CN110996993A - 包含源自超抗原类毒素的融合肽的免疫原性组合物 - Google Patents

Abstract

本公开提供了用于预防和治疗金黄色葡萄球菌感染的免疫原性组合物。特别地，本公开提供了包含以任何顺序融合在一起成为单一多肽的两种或更多种葡萄球菌超抗原(SAg)蛋白或其任何片段、变体或衍生物的多价寡肽、融合蛋白。

Description

包含源自超抗原类毒素的融合肽的免疫原性组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年7月27日提交的美国临时专利申请号62/537,706的权益，所述临时专利申请以引用的方式整体并入本文。

本申请涉及2015年12月18日提交的美国专利申请号14/899,993(现在美国专利号9,815,872)，所述专利申请以引用的方式整体并入本文。

序列表的并入

含有名称为“IBT_176965_PCT_SeqListing_ST25.txt”的文件的序列表随此提供并且以引用的方式整体并入本文，所述序列表是34,503字节(在

中测量)、含有12个序列并且于2018年7月19日创建。

政府权利

本发明是在政府支持下根据美国国立卫生研究院授予的AI111205进行。政府拥有本发明的某些权利。

背景技术

金黄色葡萄球菌(SA)是引起从皮肤和软组织感染(SSTI)至危及生命的败血症和肺炎的广泛感染的革兰氏阳性人病原体。它是全世界医院和社区相关感染的主要原因(Brown等人,2009,Journal/Clin Microbiol Infect,15(2):156-164)。病理范围反映了SA使用大量毒力因子逃避免疫应答的多种能力：超抗原和成孔毒素、凝固酶、荚膜多糖、粘附素、蛋白酶、补体失活胞外蛋白和其它先天性应答调节剂(Powers和Wardenburg,2014,Journal/PLOS Pathogens,10(2):e1003871)。

自其于20世纪60年代首次出现以来，耐甲氧西林的SA(MRSA)已在全世界的医疗保健环境中成为地方病(Diep等人,2006,J Infect Dis,193(11):1495-1503)。自20世纪90年代以来，社区相关的MRSA菌株(CA-MRSA)出现并且构成主要的全球挑战(Bassetti等人,2009,Int J Antimicrob Agents,34增刊1:S15-19；Bradley,2005,Semin Respir CritCare Med,26(6):643-649；Chambers,2005,N.Engl J Med,352(14):1485-1487.)。因此，已经加大了针对用于金黄色葡萄球菌感染的疫苗和治疗剂的开发的努力。

α溶血素(α-毒素，Hla)是SA肺炎和SSTI中的主要毒力因子(Bubeck Wardenburg和Schneewind,2008,J Exp Med,205(2):287-294；Kennedy等人,2010,J Infect Dis,202(7):1050-1058)。最近，溶细胞短肽被称为酚溶性调控蛋白(PSM)被鉴定为溶解嗜中性粒细胞(针对金黄色葡萄球菌的主要防线)的关键毒力因子(Wang等人,2007,Nat Med,13(12):1510-1514)。葡萄球菌的另一种相关的细胞溶解短肽被称为δ溶血素或δ毒素(δ毒素)，其是金黄色葡萄球菌群体感应系统(agr)的关键标志物(Novick等人,1993,EMBO J,12(10):3967-3975)。在患有SA菌血症的一组患者中的最近流行病学研究表明，败血症的概率与针对Hla、PSM-α3以及δ-毒素的预先存在的抗体之间呈负相关(Adhikari等人,2012,J InfectDis,206(6):915-923)。

超抗原(SAg)构成由葡萄球菌肠毒素(SE)和中毒性休克综合征毒素1(TSST-1)组成的致热性毒素大家族。与通过抗原呈递细胞进行蛋白水解加工并以MHC/肽复合物形式呈递至T细胞的常规抗原相比，SAg将T细胞受体(TCR)与II类MHC教练并活化达30％的T细胞(Schlievert,1993,Journal/The Journal of Infectious Diseases,167(5):997-1002)，从而导致细胞因子和趋化因子的大量释放、增强的表达以及细胞粘附分子的活化、增加的T细胞增殖以及最终T-细胞凋亡/无变应性。这一系列事件可以中毒性休克综合征(TSS)告终，中毒性休克综合征是一种特征在于皮疹、低血压、发热和多系统功能障碍的危及生命的疾病(Bohach等人,1990,Journal/Crit Rev Microbiol,17(4):251-272)。抗体在针对TSS的保护中起重要作用，因此由于低反应性T细胞(Mahlknecht等人,1996,Journal/HumImmunol,45(1):42-45)和/或T细胞依赖性B细胞凋亡(Hofer等人,1996,Journal/ProcNatl Acad Sci U S A,93(11):5425-5430)而不会血清转化为有害毒素的个体更有可能经历反复发作。此外，在较低的非TSS诱导浓度下，SAg通过诱导局部过度炎症应答而影响金黄色葡萄球菌菌株的毒力。

在开发包括超抗原的多价金黄色葡萄球菌疫苗中的主要挑战是，存在超过20种不同的SAg，并且存在临床分离株中SAg存在的广泛范围的变化性，因为大多数SAg位于移动遗传元件上，所述移动遗传元件如质粒或致病岛(葡萄球菌肠毒素K(SEK)、葡萄球菌肠毒素Q(SEQ))、溶原性噬菌体(葡萄球菌肠毒素A(SEA))或抗生素抗性盒，如SCC mec葡萄球菌肠毒素H(SEH)(Omoe等人,2002,Journal/J Clin Microbiol,40(3):857-862)。基于涵盖超过6000种临床分离株的广泛文献综述，最广泛代表的超抗原(SAg)似乎是中毒性休克综合征毒素1(TSST-1)和葡萄球菌肠毒素C(SEC)，随后是SEA、葡萄球菌肠毒素D(SED)和葡萄球菌肠毒素B(SEB)。最近的研究表明SEK和SEQ的出现，主要是由于USA300克隆的循环(Proft和Fraser,2003,Journal/Clinical and Experimental Immunology,133(3):299-306)。已发现针对多种SAg的单克隆抗体和疫苗接种可针对小鼠的SA败血症部分保护。据报告，使用去毒SAg和溶细胞素的各种组合进行多价免疫针对兔的肺炎具有显著保护(Spaulding等人,2012,Vaccine 30(34):5099-109；Salgado-Pabón等人,2014,J Infec Dis,210(5):784-792)。

发明内容

在一方面，本公开提供了一种减毒的金黄色葡萄球菌来源的超抗原(SAg)SEA类毒素或其免疫原性或抗原活性片段、变体或衍生物，其包含四个相对于野生型SEA的突变，所述四个相对于野生型SEA的突变对应于SEQ ID NO:4中的L48R、D70R、Y92A和H225A突变。在某些方面，所述类毒素或其片段、变体或衍生物与包含SEQ ID NO:3的SEA类毒素相比具有降低的超抗原活性和/或毒性较低，同时维持免疫原性。在某些方面，所述减毒SEA类毒素或其片段、变体或衍生物包含与SEQ ID NO:4至少90％相同的氨基酸序列。在某些方面，所述减毒SEA类毒素或其片段、变体或衍生物包含SEQ ID NO:4。此外，在某些方面，所述减毒SEA类毒素或其片段、变体或衍生物具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于3％、小于2％或小于1％的包含SEQ ID NO:3的SEA类毒素的超抗原活性。应当理解，本文用于描述点突变的命名法(例如“L48R”)是与不含有异源表达所需的N-末端甲硫氨酸的野生型SAg蛋白相比。

在另一方面，本公开还提供了一种多价寡肽，所述多价寡肽包含以任何顺序排列的如本文其它地方所述的两种或更多种减毒的金黄色葡萄球菌来源的超抗原(SAg)类毒素或其免疫原性或抗原性活性片段、变体或衍生物的融合物，其中所述SAg类毒素或其片段、变体或衍生物可以是相同或不同的，并且其中所述SAg类毒素中的至少一种是本文其它地方所述的SEA类毒素。在某些方面，所述寡肽包含三种或更多种SAg类毒素或其片段、变体或衍生物的融合物。在某些方面，所述寡肽与包含SEQ ID NO:5的SAg融合蛋白相比具有降低的超抗原活性和/或毒性较低。在某些方面，所述寡肽维持包含SEQ ID NO:5的SAg融合蛋白的免疫原性。在某些方面，所述寡肽具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于3％、小于2％或小于1％的包含SEQ ID NO:5的SAg融合蛋白的超抗原活性。此外，在某些方面，所述寡肽被完全减毒。

在某些方面，所述多价寡肽包含以下中的一种或多种：葡萄球菌中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)减毒类毒素；葡萄球菌肠毒素B(SEB)减毒类毒素；或其任何组合。在某些方面，所述TSST-1减毒类毒素包含三个相对于野生型TSST-1的突变，所述三个相对于野生型TSST-1的突变对应于SEQ ID NO:1中的L30R、D27A和I46A突变；以及与SEQ ID NO:1至少90％相同的氨基酸序列。在某些方面，所述SEB减毒类毒素包含三个相对于野生型SEB的突变，所述三个相对于野生型SEB的突变对应于SEQ ID NO:2中的L45R、Y89A和Y94A突变；以及与SEQ ID NO:2至少90％相同的氨基酸序列。在某些方面，所述SEA减毒类毒素包含四个相对于野生型SEA的突变，所述四个相对于野生型SEA的突变对应于SEQ ID NO:4中的L48R、D70R、Y92A和H225A突变；以及与SEQ ID NO:4至少90％相同的氨基酸序列。在某些方面，所述TSST-1类毒素包含氨基酸序列SEQ ID NO:1。在某些方面，所述SEB类毒素包含氨基酸序列SEQ ID NO:2。在某些方面，所述SEA减毒类毒素包含氨基酸序列SEQ ID NO:4。在某些方面，所述多价寡肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:6。

在某些方面，本文中其它地方描述的至少两种SAg类毒素或其片段、变体或衍生物各自经由接头缔合。在某些方面，所述接头包含选自由以下组成的组的至少一个、但不超过50个氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸以及其组合。在某些方面，所述接头包含(GGGS)_n或(GGGGS)_n，其中n是1至10的整数。在某些方面，所述接头包含(GGGGS)_n。在某些方面，n是3。

所述多价寡肽还可包含异源多肽。在某些方面，所述异源多肽包含His-标签、泛素标签、NusA标签、几丁质结合结构域、B-标签、HSB-标签、绿色荧光蛋白(GFP)、钙调素结合蛋白(CBP)、半乳糖结合蛋白、麦芽糖结合蛋白(MBP)、纤维素结合结构域(CBD)、抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白/Strep-标签、trpE、氯霉素乙酰转移酶、lacZ(β-半乳糖苷酶)、FLAG^TM肽、S-标签、T7-标签、所述异源多肽中任一者的片段或所述异源多肽中的两者或更多者的组合。在某些方面，所述异源多肽包含免疫原、T细胞表位、B细胞表位、其片段或其组合。

所述多价寡肽还可还包含免疫原性碳水化合物。在某些方面，所述免疫原性碳水化合物是糖。在某些方面，所述免疫原性碳水化合物是荚膜多糖或表面多糖。在某些方面，所述免疫原性碳水化合物选自由以下组成的组：荚膜多糖(CP)血清型5(CP5)、CP8、聚-N-乙酰葡糖胺(PNAG)、聚-N-琥珀酰葡糖胺(PNSG)、壁磷壁酸(WTA)、脂磷壁酸(LTA)、所述免疫原性碳水化合物中任一者的片段以及所述免疫原性碳水化合物中的两者或更多者的组合。在某些方面，所述免疫原性碳水化合物与所述寡肽缀合。

还提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码本文其它地方所述的减毒SEA类毒素多肽或本文其它地方所述的多价寡肽的核酸。在某些方面，所述多核苷酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:8。所述多核苷酸还可包含异源核酸。在某些方面，所述异源核酸包含与编码所述寡肽的核酸可操作地缔合的启动子。还提供了一种载体，所述载体包含所述多核苷酸。在某些方面，所述载体是质粒。还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含所述载体。在某些方面，所述宿主细胞是细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞或植物细胞。在某些方面，所述细菌是大肠杆菌(Escherichia coli)。

还提供了一种产生多价寡肽的方法。在某些方面，所述方法包括培养本文其它地方所述的宿主细胞以及回收所述寡肽。

还提供了一种组合物，如治疗性、免疫原性和/或抗原性组合物，所述组合物包含本文其它地方所述的减毒SEA类毒素或多价寡肽或其任何组合以及载剂。所述组合物还可包含佐剂。在某些方面，所述佐剂是明矾、氢氧化铝、磷酸铝或基于吡喃葡萄糖基脂质A的佐剂。所述组合物还可还包含另外的免疫原。在某些方面，所述另外的免疫原是细菌抗原。在某些方面，所述细菌抗原选自由以下组成的组：成孔毒素、超抗原、细胞表面蛋白、所述细菌抗原中任一者的片段以及所述细菌抗原中的两者或更多者的组合。

还提供了一种诱导针对金黄色葡萄球菌的宿主免疫应答的方法。在某些方面，所述方法包括向需要所述免疫应答的受试者施用有效量的本文其它地方所述的免疫原性或抗原性组合物。在某些方面，所述免疫应答选自由以下组成的组：先天性应答、体液应答、抗体应答、细胞应答以及所述免疫应答中的两种或更多种的组合。在某些方面，所述免疫应答是抗体应答。

还提供了一种预防或治疗受试者的葡萄球菌疾病或感染的方法。在某些方面，所述方法包括向有需要的受试者施用本文其它地方所述的组合物。在某些方面，所述感染是皮肤、软组织、血液或器官的局部或全身性感染，或者本质上是自身免疫的。在某些方面，所述疾病是呼吸系统疾病，例如肺炎。在某些方面，所述疾病是败血症。

本文公开的任何方法中的受试者可以是哺乳动物。在某些方面，所述哺乳动物是人。在某些方面，所述哺乳动物是牛科动物或犬科动物。

用于在本文公开的任何方法中施用的组合物可经由肌内注射、皮内注射、腹膜内注射、皮下注射、静脉内注射、口服施用、粘膜施用、鼻内施用或肺部施用来施用。

还提供了一种用于在受试者中诱导针对金黄色葡萄球菌的宿主免疫应答的组合物。还提供了一种用于预防或治疗受试者的葡萄球菌疾病或感染的组合物。还提供了一种产生针对金黄色葡萄球菌感染的疫苗的方法。在某些方面，所述方法包括分离本文其它地方所述的减毒SEA类毒素、本文其它地方所述的多价寡肽或其任何组合；以及将所述类毒素、寡肽或其任何组合与佐剂组合。

附图说明

图1是rTBA和rTBA225构建体的示意图。还示出融合肽的另外潜在构型。接头：接头GGGGS(4GS)的三个重复序列。

图2A-B示出rTBA的纯化。图2A)用于纯化rTBA和rTBA 225的过程。图2B)rTBA的SDS-PAGE分析。

图3示出小鼠中rTBA对比三种单独类毒素的混合物的比较免疫原性。A)针对所述三种SAg对来自每组5只经免疫小鼠的汇集血清进行ELISA和毒素中和测定(TNA)。B)用在CpG或铝胶中配制的rTBA对10只小鼠的组免疫3次，并在ELISA和TNA测定中确定免疫原性。所示的数据是ELISA EC₅₀和TNA NT₅₀值。

