CN113549244A - 利用两种酶协同作用降解pet塑料的方法 - Google Patents

利用两种酶协同作用降解pet塑料的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113549244A
CN113549244A CN202110803574.2A CN202110803574A CN113549244A CN 113549244 A CN113549244 A CN 113549244A CN 202110803574 A CN202110803574 A CN 202110803574A CN 113549244 A CN113549244 A CN 113549244A
Authority
CN
China
Prior art keywords
enzyme
petase
mhetase
gene
pet plastic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110803574.2A
Other languages
English (en)
Inventor
孔亮
李慧
余冲
杜灿
王东旭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian Ocean University
Original Assignee
Dalian Ocean University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian Ocean University filed Critical Dalian Ocean University
Priority to CN202110803574.2A priority Critical patent/CN113549244A/zh
Publication of CN113549244A publication Critical patent/CN113549244A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J11/00—Recovery or working-up of waste materials
    • C08J11/04—Recovery or working-up of waste materials of polymers
    • C08J11/10—Recovery or working-up of waste materials of polymers by chemically breaking down the molecular chains of polymers or breaking of crosslinks, e.g. devulcanisation
    • C08J11/105—Recovery or working-up of waste materials of polymers by chemically breaking down the molecular chains of polymers or breaking of crosslinks, e.g. devulcanisation by treatment with enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2367/00—Characterised by the use of polyesters obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain; Derivatives of such polymers
    • C08J2367/02—Polyesters derived from dicarboxylic acids and dihydroxy compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
    • Y02W30/00—Technologies for solid waste management
    • Y02W30/50—Reuse, recycling or recovery technologies
    • Y02W30/62—Plastics recycling; Rubber recycling

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Separation, Recovery Or Treatment Of Waste Materials Containing Plastics (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开一种利用两种酶协同作用降解PET塑料的方法，将PET塑料放入PETase酶和MHETase酶的混合酶液中，在30℃温度下降解反应48h，所述PETase酶和MHETase酶的酶活力单位比为3：1。可将PET塑料快速降解为对苯二甲酸和乙二醇两种单体，与细菌Ideonella sakaiensis及单独使用降解酶相比，其降解速率明显提高，反应条件温和，反应过程安全，不会产生二次污染。尤其是将PETase酶的基因和MHETase酶基因均经过密码子优化后构建可表达MHETase酶和PETase酶的重组大肠杆菌，在优化的条件下进行表达，可进一步提高对PET的降解速度。

