CN101993887A - 一种芽孢杆菌高效分泌表达载体及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
一种芽孢杆菌高效分泌表达载体及其构建方法，属于微生物、基因工程技术领域。芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2，该芽孢杆菌分泌型表达载体的大肠杆菌转化子JM109/pCHA03已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 2010199。本发明主要利用我国中温α-淀粉酶生产菌株(B.myloliquefaciens)CICIM B4311α-淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区构建适合在芽孢杆菌中分泌表达外源蛋白的载体pCHA03。本发明实施后获得的分泌表达载体可以实现多种外源蛋白在芽孢杆菌宿主中的高效分泌表达，在酶制剂生产、多肽类药物生产等领域具有应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及采用基因工程手段构建芽孢杆菌高效分泌表达载体，属于微生物、基因工程技术领域。
背景技术
芽孢杆菌是一类格兰仕阳性细菌，其很多菌株如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等被用作淀粉酶、蛋白酶等酶制剂的生产，许多产品如中温α-淀粉酶、1398蛋白酶等被长期用于食品加工。芽孢杆菌还具有严格好氧生长的特点，因此一般不具有致病性，是一类比较安全的微生物。除具有较高的安全性外，芽孢杆菌还具有向细胞外大量分泌蛋白质的能力，因此也是一类表达外源蛋白的理想宿主菌。
中温α-淀粉酶的工业生产菌株主要为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，目前我国酶制剂工业所采用的生产菌株是60年代中温α-淀粉酶生产菌株BF7658基础上获得的，为我国酶制剂工业所特有，这一菌株是在野生型解淀粉芽孢杆菌基础上经反复物理化学诱变产生的淀粉酶高产菌株[无锡酶制剂厂.枯草杆菌BF-7658α-淀粉酶高产菌株209的选育和投产.遗传学报，1976，9(3)：216-223.]。在这一淀粉酶高产菌株中，其控制淀粉酶表达的启动子是用于构建芽孢杆菌表达载体的理想材料。本发明所使用的中温α-淀粉酶生产菌株由江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心(http://www.cicim-cu.Jiangnan.edu.cn)提供，其收藏编号为B.amyloliquefaciens CICIM B4311。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：通过基因重组的方法，利用中温α-淀粉酶生产菌株细胞内α-淀粉酶基因的强启动子和信号肽编码区构建一种能控制外源蛋白在芽孢杆菌宿主中高效分泌表达的载体，为酶制剂、多肽类药物等蛋白质的生产提供一种高效分泌表达载体。
本发明的技术方案：一种芽孢杆菌分泌表达载体，分类命名为pCHA03，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2，该芽孢杆菌分泌型表达载体的大肠杆菌转化子JM109/pCHA03已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M2010199。
所述表达载体pCHA03的构建方法：
(1)制备中温α-淀粉酶表达控制元件Pamy：以生产菌CICIM B4311中温α-淀粉酶基因启动子和信号肽编码区组成表达调控元件Pamy，利用PCR方法获得生产菌CICIM B4311中温α-淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区的基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，与文献报道的解淀粉芽孢杆菌标准株α-淀粉酶基因核苷酸序列[Palva I.Molecular cloning of alpha-amylase gene fromBacillus amyloliquefaciens and its expression in B.subtilis(J).Gene，1982，19(1)：81-87.]相比，序列SEQ ID NO：1在基因的启动子区有1个碱基序列发生变化，位于-49位的碱基发生改变C转变为T；
(2)构建大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02：它含有芽孢杆菌复制元件ori-pama，大肠杆菌复制元件pMB1 ori和能在芽孢杆菌和大肠杆菌中使用的四环素抗性基因tet；
该大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02的构建步骤如下：
第一步：以大肠杆菌质粒pBR322为模板，用PCR方法获得大肠杆菌复制原件pMB1 ori；
