CN118063852A - 一种pet塑料解聚方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种PET塑料解聚方法，将角质酶ICCG与蛋白标签连接，获得融合蛋白酶；将融合蛋白酶的酶液与PET塑料混合，在4‑30℃下孵育2‑5h，之后在40‑60℃下反应，完成PET塑料解聚；其中，所述蛋白标签为来源于Hypocrea jecorina的碳水化合物结合模块，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明利用融合蛋白ICCG‑CBM进行PET塑料降解，并利用低温预结合过程有效提高了PET塑料的解聚效率，从而实现在较低的解聚温度下获得更好的降解效果，显著降低了塑料闭环回收的成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程及环保技术领域，具体涉及一种PET塑料解聚方法。
背景技术
PET（聚对苯二甲酸乙二醇酯）优于价格低、重量轻且耐用，广泛应用于建筑、包装、运输等领域。巨大的市场使得全球塑料产量不断上升，根据欧洲塑料协会每年出局的报告显示，2023年全球生产塑料达5亿吨以上，同时对塑料的需求呈现强劲的上升。然而PET塑料并非能在自然环境下自动降解，而是在环境中不断累积，并随着人类活动流入到自然环境中，导致了严重的环境污染。
采取合适的方式降解PET塑料无疑是缓解塑料污染最有效的方式之一。酶法降解PET因其绿色性和简单的操作性以及可持续性，受到了科学家的关注。2012年，大阪大学的Shigenori Kanaya等研究人员在堆肥中发现了一种角质酶，称之为LCC（leaf-branchcompost cutinase），可以切断酯基，将PET分解为对苯二甲酸和乙二醇，法国图卢兹大学Alain Marty、Sophie Duquesne、Isabelle Andre等研究者重新设计了角质酶LCC，基因改造后得到ICCG，ICCG酶不但可以高效的降解聚对苯二甲酸乙二酯（PET），而且降解产物可以重新作为合成PET的原料，实现了完美的循环利用，不过此方法虽然提高酶的热稳定性，但是在常温下的解聚效果很差。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的问题，提供一种PET塑料解聚方法。基于现有ICCG酶构建融合蛋白，并通过低温预结合提高后续PET解聚效率。本发明提供的融合蛋白，性质优良，应用范围广，显著降低了塑料闭环回收的成本：
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
一种PET塑料解聚方法，包括：
将角质酶ICCG与蛋白标签连接，获得融合蛋白酶；
将融合蛋白酶的酶液与PET塑料混合，在4-30℃下孵育2-5h，之后在40-60℃下反应，完成PET塑料解聚；
其中，所述蛋白标签为来源于Hypocrea jecorina的碳水化合物结合模块，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
作为一种优选的实施方式，所述角质酶ICCG与蛋白标签通过连接肽连接。优选的，所述连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGS。
作为一种优选的实施方式，所述蛋白标签通过重叠延伸PCR及同源重组的方式与ICCG连接，构建融合蛋白酶。
作为一种优选的实施方式，所述融合蛋白酶的酶液的获取方式为：
以大肠杆菌为宿主菌，构建包含所述融合蛋白酶的工程菌株，利用IPTG诱导工程菌株中融合蛋白酶的表达，获得融合蛋白酶的酶液。
作为一种优选的实施方式，所述融合蛋白酶的酶液与PET塑料混合后在4-30℃下静置孵育2-5h，之后在40-60℃、500rpm条件下反应。
作为一种优选的实施方式，所述酶液中融合蛋白酶的浓度为2-50mg/L。
作为一种优选的实施方式，所述PET塑料为无定形PET薄膜GF-PET粉碎后得到的粉末。
作为一种优选的实施方式，所述融合蛋白酶的酶液与PET塑料混合后在4℃下孵育2-5h。
作为一种优选的实施方式，PET塑料解聚的反应温度为40℃。
本发明利用融合蛋白ICCG-CBM进行PET塑料降解，并利用低温预结合过程有效提高了PET塑料的解聚效率，从而实现在较低的解聚温度下获得更好的降解效果，显著降低了塑料闭环回收的成本。
附图说明
图1为ICCG、融合蛋白ICCG-CBM、ICCG-HFB4、CBM-GFP、HFB4-GFP的蛋白胶图。
图2为不同浓度CBM-GFP、HFB4-GFP结合PET底物的吸附速率图。
图3为不同温度下结合模块对于PET底物的负载量。
图4为ICCG和融合蛋白ICCG-CBM在不同条件下对PET塑料粉末的解聚产物，其中ICCG-CBM-A、ICCG-CBM-B、ICCG-CBM-C分别指ICCG-CBM溶液在4℃、16℃、30℃预结合。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明所提供的方法予以进一步的说明，但本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其它任何公知的改变。
实施例1
本实施例具体说明融合蛋白ICCG-CBM、ICCG-HFB4、HFB4-GFP、CBM-GFP 的构建、表达和纯化的方法。
