CN105647949A - 福寿螺内源性纤维素酶eg27i在毕赤酵母中的组成型表达与纯化 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及福寿螺内源性纤维素酶EG27I在毕赤酵母中的组成型表达与纯化。本发明通过福寿螺内源性纤维素酶EG27基因的重组表达质粒的构建获得了在巴斯德毕赤酵母(Pichia？pastoris)中的组成型高表达和纯化福寿螺内源性纤维素酶EG27I方法。
Description
技术领域
本发明涉及福寿螺内源性纤维素酶，尤其涉及福寿螺内源性纤维素酶EG27基因的重组表达质粒的构建，以及在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中的组成型高表达以及重组酶发酵生产和纯化方法。
背景技术
纤维素酶是一种复合酶系，在酶系中各组分的协同作用下可水解纤维素产生葡萄糖。根据纤维素酶水解纤维素的机理，可以将纤维素酶分为三类：葡聚糖内切酶(endoglucanase，EC3.2.1.4)；葡聚糖外切酶(纤维素外切酶(exoglucanases,EC3.2.1.91)以及β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,EC2.1.21)。
纤维素酶在工业上的应用十分广泛，例如，其在水果蔬菜加工业、饲料业、饮料业、酿造发酵工业、纺织工业、医药工业以及新能源领域都有广泛的用途。
很多有机体都可以产生内源性的纤维素酶，包括微生物(细菌、放线菌、真菌)、植物以及一些动物。工业上应用较多的纤维素酶大多来源于木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)以及青霉属(Penicillium)等微生物。动物内源性纤维素酶的发现较晚，直到1997年才开始有动物内源性纤维素酶基因被克隆得到[WatanabeHetal.CellNature,1998,394:330-331；TokudaGetal.ZoolSci,1997,14:83-93；TokudaGetal.Genebanksubmission,AccessionNo.AB013273,1998；YanYetal.Gene,1998,220:61-70]。相较于工业上常用的微生物来源的纤维素酶，动物内源性纤维素酶往往具有更好的温度稳定性和pH稳定性，而且常具有较高的比活力。
虽然动物内源性纤维素酶具备诸多优点，但是通过组织纯化法生产效率极其低下，并且通过重组表达的方法产量也普遍不高(最高为31mg/L)。ShahramKhademi[ActaCrystallographica,SectionD,BiologicalCrystalography,2002,58(Pt4):653-659]等通过将白蚁来源的纤维素酶NtEG与三种分子伴侣dnaK、dnaJ、GroEL在大肠杆菌中共表达，成功表达了有活力的重组蛋白，但其表达量十分微弱。Ni等[BiosciBiotechnolBiochem,2005,69:1711-1720；ProteinEngDesSel,2007,20:535-542]人以四种白蚁来源的纤维素酶为模版，通过DNAshuffling得到两种突变体PA68和A18，其中PA68的最高表达量是20mg/L，然而天然的RsEG和NtEG重组表达依旧没有成功；KayokoHirayama等[BiosciBiotechnolBiochem,2010,74(8):1680-1686]在米曲霉(Aspergillusoryzae)中重组表达了RsEG和NtEG，其重组表达量分别为26mg/L和31mg/L,这是文献报道的动物内源性纤维素酶重组研究中已知的最高表达量。
EG27是软体动物福寿螺来源的一种动物内源性纤维素酶，属于GHF45家族，最适温度为50℃，最适pH为5.0，具有良好的温度稳定性和pH稳定性，在60℃温浴24小时后仍然残留了80％的酶活力，在pH3.0-12.0、30℃温浴24小时后酶活力基本保留完全。天然的EG27I的比活力约为11U/mg，与工业上常用的里氏木酶来源的纤维素酶的比活力相当。由于EG27I的这些特点，因此在工业上具有良好的应用前景，但是与其他来源的动物内源性纤维素酶一样，EG27I的重组表达也十分的困难。RuiGuo等使用pPIC9K载体在毕赤酵母中对EG27I进行了重组表达，其表达量仅为0.7mg/L。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种在pGAPZαA载体基础上改进的毕赤酵母表达载体pGAPH，包含Kozaksequence(GCCACC)和经密码子优化后的里氏木霉来源的疏水球蛋白HFBII的分泌信号肽的核苷酸序列：