第二步：以大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pHY300PLK[Ishiwa H andShibahara-Sone H.New shuttle vectors for Escherichia coli and Bacillus subtilis.IV.The nucleotide sequence of pHY300PLK and some properties in relation totransformation(J).Jpn J Genet，61：515-528(1986).]为模板，利用PCR方法获得该质粒中芽孢杆菌复制元件ori-pama和四环素抗性基因tet；
将上述两步获得的DNA片段进行连接，获得大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02；
(3)步骤(1)中获得的中温α-淀粉酶表达控制元件Pamy与步骤(2)中获得的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02进行重组，获得芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03。
所述的芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03的应用，芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03用于转化不同类型的芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，及地衣芽孢杆菌，利用中温α-淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区控制外源蛋白的表达。
材料和方法
普通分子生物学方法：
除非提及，DNA操作和转化按照标准的分子生物学方法进行(Sambrook等1989分子克隆实验手册)，芽孢杆菌的转化按照芽孢杆菌分子生物学操作的经典方法进行(Harwood，C，R.和Cutting，S.M.(eds)芽孢杆菌的分子生物方法)。
除非另外提及，PCR操作使用标准方法和PCR反应数据进行，可参见(Sambrook等1989分子克隆实验手册)。
DNA操作所使用的酶根据供应商的说明等使用。
引物均为本专利发明人设计并由上海生工生物工程有限公司合成。
大肠杆菌JM109，枯草芽孢杆菌标准株168，地衣芽孢杆菌标准株14580均由中国高校工业微生物资源与信息中心(http://www.cicim-cu.jiangnan.edu.cn)提供。
DNA操作使用的酶
除非另外提及，所有的酶，例如限制性内切酶，连接酶等均来自上海生工生物工程有限公司。
培养基
LB在“Sambrook等1989分子克隆实验手册”中描述。发酵培养基：豆饼粉32g/L，鱼粉11g/L，淀粉10g/L，(NH4)2SO4 10g/L，用自来水配制。液体摇瓶培养均采用500mL三角瓶，在37℃条件下按220r/min条件在恒温摇瓶柜中进行。
α-淀粉酶活力测定
参考中国轻工业部标准GB1805.1-93
生物材料样品保藏：芽孢杆菌分泌型表达载体的大肠杆菌转化子JM109/pCHA03，已保藏在中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏日期2010年8月11日，保藏编号CCTCC M 2010199。
本发明的有益效果：本发明实施后获得的分泌表达载体可以实现多种蛋白在芽孢杆菌宿主中的高效分泌表达，在酶制剂生产、多肽类药物生产等领域具有应用前景。
附图说明
图1大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02的限制性酶切图谱结构。
图中符号意义如下：T7 termi：来源于T7噬菌体的转录终止子；pMB1 ori：来源于大肠杆菌质粒pBR322的大肠杆菌复制原件；ori-pama：来源于芽孢杆菌载体pHY300PLK的芽孢杆菌复制元件；tet：四环素抗性基因，可以使含有质粒的大肠杆菌和芽孢杆菌转化子表现出四环素抗性。
图2芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03的限制性酶切图谱。
图中符号意义如下：Pamy：中温α-淀粉酶表达控制元件，包括中温α-淀粉酶基因强启动子和信号肽编码区；T7 termi：来源于T7噬菌体的转录终止子；pMB1 ori：来源于大肠杆菌质粒pBR322的大肠杆菌复制原件；ori-pama：来源于芽孢杆菌载体pHY300PLK的芽孢杆菌复制元件；tet：四环素抗性基因，可以使含有质粒的大肠杆菌和芽孢杆菌转化子表现出四环素抗性。
具体实施方式
通过实施例对本发明作进一步说明，实施例将不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：中温α-淀粉酶基因表达调控元件Pamy的克隆
以解淀粉芽孢杆菌CICIM B4311染色体DNA为模板扩增α-淀粉酶基因的表达控制元件(Pamy)，采用引物：
5′-AATTACCGGGTACCCTGGCTGAAAACATTGAGCC-3′，(SEQ ID NO：3)