突变体ICCG来源于叶枝堆肥宏基因组（即背景技术所指ICCG酶，核苷酸序列可参见CN113584057A）。以包含来源于Hypocrea jecorina的碳水化合物结合块CBM（氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示），来源于Trichoderma simmonsii疏水蛋白HFB4（氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示）和LCC-ICCG的DNA片段为模板，设计上述上下游引物PCR扩增，得到上游和下游的目的基因；再通过重叠延伸得到全长的目的基因；将目的基因使用一步克隆的方式连接到表达载体pET-29a上并化学转化到DH5α感受态中，通过含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板筛选，挑选单克隆子测序验证。验证成功的质粒再通过化学转化到BL21表达菌株中。引物序列如下表1所示：
表1 引物序列
| F1 | GGAGATATACATATGGCCTTCACCTGTACTGCCACC |
| R1 | CGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTGGACAATTGCCGACGATGTAG |
| F2 | GGAGATATACATATGCCTACCCAGTCTCACTACGGC |
| R2 | CGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCCAGGCACTGAGAGTAGTAAGGGTTC |
| F3 | GGAGATATACATATGCAGTACTCCGCCCATCGTCG |
| R3 | CGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCCTCGGGGAGAGCATCCTGG |
| F4 | GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGATGAGTAAAGGAGAAGAAC |
| R4 | GTGGTGGTGCTCGAGTTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTG |
| F5 | GATGTAGCAGCCGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCG |
| R5 | GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGTGCCTGCACCACT |
| F6 | CCACTGACTACTACCCCGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCG |
| R6 | GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGG |
表中，F1、R1为同源重组ICCG的上、下游引物，F2、R2为CBM的上、下游引物，F3、R3为HFB4的上、下游引物，F4、R4为绿色荧光蛋白GFP的上、下游引物，F5、R5为ICCG与CBM重叠区的上、下游引物（连接肽A），F6、R6为融合蛋白ICCG与HFB4重叠区(连接肽B)的上、下游引物，其中连接肽A、B的氨基酸序列均为：GGGGSGGGGS。
将5mL含有pET29a-ICCG、pET29a-ICCG-CBM、pET29a-ICCG-HFB4、pET29a-CBM-GFP、pET29a-HFB4-GFP质粒的BL21大肠杆菌接种到含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB培养基中，在37°C和 200 rpm 下孵育 12 h。然后，取出2 mL种子培养液，接种200mL LB培养基，用卡那霉素（50 μg/ mL）在37°C和200rpm下孵育4小时。当OD值达到0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，通过在18°C下进一步孵育24小时来诱导重组蛋白表达。通过在 4°C下以12,000 rpm离心 10 分钟来收获细菌细胞。获得的细胞沉淀用磷酸缓冲液（50 mM，pH 8.0）洗涤两次，并用50 mM磷酸缓冲液（pH 8.0）重悬。然后，用scientz-II D超声发生器破碎细胞，并通过在12,000 rpm和4°C下离心20 min去除细胞碎片。使用生物分子液相色谱系统的NTA纯化具有C端His6标签的重组酶。用咪唑缓冲液洗脱目的蛋白（300 mM NaCl，250 mM 咪唑，pH8.0）。收集纯化的蛋白，用超滤管浓缩，除去咪唑，使用SDS-PAGE（聚丙烯酰胺）蛋白电泳验证融合蛋白的表达，如图1所示。
实施例2
分别配置10、20、30、40、50mg/L浓度的CBM-GFP溶液、HFB4-GFP溶液，再称量0.02gPET塑料置于100mL玻璃瓶中，进行动力学实验，以200r/min摇动6小时后，用带针头的5mL针管取样，并通过0.22 μm水系滤头过滤，存储在1mL的离心管中，待测，为保证实验误差，每次取两个平行样。
