas9不带有任何的纯化标签。

本发明中，所述纯化标签包括本领域已知或未知的所有表达纯化标签（多肽），包括但不限于His标签、GST标签、MBP标签、CBD标签、Strep标签、Halo标签、SNAP标签、SUMO标签、NusA标签、TtxA标签、DsbA标签等。

上述方法中，所述聚乙烯亚胺为线性聚乙烯亚胺或分枝状聚乙烯亚胺。

优选地，上述步骤（a）中，添加聚乙烯亚胺至其工作浓度为0.6-0.8%。

具体地，步骤（a）为将所述溶液与聚乙烯亚胺混合，使得聚乙烯亚胺达到工作浓度0.6-0.8%，待沉淀完全后，进行离心，收集沉淀。

上述方法中，所述溶液为宿主细胞破碎上清液、宿主细胞发酵上清液或者无细胞表达体系。

优选地，上述步骤（b）中，所述洗脱缓冲液的pH值为7-9，优选为7-8，更优选为7.2-7.8。

优选地，所述洗脱缓冲液包括：600-1000mM NaCl，40-60mM Tris-HCl，15-25%甘油，1-3mM TCEP。

优选地，所述洗脱缓冲液的用量为与上一步收集的沉淀以体积比为（1-2）：1混合。

在洗脱缓冲液洗涤后，经离心去除沉淀，收集上清。该上清中包含去除了核酸的Cas9蛋白。

上述步骤（c）中，所述梯度沉淀为先采用终浓度为26-28%的硫酸铵进行沉淀后，收集上清，再采用终浓度为12-14%的硫酸铵进行沉淀后，收集沉淀。

上述第一次硫酸铵沉淀（终浓度为26-28%的硫酸铵进行沉淀）能够使得蛋白聚集体高效沉淀并通过分离去除，第二次硫酸铵沉淀（终浓度为12-14%的硫酸铵进行沉淀）能够与第一次硫酸铵沉淀很好地配合作用，将去除了大部分蛋白聚集体的目的蛋白Cas9沉淀，并通过离心的方式去除上清中高浓度的硫酸铵及残留的PEI。

以上所述的硫酸铵的终浓度为硫酸铵在沉淀体系中的终浓度。

优选地，上述各次硫酸铵沉淀的时间均为20-40min。

本发明中，收集上清或沉淀可采用离心分离上清和沉淀。优选为在9000-11000 g条件下离心20-40min。

进一步地，对于上述第二次硫酸铵沉淀收集的沉淀复溶后进行层析。

优选地，所述层析为疏水作用层析。

具体地，采用缓冲液A将硫酸铵梯度沉淀后收集的沉淀进行复溶，然后进行疏水作用层析，采用缓冲液B进行洗脱；

其中，缓冲液A包括：1-2M硫酸铵，40-60mM Tris-HCl，1-3mM TCEP。

缓冲液B包括：40-60mM Tris-HCl，1-3mM TCEP。

优选地，缓冲液A和缓冲液B的pH为7.2-7.8。

优选地，所述洗脱为线性洗脱。

进一步优选地，所述线性洗脱的体积为10-20cv，上样流速及洗脱流速均为25-35cm/h。

经上述洗脱后，收集峰组分，即得Cas9蛋白。

本发明中，所述宿主细胞是指能够表达Cas9蛋白的宿主细胞，其中含有编码Cas9蛋白的核酸分子。

本发明中，所述宿主细胞优选为大肠杆菌。利用大肠杆菌表达系统可在短时间内发酵制得大量可溶的Cas9重组蛋白，实现高效可溶表达Cas9蛋白。

对于大肠杆菌的具体菌株，本发明没有特殊限制，只要能表达Cas9蛋白即可。

对于Cas9蛋白的氨基酸序列和来源微生物，本发明没有特殊限制，只要属于Cas9家族蛋白即可。

在本发明的一些实施方式中，所述Cas9蛋白的Uniprot登录号为Q99ZW2-1。来源于其他微生物的Cas9蛋白或与Q99ZW2-1所示序列具有至少50%相似性的Cas9蛋白或其变体也在本发明的保护范围内。

本发明还提供通过以上所述的方法制备得到的目标蛋白Cas9。

本发明的有益效果至少包括：本发明提供的从溶液中纯化目标蛋白Cas9的方法可快速制备高纯度、聚集体形式正确、具有良好DNA切割活性的无标签Cas9蛋白；而且该纯化方法的操作过程简单、可重复性高，可投入大量生产，极大地降低了无标签Cas9蛋白的纯化成本，提高了纯化效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中表达载体pET28a-Cas9-Tag-free的质粒图谱。