图4示出了rTBA和rTBA225安全性概况。来自三个供体的人PBMC对SEA、rTBA、SEAH225A、rSEA225和rTBA225的应答。

图5示出小鼠中rTBA225对比rTBA对比三种单独类毒素的混合物的比较免疫原性。针对SEA、SEB和TSST-1对来自每组10只经免疫小鼠的单独血清进行ELISA和毒素中和测定(TNA)。所示的数据是ELISA EC₅₀(A)和TNA NT₅₀(B)值。还对来自经免疫小鼠的合并血清进行了TNA以测试针对其它超抗原的交叉中和。所示的数据是在1:40血清稀释度(C)下的中和百分比。误差棒代表平均值的标准误差，并且星号显示如通过曼-惠特尼非参数检验所确定的rTBA225和SAg混合物免疫的小鼠血清之间的统计学差异。

图6示出铝胶对rTSST-1(A)和rTBA225(B)的吸附。将蛋白质单独孵育(左泳道)或与铝胶一起以指定比例(蛋白质:铝胶)在室温下孵育30分钟。在孵育后，将样品离心以沉淀所吸附的蛋白质。然后将上清液进行SDS-PAGE分析，并通过考马斯染色进行可视化。缺乏可检测的蛋白质条带表明与铝胶结合。

图7示出由rTBA225提供的针对毒素激发的保护。用作为对照的BSA或在铝胶中配制的rTBA225将10只小鼠的组疫苗接种三次，并用指定剂量的野生型TSST-1、SEA或SEA激发。监测动物5天的死亡率和发病率。

具体实施方式

I.定义

应注意，术语“一个/种(a/an)”实体是指一个或多个所述实体；例如，“一种多核苷酸”被理解为表示一种或多种多核苷酸。因此，术语“一个/种(a)”(或“一个/种(an)”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。

此外，当在本文中使用时将“和/或”视为对两个指定特征或组分中的每一者具有或不具有另一者的具体公开内容。因此，如本文中诸如“A和/或B”的短语中所用的术语“和/或”意图包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中所用的术语“和/或”意图涵盖以下中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

除非另外定义，否则本文所使用的技术和科学术语具有与本公开涉及的领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。例如，the Concise Dictionary of Biomedicineand Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；The Dictionary ofCell and Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；以及Oxford Dictionary OfBiochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Press为本领域的技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。

单位、前缀和符号以它们的国际单位制(SI)公认的形式来表示。数值范围包括限定所述范围的数字。除非另外说明，否则氨基酸序列是以氨基至羧基取向从左向右书写。本文提供的标题不是对本公开内容的各个方面或实施方案的限制，所述方面或实施方案可通过参考整个说明书来获得。因此，通过参考说明书全文，更充分地定义了紧接着在下文中定义的术语。

当用语言“包含”来描述多个方面或实施方案时，还提供了以术语“由……组成”和/或“主要由……组成”来描述的其它类似方面或实施方案。

氨基酸在本文中通过其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，核苷酸通过它们的普遍公认的单字母代码来提及。

术语“核酸”或“核酸序列”是指存在于多核苷酸或构建体中的任何一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。本公开的两种或更多种核酸可存在于单一多核苷酸构建体中，例如在单一质粒上，或存在于单独的(不同的)多核苷酸构建体中，例如，在单独的质粒上。此外，任何核酸或核酸片段可编码单一多肽，例如单一抗原、细胞因子或调控性多肽；或者可编码多于一种多肽，例如，核酸可编码两种或更多种多肽。此外，核酸可编码调控元件，如启动子或转录终止子，或者可编码多肽或蛋白质的特化的元件或基序，如分泌信号肽或功能结构域。

术语“多核苷酸”意图涵盖单数核酸或核酸片段以及复数核酸或核酸片段，并且是指分离的分子或构建体，例如病毒基因组(例如，非感染性病毒基因组)、信使RNA(mRNA)、质粒DNA(pDNA)或pDNA的衍生物(例如，如在(Darquet,A-M等人,Gene Therapy 4:1341-1349,1997)中描述的包含多核苷酸的小环)。可以线性(例如，mRNA)、环状(例如，质粒)或分支形式以及双链或单链形式提供多核苷酸。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如，酰胺键，如在肽核酸(PNA)中所发现)。

如本文所用，术语“多肽”意图涵盖单数“多肽”以及复数“多肽”，并且包含两个或更多个氨基酸的任何一个或多个链。因此，如本文所用，“肽”、“寡肽”、“二肽”、“三肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”、“氨基酸序列”、“肽亚基”或用于指具有两个或更多个氨基酸的一个或多个链的任何其它术语包括在“多肽”的定义中(即使这些术语中的每个可具有更具体的含义)，并且术语“多肽”也可用来代替这些术语中的任一者，或与这些术语中的任一者互换使用。所述术语还包括已经历翻译后修饰的肽，所述修饰例如，糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团进行的衍生化、蛋白水解裂解或通过非天然存在的氨基酸进行的修饰。

如本文所用的术语“多价寡肽”是指包含两种或更多种减毒葡萄球菌蛋白的融合蛋白，例如，以任何顺序融合在一起成为单一多肽的超抗原(SAg)类毒素或其任何片段、变体或衍生物。寡肽可包括如本文其它地方所述的其它异源肽。用于包含在本文提供的多价寡肽中的其它肽包括本文其它地方或PCT公布号WO 2012/109167A1和WO 2013/082558 A1中描述的各种其它葡萄球菌类毒素或其片段、变体或衍生物，所述PCT公布均以引用的方式整体并入本文。

本公开所提供的类毒素和类毒素的融合物的寡肽的集合在本文中统称为“多价寡肽和/或SAg类毒素”或“多价寡肽、SAg类毒素或其任何组合”。这些集合提及意图包括但不限于如本文提供的任何一种类毒素或寡肽，或如本文提供的两种、三种、四种或更多种类毒素或寡肽。

当提及本公开的多价寡肽和/或SAg类毒素时，术语“片段”、“衍生物”或“变体”包括保留一种或多种源蛋白的至少一些免疫原性或抗原性的任何多肽。如本文所述的多价寡肽和/或SAg的片段包括蛋白水解片段、缺失片段或在表达、纯化和/或施用至动物期间表现出增加的溶解度的片段。如本文所述的多价寡肽和/或SAg的片段还包括在递送至受试者时表现出降低的致病性或毒性的蛋白水解片段或缺失片段。多肽片段还包括多肽的包含源多肽的抗原或免疫原性表位，包括线性以及三维表位的任何部分。

多肽的“表位片段”是含有表位的多肽的一部分。“表位片段”除了一个或多个表位外，还可但不必含有氨基酸序列。

如本文所用，术语“变体”是指由于氨基酸取代、缺失、插入和/或修饰而不同于所列举多肽的多肽。非天然存在的变体可使用本领域已知的诱变技术来产生。在一些方面，变体多肽因三个氨基酸或更少氨基酸的取代、缺失或添加而不同于鉴定的序列。通常可通过修饰多肽序列并使用例如本文所述的代表性程序评价修饰的多肽的抗原性或致病性性质来鉴定此类变体。在一些方面，多价寡肽和/或SAg类毒素的变体形成蛋白质复合物，所述蛋白质复合物的毒性低于野生型复合物。

本文公开的多肽变体表现出与鉴定的多肽至少约85％、90％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的序列同一性。变体多肽可包含保守或非保守氨基酸取代、缺失或插入。除了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个氨基酸取代(包括本文其它地方所述的特定突变)外，变体可包含与各种野生型葡萄球菌蛋白相同的多价寡肽和/或SAg，其中所述取代使复合物的毒性低于相应的野生型蛋白质复合物。如本文所述的多价寡肽和/或SAg的衍生物是已被改变以便表现出在天然多肽上未发现的另外特征的多肽。实例包括融合蛋白。类似物是本文所述的多价寡肽和/或SAg类毒素的另一种形式。一个实例是可通过裂解原蛋白而活化以产生活性成熟多肽的原蛋白。

变体也可以或可替代地含有其它修饰，由此，例如多肽可缀合或偶联，例如融合至异源氨基酸序列，例如在共同翻译或翻译后引导蛋白质转移的蛋白质的N-末端的信号(或前导)序列。多肽也可缀合或偶联至接头或其它序列以易于合成、纯化或鉴定多肽(例如6-His)，或增强多肽与固体载体的结合。例如，多肽可缀合或偶联至免疫球蛋白Fc区。多肽也可缀合或偶联至赋予或调节对所述多肽的免疫应答的序列(例如，T细胞表位、B细胞表位、细胞因子、趋化因子等)和/或增强多肽的摄取和/或抗原呈递细胞或其它免疫系统细胞对多肽的加工。所述多肽也可缀合或偶联至来自葡萄球菌属物种和/或来自其它细菌和/或其它病毒的其它多肽/表位以产生杂合免疫原性蛋白，所述杂合免疫原性蛋白单独或与各种佐剂组合可引发对其它病原生物体的保护性免疫。多肽也可缀合或偶联至赋予更大稳定性或改善半衰期的部分，如但不限于白蛋白、免疫球蛋白Fc区、聚乙二醇(PEG)等。所述多肽也可缀合或偶联至来自葡萄球菌属物种和/或来自其它细菌和/或其它病毒的部分(例如，免疫原性碳水化合物，例如荚膜多糖或表面多糖)以产生修饰的免疫原性蛋白，所述修饰的免疫原性蛋白单独或与一种或多种佐剂组合可增强和/或协同保护性免疫。在某些方面，本文所述的多肽还包含免疫原性碳水化合物。在一方面，所述免疫原性碳水化合物是糖。

在整个说明书中，术语“糖”可表示多糖或寡糖，并且包括两者。本公开的多糖可从细菌中分离并且可通过已知方法确定大小。例如，可确定全长多糖的“大小”(例如，可通过各种方法减小它们的大小，所述方法如酸水解处理、过氧化氢处理、通过

随后过氧化氢处理确定大小以产生寡糖片段或微流化)。可确定多糖的大小以降低多糖样品中的粘度和/或改善缀合产物的过滤性。寡糖具有少量重复单元(例如，5-30个重复单元)，并且通常是水解的多糖。本公开的多糖可重组产生。

金黄色葡萄球菌荚膜抗原是表面相关的、抗原特异性有限的并且在临床分离株中高度保守的。在一方面，本公开的免疫原性碳水化合物是金黄色葡萄球菌的荚膜多糖(CP)。在一方面，荚膜糖可以是全长多糖，然而在其它方面，它可以是一个寡糖单元，或者比重复寡糖单元的天然长度的糖链短。葡萄球菌分离株的血清分型研究揭示了若干推定荚膜血清型，其中5型和8型(CP5和CP8)在来自临床感染的分离株中最普遍，分别占从人回收的分离株的约25％和50％(O’Riordan和Lee,Clinical Microbiology Reviews,2004年1月,第218-234页,第17卷,第1期；Poutrel和Sutra,J Clin Microbiol.1993年2月；31(2):467-9)。还从家禽、牛、马和猪回收了相同的分离株(Tollersrud等人,J Clin Microbiol.2000年8月；38(8):2998-3003；Cunnion KM等人,Infect Immun.2001年11月；69(11):6796-803)。分别从原型菌株Reynolds和Becker纯化的5型和8型荚膜多糖在结构上彼此非常相似，并且与由菌株T制得的胶囊非常相似，如Wu和Park先前所描述(Wu和Park.1971.J.Bacteriol.108:874-884)。5型具有结构(→4)-3-O-Ac-β-D-ManNAcA-(1→4)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→)_n(Fournier,J.M.,等人,1987.Ann.Inst.Pasteur Microbiol.138:561-567；Moreau,M.,等人,1990.Carbohydr.Res.201:285-297)，并且8型具有结构(→3)-4-O-Ac-β-D-ManNAcA-(1→3)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→)_n(Fournier,J.M.,等人,1984.Infect.Immun.45:87-93)。5型和8型多糖的不同之处仅在于糖之间的键联以及氨基甘露醇醛酸残基的O-乙酰化的位点，但它们在血清学上是不同的。

与去毒的重组铜绿假单胞菌外毒素A载剂缀合的5型和8型CP在小鼠模型中显示出高度免疫原性和保护性(A Fattom等人,Infect Immun.1993年3月；61(3):1023–1032；AFattom等人,Infect Immun.1996年5月；64(5):1659–1665)，并且CP5特异性抗体从免疫的动物的被动转移诱导针对小鼠的全身性感染(Lee等人,Infect Immun.1997年10月；65(10):4146–4151)和针对用血清型5金黄色葡萄球菌激发的大鼠的心内膜炎(Shinefield H等人,N Engl J Med.2002年2月14日；346(7):491-6)的保护。开发了在小鼠中提供针对金黄色葡萄球菌激发的75％保护的二价CP5和CP8缀合物疫苗(

NabiBiopharmaceutical)。疫苗已在人体上进行了测试(Fattom AI等人,Vaccine.2004年2月17日；22(7):880-7；Maira-Litrán T等人,Infect Immun.2005年10月；73(10):6752-62)。在某些方面，本公开的重组肽或多价寡肽与免疫原性碳水化合物(例如，CP5、CP8、CP片段或其组合)组合或缀合。

用聚-N-乙酰葡糖胺(PNAG)(McKenney D.等人,Science.1999年5月28日；284(5419):1523-7)或聚-N-琥珀酰乙酰葡糖胺(PNSG)(Tuchscherr LP.等人,InfectImmun.2008年12月；76(12):5738-44.Epub 2008年9月22日)(两者均是金黄色葡萄球菌表面碳水化合物)免疫在实验动物模型中显示出针对金黄色葡萄球菌激发的至少部分保护。PNSG被鉴定为表皮葡萄球菌荚膜多糖/粘附素(PS/A)的化学形式，其介导凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)与生物材料的粘附，充当表达PS/A的CoNS菌株的胶囊，并且是保护性抗体的靶标。PNSG也由金黄色葡萄球菌制成，其中它是环境调控的、体内表达的表面多糖并且类似地充当保护性免疫的靶标(McKenney D.等人,J.Biotechnol.2000年9月29日；83(1-2):37-44)。在本公开的某些方面，免疫原性碳水化合物是表面多糖，例如聚-N-乙酰葡糖胺(PNAG)、聚-N-琥珀酰葡糖胺(PNSG)、表面多糖片段或其组合。

壁磷壁酸(WTA)是在金黄色葡萄球菌菌株上广泛表达的重要多糖(Neuhaus,F.C.和J.Baddiley,Microbiol Mol Biol Rev,2003.67(4):686-723)，并且WTA的抗血清已显示出单独和在补体存在下诱导调理吞噬杀伤((Thakker,M.,等人,Infect Immun,1998.66(11):5183-9)和Fattom等人,美国专利7,754,225)。WTA与肽聚糖连接，并且突出穿过细胞壁，从而在非胶囊化菌株(如USA300)上变得显著暴露，所述菌株负责美国的大多数社区获得性MRSA(CA MRSA)病例例(Hidron,A.I.,等人,Lancet Infect Dis,2009.9(6):384-92)。

脂磷壁酸(LTA)是革兰氏阳性细菌，例如金黄色葡萄球菌的细胞壁的成分。LTA可通过膜磷脂非特异性地结合至靶细胞，或者特异性地结合至CD14和Toll样受体。靶标结合的LTA可与循环抗体相互作用并活化补体级联，以诱导被动免疫杀伤现象。它还触发从嗜中性粒细胞和巨噬细胞释放活性氧和氮物质、酸性水解酶、高度阳离子性的蛋白酶、杀菌阳离子肽、生长因子和细胞毒性细胞因子，它们可协同作用来增强细胞损伤。