Description

利用两种酶协同作用降解PET塑料的方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种利用两种酶协同作用降解PET塑料的方法。
背景技术
自18世纪塑料首次被合成以来，已广泛应用于各个领域，仅2016年全球塑料生产总量已经高达3.35亿吨。聚对苯二甲酸乙酯（polyethylene terephthalate，PET）是最常见的塑料之一，约占全球塑料产量的1/5。由于塑料为人工合成的高聚物而质地紧密，自然环境下难以降解，所以以往的处理方法为填埋或焚烧，对环境产生了巨大的污染。2016年日本科学家发现了一种以PET塑料为食的细菌Ideonella sakaiensis 201-F6，但是这种细菌生长缓慢，降解效率较低。(Yoshida S ,Hiraga K ,Takehana T ,Taniguchi I ,Yamaji H ,Maeda Y ,Toyohara K ,Miyamoto K ,Kimura Y ,Oda K .2016 .Abacterium thatdegrades and assimilates poly(ethylene terephthalate) .Science ,351(6278):1196-1199 .)。
中国专利申请号为201710963873 .6的发明专利申请，公开了一种“降解PET塑料的基因工程菌”，是基于有效分泌表达PET水解酶（PETase）的大肠杆菌DNA重组载体构建、制备、活性验证及在PET塑料降解中应用的方法。所提供的降解PET塑料的基因工程菌需要对PET塑料经过20天的培养降解且每二天换一次培养基，才能达到降解PET塑料的目的。虽然与细菌Ideonella sakaiensis 201-F6相比，降解速度有所提高，但是依然存在降解效率低下的问题。
后来研究发现，细菌Ideonella sakaiensis中存在两种与PET降解相关的酶类PETase和MHETase，但是对PET塑料降解均是采用阶段式的降解方式，即第一阶段单独使用PETase酶，将PET转化为单（2-羟乙基）对苯二甲酸酯（MHET），第二阶段单独使用MHETase，水解MHET得到对苯二甲酸和乙二醇，还是没有彻底解决酶降解PET塑料速度慢的现象，难以在工业上应用。
迄今为止，并没有将两种酶联用进行PET塑料降解的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种利用两种酶协同作用降解PET塑料的方法。
本发明的技术解决方案是：一种利用两种酶协同作用降解PET塑料的方法，其特征在于：将PET塑料放入PETase酶和MHETase酶的混合酶液中，在30℃温度下降解反应48h，所述PETase酶和MHETase酶的酶活力单位比为3：1。
所述PETase酶和MHETase酶是按照如下步骤制备而成：
步骤1.将PETase酶的基因和MHETase酶基因均经过密码子优化后与表达载体连接，使构建的重组表达载体中PETase酶的基因和MHETase酶基因的C端都带有6个组氨酸标签，再分别构建可表达MHETase酶或PETase酶的重组大肠杆菌；
步骤2. 将所构建的可表达MHETase酶或PETase酶的重组大肠杆菌在诱导时间为16h，诱导温度为20℃，诱导剂IPTG浓度为50mmol/L的条件下进行扩大培养；
步骤3：将进行扩大培养后的重组大肠杆菌破碎后，采用铜离子或镍离子亲和凝胶分别获得PETase酶和MHETase酶。
本发明是将PETase酶和MHETase酶按比例混合实现对PET塑料的降解，可将PET塑料快速降解为对苯二甲酸和乙二醇两种单体，与细菌Ideonella sakaiensis及单独使用降解酶相比，其降解速率明显提高，反应条件温和，反应过程安全，不会产生二次污染。尤其是将PETase酶的基因和MHETase酶基因均经过密码子优化后构建可表达MHETase酶和PETase酶的重组大肠杆菌，在优化的条件下进行表达，可进一步提高对PET塑料的降解速度。
附图说明
图1是本发明实施例中PETase和MHETase蛋白的电泳图。
图2是本发明实施例与使用PETase酶或MHETase酶降解PET塑料的电镜图。
图3是本发明实施例与不同反应时间对比例降解PET塑料的电镜图。
图4是本发明实施例与不同反应温度对比例降解PET塑料的电镜图。
具体实施方式
本发明的利用两种酶协同作用降解PET塑料的方法，是将PET塑料放入PETase酶和MHETase酶的混合酶液中，在30℃温度下降解反应48h，所述PETase酶和MHETase酶的酶活力单位比为3：1；
所述PETase酶和MHETase酶是按照如下步骤制备而成：
步骤1. 通过人工基因合成方法，获得PETase基因和MHETase基因，再根据宿主类型，合成序列时进行了密码子优化，再将经过密码子优化后PETase基因和MHETase基因分别与表达载体pET29a连接，使构建的重组表达载体中PETase酶的基因和MHETase酶基因的C端都带有6个组氨酸标签，再分别构建可表达MHETase酶或PETase酶的重组大肠杆菌BL21。
具体是通过比对基因与pET29a质粒酶切位点获得确定酶切位点SacⅠ与Hind Ⅲ，加入限制性内切酶SacⅠ与限制性内切酶Hind Ⅲ，将SacⅠ与Hind Ⅲ 之间的基因片段切除，将分别存于TOP10质粒的PETase基因和MHETase基因进行SacⅠ与Hind Ⅲ 酶切，获得基因片段与pET29a质粒空载连接，再将接有两种基因的pET29a质粒分别转入DH5ɑ大肠杆菌进行基因扩增，将 DH5ɑ大肠杆菌扩增后的质粒提取出来分别导入大肠杆菌BL21。
步骤2. 将所构建的可表达MHETase酶和PETase酶的重组大肠杆菌在诱导时间为16h，诱导温度为20℃，诱导剂IPTG浓度为50mmol/L的条件下进行扩大培养；
步骤3：将进行扩大培养后的培养液中的细胞离心用PBS重悬，重悬液超声破碎（超声3s停2s，40min），得到两种酶的粗酶液，采用铜离子或镍离子亲和凝胶分别获得PETase酶和MHETase酶，选优的使用镍柱纯化，75mM咪唑洗脱。
所获得的PETase酶和MHETase酶的电泳图如图1所示，PETase酶的分子量约为33kDa,，MHETase酶的分子量约为66kDa。
本发明实施例与使用PETase酶或MHETase酶降解PET塑料的电镜图如图2所示，所述使用PETase酶或MHETase酶降解PET塑料是指将PET塑料放入单独的PETase酶或单独的MHETase酶中，单独的PETase酶或单独的MHETase酶与本发明实施例总酶量相等，在30℃温度下降解反应48h。图2中（a）是空白对照（添加缓冲液不加酶）；（b）是单独的MHETase酶与PET反应电镜图；（c）是单独的PETase酶与PET反应电镜图；（d）是本发明实施例的反应结果电镜图。
图2结果表明，MHETase酶降解PET塑料的效果是PETase的五分之一，本发明实施例降解PET塑料的效果明显好于单独使用PETase酶或MHETase酶降解PET塑料的效果。
本发明实施例与不同反应时间对比例降解PET塑料的电镜图如图3所示，所述不同反应时间对比例降解PET塑料是除降解反应时间分别为72h和96h外，其余方法与本发明实施例相同，即将PET塑料放入PETase酶和MHETase酶的混合酶液中，在30℃温度下分别降解反应72h和96h，所述PETase酶和MHETase酶的酶活力单位比为3：1。图3中（a）是空白对照（添加缓冲液不加酶）；（b）是发明实施例的反应结果电镜图；（c）反应72h产物电镜图；（d）是反应96h产物电镜图。
图3结果表明，本发明实施例降解PET塑料的效果明显好于反应时间为72h和96h对比例降解PET塑料的效果。
本发明实施例与不同反应温度对比例降解PET的电镜图如图4所示，所述不同反应温度对比例降解PET是除降解温度分别为20℃、40℃外，其余方法与本发明实施例相同，即将PET塑料放入PETase酶和MHETase酶的混合酶液中，在20℃、40℃温度下分别降解反应48h，所述PETase酶和MHETase酶的酶活力单位比为3：1。图3中（a）是空白对照（30℃，添加缓冲液不加酶）；（b）温度为20℃的反应产物电镜图；（c）是发明实施例的反应结果电镜图；（d）温度为40℃的反应产物电镜图。
图3结果表明，本发明实施例降解PET塑料的效果明显好于反应温度为20℃和40℃对比例降解PET塑料的效果。
同时，本发明还将收集的两种酶液按不同比例（v:v=1:1；1:2；1:3；2:1；3:1混合后与PET塑料在30℃温度进行48h反应。相同的培养及诱导条件下，单位细胞表达的酶量相同，故体积比与酶活力单位相比是一致的。采用HPLC检测PET代谢产物对苯二甲酸产量，结果表明，PETase酶和MHETase酶体积混合比为3：1时，降解产物的浓度最高，是单独使用PETase酶降解率的2倍多。