图2为本发明实施例2中大肠杆菌发酵表达无标签Cas9蛋白的SDS-PAGE分析图，其中泳道由左至右依次为：M：蛋白Marker、诱导前：诱导前全蛋白、全蛋白：诱导后全蛋白、上清：破菌上清、沉淀：破菌沉淀。

图3为本发明实施例3中使用硫酸铵梯度沉淀去除Cas9蛋白聚集体的SEC-MALS检测结果图，其中Cas9蛋白的聚集体出峰时间在11min左右，单体出峰时间在15.3min左右。

图4为本发明实施例3中PEI沉淀纯化Cas9蛋白的SDS-PAGE分析图，其中泳道由左至右依次为：M：蛋白Marker、破上：破菌上清、PEI沉淀上：PEI沉淀离心后上清、洗脱上：洗脱上清、复溶上：硫酸铵沉淀后Cas9蛋白复溶上清。

图5为本发明实施例4中使用AKTA prime进行疏水层析时，目的蛋白出峰部分的纯化色谱图。

图6为本发明实施例4中Cas9蛋白终样品SDS-PAGE图，其中，M：蛋白Marker。

图7为本发明实施例4中Cas9蛋白终样品SEC-MALS检测图，结果表明出峰时间在15.3min左右， Cas9蛋白为单体形式，且单体占比大于95%。

图8为本发明实施例5中Cas9蛋白体外切割活性的琼脂糖凝胶电泳检测图，其中，M：DNA Marker，由上至下的条带依次为4500bp、3000bp、2000bp、1200bp、800bp、500bp、200bp，1：添加了dsDNA与sgRNA，但未添加Cas9的对照组，2：添加了Cas9、sgRNA、dsDNA的实验组，结果表明无标签Cas9蛋白体外切割效率大于90%。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 无标签Cas9蛋白重组表达载体的构建

无标签Cas9蛋白重组表达载体（pET28a-Cas9-Tag-free）的构建方法如下：

由上海生物工程有限公司合成编码无标签Cas9蛋白（Uniprot登录号：Q99ZW2-1)氨基酸序列对应的核苷酸序列，并在5’末端添加限制性内切酶Nco Ⅰ酶切位点、3’末端添加终止子和限制性内切酶Nde Ⅰ酶切位点。合成产物用限制性内切酶Nco Ⅰ和NdeⅠ双酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。将目的片段分别与同样经限制性内切酶Nco Ⅰ和NdeⅠ双酶切的pET28a(+)连接，构建重组pET28a-Cas9-Tag-free表达载体，转化大肠杆菌E.coli DH5α，37℃培养16h后挑取单菌落进行质粒提取，将提取后的质粒用限制性内切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，将阳性克隆测序，选择测序正确的克隆进行质粒的放大提取，提取后的质粒无菌过滤后，-20℃保存备用，构建成功的质粒图谱见图1。

实施例2 无标签Cas9重组蛋白在大肠杆菌中的表达

将上述-20℃保存的pET28a-Cas9-Tag-free表达载体转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，加入1mL的LB液体培养基后置于37℃摇床培养45min后，取200μL涂布于Kan⁺抗性LB固体平板上，倒置于37℃培养箱中培养过夜。过夜培养后，挑取平板上单克隆菌落至20mL的LB液体培养基，添加终浓度50μg/mL Kan⁺，置于37℃摇床过夜培养，将生长到对数期的菌液接种到300mL的TB培养基中，选用底部具有挡板的三角锥形瓶，37℃下培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8，加入终浓度为0.2mM的IPTG，降温至20℃培养20小时后结束发酵。发酵液在8000g条件下离心15min，收集离心后沉淀。

用破碎缓冲液（购自ACROBIO）比例重悬沉淀，超声破碎，10000 g条件下离心30min，收集破胞离心后的上清和沉淀制备SDS-PAGE样品，与全菌样品一同进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），结果见图2。

实施例3 无标签Cas9重组蛋白的分离纯化

使用本发明开发的纯化工艺对实施例2中大肠杆菌表达的无标签Cas9蛋白进行纯化，具体方法如下：

在实施例2的超声破碎后离心的上清液中边搅拌边加入5%（w/v）的PEI溶液，使溶液中PEI工作浓度为0.8%，待沉淀完全后在10000 g条件下离心20min，收集沉淀。使用洗脱缓冲液（900mM NaCl，50mM Tris-HCl，20%甘油，2mM TCEP，pH 7.5）等体积重悬沉淀，进行样品中核酸沉淀及蛋白的洗脱，在10000 g条件下室温离心30min，收集上清，该上清中包含去除核酸等污染的Cas9蛋白。对离心后收集的上清采用硫酸铵梯度沉淀的方法进行Cas9蛋白聚集体的去除和单体的沉淀，在上清中边搅拌边加入硫酸铵固体至终浓度为27%（w/v）进行蛋白聚集体的沉淀；沉淀30min后在10000 g条件下4℃离心30min，将沉淀复溶后使用SEC-MALS测定蛋白聚集形态，图3表明沉淀组分为蛋白聚集体，硫酸铵梯度沉淀能有效将其去除。收集离心后上清重复上述操作加入固体硫酸铵至终浓度为13%（w/v），沉淀30min后于10000 g条件下4℃离心30min，收集沉淀，该沉淀中包含去除大部分蛋白聚集体后的无标签Cas9单体。