在某些方面，表面多糖与本公开的多肽组合或缀合。在某些方面，表面多糖是例如聚-N-乙酰葡糖胺(PNAG)、聚-N-琥珀酰葡糖胺(PNSG)、壁磷壁酸(WTA)、脂磷壁酸(LPA)、所述表面多糖的任一者的片段、或所述表面多糖的两者或更多者的组合。

如本文所用的术语“序列同一性”是指两个或更多个多核苷酸序列之间或两个或更多个多肽序列之间的关系。当一个序列中的位置被比较器序列的相应位置中相同核酸碱基或氨基酸占据时，所述序列在所述位置被称为“相同”。百分比“序列同一性”是通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸的位置的数量以产生“相同”位置的数量来计算。然后将“相同”位置的数量除以比较窗口中的位置总数并且乘以100以产生“序列同一性”的百分比。“序列同一性”的百分比是通过比较在窗口上的两个最佳比对的序列和来自另一种分离株的同源多肽来确定。为了最佳比对序列以进行比较，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可包含称为空位的添加或缺失，而参考序列保持恒定。最佳比对是即使具有空位也能在参考序列与比较物序列之间产生最大可能数量的“相同”位置的比对。可使用程序“BLAST 2Sequences”的版本来确定两个序列之间的“序列同一性”百分比，所述程序可自2004年9月1日起从美国国家生物技术信息中心获得，所述程序结合程序BLASTN(用于核苷酸序列比较)和BLASTP(用于多肽序列比较)，所述程序BLASTN和BLASTP是基于Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(12):5873-5877,1993)的算法。使用“BLAST 2序列”时，自2004年9月1日起作为默认参数的参数可用于字长(3)、空位罚分(11)、空位延伸罚分(1)、空位下降(50)、期望值(10)和任何其它所需的参数，包括但不限于矩阵选项。

如本文所用，术语“表位”是指在动物，例如哺乳动物，例如人中具有抗原或免疫原性活性的多肽的部分。如本文所用，“免疫原性表位”被定义为如通过本领域已知的任何方法确定的在动物中引发免疫应答的蛋白质的一部分。如本文所用，术语“抗原表位”被定义为如通过本领域熟知的任何方法确定的抗体或T细胞受体可免疫特异性地结合其抗原的蛋白质的一部分。免疫特异性结合不包括非特异性结合，但不一定排除与其它抗原的交叉反应性。尽管所有的免疫原性表位都是抗原性的，但是抗原表位不需要是免疫原性的。

如本文所用，“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的一部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸，但它可被认为是编码区的一部分，但任何侧翼序列(例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子等)在编码区之外。

术语“密码子优化”在本文中被定义为通过用在目标宿主的基因中更常或最常使用的密码子置换天然序列的至少一个、多于一个或大量密码子来修饰核酸序列以增强所述宿主的细胞中的表达。不同的物种对于具有特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏好。

术语“组合物”或“药物组合物”可包括含有本公开的免疫原性多肽以及例如佐剂或药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂的组合物，所述组合物被施用至已经患有金黄色葡萄球菌感染的个体或需要针对金黄色葡萄球菌感染的免疫的个体。

术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适合于与人类和动物的组织接触而无过度毒性或其它并发症、与合理的利益/风险比相称的组合物。在一些方面，本文所述的多肽、多核苷酸、组合物和疫苗是药学上可接受的。

“有效量”是以单剂量或作为一系列剂量的一部分向个体施用对于治疗或预防而言有效的量。量例如在其施用使得相对于未治疗的个体金黄色葡萄球菌感染的发生率降低时是有效的，如例如用感染性金黄色葡萄球菌感染或激发之后所确定，包括但不限于菌血症减轻、毒血症减轻、败血症减轻、症状减轻、免疫应答增强、免疫反答调节或恢复所需的时间减少。这种量取决于待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的分类组(例如，人、非人灵长类、灵长类等)、个体免疫系统的应答能力、所需治疗或保护的程度、疫苗的配制、医学情况的专业评估以及其它相关因素而变化。预期所述有效量将属于可通过常规试验确定的相对宽泛范围。通常，单剂量是约10μg至10mg/kg体重的纯化的多肽或一定量的修饰的载剂生物体或病毒、或其片段或残余物，足以提供相当数量的重组表达的多价寡肽和/或SAg类毒素，如本文所述。术语“肽疫苗”或“亚单位疫苗”是指包含一种或多种本文所述的多肽的组合物，当将其施用至动物时可用于刺激针对葡萄球菌(例如金黄色葡萄球菌)感染的免疫应答。

术语“受试者”是指需要诊断、预后、免疫或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括但不限于人、家养动物、农场动物、动物园动物如熊、运动动物、宠物动物如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、熊、奶牛；灵长类动物，如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科动物，如狗和狼；猫科动物，如猫、狮子和老虎；马科动物，如马、驴和斑马；食用动物，如牛、猪和绵羊；有蹄类动物，如鹿和长颈鹿；啮齿动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等。在一方面，受试者是人受试者。

如本文所用，“有需要的受试者”是指期望治疗，即预防、治愈、延缓葡萄球菌(例如金黄色葡萄球菌)疾病症状或降低其严重程度或者使得在指定时间段内没有由金黄色葡萄球菌引起的疾病的恶化或两者的个体。

如本文所用的术语“初免(priming)”或“初免(primary)”和“加强(boost)”或“加强(boosting)”分别是指初始免疫和随后免疫，即根据这些术语在免疫学中通常具有的定义。然而，在某些方面，例如，在初免组分和加强组分在单一制剂的情况下，由于同时施用“初免”和“加强”组合物，因此不需要进行初始免疫和随后免疫。

如本文所用，“超抗原活性”是对多价寡肽或SAg类毒素的残余毒性的量度，并且可与野生型SAg毒素或与另一参考SAg类毒素或含有多价寡肽的SAg类毒素的残余毒性相比进行测量。出于本公开的目的，可通过在如本文其它地方所述的体外刺激测定种测量SAg毒素、类毒素或寡肽针对分离的外周血单核细胞(PBMC)的活性来确定与参考多肽相比“超抗原活性”的增加或减少。

II.超抗原(SAg)类毒素和多价寡肽

本公开提供了包含源自葡萄球菌超抗原的减毒多肽亚基(在本文中称为“类毒素”)的重组寡肽融合蛋白。在某些方面，所述SAg类毒素通过一个或多个突变减毒，以降低其超抗原活性、毒性和/或毒力，同时保持其免疫原性。因此，本公开提供了一种减毒的金黄色葡萄球菌来源的超抗原(SAg)葡萄球菌肠毒素A(SEA)类毒素或其片段、变体或衍生物，其包含四个相对于野生型SEA的突变，所述四个相对于野生型SEA的突变对应于SEQ ID NO:4中的L48R、D70R、Y92A和H225A突变。在某些方面，具有所述四个指定突变的减毒SEA类毒素或其片段、变体或衍生物包含与SEQ ID NO:4至少90％相同的氨基酸序列。在某些方面，所述减毒SEA类毒素或其片段、变体或衍生物包含SEQ ID NO:4和/或由SEQ ID NO:4组成。应当理解，本文用于描述点突变的命名法(例如“L48R”)是与不含有异源表达所需的N-末端甲硫氨酸的野生型SAg蛋白相比。

在某些方面，具有所述四个指定突变的SEA类毒素或其片段、变体或衍生物与野生型SEA毒素相比具有降低的超抗原活性、降低的毒性和/或毒性较低。在某些方面，具有所述四个指定突变的SEA类毒素或其片段、变体或衍生物与包含SEQ ID NO:3的SEA毒素(SEA_{L48R/D70R/Y92A})相比具有降低的超抗原活性、降低的毒性和/或毒性较低。在某些方面，具有所述四个指定突变的SEA类毒素或其片段、变体或衍生物与由SEQ ID NO:3组成的SEA毒素相比具有降低的超抗原活性、降低的毒性和/或毒性较低。

在某些方面，具有所述四个指定突变的减毒SEA类毒素或其片段、变体或衍生物具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于3％、小于2％或小于1％的野生型SEA毒素的超抗原活性。在某些方面，具有所述四个指定突变的减毒SEA类毒素或其片段、变体或衍生物具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于3％、小于2％或小于1％的包含SEQ ID NO:3的SEA类毒素的超抗原活性。在某些方面，具有所述四个指定突变的减毒SEA类毒素或其片段、变体或衍生物具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于3％、小于2％或小于1％的由SEQ IDNO:3组成的SEA类毒素的超抗原活性。

在如本文公开的包含对应于SEQ ID NO:4中的L48R、D70R、Y92A和H225A突变的四个相对于野生型SEA的突变的任何减毒SEA类毒素或其片段、变体或衍生物的某些方面，如与野生型SEA毒素、包含SEQ ID NO:3的SEA类毒素和/或由SEQ ID NO:3组成的SEA类毒素相比，免疫原性得以维持。在某些方面，用包含所述四个指定突变的SEA类毒素或其片段、变体或衍生物免疫引发针对野生型SEA毒素的中和抗体。

此外，在某些方面，本公开提供了一种多价寡肽，所述多价寡肽包含以任何顺序排列的两种或更多种，例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种金黄色葡萄球菌来源的类毒素或其片段、变体或衍生物。所述多价寡肽的两种或更多种金黄色葡萄球菌来源的类毒素或其片段、变体或衍生物可以是相同或不同的。

美国公布号2016/0185829A1(以引用的方式并入本文)描述了简化的超抗原(SAg)类毒素疫苗，其包含超抗原的突变型的融合寡肽，即重组TSST-1_{L30R/D27A/I46A}(SEQ ID NO:1)、SEB_{L45R/Y89A/Y94A}(SEQ ID NO:2)和SEA_{L48R/D70R/Y92A}(SEQ ID NO:3)。这种多价寡肽在本文中称为rTBA(图1)并且具有氨基酸序列SEQ ID NO:5。rTBA构建体能够诱导广泛中和抗体。与三种单独类毒素的简单混合物相比，这种融合蛋白诱导更好的总体抗体和中和应答，但它保留一些残余超抗原活性。

本文提供了一种改进rTBA的多价寡肽。在某些方面，所述多价寡肽包含两种或更多种SAg类毒素的融合蛋白，所述融合蛋白相对于包含SEQ ID NO:5和/或由SEQ ID NO:5组成的SAg融合蛋白具有降低的超抗原活性、毒性和/或毒力。在某些方面，所述多价寡肽具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于3％、小于2％或小于1％的包含SEQ ID NO:5的野生型SEA毒素和/或SAg融合蛋白的超抗原活性、毒性和/或毒力(图4)。在某些方面，所述多价寡肽维持包含SEQ ID NO:5和/或由SEQ ID NO:5组成的SAg融合蛋白的免疫原性。在某些方面，用所述多价寡肽免疫引发针对SAg TSST-1毒素、SAg SEB毒素、SAg SEA毒素或其任何组合的中和抗体。在某些方面，用所述多价寡肽免疫引发针对除TSST-1、SEB或SEA以外的SAg毒素的中和抗体。在某些方面，所述多价寡肽与组成其的单独SAg类毒素的等摩尔混合物相比表现出更大和/或更广泛的免疫原性(图5)。在某些方面，用所述多价寡肽对受试者进行免疫提供针对野生型SAg TSST-1毒素、野生型SAg SEB毒素和野生型SAg SEA毒素中的至少一种或多种的保护(图7)。在某些方面，所述多价寡肽或包含所述寡肽的组合物可用于治疗或预防葡萄球菌疾病或感染。

在本公开的某些方面，多价寡肽包含呈任何顺序的葡萄球菌SAg类毒素或其片段、变体或衍生物，但不限于葡萄球菌肠毒素A(SEA)、葡萄球菌肠毒素B(SEB)、葡萄球菌肠毒素C1-3(SEC1-3)、葡萄球菌肠毒素E(SEE)、葡萄球菌肠毒素H(SHE)、葡萄球菌肠毒素I(SEI)、葡萄球菌肠毒素K(SEK)、葡萄球菌中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)、链球菌致热性外毒素C(SpeC)、葡萄球菌肠毒素D(SED)、链球菌致热性外毒素A(SpeA)或其任何组合。

在某些方面，所述多价寡肽包含葡萄球菌中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)类毒素或其片段、变体或衍生物。在某些方面，所述TSST-1类毒素是减毒类毒素TSST-1_{L30R/D27A/I46A}(SEQ ID NO:1)，或包含对应于SEQ ID NO:1中的L30R、D27A和I46A突变的三个相对于野生型TSST-1的减毒突变以及与SEQ ID NO:1至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的TSST-1类毒素。在某些方面，所述寡肽包含葡萄球菌肠毒素B(SEB)类毒素或其片段、变体或衍生物。在某些方面，所述SEB类毒素是减毒类毒素SEB_{L45R/Y89A/Y94A}(SEQ ID NO:2)，或包含对应于SEQ ID NO:2中的L45R、Y89A和Y94A突变的三个相对于野生型SEB的减毒突变以及与SEQ ID NO:2至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的SEB类毒素。在某些方面，所述寡肽包含葡萄球菌肠毒素A(SEA)类毒素或其片段、变体或衍生物。在某些方面，所述SEA类毒素是减毒类毒素SEA_{L48R/D70R/Y92A/H225A}(SEQ ID NO:4)，或包含对应于SEQ ID NO:4中的L48R、D70R、Y92A和H225A突变的四个相对于野生型SEA的减毒突变以及与SEQ ID NO:4至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的SEA类毒素。

在某些方面，如本文提供的多价寡肽包含至少一种葡萄球菌肠毒素A(SEA)减毒类毒素，其包含四个相对于野生型SEA的突变，所述四个相对于野生型SEA的突变对应于如本文其它地方所述的SEA_{L48R/D70R/Y92A/H225A}(SEQ ID NO:4)中的L48R、D70R、Y92A和H225A突变。在某些方面，所述多价寡肽包含两种或更多种或三种或更多种SAg类毒素或其片段、变体或衍生物。在某些方面，所述寡肽还包含如本文其它地方所述的葡萄球菌肠毒素B(SEB)减毒类毒素、如本文其它地方所述的葡萄球菌中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)减毒类毒素以及其任何组合。在某些方面，所述TSST-1类毒素包含对应于SEQ ID NO:1中的L30R、D27A和I46A突变的三个相对于野生型TSST-1的突变以及与SEQ ID NO:1至少90％相同的氨基酸序列；所述SEB类毒素包含对应于SEQ ID NO:2中的L45R、Y89A和Y94A突变的三个相对于野生型SEB的突变以及与SEQ ID NO:2至少90％相同的氨基酸序列；并且所述SEA减毒类毒素包含对应于SEQ ID NO:4的SEA类毒素中的L48R、D70R、Y92A和H225A突变的四个相对于野生型SEA的突变以及与SEQ ID NO:4至少90％相同的氨基酸序列。在某些方面，所述TSST-1类毒素包含氨基酸序列SEQ ID NO:1；所述SEB类毒素包含氨基酸序列SEQ ID NO:2；并且所述SEA减毒类毒素包含氨基酸序列SEQ ID NO:4。

在某些方面，所述多价寡肽包含SAg减毒类毒素SEB_{L45R/Y89A/Y94A}(“B”)、SEA_{L48R/D70R/Y92A/H225A}(“A225”)、TSST-1_{L30R/D27A/I46A}(“T”)或其任何组合。在某些方面，所述多价寡肽至少包含SEA_{L48R/D70R/Y92A/H225A}。在某些方面，所述多价寡肽包含“TBA225”融合物(rTBA225；SEQ ID NO:6)、由所述“TBA225”融合物组成或基本上由所述“TBA225”融合物组成，所述“TBA225”融合物是呈所述顺序的TSST-1_{L30R/D27A/I46A}、SEB_{L45R/Y89A/Y94A}和SEA_{L48R/D70R/Y92A/H225A}的融合物。或者所述寡肽具有对应于SEB_{L45R/Y89A/Y94A}、SEA_{L48R/D70R/Y92A/H225A}和TSST-1_{L30R/D27A/I46A}的那些的减毒突变，其中所述寡肽包含与SEQ ID NO:6至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列、由所述氨基酸序列组成或基本上由所述氨基酸序列组成。

