CN105671069A - 一种蜜蜂肽表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种蜜蜂肽表达载体及其构建方法和应用。构建方法包括如下步骤：1)合成含编码NTEV蛋白酶的表达操纵子基因；2)合成含编码木聚糖酶与蜜蜂肽的融合蛋白表达操纵子基因；3)分别对步骤1)和2)的表达操纵子基因进行双酶切，构建入载体pBluescriptⅡSK(+)，得到重组质粒；4)提取枯草芽孢杆菌168的基因组DNA，扩增其启动子p43，采用T载体克隆得到含启动子基因质粒，构建入质粒pGJ103，得到质粒pGJ284；通过反向PCR得到含p43启动子部分基因序列的高效启动子序列基因，构建入质粒pGJ284，得到质粒pGJ288；5)分别对上述重组质粒和质粒pGJ288进行双酶切，回收酶切产物后连接，得到蜜蜂肽表达载体。该表达载体表达量高，并且蜜蜂肽的提取方法简便，适合工业化大规模制备。

Description

一种蜜蜂肽表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种表达载体的构建方法，特别是涉及一种蜜蜂肽表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

蜜蜂肽(apidaecin，简称AP)是一类来源于膜翅目昆虫的富脯氨酸的多肽，最早从蜜蜂的淋巴液中分离得到，一般含有16～18个氨基酸残基，其对多种革兰氏阴性菌，特别是肠杆菌科，具有很强的伤杀作用，而对包括乳酸乳球菌在内的革兰氏阳性菌不起作用，并且对真核细胞没有毒性作用，因此在食品和饲料添加剂、医药工业和植物抗细菌病基因工程上有着广阔的应用前景。

由于蜜蜂肽在昆虫中的含量较少，直接从昆虫淋巴中纯化蛋白成本较高，不利于工业化生产，因此人们日渐尝试在不同的表达系统中对蜜蜂肽进行表达，例如大肠杆菌和酵母等表达系统。然而，抗菌肽在外源基因表达中存在基因表达量低、表达产物易降解、表达产物活性低、抗菌肽易对宿主菌产生毒害等问题。

近年来，随着泛素融合技术在多种外源基因表达中的应用，也有将泛素基因与蜜蜂肽融合后在乳酸乳球菌中进行表达的相关报道。然而，该表达系统表达量较低，表达产物的最高产量仅为宿主菌可溶性蛋白的10％以下；此外，该表达系统需要裂解细胞来释放蜜蜂肽，提取工艺操作相对复杂，不利于蜜蜂肽的大规模制备。

发明内容

本发明提供一种蜜蜂肽表达载体及其构建方法和应用，用于解决现有技术的蜜蜂肽表达系统表达量低、蜜蜂肽提取工艺操作复杂等技术缺陷。

本发明提供的一种蜜蜂肽表达载体的构建方法，包括如下步骤：

1)合成含编码TEV蛋白酶的表达操纵子基因；

2)合成含编码木聚糖酶与蜜蜂肽的融合蛋白表达操纵子基因；

3)分别对所述步骤1)和步骤2)的表达操纵子基因进行双酶切，然后构建入载体pBluescriptⅡSK(+)，得到重组质粒；

4)提取枯草芽孢杆菌168的基因组DNA，扩增其启动子p43，采用T载体克隆得到含启动子基因质粒，构建入质粒pGJ103，得到质粒pGJ284；通过反向PCR得到含p43启动子部分基因序列的高效启动子序列基因，构建入质粒pGJ284，得到质粒pGJ288；

5)分别对所述步骤3)的重组质粒和步骤4)的质粒pGJ288进行双酶切，回收酶切产物后采用T4DNA连接酶连接，得到蜜蜂肽表达载体。

本发明人经大量研究发现：采用蜜蜂肽AP与枯草芽孢杆菌宿主同源表达的木聚糖酶融合表达体系，可以使枯草芽孢杆菌高效并且大量分泌蜜蜂肽AP；同时，由木聚糖酶与蜜蜂肽AP融合表达得到的AP融合体不具有抗菌肽活性，其不会对宿主菌产生毒害作用，因此能够保证宿主菌持续且大量地表达AP融合体，而该AP融合体在TEV蛋白酶的作用下可产生具有活性的蜜蜂肽AP，因此可以实现蜜蜂肽AP在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达。

并且，鉴于TEV蛋白酶较为昂贵，因此本发明采用使宿主菌产生TEV蛋白酶的双顺反子表达体系，含有蜜蜂肽表达载体的基因工程菌在发酵培养一段时间后，调整至TEV蛋白酶水解所需的适宜条件，即可大量产生具有活性的蜜蜂肽AP。