Claims (2)

1.一种利用两种酶协同作用降解PET塑料的方法，其特征在于：将PET塑料放入PETase酶和MHETase酶的混合酶液中，在30℃温度下降解反应48h，所述PETase酶和MHETase酶的酶活力单位比为3：1。
2.根据权利要求1所述利用两种酶协同作用降解PET塑料的方法，其特征在于所述PETase酶和MHETase酶是按照如下步骤制备而成：
步骤1.将PETase酶的基因和MHETase酶基因均经过密码子优化后与表达载体连接，使构建的重组表达载体中PETase酶的基因和MHETase酶基因的C端都带有6个组氨酸标签，再分别构建可表达MHETase酶或PETase酶的重组大肠杆菌；
步骤2. 将所构建的可表达MHETase酶和PETase酶的重组大肠杆菌在诱导时间为16h，诱导温度为20℃，诱导剂IPTG浓度为50mmol/L的条件下进行扩大培养；
步骤3：将进行扩大培养后的重组大肠杆菌破碎后，采用铜离子或镍离子亲和凝胶分别获得PETase酶和MHETase酶。
CN202110803574.2A 2021-07-16 2021-07-16 利用两种酶协同作用降解pet塑料的方法 Pending CN113549244A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110803574.2A CN113549244A (zh) 2021-07-16 2021-07-16 利用两种酶协同作用降解pet塑料的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110803574.2A CN113549244A (zh) 2021-07-16 2021-07-16 利用两种酶协同作用降解pet塑料的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113549244A true CN113549244A (zh) 2021-10-26

Family

ID=78103223

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110803574.2A Pending CN113549244A (zh) 2021-07-16 2021-07-16 利用两种酶协同作用降解pet塑料的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113549244A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114891776A (zh) * 2022-05-24 2022-08-12 天津大学 双酶分层级联纳米晶体的构建及其作用pet塑料降解的方法
CN114941004A (zh) * 2022-04-15 2022-08-26 大连理工大学 一种高效降解pet塑料的工程酶复合物及其制备方法和应用
CN115197927A (zh) * 2022-08-09 2022-10-18 武汉新华扬生物股份有限公司 一种降解生物基塑料的复合酶制剂及其应用
CN115896066A (zh) * 2022-09-27 2023-04-04 自然资源部第三海洋研究所 嗜吡啶红球菌pet降解酶及其编码基因与应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109402037A (zh) * 2018-11-07 2019-03-01 深伦生物科技（深圳）有限公司 一种用于pet塑料降解的基因工程菌
CN109929789A (zh) * 2019-03-26 2019-06-25 天津大学 一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯的方法
WO2020055369A2 (en) * 2018-09-11 2020-03-19 Istanbul Medipol Universitesi Method for preparing recombinant petase and mhetase enzymes for use in decomposition of plastics
US20200216851A1 (en) * 2018-12-04 2020-07-09 Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation Recombinant petase producing strain, recombinant mhetase producing strain, and composition for degrading pet containing the same
US20210180007A1 (en) * 2018-05-15 2021-06-17 Alliance For Sustainable Energy, Llc Engineered microorganisms for the deconstruction of polymers

