CN114395577A - 一种基因工程菌的制备方法、基因工程菌及重组壳聚糖酶 - Google Patents

一种基因工程菌的制备方法、基因工程菌及重组壳聚糖酶 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基因工程菌的制备方法、基因工程菌及重组壳聚糖酶。本发明的基因工程菌的制备方法包括：去除壳聚糖酶编码基因csn信号肽编码序列；将芽孢杆菌信号肽编码序列连接csn，插入大肠杆菌‑芽孢杆菌穿梭载体，并转入芽孢杆菌中，即可获得能够大量分泌表达重组壳聚糖酶蛋白的基因工程菌。将基因工程菌在适宜条件下培养后可大量分泌重组壳聚糖酶，通过简单醇沉及亲和层析即可获得高纯度的重组壳聚糖酶。本发明制备壳聚糖酶的工艺简单，适于工业放大，可广泛应用于食品、药品、生物等领域。

Description

一种基因工程菌的制备方法、基因工程菌及重组壳聚糖酶
技术领域
本发明涉及一种基因工程菌的制备方法、基因工程菌及重组壳聚糖酶，属于生物工程技术领域。
背景技术
甲壳素是地球上仅次于纤维素的第二大天然类高分子化合物，经脱乙酰后成为壳聚糖。壳聚糖含有游离氨基，是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有可生物降解、细胞亲和性和多种生物活性。但是，由于壳聚糖水溶性差，难以发挥大多数生物活性，大大限制壳聚糖的应用。近年发现壳聚糖的水解产物壳寡糖具有独特的生理活性。壳寡糖由2-20个单糖通过糖苷键连接，相较于壳聚糖具有水溶性好、易于吸收、功能性强、生物活性高等特点，被科学界誉为“第六大生命元素”，在食品、药品、生物等领域应用广泛。因此，关于壳寡糖的生产受到广大研究人员的高度重视，也取得显著成效。
目前，壳寡糖常见的制备方法有物理降解法和化学降解法。物理降解法以微波、超声波、辐照、射线、加热、加压等方式断裂壳聚糖分子中的糖苷键。物理法污染小，产物纯度高且结构简单，但设备成本高、生产效率低，因此通常与其他方法结合，工业上未建立纯物理法大规模生产壳寡糖。目前工业化生产壳寡糖的传统方法是化学降解法，即酸法水解制备壳寡糖。利用壳聚糖分子中的氨基基团与酸性溶液中的氢离子结合，使壳聚糖分子间氢键断裂，形成聚合度不同的混合产物。该方法技术要求相对较低，降解速度快，设备、原料成本较低，非常适合工业化生产。但化学法反应复杂，难以控制，降解副产物多，污染大，且水解反应会破坏壳聚糖分子中的糖苷键，过度水解时糖苷键全部断裂生成单糖，因此分离纯化成本高，壳寡糖收率低。
随着生物技术的发展，酶法逐渐被应用于壳寡糖的制备。壳聚糖酶(Chitosanase)通常由细菌、放线菌、真菌等微生物发酵生产，其中细菌来源最丰富，如芽孢杆菌属、假单胞菌属、链霉菌属等。壳聚糖酶属水解酶，可分为内切酶和外切酶。其中壳聚糖内切酶以内切方式专一性水解壳聚糖分子中的β-1,4糖苷键。壳聚糖酶水解制备壳寡糖工艺对环境友好，可以低成本控制产品的聚合度。与前两种方法相比，酶法制备壳寡糖可克服物理法得率低与化学法选择性差的缺点，且因其高效可控、条件温和、选择性高等优点近年逐渐引发关注。
壳聚糖酶可通过菌株分泌获得，由于大多数野生菌株产壳聚糖酶效率低，成本高，造成壳寡糖生产成本相应提高，限制了酶解法制备壳寡糖的工业化应用。菌种筛选、高密度发酵、优化培养条件等方法，虽然在一定程度上提高了野生菌株壳聚糖酶产量，但仍难以满足工业化需求。随着科技进步，构建重组壳聚糖酶并用于壳寡糖制备成为发展趋势。然而胞内表达壳聚糖酶的纯化需经过细胞破碎等繁琐步骤，不仅提高了酶的制备成本，酶活也会受到影响。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：目前胞内表达壳聚糖酶的纯化需经过细胞破碎等繁琐步骤，从而导致壳聚糖酶的制备成本高和酶活下降等问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：通过PCR反应将编码壳聚糖酶的csn基因和信号肽编码DNA序列融合，得到融合后的基因片段；所述csn基因的序列如SEQ ID No.1所示，所述信号肽编码DNA序列如SEQ ID No.2所示；