如所指出的，在某些方面，所述多价寡肽是rTBA225(SEQ IN NO:6)，其是SAg三重突变型TSST-1_{L30R/D27A/I46A}(SEQ ID NO:1)和SEB_{L45R/Y89A/Y94A}(SEQ ID NO:2)以及SEA四重突变型SEA_{L48R/D70R/Y92A/H225A}(SEQ ID NO:4)的融合物。rTBA225保留rTBA(SEQ ID NO:5)的优异免疫原性，同时具有降低的超抗原活性。图1中示出具有上述SAg类毒素的不同排序的其它可能的构型。本公开中还提供了一种用于rTBA和rTBA225的无标签纯化的方法。

所述SAg类毒素可在有或无接头的情况下以任何顺序连接在一起，并且可以是相同或不同的。在一些方面，包含在所述多价寡肽中的SAg类毒素可彼此直接融合。在其它方面，包含在所述多价寡肽中的SAg类毒素可经由接头缔合。可基于它们采用柔性、延伸构象、或可与连接的表位相互作用的二级结构的能力、或基于它们增加融合多肽的总体溶解性的能力、或基于它们缺乏影响连接的肽区的静电或水相互作用效应而选择合适的接头。在某些方面，所述接头是肽接头。在某些方面，用于如本文提供的多价寡肽中的肽接头可包含至少一个、但不超过50个氨基酸，例如提供柔性链的小氨基酸，例如甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸或其组合。在某些方面，用于如本文提供的多价寡肽中的接头可包括(GGGS)_n或(GGGGS)_n，其中n是1至10的整数。在某些方面，如在融合肽rTBA225(SEQ ID NO:6)中，所述接头是(GGGGS)_n接头，其中n＝3。

在某些方面，所述多价寡肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:6、由SEQ ID NO:6组成或基本上由SEQ ID NO:6组成。

表1：SAg和多价寡肽蛋白质序列

在另一方面，如本文提供的多价寡肽和/或SAg类毒素可连接至异源多肽。可使用各种异源多肽，包括但不限于赋予稳定、分泌或简化纯化的N-或C-末端肽，如六聚组氨酸-标签、泛素标签、NusA标签、几丁质结合结构域、ompT、ompA、pelB、DsbA、DsbC、c-myc、KSI、聚天冬氨酸、(Ala-Trp-Trp-Pro)n、聚苯丙氨酸、聚半胱氨酸、聚精氨酸、B-标签、HSB-标签、绿色荧光蛋白(GFP)、流感病毒血凝素(HAI)、钙调素结合蛋白(CBP)、半乳糖结合蛋白、麦芽糖结合蛋白(MBP)、纤维素结合结构域(CBD)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、链球菌蛋白G、葡萄球菌蛋白A、T7基因10、抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白/Strep-标签复合物、trpE、氯霉素乙酰转移酶、lacZ(β-半乳糖苷酶)、His-patch硫氧还蛋白、硫氧还蛋白、FLAG^TM肽(Sigma-Aldrich)、S-标签或T7标签。参见例如，Stevens,R.C.,Structure,8:R177-R185(2000)。异源多肽还可包括有助于从宿主细胞进行如本文所述的多价寡肽和/或SAg类毒素的转运、易位、加工和/或纯化的任何前序列和/或原序列或任何有用的免疫原性序列，包括但不限于编码微生物病原体的T细胞表位或其它免疫原性蛋白质和/或表位的序列。

在一些方面，如本文所述连接至异源多肽的多价寡肽和/或SAg类毒素可包含肽接头序列，所述肽接头序列连接包含两个或更多个肽区的序列。可基于它们采用柔性、延伸构象、或可与连接的表位相互作用的二级结构的能力、或基于它们增加融合多肽的总体溶解性的能力、或基于它们缺乏影响连接的肽区的静电或水相互作用效应而选择合适的肽接头序列。

在一些方面，如本文所述的多价寡肽和/或SAg类毒素是分离的。“分离”的多肽是已从其天然环境除去的多肽。术语“分离的”并不意味着纯化的任何特定水平。出于本公开的目的，在非天然宿主细胞中表达的如本文所述的重组产生的多价寡肽和/或SAg被认为是分离的，已通过任何合适的技术(包括通过过滤、色谱法、离心等)分离、分级分离或部分或基本上纯化的多肽也被认为是分离的。

如本文所述提供，如本文所述的多价寡肽和/或SAg的产生可通过培养包含可操作地编码本公开多肽的多核苷酸的宿主细胞并回收所述多肽来实现。确定用于培养这种宿主细胞并表达所述多核苷酸的条件通常对所述宿主细胞和表达系统具有特异性，并且在本领域技术人员的知识范围内。同样，用于回收本公开的多肽的合适方法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于色谱法、过滤、沉淀或离心。

III.多核苷酸

本公开还提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码如本文其它地方所述的多价寡肽和/或SAg类毒素的核酸。在某些方面，如本文提供的分离的多核苷酸还包含非编码区，诸如本文其它地方所述的启动子、操纵子或转录终止子。在一些方面，本公开涉及如本文所述并且还包含异源核酸的多核苷酸。在一些方面，所述异源核酸可编码与如本文所述的多肽融合的异源多肽。例如，如本文所述的分离的多核苷酸可包含编码例如与如本文所述的多肽融合的异源多肽的另外编码区，或编码与如本文所述的多肽分离的异源多肽的编码区，如但不限于选择性标记、另外的免疫原、免疫增强子等。

还提供了包含本文所述的多核苷酸的表达构建体、载体和/或宿主细胞。分离的多核苷酸的实例是在载体中包含的重组多核苷酸。在某些方面，所述载体是表达载体。分离的多核苷酸的其它实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的(部分或基本上)纯化的多核苷酸。在本公开的某些方面，多核苷酸是“重组的”。根据本公开的分离的多核苷酸或核酸还包括以合成方式产生的此类分子。本文所述的多核苷酸或多肽的相对纯度可通过熟知的方法容易地确定。

编码如本文所述的多价寡肽和/或SAg的遗传工程化的多核苷酸也包括在本公开的范围内。编码如本文所述的多价寡肽和/或SAg的核酸的修饰可由本领域技术人员容易地实现，例如通过寡核苷酸定向的位点特异性诱变或从头核酸合成来实现。

一些方面公开了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码如本文其它地方所述的多价寡肽和/或SAg类毒素的核酸，其中编码所述多肽的编码区已进行密码子优化。如本领域普通技术人员所了解的，由于遗传密码的冗余，各种核酸编码区将编码同一多肽。包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列的偏差允许编码区序列的差异。由于每个密码子由三个核苷酸组成，并且包含DNA的核苷酸被限制为四个特定碱基，因此存在64种可能的核苷酸组合，其中61种编码氨基酸(剩余三个密码子编码终止翻译的信号)。显示哪些密码子编码哪些氨基酸的“遗传密码”在本文中如表2所重现。结果，许多氨基酸由多于一个密码子指定。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四个三联体编码，丝氨酸和精氨酸由六个三联体编码，而色氨酸和蛋氨酸仅由一个三联体编码。这种简并性允许DNA碱基组成在广泛范围内变化，而不会改变由DNA编码的多肽的氨基酸序列。

表2：标准遗传密码

应了解，根据本公开的编码多肽的任何多核苷酸均在本公开的范围内，而与所使用的密码子无关。

许多生物体显示出对使用特定密码子编码在生长多肽链中特定氨基酸的插入的偏倚。密码子偏好或密码子偏倚(生物体之间密码子使用的差异)由遗传密码的简并性提供，并且在许多生物体中都有据可查。

已经提出了不同的因素来促进密码子使用偏好，包括翻译选择、GC组成、链特异性突变偏倚、氨基酸保守性、蛋白质亲水性、转录选择以及甚至RNA稳定性。决定密码子使用的一种因素是形成基因组GC组成的突变偏倚。这种因素在具有极端碱基组成的基因组中最显著：具有高GC含量的物种(例如革兰氏阳性细菌)。突变偏倚不仅是密码子使用的基因间差异的原因，而且是同一基因组内的密码子使用的基因间差异的原因(Ermolaeva M,Curr.Issues Mol.Biol.3(4):91-97,2001)。

密码子偏倚经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，所述翻译效率进而被认为依赖于(除其它之外)所翻译的密码子的性质和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。所选tRNA在细胞中的优势通常反映肽合成中最常使用的密码子。因此，可基于密码子优化来定制基因以在给定生物体中最佳基因表达。

本公开提供了一种包含密码子优化的编码区的多核苷酸，所述密码子优化的编码区编码如本文所述的多价寡肽和/或SAg类毒素。密码子使用适于在给定原核或真核宿主细胞中的优化表达。在某些方面，密码子使用适于在大肠杆菌中的优化表达。

例如，SEQ ID NO:7是对编码rTBA融合蛋白的大肠杆菌表达进行密码子优化的核苷酸序列：

例如，SEQ ID NO:8是对编码rTBA225融合蛋白的大肠杆菌表达进行密码子优化的核苷酸序列：

通过将优选用于给定物种的基因的密码子并入DNA序列中来制备密码子优化的多核苷酸。还提供了包含多核苷酸的多核苷酸表达构建体、载体、宿主细胞，所述多核苷酸包含密码子优化的编码区，所述密码子优化的编码区编码如本文所述的多价寡肽和/或SAg。

鉴于可用于多种动物、植物和微生物物种的大量基因序列，有可能计算出密码子使用的相对频率。密码子使用表可容易地例如在http://www.kazusa.or.jp/codon/(2011年10月12日访问)的“密码子使用数据库”获得，并且可以多种方式对这些表进行修改。(Nakamura,Y.,等人,“Codon usage tabulated from the international DNA sequencedatabases:status for the year 2000”Nucl.Acids Res.28:292,2000)。

通过利用可用的表，本领域普通技术人员可将频率应用于任何给定的多肽序列，并且产生密码子优化的编码区的核酸片段，所述编码区编码所需的多肽、但是使用对于给定物种而言最佳的密码子。使用本领域普通技术人员熟知的标准和常规分子生物学操作，许多选项可用于合成通过任何上述方法设计的密码子优化的编码区。此外，基因合成可容易地商购获得。

IV.载体和表达系统

还提供了一种包含如本文提供的多核苷酸的载体。如本文所用，术语“载体”是指例如可例如通过限制性和连接将所需序列插入其中以便在不同遗传环境之间转运或在宿主细胞中表达的许多核酸中的任一种。核酸载体可以是DNA或RNA。载体包括但不限于质粒、噬菌体、噬菌粒、细菌基因组和病毒基因组。克隆载体是能够在宿主细胞中复制的载体，并且其特征还在于一个或多个核酸内切酶限制性位点，在所述位点可以可确定的方式裂解所述载体，并且可将所需的DNA序列连接至其中，以使得新的重组载体保留其在宿主细胞中复制的能力。就质粒而言，当质粒在宿主细菌内的拷贝数增加时，所需序列的复制可发生多次，或者在宿主通过有丝分裂繁殖之前每个宿主仅复制一次。在噬菌体的情况下，复制可在裂解阶段主动发生，或在溶菌阶段被动发生。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制。其它载体在引入宿主细胞中后整合至所述宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。

可与适当的宿主一起使用的多种合适的克隆载体中的任一种是本领域已知并且可商购的。如本文所用，术语“质粒”是指由遗传物质(即，核酸)组成的环状双链构建体，其中所述遗传物质是染色体外的并且在一些情况下自主复制。本文所述的多核苷酸可在环状或线性化质粒中或在任何其它种类的载体中。用于将核苷酸序列插入载体(例如表达载体)并转化或转染至适当宿主细胞中且在适合表达的条件下培养的程序通常是本领域已知的。

本公开还提供了一种载体，所述载体包含编码如本文其它地方所述的多价寡肽和/或SAg类毒素的核酸序列。在某些方面，所述载体是能够在合适的宿主细胞中表达如本文所述的多价寡肽和/或SAg类毒素的表达载体。术语“表达载体”是指能够表达本文描述的多肽的载体，即载体序列含有调控多肽的转录和翻译的调控序列，包括但不限于启动子、操纵子、转录终止位点、核糖体结合位点等。术语“表达”是指由编码序列编码的产物的生物产生。在大多数情况下，DNA序列(包括编码序列)被转录以形成信使RNA(mRNA)。然后，所述信使RNA被翻译以形成具有相关生物活性的多肽产物。此外，表达过程可涉及进一步加工步骤至RNA产物的转录，如剪接以除去内含子和/或多肽产物的转录后加工。

载体-宿主系统包括但不限于在体内(例如在动物中)或在体外(例如在细菌或细胞培养物中)的系统诸如细菌、哺乳动物、酵母、昆虫或植物细胞系统。根据本文的教义，适当宿主的选择应在本领域技术人员的范围内。在某些方面，所述宿主细胞是细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞或植物细胞。在某些方面，所述细菌是大肠杆菌。

用本公开的载体对宿主细胞进行遗传工程化(感染、转导、转化或转染)。因此，本公开的一个方面涉及一种包含载体的宿主细胞，所述载体包含如本文所述的多核苷酸。工程化的宿主细胞可在被改良为适合用于活化启动子、选择转化子或扩增多核苷酸常规营养培养基中培养。培养条件，如温度、pH等是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对普通技术人员将是显而易见的。如本文所用，术语“转染”是指诱导真核细胞接受分离的DNA(包括但不限于呈质粒形式的DNA)并将分离的DNA并入其基因组中的任何程序。如本文所用，术语“转化”是指诱导细菌细胞接受分离的DNA(包括但不限于呈质粒形式的DNA)并将分离的DNA并入其基因组中的任何程序。

细菌宿主表达载体系统包括但不限于用重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的原核生物(例如大肠杆菌)。在一些方面，与大肠杆菌一起使用的质粒使用由LacI蛋白经由IPTG诱导调控的T7启动子驱动的系统。大量合适的载体是本领域技术人员已知的，并且可商购获得。通过举例提供以下细菌载体：pET(Novagen)、pET28、pBAD、pTrcHIS、pBR322、pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK243-3、pDR540、pBR322、pPS10、RSF1010、pRIT5(Pharmacia)；pCR(Invitrogen)；pLex(Invitrogen)以及pUC质粒衍生物。

合适的表达载体含有调控序列，所述调控序列可以可操作地连接至编码如本文所述的多价寡肽和/或SAg类毒素的插入核苷酸序列。如本文所用，术语“调控序列”是指对宿主细胞转录编码如本文所述的多价寡肽和/或SAg类毒素的插入序列而言必需或有利和/或对宿主细胞将所得转录物翻译成所需的多价寡肽和/或SAg类毒素而言必需或有利的核苷酸序列。调控序列包括但不限于5'序列，如操纵子、启动子和核糖体结合序列；和3'序列，如聚腺苷酸化信号或转录终止子。调控序列也可包括增强子序列或上游活化子序列。

