CN101993887A - 一种芽孢杆菌高效分泌表达载体及其构建方法 - Google Patents
一种芽孢杆菌高效分泌表达载体及其构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101993887A CN101993887A CN2010102527425A CN201010252742A CN101993887A CN 101993887 A CN101993887 A CN 101993887A CN 2010102527425 A CN2010102527425 A CN 2010102527425A CN 201010252742 A CN201010252742 A CN 201010252742A CN 101993887 A CN101993887 A CN 101993887A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacillus
- pcha03
- intestinal bacteria
- genus bacillus
- alpha
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title claims abstract description 66
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 title abstract description 15
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 38
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 30
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 24
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 17
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 claims description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 11
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims description 9
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims description 9
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims description 9
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims description 9
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims description 9
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 8
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 18
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 9
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 abstract description 6
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 abstract description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 abstract 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 abstract 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 abstract 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 abstract 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 235000019733 Fish meal Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000170793 Phalaris canariensis Species 0.000 description 1
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 230000009603 aerobic growth Effects 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000004467 fishmeal Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
一种芽孢杆菌高效分泌表达载体及其构建方法，属于微生物、基因工程技术领域。芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2，该芽孢杆菌分泌型表达载体的大肠杆菌转化子JM109/pCHA03已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 2010199。本发明主要利用我国中温α-淀粉酶生产菌株(B.myloliquefaciens)CICIM B4311α-淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区构建适合在芽孢杆菌中分泌表达外源蛋白的载体pCHA03。本发明实施后获得的分泌表达载体可以实现多种外源蛋白在芽孢杆菌宿主中的高效分泌表达，在酶制剂生产、多肽类药物生产等领域具有应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及采用基因工程手段构建芽孢杆菌高效分泌表达载体，属于微生物、基因工程技术领域。