蛋白质浓度通过Bradford方法测定，使用INFINITE M NANO酶标仪再495nm下，测量蛋白浓度，蛋白浓度测定的线性方程为y=0.0018x+0.7004，R2=0.9988。
荧光强度通过日立F7000荧光分光光度测得，在325nm处发射一个激发波长，在488nm获得一个吸收波，荧光强度就是吸收峰值。
不同浓度的酶液加入到体积的塑料反应一段时间后呈现出相同的动力学特征，前两个小时吸附速率迅速增加，而后速率放缓，三小时后速率平稳。
实施例3
本实施例探究温度对与吸附能力的影响。
配置CBM-GFP、HFB4-GFP酶液50mg/L，称量0.02g塑料与酶液置于100mL玻璃瓶中，加入转子，配置好的瓶子放入水浴锅中分别在4、15、30、45、60、80℃下旋转3小时，转速为500r/min，用带针头的5mL针管取样，并通过0.22 μm水系滤头过滤，存储在1mL的离心管中，待测，为保证实验误差，每次取三个平行样。
蛋白质浓度通过Bradford方法测定，使用INFINITE M NANO酶标仪在495nm下，测量蛋白浓度，蛋白浓度测定的线性方程为y=0.0018x+0.7004，R2=0.9988。 蛋白吸附量（mg/g）=上清液中蛋白浓度/PET浓度。
随着温度的升高，蛋白标签对PET的吸附能力先降低后升高，其中4℃时吸附能力最强，且CBM的吸附能力优于HFB4。
实施例4
本实施例探究低温下融合模块对于PET塑料的解聚性能的影响。取0.04g结晶度为6.7%的PET塑料粉末，配置2mg/L的ICCG、ICCG-CBM、ICCG-HFB4溶液，将酶液与塑料混合放置于20mL的玻璃瓶中，设置对照组和三个不同温度预结合的实验组：
对照组：将溶液置于40℃的磁力水浴锅，转速为500r/min，反应24小时。
实验组：先在低温下（4℃、16℃、30℃）静置孵育3小时，然后置于40℃的磁力水浴锅，转速为500r/min，反应24小时。
反应完毕后，用带针头的5mL针管取样，并通过0.22 μm水系滤头过滤，存储在1mL的离心管中，待测，为保证实验误差，每次取两个平行样。使用HPLC测量反应上清液中的BHET、MHET和TPA的总量来计算酶解聚效率。样品通过0.22 μm过滤器过滤，并通过岛津CMB-20 A HPLC系统与C18色谱柱（InerSustain，4.6 × 250 mm，5 μm）联用进行分析。用溶剂（18%乙腈、1%甲酸和81%水，pH 2.5）在0–25 min内洗脱C18色谱柱。样品在254 nm处监测。
结果如图4所示，ICCG-CBM溶液对PET塑料的解聚能力明显优于ICCG，且低温预结合的ICCG-CBM溶液实验组对PET塑料的解聚能力明显优于ICCG-CBM溶液无预结合对照组。4℃低温预结合条件下释放了0.56mM的MHET和0.70mM的TPA，而ICCG释放了0.34mM的MHET和0.42mM的TPA；16℃低温预结合条件下，释放了0.50mM的MHET和0.51mM的TPA；30℃低温预结合条件下，释放了0.46mM的MHET和0.38mM的TPA。
对于ICCG溶液和ICCG-HFB4溶液，实验组与对照组相比无产物释放无明显提升。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种PET塑料解聚方法，其特征在于，包括：
将角质酶ICCG与蛋白标签连接，获得融合蛋白酶；
将融合蛋白酶的酶液与PET塑料混合，在4-30℃下孵育2-5h，之后在40-60℃下反应，完成PET塑料解聚；
其中，所述蛋白标签为来源于Hypocrea jecorina的碳水化合物结合模块，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述角质酶ICCG与蛋白标签通过连接肽连接。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGS。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白标签通过重叠延伸PCR及同源重组的方式与ICCG连接，构建融合蛋白酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白酶的酶液的获取方式为：
以大肠杆菌为宿主菌，构建包含所述融合蛋白酶的工程菌株，利用IPTG诱导工程菌株中融合蛋白酶的表达，获得融合蛋白酶的酶液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白酶的酶液与PET塑料混合后在4-30℃下静置孵育2-5h，之后在40-60℃、500rpm条件下反应。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶液中融合蛋白酶的浓度为2-50mg/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PET塑料为无定形PET薄膜GF-PET粉碎后得到的粉末。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白酶的酶液与PET塑料混合后在4℃下孵育2-5h。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，PET塑料解聚的反应温度为40℃。
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