一般来说，细菌载体将包括复制起点和选择性标记，例如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、大肠杆菌的抗性基因，从而允许宿主细胞转化；以及源自高度表达基因的启动子以直接转录下游结构序列。合适的启动子包括但不限于T7启动子、λ(λ)启动子、T5启动子和lac启动子，或源自编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、酸性磷酸酶或热休克蛋白的操纵子的启动子，或诱导型启动子如镉(pcad)和β-内酰胺酶(pbla)。

一旦选择了表达载体，就可将如本文所述的多核苷酸克隆在启动子的下游，例如在多接头区中。将所述载体转化至适当的大肠杆菌菌株中，并且使用标准技术制备DNA。使用限制性酶切作图、DNA序列分析和/或PCR分析确认多核苷酸的取向和DNA序列以及包括在载体中的所有其它元件。带有正确质粒的细菌细胞可作为细胞库储存。

V.免疫原性组合物和药物组合物

还公开了含有有效量的如本文所述的多价寡肽和/或SAg类毒素或编码本公开的多肽的多核苷酸的组合物，例如免疫原性组合物或药物组合物。如本文所述的组合物还可包含另外的免疫原性组分(例如作为多价疫苗)以及载剂、赋形剂或佐剂。

可根据已知的方法配制如本文提供的组合物。适合的制备方法描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第19版,A.R.Gennaro,编辑,Mack PublishingCo.,Easton,PA(1995)中，所述文献以引用的方式整体并入本文。组合物可呈多种形式，包括但不限于，水溶液、乳液、凝胶、悬浮液、冻干形式或本领域已知的任何其它形式。此外，所述组合物可含有药学上可接受的添加剂，包括例如稀释剂、粘合剂、稳定剂和防腐剂。一旦配制，本公开的组合物即可直接施用至受试者。待治疗的受试者可以是动物；特别地，可治疗人受试者。

可与本公开的组合物一起使用的载剂是本领域熟知的，并且包括但不限于，例如甲状腺球蛋白、白蛋白(如人血清白蛋白)、破伤风类毒素和聚氨基酸(如聚L-赖氨酸、聚L-谷氨酸)、流感病毒、乙型肝炎病毒病毒核心蛋白等。可使用多种水性载剂，例如水、缓冲水、0.8％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。可通过常规的、熟知的灭菌技术将组合物灭菌，或者可将其过滤灭菌。可将得到的组合物包装为原样使用、或冻干，所述冻干制剂在施用之前与无菌溶液组合。组合物可含有药学上可接受的辅助物质以便接近生理条件，如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。

如本文提供的某些组合物还包含一种或多种佐剂，佐剂是添加至免疫原性组合物以例如增强、维持、定位或调节对免疫原的免疫应答的物质。术语“佐剂”是指具有(1)改变或增加对特定抗原的免疫应答或(2)增加或有助于药剂的作用的能力的任何材料。可增加多肽的表达、抗原性或免疫原性的任何化合物都是潜在佐剂。如本文所用，术语“免疫原性载剂”是指增强第二多肽或其片段、变体或衍生物的免疫原性的第一部分，例如多肽或其片段、变体或衍生物。

多种材料已显示出通过多种机制具有佐剂活性。例如，体液免疫的增加典型地通过针对抗原产生的抗体的效价的显著升高来表现，并且T细胞活性的增加典型地在细胞增殖或细胞毒性或细胞因子分泌方面的增加中来表现。佐剂还可例如通过将初次体液或Th₂应答改变为初次细胞或Th₁应答而改变或调节免疫应答。对给定抗原的免疫应答可通过本领域普通技术人员熟知和/或本文其它地方描述的各种免疫测定来进行测试。

多种佐剂是本领域普通技术人员熟悉的，并且在许多参考文献中进行了描述。可用于本文所述的组合物中的佐剂包括但不限于：惰性载剂，如明矾、膨润土、胶乳和丙烯酸类颗粒；不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂；基于铝的盐，如氢氧化铝；铝胶(Al(OH₃))；磷酸铝(AlPO₄)；基于钙的盐；二氧化硅；任何TLR生物配体；IDC-1001(也称为GLA-SE；吡喃葡萄糖基脂质佐剂稳定乳液)(Coler等人,PLoS One,2010.5(10):第e13677页；Coler等人,PLoSOne,2011.6(1):第e16333页)；CpG(Mullen等人,PLoS One,2008.3(8):第e2940页)或其任何组合。在某些方面，佐剂包含铝胶。佐剂的量、如何配制以及如何施用的所有参数完全在本领域普通技术人员的能力范围内。

在一些方面，本公开的组合物还包含脂质体或其它微粒载剂，所述脂质体或其它颗粒载剂可例如用于稳定制剂、使制剂靶向特定组织如淋巴组织、或增加多肽组合物的半衰期。此类微粒载剂包括乳液、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散物、板状层(lamellar layer)、iscoms等。在这些制剂中，本文描述的多肽可作为脂质体或其它颗粒的一部分并入，或者可与脂质体缀合递送。根据本公开使用的脂质体可由标准的形成囊泡的脂质形成，所述脂质通常包括中性或带负电荷的磷脂和固醇，如胆固醇。包含脂质体或其它微粒悬浮液以及如本文所述的多肽的组合物可按一定剂量静脉内、局部、局部施用，所述剂量尤其根据施用方式、所递送的多肽和所治疗疾病的阶段而变化。

对于固体组合物，可使用常规无毒固体载剂，其包括例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服施用，通过并入任何通常使用的赋形剂(如先前列出的那些载剂)和通常10％-95％的活性成分(即，如本文所述肽，通常处于25％-75％的浓度)而形成药学上可接受的无毒组合物。

对于气雾剂或粘膜施用，如本文所述的多肽可以细分形式提供，任选地与表面活性剂和推进剂和/或粘膜粘附剂(例如壳聚糖)一起提供。在某些方面，表面活性剂是药学上可接受的，并且在一些方面可溶于推进剂中。此类剂的代表是含有6至22个碳原子的脂肪酸与脂肪族多元醇或其环酐的酯或偏酯，所述脂肪酸如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油硬脂酸以及油酸。可使用混合酯，如混合的或天然的甘油酯。表面活性剂可占组合物的0.1重量％-20重量％，在一些方面0.25重量％-5重量％。组合物的余量通常是推进剂，尽管可使用不需要推进剂的雾化器并且相应地调整其它百分比。在一些方面，可将免疫原性多肽并入空气动力学轻颗粒(如美国专利号6,942,868或美国专利公布号2005/0008633中所述的那些颗粒)内。也可包括载剂，例如用于鼻内递送的卵磷脂。

本公开还涉及一种产生根据本公开的组合物的方法。在一些方面，所述产生所述组合物的方法包括：(a)分离根据本公开的多肽；以及(b)向所述分离的多肽添加佐剂、载剂和/或赋形剂。一些方面公开了将多肽与其它葡萄球菌抗原进一步组合。

一些方面包括多价疫苗。本公开的多价疫苗可包含如本文所述的多价寡肽和/或SAg类毒素，或编码多价寡肽和/或SAg类毒素的多核苷酸，以及一种或多种另外的免疫原性组分。此类组分可以是同一传染因子(例如金黄色葡萄球菌)或来自其它葡萄球菌的另外免疫原，或者可以是源自其它传染因子的可有效、方便或经济地一起施用的免疫原。在某些方面，如本文所述的多价寡肽和/或SAg类毒素可与其它毒素或其它基于毒性组分的疫苗组合以制备能够靶向多个细菌毒力决定簇的基于广泛毒素的多价疫苗。在其它方面，如本文所述的多价寡肽和/或SAg类毒素可与含有其它免疫原性、生物学上重要或保护性表位的多肽融合，以在单链中产生多价疫苗并诱导针对多种抗原的免疫应答。在另一方面，如本文所述的多价寡肽和/或SAg类毒素可与一个或多个T细胞表位融合以诱导T细胞免疫。

VI.治疗/预防方法和方案

还提供了一种在受试者中治疗或预防葡萄球菌(例如，金黄色葡萄球菌)感染或治疗或预防由葡萄球菌(例如，金黄色葡萄球菌)引起的疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的包含如本文所述的多价寡肽和/或SAg类毒素的组合物或编码所述多价寡肽和/或SAg类毒素的多核苷酸、载体或宿主细胞。在某些方面，受试者是动物，例如脊椎动物，例如哺乳动物，例如人。一些方面包括一种诱导针对金黄色葡萄球菌菌株的免疫应答的方法，所述方法包括向需要所述免疫应答的受试者施用有效量的包含如本文所述的多价寡肽和/或SAg类毒素的组合物或编码所述多价寡肽和/或SAg类毒素的多核苷酸、载体或宿主细胞。

在一些方面，向受试者预防性地施用包含如本文所述的多价寡肽和/或SAg类毒素的组合物或编码所述多价寡肽和/或SAg类毒素的多核苷酸、载体或宿主细胞，例如作为预防性疫苗，以在潜在或实际暴露于葡萄球菌(例如金黄色葡萄球菌)或罹患葡萄球菌相关症状之前在健康动物中建立或增强针对葡萄球菌(例如金黄色葡萄球菌)的免疫，从而预防疾病、缓解症状、减轻症状或降低疾病症状的严重程度。在一方面，所述疾病是呼吸系统疾病，例如肺炎。待治疗或预防的其它疾病或疾患包括但不限于菌血症、败血症、皮肤感染、伤口感染、心内膜炎、骨骼和关节感染、骨髓炎和/或脑膜炎。如本文所述的一种或多种组合物、多肽、多核苷酸、载体或宿主细胞也可用于治疗已经暴露于葡萄球菌(例如金黄色葡萄球菌)或已经患有葡萄球菌相关症状的受试者以进一步刺激动物的免疫系统，从而减轻或消除与所述暴露相关的症状。如本文所定义，“动物的治疗”是指使用本公开的一种或多种组合物、多肽、多核苷酸、载体或宿主细胞来在动物中预防、治愈、延缓金黄色葡萄球菌症状或降低金黄色葡萄球菌症状的严重程度，和/或使得在指定时间段内没有金黄色葡萄球菌症状的恶化。不需要如本文所述的任何组合物、多肽、多核苷酸、载体或宿主细胞提供针对葡萄球菌感染的全面保护或完全治愈或消除与葡萄球菌有关的所有症状。

如本文所用，“需要治疗性和/或预防性免疫的受试者”是指期望治疗，即预防、治愈、延缓葡萄球菌相关症状或降低葡萄球菌相关症状的严重程度或使得在指定时间内没有葡萄球菌相关症状的恶化的受试者。如本文所用，“需要免疫应答的受试者”是指需要针对金黄色葡萄球菌相关疾病的免疫应答的受试者。

在适当的情况下，用包含如本文所述的免疫原性组合物、多肽或多核苷酸的药物组合物治疗可单独发生或与其它治疗结合发生。

在治疗性应用中，将本公开的组合物、多肽或多核苷酸以足以引发针对所述多价寡肽和/或SAg类毒素的有效先天性体液和/或细胞应答以治愈或至少部分地阻止症状或并发症的量施用至患者。

足以实现此目标的量被定义为“治疗有效剂量”或“单位剂量”。对于这种用途有效的量将取决于(例如)所述多肽或多核苷酸组成、施用方式、所治疗疾病的阶段和严重程度、患者的体重和总体健康状况以及处方医师的判断。在一些方面，在一段时间内，初免剂量之后是加强剂量。

在一些方面，通常对于人，施用初始免疫(用于治疗性或预防性施用)，然后取决于通过测量患者血液中的抗体或T淋巴细胞应答确定的患者的应答和状况在数周至数月内根据加强方案在相同剂量范围内施用加强剂量。

如本文所述的多肽和组合物通常可用于严重的疾病状态，即危及生命或潜在危及生命的情况。在此类情况下，鉴于外来物质的最小化和多肽的相对无毒性质，治疗医师有可能并且感觉到需要施用显著过量的这些多肽组合物。

对于治疗性用途，可从金黄色葡萄球菌感染或风险因素的第一个迹象开始施用。在某些方面，初始剂量之后是加强剂量，直到例如症状基本减轻并且持续此后一段时间。在频繁感染中，可指示负载剂量，然后是加强剂量。

在某些方面，通过本文所述的方法将如本文所述的组合物递送至受试者，从而实现有效的免疫应答和/或有效的治疗性或预防性免疫应答。可使用任何施用方式，只要所述方式以足以产生对葡萄球菌(例如金黄色葡萄球菌)的免疫应答和/或在需要这种应答的动物中产生针对葡萄球菌(例如金黄色葡萄球菌)的预防或治疗上有效的免疫应答的量来产生所需多肽在所需组织中的递送和/或表达。根据所公开的方法，本文所述的组合物可通过粘膜递送、透皮递送、皮下注射、静脉内注射、口服施用、肺部施用、肌内(i.m.)施用或经由腹膜内注射来施用。其它合适的施用途径包括但不限于气管内、透皮、眼内、鼻内、吸入、腔内、导管内(例如，进入胰腺)和实质内(即进入任何组织)施用。透皮递送包括但不限于皮内(例如进入真皮或表皮)、透皮(例如经皮)和经粘膜施用(即进入或通过皮肤或粘膜组织)。腔内施用包括但不限于施用至口腔、阴道、直肠、鼻、腹膜或肠腔内以及鞘内(即进入椎管)、脑室内(即进入脑室或心室)、动脉内(即进入心房)和蛛网膜下(即进入脑的蛛网膜下腔)施用。

可使用任何施用方式，只要所述方式以足以产生对葡萄球菌(例如金黄色葡萄球菌)的免疫应答和/或在需要这种应答的动物中产生针对葡萄球菌(例如金黄色葡萄球菌)的预防或治疗上有效的免疫应答的量产生所需多肽的递送和/或表达。如本文所述的施用可通过例如针注射或本领域已知的其它递送或装置进行。

在一些方面，包含如本文所述的多价寡肽和/或SAg类毒素的组合物或编码所述多价寡肽和/或SAg类毒素的多核苷酸、载体或宿主细胞刺激抗体应答或细胞介导的免疫应答以足以用于保护动物免受葡萄球菌(例如金黄色葡萄球菌)感染。在其它方面，包含如本文所述的多价寡肽和/或SAg类毒素的组合物或编码所述多价寡肽和/或SAg类毒素的多核苷酸、载体或宿主细胞刺激体液和细胞介导的应答两者，其组合足以用于保护动物免受葡萄球菌(例如金黄色葡萄球菌)感染。在一些方面，包含如本文所述的多价寡肽和/或SAg类毒素的组合物或编码所述多价寡肽和/或SAg类毒素的多核苷酸、载体或宿主细胞进一步刺激先天性、抗体和/或细胞免疫应答。

在一些方面，包含如本文所述的多价寡肽和/或SAg类毒素的组合物或编码所述多价寡肽和/或SAg类毒素的多核苷酸、载体或宿主细胞可诱导针对金黄色葡萄球菌的抗体应答。在某些方面，将诱导T细胞应答的组分(例如，T细胞表位)与诸如本文所述的主要诱导抗体应答的多肽的组分组合。

还公开了一种用于在受试者中产生、增强或调节针对金黄色葡萄球菌感染的保护性和/或治疗性免疫应答的方法，所述方法包括向需要治疗性和/或预防性免疫的受试者施用一种或多种如本文所述的组合物。

如本文所述的组合物可在其所施用至的动物的生命周期中的任何时间施用至动物。在人中，如本文所述的组合物的施用可以并且通常有利地在施用其它疫苗的同时发生，例如作为如本文其它地方所述的多价疫苗。