背景技术
芽孢杆菌是一类格兰仕阳性细菌，其很多菌株如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等被用作淀粉酶、蛋白酶等酶制剂的生产，许多产品如中温α-淀粉酶、1398蛋白酶等被长期用于食品加工。芽孢杆菌还具有严格好氧生长的特点，因此一般不具有致病性，是一类比较安全的微生物。除具有较高的安全性外，芽孢杆菌还具有向细胞外大量分泌蛋白质的能力，因此也是一类表达外源蛋白的理想宿主菌。
中温α-淀粉酶的工业生产菌株主要为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，目前我国酶制剂工业所采用的生产菌株是60年代中温α-淀粉酶生产菌株BF7658基础上获得的，为我国酶制剂工业所特有，这一菌株是在野生型解淀粉芽孢杆菌基础上经反复物理化学诱变产生的淀粉酶高产菌株[无锡酶制剂厂.枯草杆菌BF-7658α-淀粉酶高产菌株209的选育和投产.遗传学报，1976，9(3)：216-223.]。在这一淀粉酶高产菌株中，其控制淀粉酶表达的启动子是用于构建芽孢杆菌表达载体的理想材料。本发明所使用的中温α-淀粉酶生产菌株由江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心(http://www.cicim-cu.Jiangnan.edu.cn)提供，其收藏编号为B.amyloliquefaciens CICIM B4311。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：通过基因重组的方法，利用中温α-淀粉酶生产菌株细胞内α-淀粉酶基因的强启动子和信号肽编码区构建一种能控制外源蛋白在芽孢杆菌宿主中高效分泌表达的载体，为酶制剂、多肽类药物等蛋白质的生产提供一种高效分泌表达载体。
本发明的技术方案：一种芽孢杆菌分泌表达载体，分类命名为pCHA03，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2，该芽孢杆菌分泌型表达载体的大肠杆菌转化子JM109/pCHA03已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M2010199。
所述表达载体pCHA03的构建方法：
(1)制备中温α-淀粉酶表达控制元件Pamy：以生产菌CICIM B4311中温α-淀粉酶基因启动子和信号肽编码区组成表达调控元件Pamy，利用PCR方法获得生产菌CICIM B4311中温α-淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区的基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，与文献报道的解淀粉芽孢杆菌标准株α-淀粉酶基因核苷酸序列[Palva I.Molecular cloning of alpha-amylase gene fromBacillus amyloliquefaciens and its expression in B.subtilis(J).Gene，1982，19(1)：81-87.]相比，序列SEQ ID NO：1在基因的启动子区有1个碱基序列发生变化，位于-49位的碱基发生改变C转变为T；
(2)构建大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02：它含有芽孢杆菌复制元件ori-pama，大肠杆菌复制元件pMB1 ori和能在芽孢杆菌和大肠杆菌中使用的四环素抗性基因tet；
该大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02的构建步骤如下：
第一步：以大肠杆菌质粒pBR322为模板，用PCR方法获得大肠杆菌复制原件pMB1 ori；
第二步：以大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pHY300PLK[Ishiwa H andShibahara-Sone H.New shuttle vectors for Escherichia coli and Bacillus subtilis.IV.The nucleotide sequence of pHY300PLK and some properties in relation totransformation(J).Jpn J Genet，61：515-528(1986).]为模板，利用PCR方法获得该质粒中芽孢杆菌复制元件ori-pama和四环素抗性基因tet；
将上述两步获得的DNA片段进行连接，获得大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02；
(3)步骤(1)中获得的中温α-淀粉酶表达控制元件Pamy与步骤(2)中获得的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02进行重组，获得芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03。
所述的芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03的应用，芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03用于转化不同类型的芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，及地衣芽孢杆菌，利用中温α-淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区控制外源蛋白的表达。
材料和方法
普通分子生物学方法：
除非提及，DNA操作和转化按照标准的分子生物学方法进行(Sambrook等1989分子克隆实验手册)，芽孢杆菌的转化按照芽孢杆菌分子生物学操作的经典方法进行(Harwood，C，R.和Cutting，S.M.(eds)芽孢杆菌的分子生物方法)。