进一步地，所述步骤1)的表达操纵子基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

进一步地，所述步骤2)的表达操纵子基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。

进一步地，所述步骤4)中反向PCR采用的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示

本发明提供的一种蜜蜂肽表达载体的构建方法，还包括对所述蜜蜂肽表达载体进行PCR鉴定，所述PCR鉴定采用的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。

本发明还提供一种蜜蜂肽表达载体，通过上述任一所述的构建方法构建得到。

本发明还提供一种重组枯草芽孢杆菌，含有上述的蜜蜂肽表达载体。该重组枯草芽孢杆菌可以通过将上述蜜蜂肽表达载体转化至枯草芽孢杆菌(例如枯草芽孢杆菌1A751)并筛选阳性转化子得到。

本发明还提供上述蜜蜂肽表达载体或重组枯草芽孢杆菌在制备蜜蜂肽上的应用。

本发明还提供一种蜜蜂肽的制备方法，包括：

将所述蜜蜂肽表达载体转化至枯草芽孢杆菌1A751后，筛选阳性转化子；

对所述阳性转化子进行培养，并从培养液中提取蜜蜂肽。

进一步地，所述培养的温度为34～40℃，转速为200～300r/min，时间为20～24h。

进一步地，所述从培养液中提取蜜蜂肽包括：

对培养液进行离心，收集离心上清液；

调节所述离心上清液的pH值为2～3后，置于60～80℃的温度下保持1～3小时。

本发明的实施，至少具有以下优势：

1、本发明采用蜜蜂肽AP与木聚糖酶融合表达体系，由于由木聚糖酶与蜜蜂肽AP融合表达得到的AP融合体不具有抗菌肽活性，其不会对宿主菌产生毒害作用，因此可以使宿主菌持续且大量地表达蜜蜂肽AP融合体。

2、本发明采用使宿主菌产生TEV蛋白酶的双顺反子表达体系，只需将含有蜜蜂肽表达载体的基因工程菌的发酵液调整至TEV蛋白酶水解所需的适宜条件，即可大量产生具有活性的蜜蜂肽AP，从而大大降低了蜜蜂肽的生产成本。

3、本发明采用枯草芽孢杆菌表达系统，相对于真核细胞表达系统和病毒表达系统具有培养条件易于控制、繁殖速度快、分泌量高、蜜蜂肽提取工艺操作相对简单等优点，特别适用于大规模的生产。

4、本发明的方法生产成本低、并且易于操作，其分泌得到的蜜蜂肽浓度高、生物活性强，并且整个工艺过程无毒害物质产生，应用范围广泛。

附图说明

图1为本发明一实施例提供的蜜蜂肽的SDS-PAGE图谱；其中：1为对照例1的分泌表达产物；2为实施例2的分泌表达产物；3为Mark；

图2(a)至图2(c)为本发明一实施例提供的蜜蜂肽的抑菌结果；其中：图2(a)为大肠杆菌抑菌圈；图2(b)为沙门氏杆菌抑菌圈；图2(c)为粪肠球菌的抑菌圈。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图和实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1、人工合成含编码TEV蛋白酶的表达操纵子基因

商业化公司应用专业软件优化TEV蛋白酶的表达操纵子基因为枯草芽孢杆菌最佳密码子基因，其中：

人工合成的含编码TEV蛋白酶的表达操纵子基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，该基因片段的大小为726bp。

2、人工合成含编码木聚糖酶与蜜蜂肽的融合蛋白表达操纵子基因

商业化公司应用专业软件优化含编码木聚糖酶与蜜蜂肽的融合蛋白表达操纵子基因为枯草芽孢杆菌最佳密码子基因，其中：

人工合成的含编码木聚糖酶与蜜蜂肽的融合蛋白表达操纵子基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，该基因片段的大小为1566bp。

3、构建重组质粒D1778-1

采用EcoRⅠ和BamHⅠ对步骤1扩增得到的含编码NTEV蛋白酶的表达操纵子基因进行双酶切，采用BamHⅠ和SacⅠ对步骤2扩增得到的含编码木聚糖酶与蜜蜂肽的融合蛋白表达操纵子基因进行双酶切，然后构建入载体pBluescriptⅡSK(+)，得到重组质粒D1778-1。