此外，如本文所述的组合物可用于任何所需的免疫或给药方案；例如，在单次施用中或者可替代地作为定期疫苗接种方案(如年度疫苗接种)的一部分、或在初免-加强方案中，其中本公开的组合物或多肽或多核苷酸在施用相同或不同的多肽或多核苷酸之前或之后施用。最近的研究已表明，初免-加强方案通常是施用疫苗的合适方法。在初免-加强方案中，如本文所述的一种或多种组合物可用于“初免加强”方案。“初免加强”方案的实例可在Yang,Z.等人J.Virol.77:799-803,2002中找到，所述文献以引用的方式整体并入本文。

待治疗的感染包括但不限于皮肤、软组织、血液或器官的局部或全身性感染或自身免疫性疾病。待治疗或预防的特定疾病或疾患包括但不限于呼吸系统疾病，例如肺炎、败血症、皮肤感染、伤口感染、心内膜炎、骨骼和关节感染、骨髓炎和/或脑膜炎。

用于金黄色葡萄球菌感染的许多动物模型是本领域已知的，并且可与本文公开的方法一起使用而无需过度实验。例如，已经描述了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)肺炎的仓鼠模型用于测试抗微生物剂。(Verghese A.等人,Chemotherapy.34:497-503(1988)；Kephart PA.等人J Antimicrob Chemother.21:33-9,(1988))。此外，描述了成年免疫活性C57BL/6J小鼠中金黄色葡萄球菌诱导的肺炎的模型，其紧密模拟人患者中肺炎的临床和病理特征。(Bubeck-Wardenburg J.等人,Infect Immun.75:1040-4(2007))。另外，如McElroy等人(McElroy MC.等人,Infect Immun.67:5541-4(1999))所述，已经在金黄色葡萄球菌肺炎的大鼠模型中测试了毒力。最后，在绵羊中建立了MRSA诱导的败血性肺炎的标准化和可再现模型以评价新疗法。(Enkhbaatar P.等人,Shock.29(5):642-9(2008))。

除非另外指出，否则本公开的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA以及免疫学的常规技术，所述技术处于本领域的技能之内。此类技术在文献中被充分解释。参见，例如Molecular Cloning A Laboratory Manual,第2版,Sambrook等人编辑,Cold Spring Harbor Laboratory Press:(1989)；MolecularCloning:A Laboratory Manual,Sambrook等人编辑,Cold Springs Harbor Laboratory,New York(1992),DNA Cloning,D.N.Glover编辑,第I和II卷(1985)；OligonucleotideSynthesis,M.J.Gait编辑,(1984)；Mullis等人美国专利号：4,683,195；Nucleic AcidHybridization,B.D.Hames和S.J.Higgins编辑(1984)；Transcription And Translation,B.D.Hames和S.J.Higgins编辑(1984)；Culture Of Animal Cells,R.I.Freshney,AlanR.Liss,Inc.,(1987)；Immobilized Cells And Enzymes,IRL Press,(1986)；B.Perbal,APractical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise,Methods InEnzymology,Academic Press,Inc.,N.Y.；Gene Transfer Vectors For MammalianCells,J.H.Miller和M.P.Calos编辑,Cold Spring Harbor Laboratory(1987)；MethodsIn Enzymology,第154和155期(Wu等人编辑)；Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology,Mayer和Walker编辑,Academic Press,London(1987)；Handbook OfExperimental Immunology,第I-IV卷,D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑,(1986)；Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,(1986)；以及Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)中。

阐述免疫学的一般原则的标准参考著作包括Current Protocols inImmunology,John Wiley&Sons,New York；Klein,J.,Immunology:The Science of Self-Nonself Discrimination,John Wiley&Sons,New York(1982)；Roitt,I.,Brostoff,J.和Male D.,Immunology,第6版London:Mosby(2001)；Abbas A.,Abul,A.和Lichtman,A.,Cellular and Molecular Immunology,第5版,Elsevier Health Sciences Division(2005)；以及Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPress(1988)。

实施例

本公开的广度和范围不应受任何上述示例性方面或实施方案限制，而应仅根据以下权利要求及其等效物定义。

实施例1：葡萄球菌超抗原类毒素的rTBA225三重融合

尽管已经广泛评价了rSEB的安全性，包括I期临床试验，但尚未广泛研究rSEA和rTSST-1的安全性。此外，为了评价三种超抗原类毒素的融合是否加剧残余超抗原活性，使用IFNγ释放作为超抗原活性的读数，评价来自健康人供体的PBMC对rTBA的应答(“PBMC刺激测定”)。

对于PBMC刺激测定，将PBMC在湿润的孵育箱中在37℃和5％CO₂下在具有不同浓度的野生型TSST-1或类毒素如rTBA的96孔板的单独孔中的培养基中孵育。在培养48小时后，将板离心5分钟并除去上清液。根据制造商的说明书，使用来自R&D Systems的ELISA试剂盒测量每个孔中的IFNγ浓度。将诱导的IFNγ的浓度针对毒素或类毒素的浓度作图，以确定每种剂的EC₅₀(50％有效浓度)。

使用了三个表征为低、中等和高应答者的供体。如图4所示，在高浓度下，rTBA在低应答者中表现出低水平的IFN-γ诱导，在中等反应者中表现出中等水平，并且在高应答者表现出高水平，尽管这些应答远低于同一供体对野生型超抗原的应答。

这些实验表明rTBA保留一些残余超抗原活性。进一步的分析表明，这种活性是由于rSEAL48R/D70R/Y92A的残余活性，而rTSSTL30R/D27A/I46A完全无活性。因此，将另外的突变引入rTBA的rSEA部分中。先前的报告表明，MHC II类的H225(SEA-H225A)结合位点的突变降低了SEA刺激T细胞的能力(Hudson等人,1995,Journal/J Exp Med,182(3):711-720；Kozono等人,1995,Journal/Immunity,3(2):187-196)。将突变在位置H225A处引入WT SEA、rSEAL48R/D70R/Y92A以及rTBA中。新的突变型在本文分别称为SEAH225A(SEQ ID NO:11)、rSEAVax225(也称为SEAL48R/D70R/Y92A/H225A)(SEQ ID NO:4)和rTBA225(SEQ ID NO:6)，并且在PBMC刺激测定中进行了测试。将单一H225A突变引入野生型SEA(SEAH225A)中使毒素减毒，但留下显著水平的残余毒性(图4)。然而，H225A和L48R/D70R/Y92A突变的组合(rSEAVax225)在低和中等应答者细胞上完全无活性，并且在非常高的浓度下在高应答者细胞上仅略有活性(图4)。类似地，rTBA显示出残余毒性，而rTBA225完全减毒，甚至比rSEAVax225更明显。这些数据表明，rTBA和rSEAVax的完全减毒需要这四个突变的组合(图4)。

实施例2：用于超抗原突变体的融合蛋白的产生和无标签纯化的方法

对编码类毒素rTBA(SEQ ID NO:5)和rTBA225(SEQ ID NO:6)的融合物的基因进行密码子优化，合成，克隆至pET24a(+)表达载体中，并转化至BL21(DE3)大肠杆菌细胞中。将过夜培养物在含有卡那霉素的Luria肉汤中扩增直至对数中期培养物(在600nm处约0.5OD)，此时将细胞冷却至约25℃并用0.3mM IPTG诱导，然后在25℃过夜培养。第二天，收获细菌细胞，称重，并重悬于细胞溶解缓冲液(20mM Tris pH 8.0，50mM NaCl，1mM EDTA，0.1％Triton X-100)中。添加溶菌酶(1mg/mL)，并将细胞在37℃下孵育30分钟。对部分溶解的细胞进行超声处理。通过分光光度法确认细菌细胞溶解。将细胞溶解产物调节至0.5MNaCl，并在恒定混合下通过添加聚乙烯亚胺(PEI)沉淀核酸。通过离心除去PEI沉淀，并对含有类毒素的上清液进行硫酸铵((NH₄)₂SO₄)沉淀。通过离心回收(NH₄)₂SO₄沉淀，并储存在-80℃。

如图2A所示，进行以下色谱步骤。将(NH₄)₂SO₄沉淀重悬并脱盐至捕获柱平衡缓冲液中，澄清，并在Poros 50HS柱上进行色谱法。将柱平衡、负载、洗涤并使用pH 6.5的磷酸盐缓冲液中25至1,000mM NaCl的40柱体积(CV)梯度洗脱。通过SDS-PAGE分析柱级分以确定含类毒素的级分。将合并的材料透析至下一柱平衡缓冲液中，并在BioRad陶瓷羟基磷灰石(HTP)I型柱上进行色谱法。将柱平衡、负载、洗涤并使用pH 6.8的磷酸盐缓冲液中50至1,000mM NaCl的40CV梯度洗脱。通过SDS-PAGE分析级分以检测类毒素(图2B)。将合并的HTP级分透析至适当的储存缓冲液中，过滤灭菌，等分并在-80℃下冷冻。

实施例3：融合构建体rTBA的免疫原性

用rTBA或三种类毒素的混合物以及Sigma佐剂系统(SAS)佐剂对5只BALB/c小鼠的组进行免疫，3次间隔14天。测试来自这些小鼠的第35天血清的总抗体ELISA和毒素中和(TNA)滴度。

通过Ficoll梯度离心从健康供体的肝素化血中分离外周血单核细胞(PBMC)。将分离的PBMC重悬于含5％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640中，洗涤细胞，通过台盼蓝排除法计数，并调节至2x10⁶个细胞/ml。将75μl存活率>95％的此细胞悬液(1.5x10⁵个细胞)添加至96孔平底板的重复孔中，所述板含有37.5μl的与固定浓度的超抗原混合的来自疫苗接种的动物的半对数稀释血清。含有仅具有毒素的培养基的孔用作对照。将培养物在37℃下在5％CO₂-95％空气的氛围中孵育48小时。按照制造商的方案，将细胞以1600x g离心10分钟，收获培养物上清液，并通过ELISA(R&D Systems,Minneapolis,MN)评估IFNγ产生。使用VersaMax板阅读器在450nm处读取板，并在Microsoft Office Excel 2007中传输和分析数据。在没有中和抗体的情况下，将用毒素刺激的细胞用作阳性对照并且被认为是0％IFNγ抑制。因此，将免疫血清存在下对IFNγ产生的抑制计算为阳性对照与样品之间的差异。使用4参数逻辑模型(方程205，XLFit v5.2)确定中和剂(人单克隆抗体)的IC₅₀值。

与三种类毒素的混合物相比，rTBA诱导与SEB和TSST-1结合的总IgG的更高滴度和更高的毒素中和(TNA)滴度(图3A)。因此，将三种类毒素融合成一个分子不仅简化疫苗，而且增强免疫原性。

还比较了在铝胶或CpG中配制的rTBA的免疫原性。如图3B所示，两种佐剂均诱导针对所有三种毒素非常高且平衡的滴度，并且抗体应答的幅度高于使用SAS佐剂所达到的那些。两种佐剂在诱导针对SEB和TSST-1的中和抗体方面是等效的，而铝胶诱导针对SEA的更强中和应答。

实施例4：融合构建体rTBA225的免疫原性

在Balb/c小鼠中与rTBA相比测试了rTBA225的免疫原性，以确定另外的突变是否影响免疫原性。用20μg SAg混合物(等摩尔量的每种单独类毒素)、rTBA或rTBA225以及铝胶将小鼠免疫3次。在第三次免疫后，通过抗原SEA、SEB和TSST-1的ELISA和毒素中和测定(TNA)测试小鼠血清的结合和中和滴度。如图5所示，用融合构建体疫苗接种的小鼠具有针对所有三种超抗原的强总抗体(图5A)和中和抗体应答(图5B)。这些数据表明添加突变不会降低融合疫苗的免疫原性。此外，如图5C所示，融合蛋白rTBA225能够诱导针对抗原中不包括的超抗原的中和活性。

观察到，在铝胶中配制的SAg类毒素混合物不能诱导针对TSST-1的任何抗体应答，而形成鲜明对比的是，融合蛋白rTBA和rTBA225诱导强TSST-1应答(图5A，左图)。这些数据表明，当与铝胶一起配制时，TSST-1的融合对于诱导强免疫应答是必要的。结合数据表明这是由于单独TSST-1无法吸附铝胶，而作为融合蛋白，抗原吸附铝胶并且因此可诱导强抗体应答(图6)。

实施例5：rTBA225疫苗针对用SEA、SEB和TSST-1毒素激发的保护功效

通过用20μg的rTBA225三次和铝胶作为佐剂免疫Balb/c小鼠、然后用腹膜内致死剂量的通过40μg/小鼠LPS增强的SEA(10μg/小鼠)、SEB(3.315μg/小鼠)或TSST-1(10μg/小鼠)激发来评价rTBA225针对SAg毒素激发的保护功效。在激发后五天监测小鼠的体重和健康得分。如图7所示，用rTBA225免疫提供对SEB和TSST-1激发的100％保护和对SEA激发的90％保护。这些数据证明rTBA225针对用相应毒素激发的保护功效。

序列表

<110> 生物综合治疗公司(INTEGRATED BIOTHERAPEUTICS, INC.)

<120> 包含源自超抗原类毒素的融合肽的免疫原性组合物

<130> 57783-176965

<150> US 62/537,706

<151> 2017-07-27

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 195

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

<220>

<221> 相似

<222> (1)..(195)

<223> TSST-1 L30R / D27A / I46A

<400> 1

Met Ser Thr Asn Asp Asn Ile Lys Asp Leu Leu Asp Trp Tyr Ser Ser

1 5 10 15

Gly Ser Asp Thr Phe Thr Asn Ser Glu Val Leu Ala Asn Ser Arg Gly

20 25 30

Ser Met Arg Ile Lys Asn Thr Asp Gly Ser Ile Ser Leu Ile Ala Phe

35 40 45

Pro Ser Pro Tyr Tyr Ser Pro Ala Phe Thr Lys Gly Glu Lys Val Asp

50 55 60

Leu Asn Thr Lys Arg Thr Lys Lys Ser Gln His Thr Ser Glu Gly Thr

65 70 75 80

Tyr Ile His Phe Gln Ile Ser Gly Val Thr Asn Thr Glu Lys Leu Pro

85 90 95

Thr Pro Ile Glu Leu Pro Leu Lys Val Lys Val His Gly Lys Asp Ser

100 105 110

Pro Leu Lys Tyr Trp Pro Lys Phe Asp Lys Lys Gln Leu Ala Ile Ser

115 120 125

Thr Leu Asp Phe Glu Ile Arg His Gln Leu Thr Gln Ile His Gly Leu

130 135 140

Tyr Arg Ser Ser Asp Lys Thr Gly Gly Tyr Trp Lys Ile Thr Met Asn

145 150 155 160

Asp Gly Ser Thr Tyr Gln Ser Asp Leu Ser Lys Lys Phe Glu Tyr Asn

165 170 175

Thr Glu Lys Pro Pro Ile Asn Ile Asp Glu Ile Lys Thr Ile Glu Ala

180 185 190

Glu Ile Asn

195

<210> 2

<211> 240

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

<220>

<221> 相似

<222> (1)..(240)

<223> SEB L45R / Y89A / Y94A

<400> 2

Met Glu Ser Gln Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser

1 5 10 15

Lys Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asn

20 25 30

His Val Ser Ala Ile Asn Val Lys Ser Ile Asp Gln Phe Arg Tyr Phe

35 40 45

Asp Leu Ile Tyr Ser Ile Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn Tyr Asp Asn

50 55 60

Val Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Asp

65 70 75 80

Lys Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Ala Tyr Tyr Gln Cys Ala Phe