除非另外提及，PCR操作使用标准方法和PCR反应数据进行，可参见(Sambrook等1989分子克隆实验手册)。
DNA操作所使用的酶根据供应商的说明等使用。
引物均为本专利发明人设计并由上海生工生物工程有限公司合成。
大肠杆菌JM109，枯草芽孢杆菌标准株168，地衣芽孢杆菌标准株14580均由中国高校工业微生物资源与信息中心(http://www.cicim-cu.jiangnan.edu.cn)提供。
DNA操作使用的酶
除非另外提及，所有的酶，例如限制性内切酶，连接酶等均来自上海生工生物工程有限公司。
培养基
LB在“Sambrook等1989分子克隆实验手册”中描述。发酵培养基：豆饼粉32g/L，鱼粉11g/L，淀粉10g/L，(NH4)2SO4 10g/L，用自来水配制。液体摇瓶培养均采用500mL三角瓶，在37℃条件下按220r/min条件在恒温摇瓶柜中进行。
α-淀粉酶活力测定
参考中国轻工业部标准GB1805.1-93
生物材料样品保藏：芽孢杆菌分泌型表达载体的大肠杆菌转化子JM109/pCHA03，已保藏在中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏日期2010年8月11日，保藏编号CCTCC M 2010199。
本发明的有益效果：本发明实施后获得的分泌表达载体可以实现多种蛋白在芽孢杆菌宿主中的高效分泌表达，在酶制剂生产、多肽类药物生产等领域具有应用前景。
附图说明
图1大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02的限制性酶切图谱结构。
图中符号意义如下：T7 termi：来源于T7噬菌体的转录终止子；pMB1 ori：来源于大肠杆菌质粒pBR322的大肠杆菌复制原件；ori-pama：来源于芽孢杆菌载体pHY300PLK的芽孢杆菌复制元件；tet：四环素抗性基因，可以使含有质粒的大肠杆菌和芽孢杆菌转化子表现出四环素抗性。
图2芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03的限制性酶切图谱。
图中符号意义如下：Pamy：中温α-淀粉酶表达控制元件，包括中温α-淀粉酶基因强启动子和信号肽编码区；T7 termi：来源于T7噬菌体的转录终止子；pMB1 ori：来源于大肠杆菌质粒pBR322的大肠杆菌复制原件；ori-pama：来源于芽孢杆菌载体pHY300PLK的芽孢杆菌复制元件；tet：四环素抗性基因，可以使含有质粒的大肠杆菌和芽孢杆菌转化子表现出四环素抗性。
具体实施方式
通过实施例对本发明作进一步说明，实施例将不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：中温α-淀粉酶基因表达调控元件Pamy的克隆
以解淀粉芽孢杆菌CICIM B4311染色体DNA为模板扩增α-淀粉酶基因的表达控制元件(Pamy)，采用引物：
5′-AATTACCGGGTACCCTGGCTGAAAACATTGAGCC-3′，(SEQ ID NO：3)
5′-AATCCGCGGCTCGAGAACTAGTGTCGACGAGCTCCTGCAGAAGCTTTACGTAGGATCCAATGAATTCGAATTCGGGCCCATTTACGGCTGATG-3′，(SEQ ID NO：4)
扩增片段全长约0.3kb，用限制性内切酶Kpn I、和Sac II消化，与经相同酶切的分子克隆通用载体pBluescript sk(-)连接，连接混合物转化大肠杆菌JM109的感受态细胞，37℃下在含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上选择转化子。转化子质粒命名为pSK-amy，该质粒含有中温α-淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区，为便于使用在信号肽编码区下游增加了多个限制性内切酶识别位点。
实施例2：大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02的构建
第一步：获得含大肠杆菌复制元件pMB1 ori的DNA片段
以质粒pBR322为模板，用PCR方法扩增大肠杆菌复制元件，利用引物如下：
5’-ATCTCGAGCAGCTGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGC AATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTT TGCTGAAAGGAGGAAT CATGACCAAAATCCCTTAAC-3’，(SEQ ID NO：5)
5’-ATAGGCCTTACCGCACAG ATGCGTAAGG AGAAAATACC GCATCAGGCG CTCTTCCGCT TCC-3’，(SEQ ID NO：6)
PCR扩增获得一约0.9kb大小的DNA片段，该片段包含大肠杆菌复制原件pMB1 ori，该片段用Xho I和Stu I酶切后备用。在引物SEQ ID NO：5中，下划线部分序列与T7噬菌体转录终止序列一致，在所构建的载体中起转录终止的作用。
第二步获得含芽孢杆菌复制元件ori-pama和四环素抗性基因tet的片段
以芽孢杆菌质粒pHY300PLK为模板，扩增含芽孢杆菌复制元件ori-pama和四环素抗性基因tet的片段，利用引物如下：
5’-ATAGGCCTGCTAGAAATTCCTTAAGG-3’，(SEQ ID NO：7)
5’-ATCTCGAGAATGCATGGTACCGCTAGAAATTCCTGTTATAAAAAAAGGATC-3’，(SEQ ID NO：8)
PCR扩增获得一约3kb大小的DNA片段，该片段含有芽孢杆菌复制元件ori-pama和四环素抗性基因tet，片段用Xho I和Stu I酶切后与在本实施例第一步中获得的片段进行连接，连接物转化大肠杆菌JM109，在含四环素的LB平板上筛选转化子，转化子质粒命名为pCH02，该质粒的限制性酶切图谱如图1所示。
实施例3：芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03的构建