4、构建质粒pGJ288

提取枯草芽孢杆菌168的基因组DNA，扩增其启动子p43，采用T载体克隆得到含启动子基因质粒，构建入质粒pGJ103，得到质粒pGJ284；

通过反向PCR得到含p43启动子部分基因序列的高效启动子序列基因，构建入质粒pGJ284，得到质粒pGJ288；其中，反向PCR的条件为：

引物F1：

GACAACAATGATCCCATACCTGATCCGGAAAACCTGTATTTTCAAGGAAA(SEQIDNO:3)

引物R1：

CGGATCAGGTATGGGATCATTGTTGTCCCACACTGTTACGTTAGAACTTCC(SEQIDNO:4)

PCR体系为：质粒pGJ284(模板)，2ul；

dNTP,2.5mmol/L，3ul；

LAtaq聚合酶buffer，2.5ul；

引物F1(SEQIDNO:3)，1.5ul；

引物R1(SEQIDNO:4)，1.5ul；

LAtaq聚合酶，0.3ul；

灭菌超纯水，14.2ul；

PCR反应条件：94℃预变性3min，进入PCR循环：94℃30s，退火41℃30s，60℃3min，共10个循环；94℃30s，退火51℃30s，86℃3min，共25个循环；72℃延伸10min；扩增得到大小为4836bp的基因片段。

5、构建蜜蜂肽表达载体

将重组质粒D1778-1和pGJ288分别用EcoRⅠ与SacⅠ进行双酶切，回收酶切产物后，用T4DNA连接酶在16℃下进行连接，得到蜜蜂肽表达载体pNF11-AP。

对该蜜蜂肽表达载体pNF11-AP进行PCR鉴定，其中：

引物F1:

CCTGATCCGAAATGGAAACTGTTTAAGAAAATTGAAAAAG(SEQIDNO:5)

引物R1：

CAGTTTCCATTTCGGATCAGGTATGGGATCATTGT(SEQIDNO:6)

PCR扩增体系：质粒GJ222(模板)，2ul；

dNTP,2.5mmol/L，3ul；

LAtaq聚合酶buffer，2.5ul；

引物F1(SEQIDNO:5)，1.5ul；

引物R1(SEQIDNO:6)，1.5ul；

LAtaq聚合酶，0.3ul；

灭菌超纯水，14.2ul；

PCR反应条件：94℃预变性3min，进入PCR循环：94℃30s，退火31℃30s，64℃3min，共10个循环；94℃30s，退火41℃30s，76℃3min，共25个循环；72℃延伸10min；扩增得到大小为1566bp的基因片段。

实施例2

1、蜜蜂肽表达载体pNF11-AP的转化

将感受态枯草芽孢杆菌1A751，质粒pZF11-AP相混合，转移至0.2cm电转杯，2500V、5ms电击，立即加入800ul预冷的枯草芽孢杆菌电转恢复培养基LBSPG，于37℃、200rpm恢复培养1h，4500rpm离心集菌涂布于LB(含终浓度50ug/ml壮观霉素)平板上，于37℃培养至单菌落出现，挑取阳性转化子培养提取质粒进行EcoRI、SacI双酶切及PCR鉴定；鉴定扩增出1566bp的克隆定义为pZF11-AP1、pZF11-AP2、pZF11-AP3的阳性转化子。

2、重组枯草芽孢杆菌的分泌表达

将筛选得到的pZF11-AP1、pZF11-AP2、pZF11-AP3的阳性转化子接种到25ml的LB培养基中，于37℃、250r/min振荡培养22小时，10000r/min离心10min收集培养液上清，调整pH值为2，置于70℃下2小时，即制得含有蜜蜂肽的混合液。

3、Tris-tricineSDS-PAGE鉴定

采用截留分子量为10KD的超滤管(美国MILLIPORE)对上述混合液进行超滤，然后用截留分子量为2000的透析袋进行透析，再经过冷冻干燥得到蜜蜂肽AP，用16％的Tricine-SDS-PAGE进行蛋白电泳分析及考马斯亮蓝G-250浓度测定，其中：

16％的聚丙烯酰胺凝胶(分离胶+浓缩胶)为：

Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳试剂为：

10×阳极缓冲液pH8.9

Tris242.28g

蒸馏水定容至1000ml

10×阴极缓冲液pH8.25

Tris121.1g

Tricine179.16g

SDS10g

蒸馏水定容至1000ml

胶缓冲液pH8.45

Tris121.0g

SDS1g

蒸馏水定容至1000ml

电泳方法为：

向内槽加入阴极缓冲液，外槽加入阳极缓冲液，形成Tricine-SDS-PAGE电泳系统，用50v恒电压5个小时，考马斯亮兰染色，用甘油孵育，并用凝胶成像仪摄影。待溴酚兰指示剂离开凝胶，停止电泳，按常规方法剥胶脱色，结果如图1所示。