上述过程中分别对菌体破碎上清、PEI沉淀后上清、洗脱缓冲液洗脱后上清、硫酸铵沉淀蛋白复溶上清的样品进行SDS-PAGE，结果见图4。

此外，经验证，上述方法中 PEI工作浓度为0.6%也能够取得与PEI工作浓度为0.8%时相当的纯化效果。将洗脱缓冲液中的各组分浓度设置在下述范围内：600-1000mM NaCl，40-60mM Tris-HCl，15-25%甘油，1-3mM TCEP，pH值为7-9，均能够取得与本实施例中上述使用的洗脱缓冲液相当的纯化效果。

实施例4 无标签Cas9重组蛋白的层析纯化

对采用实施例3的纯化方法制得的无标签Cas9单体（硫酸铵梯度沉淀后收集的沉淀）使用Cytiva HiTrap Phenyl HP进行疏水层析（HIC），使用缓冲液A（1.5M (NH₄)₂SO₄，50mM Tris-HCl，2mM TCEP，pH 7.5）进行蛋白的复溶，复溶后蛋白样品使用0.2μm针式滤器过滤去除絮状沉淀后进行疏水层析，使用缓冲液A平衡后进行上样及线性洗脱，洗脱采用缓冲液 B（50mM Tris-HCl，2mM TCEP，pH 7.5）进行，线性洗脱体积为15cv。目的蛋白单体出峰对应电导范围110mS/cm-91mS/cm，蛋白聚集体在单体之后出峰，出峰部分的AKTA纯化色谱图见图5。

将疏水层析收集的峰组分进行超滤浓缩，换液至保存缓冲液后添加终浓度50%甘油，制成蛋白终样品，取样进行SDS-PAGE电泳，结果见图6。对蛋白终样品进行SEC-MALS检测单体占比，结果表明纯化最终所得Cas9蛋白单体占比大于95%（图7）。

将本发明的Cas9蛋白纯化方法与无标签Cas9蛋白的常规层析纯化方法及其蛋白收率和蛋白单体占比情况进行对比，如表1所示，采用PEI进行初步纯化捕获无标签Cas9蛋白，不仅具有较高的蛋白收率，而且能够极大地减轻后续纯化除杂的压力，结合硫酸铵梯度沉淀可以简便快速地去除蛋白聚集体，整体纯化方法相比常规层析纯化采用更少的纯化步骤、且能够实现更高的蛋白收率，具有明显优势。

表1

实施例5 无标签Cas9重组蛋白的体外切割活性验证

使用商业Cas9体外酶切试剂盒（英茂盛业Cas9体外酶切试剂盒，货号PC1400）进行切割活性检测，实验操作依照产品说明书进行，检测结果的琼脂糖凝胶电泳分析见图8。第1泳道为DNA Marker，第2泳道为添加了dsDNA与sgRNA，但未添加Cas9的对照组，第3泳道为添加了Cas9、sgRNA、dsDNA的实验组，电泳结果表明无标签Cas9蛋白体外切割效率大于90%。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种从溶液中纯化目标蛋白Cas9的方法，其特征在于，其至少包括以下的步骤：

（a）向溶液中添加聚乙烯亚胺，收集沉淀；

（b）用洗脱缓冲液进行洗涤，收集上清；

（c）硫酸铵梯度沉淀。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括至少一个层析的步骤，选自阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水作用层析或尺寸排阻层析。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白Cas9不带有任何的纯化标签。

4.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，步骤（a）中，添加聚乙烯亚胺至其工作浓度为0.6-0.8%。

5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述溶液为宿主细胞破碎上清液、宿主细胞发酵上清液或者无细胞表达体系。

6.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液的pH值为7-9。

7.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤（c）中，所述梯度沉淀为先采用终浓度为26-28%的硫酸铵进行沉淀后，收集上清，再采用终浓度为12-14%的硫酸铵进行沉淀，收集沉淀。

8.通过权利要求1-7任一项所述的方法所制备得到的Cas9蛋白。