将实施例1中获得的重组质粒pSK-amy用限制性内切酶Kpn I和Sac II酶切，分离其中约0.3kb大小的片段，该片段含有中温α-淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区组成的表达调控元件Pamy，分离后备用。
将实施例2中获得的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02用限制性内切酶Kpn I和Xho I酶切，与上一步骤中用同样酶切并分离获得的0.3kb片段进行连接，连接物转化大肠杆菌JM109，在含四环素的LB平板上筛选转化子，转化子质粒命名为pCHA03，该质粒的限制性酶切图谱结构如图2所示。
实施例4：利用芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03实现高嗜热α-淀粉酶基因在芽孢杆菌中的分泌表达
以含有古细菌Pyrococcus furisus来源的高嗜热α-淀粉酶基因的质粒pEtac-amy[沈微王正祥唐雪明等.古细菌Pyrococcus furiosus高嗜热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的分泌表达.中国酿造，2003，1：12-14.]为模板，利用引物如下：
5’-AATGAATTCATGGCAAAATACTTGGAGC-3’，(SEQ ID NO：9)
5’-AATAAGCTTTTACCCAACACCACAATAAC-3’，(SEQ ID NO：10)
PCR扩增获得一约1.4kb大小的DNA片段，该DNA片段为P.furiosusα-淀粉酶基因的成熟肽编码基因(pfa)，编码的α-淀粉酶具有极高的耐热性，在121℃条件下处理1小时酶活仍能保留一半以上[4]。上述DNA片段用EcoR I和Hind III酶切后与实施例3中获得的经同样酶切处理的载体pCHA03进行连接，连接物转化大肠杆菌JM109，在含四环素的LB平板上筛选转化子，转化子质粒命名为pCHA-pfa。大量提取质粒pCHA-pfa分别转化枯草芽孢杆菌标准株168、解淀粉芽孢杆菌CICIM B2125和地衣芽孢杆菌标准株14580等，在含15μg/mL四环素的LB固体培养基中筛选转化子，转化子分离纯化后分别接种含15μg/mL四环素的LB液体培养基，培养24小时后分别取10mL培养液接种100mL发酵培养基中。作为对照，用空质粒pCHA03转化枯草芽孢杆菌标准株168、解淀粉芽孢杆菌CICIM B2125和地衣芽孢杆菌标准株14580等获得的转化子也同样接种。上述菌株在发酵培养基中摇瓶培养48小时后各取培养液30mL，以8,000r/min离心20min，取上清液在高压灭菌锅中121℃保温1小时，保温后分别取少量培养液检测酶活，结果如表1
表1不同转化子培养液的酶活
| 宿主菌 | 转化子所含质粒 | 酶活 |
| 枯草芽孢杆菌 | pCHA03 | 0 |
| 枯草芽孢杆菌 | pCHA-pfa | 8.3 |
| 地衣芽孢杆菌 | pCHA03 | 0 |
| 地衣芽孢杆菌 | pCHA-pfa | 16.1 |
| 解淀粉芽孢杆菌 | pCHA03 | 0 |
| 解淀粉芽孢杆菌 | pCHA-pfa | 32.5 |
由表1可见，含有空质粒pCHA03的转化子发酵液高温处理后均不能检测出酶活。虽然上述三种芽孢杆菌自身均能产生一定量的α-淀粉酶，但其自身所产生的α-淀粉酶在121℃保温1小时后均已失活。含重组质粒pCHA-pfa的转化子的发酵液在高温处理后均能检测到明显的α-淀粉酶活力，显然这是P.furiosusα-淀粉酶基因表达的结果，由于本实施例中使用的P.furiosusα-淀粉酶基因只有成熟肽编码区，不含信号肽，因此该基因是在pCHA03的中温α-淀粉酶基因启动子的控制下表达并且在中温α-淀粉酶信号肽的引导下分泌到细胞外的。由本实施例可见，利用pCHA03质粒可以成功实现外源基因在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌等多种芽孢杆菌中的分泌表达。
Claims (3)
1.一种芽孢杆菌分泌表达载体，分类命名为pCHA03，其核苷酸序列为SEQID NO：2，该芽孢杆菌分泌型表达载体的大肠杆菌转化子JM109/pCHA03已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 2010199。
2.权利要求1所述表达载体pCHA03的构建方法，其特征在于：
(1)制备中温α-淀粉酶表达控制元件Pamy：以生产菌CICIM B4311中温α-淀粉酶基因启动子和信号肽编码区组成表达调控元件Pamy，利用PCR方法获得生产菌CICIM B4311中温α-淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区的基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，与文献报道的解淀粉芽孢杆菌标准株α-淀粉酶基因核苷酸序列相比，序列SEQ ID NO：1在基因的启动子区有1个碱基序列发生变化，位于-49位的碱基发生改变C转变为T；
(2)构建大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02：它含有芽孢杆菌复制元件ori-pama，大肠杆菌复制元件pMB1 ori和能在芽孢杆菌和大肠杆菌中使用的四环素抗性基因tet；
该大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02的构建步骤如下：
第一步：以大肠杆菌质粒pBR322为模板，用PCR方法获得大肠杆菌复制原件pMB1 ori；
第二步：以大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pHY300PLK为模板，利用PCR方法获得该质粒中芽孢杆菌复制元件ori-pama和四环素抗性基因tet；
将上述两步获得的DNA片段进行连接，获得大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02；
(3)步骤(1)中获得的中温α-淀粉酶表达控制元件Pamy与步骤(2)中获得的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02进行重组，获得芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03。