5′-AATCCGCGGCTCGAGAACTAGTGTCGACGAGCTCCTGCAGAAGCTTTACGTAGGATCCAATGAATTCGAATTCGGGCCCATTTACGGCTGATG-3′，(SEQ ID NO：4)
扩增片段全长约0.3kb，用限制性内切酶Kpn I、和Sac II消化，与经相同酶切的分子克隆通用载体pBluescript sk(-)连接，连接混合物转化大肠杆菌JM109的感受态细胞，37℃下在含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板上选择转化子。转化子质粒命名为pSK-amy，该质粒含有中温α-淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区，为便于使用在信号肽编码区下游增加了多个限制性内切酶识别位点。
实施例2：大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02的构建
第一步：获得含大肠杆菌复制元件pMB1 ori的DNA片段
以质粒pBR322为模板，用PCR方法扩增大肠杆菌复制元件，利用引物如下：
5’-ATCTCGAGCAGCTGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGC AATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTT TGCTGAAAGGAGGAAT CATGACCAAAATCCCTTAAC-3’，(SEQ ID NO：5)
5’-ATAGGCCTTACCGCACAG ATGCGTAAGG AGAAAATACC GCATCAGGCG CTCTTCCGCT TCC-3’，(SEQ ID NO：6)
PCR扩增获得一约0.9kb大小的DNA片段，该片段包含大肠杆菌复制原件pMB1 ori，该片段用Xho I和Stu I酶切后备用。在引物SEQ ID NO：5中，下划线部分序列与T7噬菌体转录终止序列一致，在所构建的载体中起转录终止的作用。
第二步获得含芽孢杆菌复制元件ori-pama和四环素抗性基因tet的片段
以芽孢杆菌质粒pHY300PLK为模板，扩增含芽孢杆菌复制元件ori-pama和四环素抗性基因tet的片段，利用引物如下：
5’-ATAGGCCTGCTAGAAATTCCTTAAGG-3’，(SEQ ID NO：7)
5’-ATCTCGAGAATGCATGGTACCGCTAGAAATTCCTGTTATAAAAAAAGGATC-3’，(SEQ ID NO：8)
PCR扩增获得一约3kb大小的DNA片段，该片段含有芽孢杆菌复制元件ori-pama和四环素抗性基因tet，片段用Xho I和Stu I酶切后与在本实施例第一步中获得的片段进行连接，连接物转化大肠杆菌JM109，在含四环素的LB平板上筛选转化子，转化子质粒命名为pCH02，该质粒的限制性酶切图谱如图1所示。
实施例3：芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03的构建
将实施例1中获得的重组质粒pSK-amy用限制性内切酶Kpn I和Sac II酶切，分离其中约0.3kb大小的片段，该片段含有中温α-淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区组成的表达调控元件Pamy，分离后备用。
将实施例2中获得的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02用限制性内切酶Kpn I和Xho I酶切，与上一步骤中用同样酶切并分离获得的0.3kb片段进行连接，连接物转化大肠杆菌JM109，在含四环素的LB平板上筛选转化子，转化子质粒命名为pCHA03，该质粒的限制性酶切图谱结构如图2所示。
实施例4：利用芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03实现高嗜热α-淀粉酶基因在芽孢杆菌中的分泌表达
以含有古细菌Pyrococcus furisus来源的高嗜热α-淀粉酶基因的质粒pEtac-amy[沈微王正祥唐雪明等.古细菌Pyrococcus furiosus高嗜热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的分泌表达.中国酿造，2003，1：12-14.]为模板，利用引物如下：
5’-AATGAATTCATGGCAAAATACTTGGAGC-3’，(SEQ ID NO：9)
5’-AATAAGCTTTTACCCAACACCACAATAAC-3’，(SEQ ID NO：10)