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210180007A1 (en) * 2018-05-15 2021-06-17 Alliance For Sustainable Energy, Llc Engineered microorganisms for the deconstruction of polymers
WO2020055369A2 (en) * 2018-09-11 2020-03-19 Istanbul Medipol Universitesi Method for preparing recombinant petase and mhetase enzymes for use in decomposition of plastics
CN109402037A (zh) * 2018-11-07 2019-03-01 深伦生物科技（深圳）有限公司 一种用于pet塑料降解的基因工程菌
US20200216851A1 (en) * 2018-12-04 2020-07-09 Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation Recombinant petase producing strain, recombinant mhetase producing strain, and composition for degrading pet containing the same
CN109929789A (zh) * 2019-03-26 2019-06-25 天津大学 一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHOSUKE YOSHIDA: "A bacterium that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate)", 《SCIENCE》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114941004A (zh) * 2022-04-15 2022-08-26 大连理工大学 一种高效降解pet塑料的工程酶复合物及其制备方法和应用
CN114891776A (zh) * 2022-05-24 2022-08-12 天津大学 双酶分层级联纳米晶体的构建及其作用pet塑料降解的方法
CN114891776B (zh) * 2022-05-24 2024-03-12 天津大学 双酶分层级联纳米晶体的构建及其作用pet塑料降解的方法
CN115197927A (zh) * 2022-08-09 2022-10-18 武汉新华扬生物股份有限公司 一种降解生物基塑料的复合酶制剂及其应用
CN115896066A (zh) * 2022-09-27 2023-04-04 自然资源部第三海洋研究所 嗜吡啶红球菌pet降解酶及其编码基因与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113549244A (zh) 利用两种酶协同作用降解pet塑料的方法
Ouyang et al. Increasing oxygen availability for improving poly (3-hydroxybutyrate) production by Halomonas
CN107794252B (zh) 降解pet塑料的基因工程菌
Lütte et al. Autotrophic production of stable-isotope-labeled arginine in Ralstonia eutropha strain H16
CN106086102B (zh) 一种生产反式-4-羟基-l-脯氨酸的工程菌及其构建方法与应用
CN114350535B (zh) 一种高产透明质酸酶的工程酵母菌株及其应用
CN108884120B (zh) 纯化3,6-脱水-l-半乳糖的方法
JPWO2021100643A5 (zh)
CN104726478A (zh) 表达精氨酸脱亚胺酶基因的重组大肠杆菌及其应用
CN113584057B (zh) Iccg表达元件及表达载体、枯草芽孢杆菌重组菌株和降解pet或其单体的方法
CN114836495A (zh) 利用烟酰胺发酵生产nmn的基因工程菌的构建与应用
CN110747212A (zh) 一种新果胶酶的基因及其蛋白表达、载体和应用
CN103898145A (zh) 一种重组肠激酶的制备方法
CN103160544B (zh) 一种使微生物可同时发酵五碳糖与六碳糖的方法
CN115746087A (zh) 一种大肠杆菌裂解澄清试剂盒及大肠杆菌的裂解方法
CN109762834B (zh) 一种获取芳香族异戊烯基转移酶的发酵和一步纯化方法
CN104152426A (zh) 一种t5核酸外切酶在大肠杆菌中的制备方法
CN103060359A (zh) 一种利用缩短后l2蛋白标签纯化重组蛋白的方法
CN109370969B (zh) 一种重组克雷伯氏杆菌在制备1，3-丙二醇中的应用
CN105950593A (zh) 一种赖氨酰肽链内肽酶的原核重组表达与制备方法
CN105671069A (zh) 一种蜜蜂肽表达载体及其构建方法和应用
CN115927248B (zh) 一种短糖链修饰的IsPETase及其制备方法和应用
CN106754945B (zh) 一种毒素Tx4(6-1)无标签重组蛋白的生产方法
CN118063852A (zh) 一种pet塑料解聚方法
CN116497003A (zh) 一种从溶液中纯化目标蛋白的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20211026