85 90 95

Ser Lys Lys Thr Asn Asp Ile Asn Ser His Gln Thr Asp Lys Arg Lys

100 105 110

Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asn Gly Asn Gln Leu Asp

115 120 125

Lys Tyr Arg Ser Ile Thr Val Arg Val Phe Glu Asp Gly Lys Asn Leu

130 135 140

Leu Ser Phe Asp Val Gln Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala Gln Glu

145 150 155 160

Leu Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys Leu Tyr

165 170 175

Glu Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu

180 185 190

Asn Glu Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys

195 200 205

Phe Asp Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Met Val

210 215 220

Asp Ser Lys Asp Val Lys Ile Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys Lys Lys

225 230 235 240

<210> 3

<211> 232

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

<220>

<221> 相似

<222> (1)..(232)

<223> SEA L48R / D70R / Y92A

<400> 3

Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu

1 5 10 15

Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn

20 25 30

Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Arg Gln

35 40 45

His Thr Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn

50 55 60

Asp Leu Leu Val Arg Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys

65 70 75 80

Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Ala Gly Tyr Gln Cys Ala

85 90 95

Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu

100 105 110

His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu

115 120 125

Trp Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr

130 135 140

Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg

145 150 155 160

Tyr Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly

165 170 175

Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser

180 185 190

Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu

195 200 205

Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met His

210 215 220

Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser

225 230

<210> 4

<211> 232

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

<220>

<221> 相似

<222> (1)..(232)

<223> SEA L48R / D70R / Y92A / H225A

<400> 4

Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu

1 5 10 15

Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn

20 25 30

Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Arg Gln

35 40 45

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50 55 60

Asp Leu Leu Val Arg Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys

65 70 75 80

Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Ala Gly Tyr Gln Cys Ala

85 90 95

Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu

100 105 110

His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu

115 120 125

Trp Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr

130 135 140

Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg

145 150 155 160

Tyr Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly

165 170 175

Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser

180 185 190

Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu

195 200 205

Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met Ala

210 215 220

Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser

225 230

<210> 5

<211> 696

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 5

Met Ser Thr Asn Asp Asn Ile Lys Asp Leu Leu Asp Trp Tyr Ser Ser

1 5 10 15

Gly Ser Asp Thr Phe Thr Asn Ser Glu Val Leu Ala Asn Ser Arg Gly

20 25 30

Ser Met Arg Ile Lys Asn Thr Asp Gly Ser Ile Ser Leu Ile Ala Phe

35 40 45

Pro Ser Pro Tyr Tyr Ser Pro Ala Phe Thr Lys Gly Glu Lys Val Asp

50 55 60

Leu Asn Thr Lys Arg Thr Lys Lys Ser Gln His Thr Ser Glu Gly Thr

65 70 75 80

Tyr Ile His Phe Gln Ile Ser Gly Val Thr Asn Thr Glu Lys Leu Pro

85 90 95

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100 105 110

Pro Leu Lys Tyr Trp Pro Lys Phe Asp Lys Lys Gln Leu Ala Ile Ser

115 120 125

Thr Leu Asp Phe Glu Ile Arg His Gln Leu Thr Gln Ile His Gly Leu

130 135 140

Tyr Arg Ser Ser Asp Lys Thr Gly Gly Tyr Trp Lys Ile Thr Met Asn

145 150 155 160

Asp Gly Ser Thr Tyr Gln Ser Asp Leu Ser Lys Lys Phe Glu Tyr Asn

165 170 175

Thr Glu Lys Pro Pro Ile Asn Ile Asp Glu Ile Lys Thr Ile Glu Ala

180 185 190

Glu Ile Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Gly Ser Glu Ser Gln Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His Lys Ser

210 215 220

Ser Lys Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp

225 230 235 240

Asn His Val Ser Ala Ile Asn Val Lys Ser Ile Asp Gln Phe Arg Tyr

245 250 255

Phe Asp Leu Ile Tyr Ser Ile Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn Tyr Asp

260 265 270

Asn Val Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys

275 280 285

Asp Lys Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Ala Tyr Tyr Gln Cys Ala

290 295 300

Phe Ser Lys Lys Thr Asn Asp Ile Asn Ser His Gln Thr Asp Lys Arg

305 310 315 320

Lys Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asn Gly Asn Gln Leu

325 330 335

Asp Lys Tyr Arg Ser Ile Thr Val Arg Val Phe Glu Asp Gly Lys Asn

340 345 350

Leu Leu Ser Phe Asp Val Gln Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala Gln

355 360 365

Glu Leu Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys Leu

370 375 380

Tyr Glu Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile

385 390 395 400

Glu Asn Glu Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp

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420 425 430

Val Asp Ser Lys Asp Val Lys Ile Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys Lys

435 440 445

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu

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Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn

485 490 495

Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Arg Gln

500 505 510

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515 520 525

Asp Leu Leu Val Arg Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys

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Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Ala Gly Tyr Gln Cys Ala

545 550 555 560

Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu

565 570 575

His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu

580 585 590

Trp Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr

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Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg

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Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met His

675 680 685

Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser

690 695

<210> 6

<211> 696

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 6

Met Ser Thr Asn Asp Asn Ile Lys Asp Leu Leu Asp Trp Tyr Ser Ser

1 5 10 15

Gly Ser Asp Thr Phe Thr Asn Ser Glu Val Leu Ala Asn Ser Arg Gly

20 25 30

Ser Met Arg Ile Lys Asn Thr Asp Gly Ser Ile Ser Leu Ile Ala Phe

35 40 45

Pro Ser Pro Tyr Tyr Ser Pro Ala Phe Thr Lys Gly Glu Lys Val Asp

50 55 60

Leu Asn Thr Lys Arg Thr Lys Lys Ser Gln His Thr Ser Glu Gly Thr

65 70 75 80

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85 90 95

Thr Pro Ile Glu Leu Pro Leu Lys Val Lys Val His Gly Lys Asp Ser

100 105 110

Pro Leu Lys Tyr Trp Pro Lys Phe Asp Lys Lys Gln Leu Ala Ile Ser

115 120 125

Thr Leu Asp Phe Glu Ile Arg His Gln Leu Thr Gln Ile His Gly Leu

130 135 140

Tyr Arg Ser Ser Asp Lys Thr Gly Gly Tyr Trp Lys Ile Thr Met Asn

145 150 155 160

Asp Gly Ser Thr Tyr Gln Ser Asp Leu Ser Lys Lys Phe Glu Tyr Asn

165 170 175

Thr Glu Lys Pro Pro Ile Asn Ile Asp Glu Ile Lys Thr Ile Glu Ala

180 185 190

Glu Ile Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Gly Ser Glu Ser Gln Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His Lys Ser

210 215 220

Ser Lys Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp

225 230 235 240

Asn His Val Ser Ala Ile Asn Val Lys Ser Ile Asp Gln Phe Arg Tyr

245 250 255

Phe Asp Leu Ile Tyr Ser Ile Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn Tyr Asp

260 265 270

Asn Val Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys

275 280 285

Asp Lys Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Ala Tyr Tyr Gln Cys Ala

290 295 300

Phe Ser Lys Lys Thr Asn Asp Ile Asn Ser His Gln Thr Asp Lys Arg

305 310 315 320

Lys Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asn Gly Asn Gln Leu

325 330 335

Asp Lys Tyr Arg Ser Ile Thr Val Arg Val Phe Glu Asp Gly Lys Asn

340 345 350

Leu Leu Ser Phe Asp Val Gln Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala Gln

355 360 365

Glu Leu Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys Leu

370 375 380

Tyr Glu Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile

385 390 395 400

Glu Asn Glu Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp

405 410 415

Lys Phe Asp Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Met

420 425 430

Val Asp Ser Lys Asp Val Lys Ile Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys Lys

435 440 445

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

450 455 460

Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu

465 470 475 480

Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn

485 490 495

Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Arg Gln

500 505 510

His Thr Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn

515 520 525

Asp Leu Leu Val Arg Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys

530 535 540

Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Ala Gly Tyr Gln Cys Ala

545 550 555 560

Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu

565 570 575

His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu

580 585 590

Trp Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr

595 600 605

Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg

610 615 620

Tyr Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly

625 630 635 640

Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser

645 650 655

Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu

660 665 670

Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met Ala

675 680 685

Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser

690 695

<210> 7

<211> 2115

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 7

atgtcgacga atgacaacat caaagacctg ctggactggt actcctcggg ctcggatacg 60

ttcacgaata gcgaagtgct ggcaaactca cgcggtagca tgcgtatcaa aaataccgat 120

ggtagcatta gcctgatcgc ttttccgtca ccgtattaca gcccggcatt caccaaaggc 180

gaaaaagtgg atctgaatac caaacgcacg aaaaaatcac agcatacctc agaaggtacc 240

tacatccact ttcagatcag cggcgtgacc aacaccgaaa aactgccgac cccgattgaa 300

ctgccgctga aagtgaaagt tcatggcaaa gattcgccgc tgaaatattg gccgaaattt 360

gataaaaaac agctggcaat ttcgaccctg gatttcgaaa ttcgccacca gctgacccag 420

atccatggtc tgtaccgttc aagcgacaaa accggcggtt attggaaaat caccatgaat 480

gatggttcga cgtaccagag cgatctgtcg aaaaaattcg aatacaacac ggaaaaaccg 540

ccgattaata tcgatgaaat caaaaccatc gaagcggaaa tcaatggcgg tggcggctcg 600

ggtggtggcg gtagcggtgg cggcggtagt gaatcgcaac cggatccgaa accggacgaa 660

ctgcacaaat cgtccaaatt taccggtctg atggaaaata tgaaagtgct gtatgatgac 720

aaccatgtgt cggcaattaa cgtgaaaagc atcgatcagt ttcgctattt cgatctgatc 780

tatagcatta aagatacgaa actgggtaat tacgataacg ttcgtgtgga atttaaaaac 840

aaagatctgg cggacaaata taaagacaaa tacgtggacg ttttcggtgc gaatgcgtat 900

taccaatgcg cctttagcaa aaagaccaat gatatcaact cccatcagac cgacaaacgt 960

aaaacctgca tgtacggtgg tgtgaccgaa cataacggta atcagctgga caaatatcgt 1020

agcatcacgg tccgtgtgtt tgaagacggc aaaaacctgc tgtcatttga tgttcagacg 1080

aacaaaaaga aagttacggc tcaagaactg gattacctga cccgccacta tctggtgaaa 1140

aataaaaaac tgtacgaatt taacaatagc ccgtacgaaa ccggctacat caaattcatt 1200

gaaaatgaaa atagcttttg gtacgatatg atgccggcac cgggtgacaa atttgaccaa 1260

agcaaatacc tgatgatgta caacgataac aaaatggtcg attcaaaaga cgtgaaaatc 1320

gaagtctatc tgacgaccaa aaagaaaggt ggcggtggtt ctggtggtgg tggctcgggc 1380

ggcggtggct cggaaaaatc cgaagaaatt aacgaaaaag acctgcgtaa aaaatccgaa 1440

ctgcagggta cggcgctggg taatctgaaa cagatttatt actacaacga aaaagccaaa 1500

accgaaaaca aagaaagcca tgatcagttc cgccagcata cgatcctgtt caaaggcttt 1560

ttcaccgatc attcgtggta taatgacctg ctggtgcgtt tcgatagcaa agacattgtg 1620

gataaatata aaggcaaaaa agtggatctg tatggcgcat acgctggtta tcagtgtgcg 1680

ggcggtacgc cgaataaaac ggcatgcatg tatggtggtg tgacgctgca tgacaataac 1740

cgcctgaccg aagaaaagaa agtgccgatt aatctgtggc tggacggtaa acagaacacc 1800

gtgccgctgg aaacggtgaa aaccaataaa aagaacgtga ccgtgcagga actggacctg 1860

caagcacgcc gttatctgca ggaaaaatat aacctgtata acagcgacgt gttcgatggc 1920

aaagtgcagc gtggtctgat cgtcttccat accagcaccg aaccgagcgt taactatgac 1980

ctgtttggcg cacaaggcca gtactccaat accctgctgc gcatttatcg cgataacaaa 2040

accattaact ccgaaaacat gcacattgac atttacctgt acacctcgta acatcatcac 2100

catcattgat aataa 2115

<210> 8

<211> 2115

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成

<400> 8

atgtcgacga atgacaacat caaagacctg ctggactggt actcctcggg ctcggatacg 60

ttcacgaata gcgaagtgct ggcaaactca cgcggtagca tgcgtatcaa aaataccgat 120

ggtagcatta gcctgatcgc ttttccgtca ccgtattaca gcccggcatt caccaaaggc 180

gaaaaagtgg atctgaatac caaacgcacg aaaaaatcac agcatacctc agaaggtacc 240

tacatccact ttcagatcag cggcgtgacc aacaccgaaa aactgccgac cccgattgaa 300

ctgccgctga aagtgaaagt tcatggcaaa gattcgccgc tgaaatattg gccgaaattt 360

gataaaaaac agctggcaat ttcgaccctg gatttcgaaa ttcgccacca gctgacccag 420

atccatggtc tgtaccgttc aagcgacaaa accggcggtt attggaaaat caccatgaat 480

gatggttcga cgtaccagag cgatctgtcg aaaaaattcg aatacaacac ggaaaaaccg 540

ccgattaata tcgatgaaat caaaaccatc gaagcggaaa tcaatggcgg tggcggctcg 600

ggtggtggcg gtagcggtgg cggcggtagt gaatcgcaac cggatccgaa accggacgaa 660

ctgcacaaat cgtccaaatt taccggtctg atggaaaata tgaaagtgct gtatgatgac 720

aaccatgtgt cggcaattaa cgtgaaaagc atcgatcagt ttcgctattt cgatctgatc 780

tatagcatta aagatacgaa actgggtaat tacgataacg ttcgtgtgga atttaaaaac 840

aaagatctgg cggacaaata taaagacaaa tacgtggacg ttttcggtgc gaatgcgtat 900

taccaatgcg cctttagcaa aaagaccaat gatatcaact cccatcagac cgacaaacgt 960

aaaacctgca tgtacggtgg tgtgaccgaa cataacggta atcagctgga caaatatcgt 1020

agcatcacgg tccgtgtgtt tgaagacggc aaaaacctgc tgtcatttga tgttcagacg 1080

aacaaaaaga aagttacggc tcaagaactg gattacctga cccgccacta tctggtgaaa 1140

aataaaaaac tgtacgaatt taacaatagc ccgtacgaaa ccggctacat caaattcatt 1200

gaaaatgaaa atagcttttg gtacgatatg atgccggcac cgggtgacaa atttgaccaa 1260

agcaaatacc tgatgatgta caacgataac aaaatggtcg attcaaaaga cgtgaaaatc 1320

gaagtctatc tgacgaccaa aaagaaaggt ggcggtggtt ctggtggtgg tggctcgggc 1380

ggcggtggct cggaaaaatc cgaagaaatt aacgaaaaag acctgcgtaa aaaatccgaa 1440

ctgcagggta cggcgctggg taatctgaaa cagatttatt actacaacga aaaagccaaa 1500

accgaaaaca aagaaagcca tgatcagttc cgccagcata cgatcctgtt caaaggcttt 1560

ttcaccgatc attcgtggta taatgacctg ctggtgcgtt tcgatagcaa agacattgtg 1620

gataaatata aaggcaaaaa agtggatctg tatggcgcat acgctggtta tcagtgtgcg 1680

ggcggtacgc cgaataaaac ggcatgcatg tatggtggtg tgacgctgca tgacaataac 1740

cgcctgaccg aagaaaagaa agtgccgatt aatctgtggc tggacggtaa acagaacacc 1800

gtgccgctgg aaacggtgaa aaccaataaa aagaacgtga ccgtgcagga actggacctg 1860

caagcacgcc gttatctgca ggaaaaatat aacctgtata acagcgacgt gttcgatggc 1920

aaagtgcagc gtggtctgat cgtcttccat accagcaccg aaccgagcgt taactatgac 1980

ctgtttggcg cacaaggcca gtactccaat accctgctgc gcatttatcg cgataacaaa 2040

accattaact ccgaaaacat ggccattgac atttacctgt acacctcgta acatcatcac 2100

catcattgat aataa 2115

<210> 9

<211> 195

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

<400> 9

Met Ser Thr Asn Asp Asn Ile Lys Asp Leu Leu Asp Trp Tyr Ser Ser

1 5 10 15

Gly Ser Asp Thr Phe Thr Asn Ser Glu Val Leu Asp Asn Ser Leu Gly

20 25 30

Ser Met Arg Ile Lys Asn Thr Asp Gly Ser Ile Ser Leu Ile Ile Phe

35 40 45

Pro Ser Pro Tyr Tyr Ser Pro Ala Phe Thr Lys Gly Glu Lys Val Asp

50 55 60

Leu Asn Thr Lys Arg Thr Lys Lys Ser Gln His Thr Ser Glu Gly Thr

65 70 75 80

Tyr Ile His Phe Gln Ile Ser Gly Val Thr Asn Thr Glu Lys Leu Pro

85 90 95

Thr Pro Ile Glu Leu Pro Leu Lys Val Lys Val His Gly Lys Asp Ser

100 105 110

Pro Leu Lys Tyr Trp Pro Lys Phe Asp Lys Lys Gln Leu Ala Ile Ser

115 120 125

Thr Leu Asp Phe Glu Ile Arg His Gln Leu Thr Gln Ile His Gly Leu

130 135 140

Tyr Arg Ser Ser Asp Lys Thr Gly Gly Tyr Trp Lys Ile Thr Met Asn

145 150 155 160

Asp Gly Ser Thr Tyr Gln Ser Asp Leu Ser Lys Lys Phe Glu Tyr Asn

165 170 175

Thr Glu Lys Pro Pro Ile Asn Ile Asp Glu Ile Lys Thr Ile Glu Ala

180 185 190

Glu Ile Asn

195

<210> 10

<211> 240

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

<400> 10

Met Glu Ser Gln Pro Asp Pro Lys Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser

1 5 10 15

Lys Phe Thr Gly Leu Met Glu Asn Met Lys Val Leu Tyr Asp Asp Asn

20 25 30

His Val Ser Ala Ile Asn Val Lys Ser Ile Asp Gln Phe Leu Tyr Phe

35 40 45

Asp Leu Ile Tyr Ser Ile Lys Asp Thr Lys Leu Gly Asn Tyr Asp Asn

50 55 60

Val Arg Val Glu Phe Lys Asn Lys Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Lys Asp

65 70 75 80

Lys Tyr Val Asp Val Phe Gly Ala Asn Tyr Tyr Tyr Gln Cys Tyr Phe

85 90 95

Ser Lys Lys Thr Asn Asp Ile Asn Ser His Gln Thr Asp Lys Arg Lys

100 105 110

Thr Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Glu His Asn Gly Asn Gln Leu Asp

115 120 125

Lys Tyr Arg Ser Ile Thr Val Arg Val Phe Glu Asp Gly Lys Asn Leu

130 135 140

Leu Ser Phe Asp Val Gln Thr Asn Lys Lys Lys Val Thr Ala Gln Glu

145 150 155 160

Leu Asp Tyr Leu Thr Arg His Tyr Leu Val Lys Asn Lys Lys Leu Tyr

165 170 175

Glu Phe Asn Asn Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu

180 185 190

Asn Glu Asn Ser Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys

195 200 205

Phe Asp Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Met Val

210 215 220

Asp Ser Lys Asp Val Lys Ile Glu Val Tyr Leu Thr Thr Lys Lys Lys

225 230 235 240

<210> 11

<211> 232

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

<220>

<221> 相似

<222> (1)..(232)

<223> SEA H225A

<400> 11

Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu

1 5 10 15

Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn

20 25 30

Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu Gln

35 40 45

His Thr Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn

50 55 60

Asp Leu Leu Val Asp Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys

65 70 75 80

Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala

85 90 95

Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu

100 105 110

His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu

115 120 125

Trp Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr

130 135 140

Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg

145 150 155 160

Tyr Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly

165 170 175

Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser

180 185 190

Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu

195 200 205

Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met Ala

210 215 220

Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser

225 230

<210> 12

<211> 232

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

<400> 12

Glu Lys Ser Glu Glu Ile Asn Glu Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ser Glu

1 5 10 15

Leu Gln Gly Thr Ala Leu Gly Asn Leu Lys Gln Ile Tyr Tyr Tyr Asn

20 25 30

Glu Lys Ala Lys Thr Glu Asn Lys Glu Ser His Asp Gln Phe Leu Gln

35 40 45

His Thr Ile Leu Phe Lys Gly Phe Phe Thr Asp His Ser Trp Tyr Asn

50 55 60

Asp Leu Leu Val Asp Phe Asp Ser Lys Asp Ile Val Asp Lys Tyr Lys

65 70 75 80

Gly Lys Lys Val Asp Leu Tyr Gly Ala Tyr Tyr Gly Tyr Gln Cys Ala

85 90 95

Gly Gly Thr Pro Asn Lys Thr Ala Cys Met Tyr Gly Gly Val Thr Leu

100 105 110

His Asp Asn Asn Arg Leu Thr Glu Glu Lys Lys Val Pro Ile Asn Leu

115 120 125

Trp Leu Asp Gly Lys Gln Asn Thr Val Pro Leu Glu Thr Val Lys Thr

130 135 140

Asn Lys Lys Asn Val Thr Val Gln Glu Leu Asp Leu Gln Ala Arg Arg

145 150 155 160

Tyr Leu Gln Glu Lys Tyr Asn Leu Tyr Asn Ser Asp Val Phe Asp Gly

165 170 175

Lys Val Gln Arg Gly Leu Ile Val Phe His Thr Ser Thr Glu Pro Ser

180 185 190

Val Asn Tyr Asp Leu Phe Gly Ala Gln Gly Gln Tyr Ser Asn Thr Leu

195 200 205

Leu Arg Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Thr Ile Asn Ser Glu Asn Met His

210 215 220

Ile Asp Ile Tyr Leu Tyr Thr Ser

225 230

Claims (58)

1.一种减毒的金黄色葡萄球菌来源的超抗原(SAg)SEA类毒素或其片段、变体或衍生物，所述减毒的金黄色葡萄球菌来源的超抗原(SAg)SEA类毒素或其片段、变体或衍生物包含四个相对于野生型SEA的突变，所述四个相对于野生型SEA的突变对应于SEQ ID NO:4中的L48R、D70R、Y92A和H225A突变；其中所述类毒素或其片段、变体或衍生物与包含SEQ IDNO:3的SEA类毒素相比具有降低的超抗原活性和/或毒性较低，同时维持免疫原性。

2.如权利要求1所述的减毒SEA类毒素或其片段、变体或衍生物，所述减毒SEA类毒素或其片段、变体或衍生物包含与SEQ ID NO:4至少90％相同的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的减毒SEA类毒素或其片段、变体或衍生物，所述减毒SEA类毒素或其片段、变体或衍生物包含SEQ ID NO:4。

4.如权利要求1至3中任一项所述的减毒SEA类毒素或其片段、变体或衍生物，所述减毒SEA类毒素或其片段、变体或衍生物具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于3％、小于2％或小于1％的包含SEQ ID NO:3的SEA类毒素的超抗原活性。

5.一种多价寡肽，所述多价寡肽包含以任何顺序排列的两种或更多种减毒的金黄色葡萄球菌来源的超抗原(SAg)类毒素或其片段、变体或衍生物的融合物，其中所述SAg类毒素或其片段、变体或衍生物可以是相同或不同的，并且其中所述SAg类毒素中的至少一种是如权利要求1至4中任一项所述的SEA类毒素。

6.如权利要求5所述的寡肽，其中所述寡肽与包含SEQ ID NO:5的SAg融合蛋白相比具有降低的超抗原活性和/或毒性较低。

7.如权利要求5或权利要求6所述的寡肽，其中所述寡肽维持包含SEQ ID NO:5的所述SAg融合蛋白的免疫原性。

8.如权利要求5至7中任一项所述的寡肽，其中所述寡肽具有小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于3％、小于2％或小于1％的包含SEQ ID NO:5的SAg融合蛋白的超抗原活性。

9.如权利要求5至8中任一项所述的寡肽，其中所述寡肽被完全减毒。

10.如权利要求5至9中任一项所述的寡肽，所述寡肽包含三种或更多种SAg类毒素或其片段、变体或衍生物。

11.如权利要求5至10中任一项所述的寡肽，所述寡肽包含以下中的一种或多种：葡萄球菌中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)减毒类毒素；葡萄球菌肠毒素B(SEB)减毒类毒素；或其任何组合。

12.如权利要求11所述的寡肽，其中所述TSST-1减毒类毒素包含对应于SEQ ID NO:1中的L30R、D27A和I46A突变的三个相对于野生型TSST-1的突变以及与SEQ ID NO:1至少90％相同的氨基酸序列；所述SEB减毒类毒素包含对应于SEQ ID NO:2中的L45R、Y89A和Y94A突变的三个相对于野生型SEB的突变以及与SEQ ID NO:2至少90％相同的氨基酸序列；并且所述SEA减毒类毒素包含对应于SEQ ID NO:4中的L48R、D70R、Y92A和H225A突变的四个相对于野生型SEA的突变以及与SEQ ID NO:4至少90％相同的氨基酸序列。

13.如权利要求11或权利要求12所述的寡肽，其中所述TSST-1类毒素包含氨基酸序列SEQ ID NO:1；所述SEB类毒素包含氨基酸序列SEQ ID NO:2；并且所述SEA减毒类毒素包含氨基酸序列SEQ ID NO:4。

14.如权利要求5至13中任一项所述的寡肽，其中所述两种或更多种SAg类毒素或其片段、变体或衍生物各自经由接头缔合。

15.如权利要求14所述的寡肽，其中所述接头包含选自由以下组成的组的至少一个、但不超过50个氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸以及其组合。

16.如权利要求15所述的寡肽，其中所述接头包含(GGGS)_n或(GGGGS)_n，其中n是1至10的整数。

17.如权利要求16所述的寡肽，其中所述接头包含(GGGGS)_n。

18.如权利要求17所述的寡肽，其中n是3。

19.如权利要求5至18中任一项所述的寡肽，所述寡肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:6。

20.如权利要求5至19中任一项所述的寡肽，所述寡肽还包含异源多肽。

21.如权利要求20所述的寡肽，其中所述异源多肽包含His-标签、泛素标签、NusA标签、几丁质结合结构域、B-标签、HSB-标签、绿色荧光蛋白(GFP)、钙调素结合蛋白(CBP)、半乳糖结合蛋白、麦芽糖结合蛋白(MBP)、纤维素结合结构域(CBD)、抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白/Strep-标签、trpE、氯霉素乙酰转移酶、lacZ(β-半乳糖苷酶)、FLAG^TM肽、S-标签、T7-标签、所述异源多肽中的任一者的片段或所述异源多肽中的两者或更多者的组合。

22.如权利要求20或权利要求21所述的寡肽，其中所述异源多肽包含免疫原、T细胞表位、B细胞表位、其片段或其组合。

23.如权利要求5至22中任一项所述的寡肽，所述寡肽还包含免疫原性碳水化合物。

24.如权利要求23所述的寡肽，其中所述免疫原性碳水化合物是糖。

25.如权利要求24所述的寡肽，其中所述免疫原性碳水化合物是荚膜多糖或表面多糖。

26.如权利要求25所述的寡肽，其中所述免疫原性碳水化合物选自由以下组成的组：荚膜多糖(CP)血清型5(CP5)、CP8、聚-N-乙酰葡糖胺(PNAG)、聚-N-琥珀酰葡糖胺(PNSG)、壁磷壁酸(WTA)、脂磷壁酸(LTA)、所述免疫原性碳水化合物中的任一者的片段以及所述免疫原性碳水化合物中的两者或更多者的组合。

27.如权利要求23至26中任一项所述的寡肽，其中所述免疫原性碳水化合物与所述寡肽缀合。

28.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码如权利要求1至4中任一项所述的减毒SEA类毒素多肽或如权利要求5至27中任一项所述的多价寡肽的核酸。

29.如权利要求28所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:8。

30.如权利要求28或权利要求29所述的多核苷酸，所述多核苷酸还包含异源核酸。

31.如权利要求30所述的多核苷酸，其中所述异源核酸包含与编码所述寡肽的所述核酸可操作地缔合的启动子。

32.一种载体，所述载体包含如权利要求28至31中任一项所述的多核苷酸。

33.如权利要求32所述的载体，所述载体是质粒。

34.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求32或权利要求33所述的载体。

35.如权利要求34所述的宿主细胞，所述宿主细胞是细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞或植物细胞。

36.如权利要求35所述的宿主细胞，其中所述细菌是大肠杆菌。

37.一种产生多价寡肽的方法，所述方法包括培养如权利要求34至36中任一项所述的宿主细胞以及回收所述寡肽。

38.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1至4中任一项所述的减毒SEA类毒素、如权利要求5至27中任一项所述的寡肽或其任何组合以及载剂。

39.如权利要求38所述的组合物，所述组合物还包含佐剂。

40.如权利要求39所述的组合物，其中所述佐剂是明矾、氢氧化铝、磷酸铝或基于吡喃葡糖基脂质A的佐剂。

41.如权利要求38至40中任一项所述的组合物，所述组合物还包含另外的免疫原。

42.如权利要求41所述的组合物，其中所述另外的免疫原是细菌抗原。

43.如权利要求42所述的组合物，其中所述细菌抗原选自由以下组成的组：成孔毒素、超抗原、细胞表面蛋白、所述细菌抗原中的任一者的片段以及所述细菌抗原中的两者或更多者的组合。

44.一种诱导针对金黄色葡萄球菌的宿主免疫应答的方法，所述方法包括向需要所述免疫应答的受试者施用有效量的如权利要求38至43中任一项所述的组合物。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述免疫应答选自由以下组成的组：先天性应答、体液应答、抗体应答、细胞应答以及所述免疫应答中的两种或更多种的组合。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述免疫应答是抗体应答。

47.一种预防或治疗受试者的葡萄球菌疾病或感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如权利要求38至43中任一项所述的组合物。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述感染是皮肤、软组织、血液或器官的局部或全身性感染，或者本质上是自身免疫的。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述疾病是呼吸系统疾病。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述呼吸系统疾病是肺炎。

51.如权利要求48的方法，其中所述疾病是败血症。

52.如权利要求44至51中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

53.如权利要求52所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

54.如权利要求52所述的方法，其中所述哺乳动物是牛科动物或犬科动物。

55.如权利要求44至54中任一项所述的方法，其中所述组合物经由肌内注射、皮内注射、腹膜内注射、皮下注射、静脉内注射、口服施用、粘膜施用、鼻内施用或肺部施用来施用。

56.如权利要求38至43中任一项所述的组合物，所述组合物用于在受试者中诱导针对金黄色葡萄球菌的宿主免疫应答。

57.如权利要求38至43中任一项所述的组合物，所述组合物用于预防或治疗受试者的葡萄球菌疾病或感染。

58.一种产生针对金黄色葡萄球菌感染的疫苗的方法，所述方法包括：分离如权利要求1至4中任一项所述的减毒SEA类毒素、如权利要求5至27中任一项所述的多价寡肽或其任何组合；以及将所述类毒素、所述寡肽或其任何组合与佐剂组合。

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