ATGCAATTCTTCGCTGTTGCTTTGTTCGCTACTAGTGCTTTGGCT。
本发明的第二个目的在于提供一种利用上述载体构建的福寿螺内源性纤维素酶EG27I的重组表达质粒pGAPH-EG27I。
本发明的第三个目的在于提供一种转化有上述重组质粒pGAPH-EG27I的毕赤酵母基因工程菌株pGAPH-EG27I/SMD1163。
本发明的第四个目的在于提供一种利用上述毕赤酵母基因工程菌重组表达EG27I的发酵培养方法。
本发明通过基因合成，合成了一段dsDNA序列(5’-ACTCAATTGAACAACTATTTCGCCACCATGCAATTCTTCGCTGTTGCTTTGTTCGCTACTAGTGCTTTGGCTGAATTCGGTACCAAT-3’)，经MfeI和KpnI限制性酶切后与pGAPZαA载体相连，得到改造后的载体pGAPH。
本发明通过PCR方法从pPIC9K-eg27I质粒[RuiGuoetal.ActaBiochimBiophysSin,2008:419-425]中扩增出了EG27I基因，经限制性酶切后与上述构建的pGAPH质粒相连接，得到重组表达质粒pGAPH-EG27I。经测序鉴定正确后，转化大肠杆菌DH5α进行亚克隆。提取重组表达质粒，经BlnI线性化后，转化毕赤酵母SMD1163，获得组成型、高表达基因工程菌株pGAPH-EG27I/SMD1163。
获得上述基因工程表达菌后，接种至30L发酵罐，进行分批补料培养。发酵培养基为Invitrogen推荐的FermentationBasalSaltsMedium[InvitrogencorpSD,CA.Amanualofmethodsexpressionofrecombinantproteinsinpichiapastoris,1998]。
附图说明
附图1、pGAPH载体示意图
附图2、SDS-PAGE分析EG27I的表达
附图3、EG27I发酵培养过程的生长曲线及酶活力曲线
具体实施方式
本发明通过以下实施例进一步阐述，但并不限制本发明的范围
实施例1pGAPH载体的构建
通过基因合成一段如下dsDNA：
5’-ACTCAATTGAACAACTATTTCGCCACCATGCAATTCTTCGCTGTTGCTTTGTTCGCTACTAGTGCTTTGGCTGAATTCGGTACCAAT-3’，该dsDNA经MfeI和KpnI限制性酶切后，将产物纯化试剂盒纯化后的酶切产物，与用相同酶切的pGAPZαA载体(InvitrogenCo.,Ltd.)连接，连接反应体系如下：
以上混合物22℃连接4小时。所得连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，涂布博来霉素抗性平板，筛选阳性克隆，利用质粒提取试剂盒制备质粒DNA。所得质粒DNA用NcoI和SpeI双酶切初步鉴定出质粒pGAPH。
实施例2表达质粒pGAPH-EG27I的构建
首先设计以下引物对：
上游：5’-GGCACTAGTGCTTTGGCTGCACAGTTGTGTCAG-3’
下游：5’-CGCTCTAGATTAGCCCGAATTGTGGCATTCAC-3’
以pPIC9K-eg27I[RuiGuoetal.ActaBiochimBiophysSin,2008:419-425]为模版，采用以上引物对，PCR扩增得到EG27I的基因，产物纯化回收目的片段后，用SpeI和XbaI酶切回收，与相同酶切的pGAPH质粒相连接，连接条件同实施例1，得到质粒pGAPH-EG27I，其结构示意图如图1所示，其核心区域包含了GAP启动子，Kozak序列，HFBII信号肽以及目的基因EG27I。连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，涂布博来霉素抗性平板筛选阳性克隆。采用碱裂解法制备质粒DNA，所得质粒DNA用SpeI和XbaI双酶切来鉴定重组质粒pGAPH-EG27I。将双酶切鉴定正确的质粒进行测序鉴定，鉴定结果正确的即为重组质粒pGAPH-EG27I。
实施例3表达质粒转化毕赤酵母SMD1163