3.权利要求1所述的芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03的应用，其特征在于：芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03用于转化不同类型的芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，及地衣芽孢杆菌，利用中温α-淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区控制外源蛋白的表达。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010252742 CN101993887B (zh) | 2010-08-13 | 2010-08-13 | 一种芽孢杆菌高效分泌表达载体及其构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010252742 CN101993887B (zh) | 2010-08-13 | 2010-08-13 | 一种芽孢杆菌高效分泌表达载体及其构建方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101993887A true CN101993887A (zh) | 2011-03-30 |
| CN101993887B CN101993887B (zh) | 2013-04-17 |
Family
ID=43784641
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201010252742 Expired - Fee Related CN101993887B (zh) | 2010-08-13 | 2010-08-13 | 一种芽孢杆菌高效分泌表达载体及其构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101993887B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103911337A (zh) * | 2013-01-09 | 2014-07-09 | 中国海洋大学 | 高粘附性丁酸梭菌及其制备方法 |
| CN104630229A (zh) * | 2015-02-11 | 2015-05-20 | 华南理工大学 | 一种具有启动子功能的dna片段与应用 |
| CN105348384A (zh) * | 2015-12-01 | 2016-02-24 | 山东隆科特酶制剂有限公司 | 透明颤菌血红蛋白突变体及其在基因工程菌中的可控表达 |
| CN114395577A (zh) * | 2022-01-06 | 2022-04-26 | 上海应用技术大学 | 一种基因工程菌的制备方法、基因工程菌及重组壳聚糖酶 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5334531A (en) * | 1986-05-07 | 1994-08-02 | Eniricerche S.P.A | Plasmid vector for expression in bacillus and used for cloning the structural gene which codes for the human growth hormone and a method of producing the hormone |
| CN1721541A (zh) * | 2005-06-27 | 2006-01-18 | 江南大学 | 在大肠杆菌或芽孢杆菌中分泌表达外源基因的表达载体及其构建 |
-
2010
- 2010-08-13 CN CN 201010252742 patent/CN101993887B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5334531A (en) * | 1986-05-07 | 1994-08-02 | Eniricerche S.P.A | Plasmid vector for expression in bacillus and used for cloning the structural gene which codes for the human growth hormone and a method of producing the hormone |
| CN1721541A (zh) * | 2005-06-27 | 2006-01-18 | 江南大学 | 在大肠杆菌或芽孢杆菌中分泌表达外源基因的表达载体及其构建 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 《 生 物 技 术》 20091231 佟小雪,牛丹丹,陈献忠,石贵阳,王正祥 地衣芽孢杆菌高温alpha- 淀粉酶异源表达研究 11－13 1－2 第19卷, 第5期 * |
| SYED DG,AGASAR D ,PANDEY A.: "Production and partial purification of alpha- amylase from a novel isolate Streptomyces gulbargensis", 《J IND MICROBIOL》 * |
| 佟小雪,牛丹丹,陈献忠,石贵阳,王正祥: "地衣芽孢杆菌高温α- 淀粉酶异源表达研究", 《 生 物 技 术》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103911337A (zh) * | 2013-01-09 | 2014-07-09 | 中国海洋大学 | 高粘附性丁酸梭菌及其制备方法 |
| CN103911337B (zh) * | 2013-01-09 | 2016-08-03 | 中国海洋大学 | 高粘附性丁酸梭菌及其制备方法 |
| CN104630229A (zh) * | 2015-02-11 | 2015-05-20 | 华南理工大学 | 一种具有启动子功能的dna片段与应用 |