PCR扩增获得一约1.4kb大小的DNA片段，该DNA片段为P.furiosusα-淀粉酶基因的成熟肽编码基因(pfa)，编码的α-淀粉酶具有极高的耐热性，在121℃条件下处理1小时酶活仍能保留一半以上[4]。上述DNA片段用EcoR I和Hind III酶切后与实施例3中获得的经同样酶切处理的载体pCHA03进行连接，连接物转化大肠杆菌JM109，在含四环素的LB平板上筛选转化子，转化子质粒命名为pCHA-pfa。大量提取质粒pCHA-pfa分别转化枯草芽孢杆菌标准株168、解淀粉芽孢杆菌CICIM B2125和地衣芽孢杆菌标准株14580等，在含15μg/mL四环素的LB固体培养基中筛选转化子，转化子分离纯化后分别接种含15μg/mL四环素的LB液体培养基，培养24小时后分别取10mL培养液接种100mL发酵培养基中。作为对照，用空质粒pCHA03转化枯草芽孢杆菌标准株168、解淀粉芽孢杆菌CICIM B2125和地衣芽孢杆菌标准株14580等获得的转化子也同样接种。上述菌株在发酵培养基中摇瓶培养48小时后各取培养液30mL，以8,000r/min离心20min，取上清液在高压灭菌锅中121℃保温1小时，保温后分别取少量培养液检测酶活，结果如表1
表1不同转化子培养液的酶活
| 宿主菌 | 转化子所含质粒 | 酶活 |
| 枯草芽孢杆菌 | pCHA03 | 0 |
| 枯草芽孢杆菌 | pCHA-pfa | 8.3 |
| 地衣芽孢杆菌 | pCHA03 | 0 |
| 地衣芽孢杆菌 | pCHA-pfa | 16.1 |
| 解淀粉芽孢杆菌 | pCHA03 | 0 |
| 解淀粉芽孢杆菌 | pCHA-pfa | 32.5 |
由表1可见，含有空质粒pCHA03的转化子发酵液高温处理后均不能检测出酶活。虽然上述三种芽孢杆菌自身均能产生一定量的α-淀粉酶，但其自身所产生的α-淀粉酶在121℃保温1小时后均已失活。含重组质粒pCHA-pfa的转化子的发酵液在高温处理后均能检测到明显的α-淀粉酶活力，显然这是P.furiosusα-淀粉酶基因表达的结果，由于本实施例中使用的P.furiosusα-淀粉酶基因只有成熟肽编码区，不含信号肽，因此该基因是在pCHA03的中温α-淀粉酶基因启动子的控制下表达并且在中温α-淀粉酶信号肽的引导下分泌到细胞外的。由本实施例可见，利用pCHA03质粒可以成功实现外源基因在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌等多种芽孢杆菌中的分泌表达。
Claims (3)
1.一种芽孢杆菌分泌表达载体，分类命名为pCHA03，其核苷酸序列为SEQID NO：2，该芽孢杆菌分泌型表达载体的大肠杆菌转化子JM109/pCHA03已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 2010199。
2.权利要求1所述表达载体pCHA03的构建方法，其特征在于：
(1)制备中温α-淀粉酶表达控制元件Pamy：以生产菌CICIM B4311中温α-淀粉酶基因启动子和信号肽编码区组成表达调控元件Pamy，利用PCR方法获得生产菌CICIM B4311中温α-淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区的基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，与文献报道的解淀粉芽孢杆菌标准株α-淀粉酶基因核苷酸序列相比，序列SEQ ID NO：1在基因的启动子区有1个碱基序列发生变化，位于-49位的碱基发生改变C转变为T；
(2)构建大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02：它含有芽孢杆菌复制元件ori-pama，大肠杆菌复制元件pMB1 ori和能在芽孢杆菌和大肠杆菌中使用的四环素抗性基因tet；
该大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02的构建步骤如下：
第一步：以大肠杆菌质粒pBR322为模板，用PCR方法获得大肠杆菌复制原件pMB1 ori；
第二步：以大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pHY300PLK为模板，利用PCR方法获得该质粒中芽孢杆菌复制元件ori-pama和四环素抗性基因tet；
将上述两步获得的DNA片段进行连接，获得大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02；
(3)步骤(1)中获得的中温α-淀粉酶表达控制元件Pamy与步骤(2)中获得的大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pCH02进行重组，获得芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03。
3.权利要求1所述的芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03的应用，其特征在于：芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03用于转化不同类型的芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，及地衣芽孢杆菌，利用中温α-淀粉酶基因的启动子和信号肽编码区控制外源蛋白的表达。
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