将构建的重组表达质粒pGAPH-EG27I用BlnI酶切线性化，酚/氯仿抽提回收并溶解于无菌水中。按Invitrogen手册介绍的方法[InvitrogencorpSD,CA.Amanualofmethodsexpressionofrecombinantproteinsinpichiapastoris,1998]制备SMD1163电转化细胞，将上述10μg线性化质粒与80μl电转化细胞混合，采用Bio-Rad电转化仪电击转化，电转化采用电转仪预设的酿酒酵母的电转化条件。电转化产物转移到10ml无菌离心管中，立即加入1ml0℃预冷的1mol/L山梨醇，30℃静置两小时，加入2mlYPD(10g/LYeastExtract,20g/LTryptone,20g/LD-glucose)后30℃保温过夜。第二天快速离心去除上清，加入100μl无菌水重悬菌体。取100μl涂布不同浓度博来霉素的YPD平板，30℃培养72小时左右，提取阳性克隆基因组利用上述引物对进行PCR鉴定，鉴定结果正确的即为EG27I的毕赤酵母重组表达菌株pGAPH-EG27I/SMD1163。
实施例4EG27I在毕赤酵母中的表达
将筛选出的EG27I重组表达菌株pGAPH-EG27I/SMD1163接种3mlYPD培养基，30℃、250rpm摇床中培养过夜，以1％接种量接种至8瓶含有250mlYPD培养基的1L锥形瓶中，30℃、250rpm培养过夜，之后将8瓶过夜培养物接种至含有30LFermentationBasalSaltsMedium的50L发酵罐中培养，接种前在发酵培养基中补加4.35ml/L的PTM1，培养温度为30℃，pH控制在5.0，转速500rpm，通气量1vvm。
待发酵罐中溶氧量由100％下降到0％之后回升时，开始向发酵罐中补加50％甘油(含4ml/L)的PTM1，补料速度与溶氧联动，通过补料将溶氧控制在20％左右。发酵过程中每隔12小时取样，将发酵上清液进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示，上清液中含有重组纤维素酶，且随着发酵时间的延长而不断积累。同时，测定各时间点发酵液在600nm处的吸光度值和上清中的酶活力。各取样点的测量值如图3所示，随着发酵时间的增长，菌体量与重组纤维素酶的表达量逐步上升，至100小时左右进入平台期，发酵过程中，上清中的最高酶活力为1259U/L，约合54.9mg/L的EG27I。
本发明的优点在于构建了一种新型的表达质粒pGAPH，利用该质粒构建的重组毕赤酵母可高效表达福寿螺内源性纤维素酶EG27I。
本领域普通技术人员应当理解，可以在本发明的实践中采用除具体例示那些外的方法和原材料等而无需过度实验。任何此类方法和原材料等的所有的本领域已知的功能等价物都预期包括在本发明中。本领域技术人员还应当理解，可对本说明书及权利要求书中描述的本发明进行各种变动和修饰，且本发明包括所有此类变动和修饰。本发明还包括本说明书中单独或同时提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何2个或更多个的任何和所有组合。
Claims (10)
1.表达质粒pGAPH的构建方法，其包括如下步骤：(a)制备如下的dsDNA：5’-ACTCAATTGAACAACTATTTCGCCACCATGCAATTCTTCGCTGTTGCTTTGTTCGCTACTAGTGCTTTGGCTGAATTCGGTACCAAT-3’；和(b)MfeI和KpnI双酶切上述dsDNA并回收产物，将所述回收产物与经过相同酶切的pGAPZαA载体相连，得到pGAPH质粒。
2.质粒，其是可根据权利要求1所述的方法构建的质粒pGAPH。
3.根据权利要求2所述的质粒，其进一步含有福寿螺内源性纤维素酶EG27I的编码序列。
4.根据权利要求3的质粒，其是通过将EG27I基因与pGAPH质粒相连接而获得。
5.如权利要求2－4中任一项所述的质粒，其特征在于，该质粒起始密码子上游有一段Kozak序列5’-GCCACC-3’，之后是分泌信号肽ATGCAATTCTTCGCTGTTGCTTTGTTCGCTACTAGTGCTTTGGCT。
6.工程菌株，其包含根据权利要求2－4中任一项的质粒。
7.根据权利要求6的工程菌株，其为DH5α工程菌株。
8.工程菌株，其被根据权利要求3或4的质粒转化。
9.根据权利要求8的菌株，其是SMD1163。
10.生产福寿螺内源性纤维素酶的方法，其包括培养根据权利要求8或9的菌株。
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