| CN104630229B (zh) * | 2015-02-11 | 2018-10-30 | 华南理工大学 | 一种具有启动子功能的dna片段与应用 |
| CN105348384A (zh) * | 2015-12-01 | 2016-02-24 | 山东隆科特酶制剂有限公司 | 透明颤菌血红蛋白突变体及其在基因工程菌中的可控表达 |
| CN105348384B (zh) * | 2015-12-01 | 2018-12-18 | 山东隆科特酶制剂有限公司 | 透明颤菌血红蛋白突变体及其在基因工程菌中的可控表达 |
| CN114395577A (zh) * | 2022-01-06 | 2022-04-26 | 上海应用技术大学 | 一种基因工程菌的制备方法、基因工程菌及重组壳聚糖酶 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101993887B (zh) | 2013-04-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106754833B (zh) | 在枯草芽孢杆菌中高效表达普鲁兰酶的方法及重组枯草芽孢杆菌 | |
| Yang et al. | Microbial production and molecular engineering of industrial enzymes: challenges and strategies | |
| CN105112313B (zh) | 马克思克鲁维酵母营养缺陷型菌株及无痕基因组改造方法 | |
| CN102268448B (zh) | 一种用于在里氏木霉细胞内表达外源蛋白的表达设备及其基因工程菌 | |
| CN109790510A (zh) | 在不存在诱导底物下丝状真菌细胞中的蛋白产生 | |
| CN107250365A (zh) | 增强的蛋白质表达 | |
| CN101993887B (zh) | 一种芽孢杆菌高效分泌表达载体及其构建方法 | |
| CN102586167B (zh) | 一株重组的枯草芽孢杆菌及由其生产转谷氨酰胺酶的方法 | |
| CN107759675A (zh) | 一种来源于枯草芽孢杆菌可提高分泌效率的信号肽及其应用 | |
| CN107287229A (zh) | 一种利用芽孢杆菌高效分泌表达外源蛋白的方法 | |
| WO2005045013A2 (en) | Recombinant microorganism | |
| CN109022438A (zh) | 一种角蛋白酶异源表达的启动子及其应用 | |
| Kim | Overproduction and secretion of Bacillus circulans endo-β-1, 3-1, 4-glucanase gene (bglBC1) in B. ásubtilis and B. ámegaterium | |
| CN109295087B (zh) | 一种表达制备udp-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的方法 | |
| CN108570477B (zh) | 一种碱性蛋白酶基因及其重组枯草芽孢杆菌菌株的构建方法 | |
| WO2021216302A1 (en) | Compositions and methods for enhanced protein production in filamentous fungal cells | |
| CN116144571B (zh) | 一种不依赖于抗生素并稳定高产α-淀粉酶的短小芽孢杆菌及其构建方法和应用 | |
| CN103114089B (zh) | 源于里氏木霉的强启动子及其表达载体和应用 | |
| CN107674119A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌可有效提高分泌的信号肽及其应用 | |
| Bergquist et al. | Production of recombinant bleaching enzymes from thermophilic microorganisms in fungal hosts | |
| CN101457230A (zh) | 一种高温α-淀粉酶及其突变体的高效制备方法 | |
| CN103045629A (zh) | 一种乳糖酶基因葡萄糖解阻遏敲除载体pMD19/HPT | |
| CN105671069B (zh) | 一种蜜蜂肽表达载体及其构建方法和应用 | |
| CA2871841C (en) | Endoglucanases with improved properties | |
| RU2646132C1 (ru) | Рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens cl14, продуцирующий компонент целллюлосомы clostridium thermocellum, и способ его культивирования |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20201116 Address after: 226500 No. 6 Haiyang South Road, Chengnan Street, Rugao City, Nantong City, Jiangsu Province Patentee after: LAIDING ELECTRONIC MATERIAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 214122 Jiangsu Province, Wuxi City Lake Road No. 1800, Jiangnan University Institute of biological engineering Patentee before: Jiangnan University |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130417 |