图1结果表明：上述重组枯草芽孢杆菌能分泌表达出3KD左右的蛋白，其与蜜蜂肽蛋白的大小一致。

薄层凝胶扫描分析电泳结果图，经band5.0软件分析估测：分泌表达的蛋白分别可占菌体上清总蛋白的36％。

对照例1

将实施例1的重组质粒D1778-1和pGJ284分别用EcoRⅠ与SacⅠ进行双酶切，回收酶切产物后，用T4DNA连接酶在16℃下进行连接，得到蜜蜂肽表达载体pNF11-AP-1。

采用实施例2的方法对蜜蜂肽表达载体pNF11-AP-1进行转化、分泌表达和SDS-PAGE鉴定，SDS-PAGE图谱如图1所示。结果表明：对照例1分泌表达的蛋白仅占菌体上清总蛋白的21％，其分泌表达量远远小于本发明采用pGJ288得到的蜜蜂肽表达载体pNF11-AP。

试验例蜜蜂肽的抑菌活性测定

在接入各指示菌的LB培养基平板上，用灭菌的打孔器进行打孔(直径2.3mm)，向每孔注入上述重组枯草芽孢杆菌的发酵液20ul，重复3次，于37℃培养过夜后，测定各指示菌的抑菌圈直径(mm)，以抑菌圈直径计算蜜蜂肽对各指示菌的杀菌活力(X)和杀菌效价(U/ml)，计算公式如下：

杀菌活力(X)＝(抑菌圈直径-2.3mm)/2

杀菌效价(U/ml)＝2X×1000

蜜蜂肽对大肠杆菌K88的抑菌圈如图2(a)所示，其中：抑菌圈直径为8.8mm，杀菌活力X为3.25，杀菌效价为6500U/ml；

蜜蜂肽对沙门氏杆菌的抑菌圈如图2(b)所示，其中：抑菌圈直径为6.9mm，杀菌活力X为2.3，杀菌效价为4600U/ml；

蜜蜂肽对粪肠球菌的抑菌圈如图2(c)所示，其中：抑菌圈直径为2.6mm，杀菌活力X为0.15，杀菌效价为300U/ml。

由此可见，本发明的重组枯草芽孢杆菌所表达的蜜蜂肽具有较强的抑菌活性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种蜜蜂肽表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)合成含编码NTEV蛋白酶的表达操纵子基因；

2)合成含编码木聚糖酶与蜜蜂肽的融合蛋白表达操纵子基因；

3)分别对所述步骤1)和步骤2)的表达操纵子基因进行双酶切，然后构建入载体pBluescriptⅡSK(+)，得到重组质粒；

4)提取枯草芽孢杆菌168的基因组DNA，扩增其启动子p43，采用T载体克隆得到含启动子基因质粒，构建入质粒pGJ103，得到质粒pGJ284；通过反向PCR得到含p43启动子部分基因序列的高效启动子序列基因，构建入质粒pGJ284，得到质粒pGJ288；

5)分别对所述步骤3)的重组质粒和步骤4)的质粒pGJ288进行双酶切，回收酶切产物后采用T4DNA连接酶连接，得到蜜蜂肽表达载体。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)的表达操纵子基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)的表达操纵子基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，还包括对所述蜜蜂肽表达载体进行PCR鉴定，所述PCR鉴定采用的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。

5.一种蜜蜂肽表达载体，其特征在于，通过权利要求1至4任一所述的构建方法构建得到。

6.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，含有权利要求5所述的蜜蜂肽表达载体。

7.权利要求5所述的蜜蜂肽表达载体或权利要求6所述的重组枯草芽孢杆菌在制备蜜蜂肽上的应用。

8.一种蜜蜂肽的制备方法，其特征在于，包括：

将权利要求5所述的蜜蜂肽表达载体转化至枯草芽孢杆菌1A751后，筛选阳性转化子；

对所述阳性转化子进行培养，并从培养液中提取蜜蜂肽。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述培养的温度为34～40℃，转速为200～300r/min，时间为20～24h。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述从培养液中提取蜜蜂肽包括：

对培养液进行离心，收集离心上清液；

调节所述离心上清液的pH值为2～3后，置于60～80℃的温度下保持1～3小时。