步骤2：将融合后的基因片段插入穿梭表达载体中，得到重组表达质粒；
步骤3：将重组表达质粒转化入宿主菌中，即得所述的基因工程菌。
优选地，所述步骤2中的穿梭表达载体为大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭表达载体，所述大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭表达载体为pJKK502、pSUGV4、pBE2RS、pGDVM或pHT304。
优选地，所述步骤3中的宿主菌为芽孢杆菌属细菌，所述的芽孢杆菌属细菌为Bacillus cereus、Bacillus circulans、Bacillus subtilis或Bacillus thuringiensis。
本发明还提供了上述基因工程菌的制备方法制备所得的基因工程菌。
本发明还提供了上述基因工程菌的制备方法制备所得的基因工程菌在制备重组壳聚糖酶中的应用。
本发明还提供了一种基因工程菌BM103，所述的基因工程菌BM103于2021年12月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC24021，分类命名为枯草芽孢杆菌，拉丁名为Bacillus subtilis。
本发明还提供了一种重组壳聚糖酶，所述的重组壳聚糖酶中包含由SEQ ID No.1所示的csn基因编码的蛋白质G，所述的蛋白质G由SEQ ID No.2所示的基因片段编码的信号肽分泌表达。
优选地，所述的重组壳聚糖酶通过以下步骤制得：
步骤1：将上述的基因工程菌BM103接种于LB培养基中培养，得到细菌培养液；
步骤2：将步骤1所得的细菌培养液接种于新鲜的LB培养基中，得到培养液；
步骤3：将步骤2所得的培养液离心分离后收集上清液，依次经过醇沉和亲和层析，即得纯化的重组壳聚糖酶。
优选地，所述步骤1中的培养条件为：在37℃、200rpm条件下振荡培养12-14h。
优选地，所述步骤2中的培养条件为：在37℃、200rpm条件下进行振荡培养，直至培养液的OD600值达到1.7-1.9。
优选地，所述步骤1和步骤2中的LB培养基中含有卡那霉素。
更优选地，所述卡那霉素的浓度为40～60μg/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明通过基因工程手段构建可高效表达和分泌壳聚糖酶的基因工程菌，只需要在适宜条件下培养即可将有活性的壳聚糖酶表达和分泌至宿主细胞的胞外，再通过简单醇沉及亲和层析等方法进行分离纯化，即可获得高纯度重组壳聚糖酶，可大大降低酶解法制备壳寡糖的生产成本；
2.本发明制备壳聚糖酶的工艺简单，无需细胞破碎，直接从培养上清即可纯化制备壳聚糖酶，克服了目前胞内表达壳聚糖酶的纯化需经过细胞破碎等繁琐步骤从而导致酶活受影响及成本高的缺陷，本发明的方法适于工业放大，可广泛应用于食品、药品、生物等领域。
附图说明
图1为实施例1中PCR反应条件；
图2为双酶切验证融合基因的琼脂糖凝胶电泳图；
图3由基因工程菌BM103制备的重组壳聚糖酶的SDS-PAGE电泳图；
图4为壳寡糖标准品校正曲线和重组壳聚糖酶酶解产物的凝胶渗透色谱图。
保藏说明
基因工程菌BM103的分类命名为枯草芽孢杆菌，拉丁名为Bacillus subtilis，保藏编号CGMCC24021，保藏时间为2021年12月02日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
本发明实施例中的壳聚糖酶编码基因来源于芽孢杆菌中编码壳聚糖酶的基因csn，其编码的蛋白具有壳聚糖水解活性，该基因的DNA序列如SEQ ID No.1所示(不包含信号肽编码序列)。所用的芽孢杆菌信号肽具有跨膜分泌的作用，芽孢杆菌信号肽的编码DNA序列如SEQ ID No.2所示，可直接帮助壳聚糖酶分泌至胞外。
所使用的穿梭表达载体是含有P43强启动子的质粒。该启动子是重叠型启动子，不需要诱导条件即可分别在细胞生长对数期和稳定期启动转录和表达。
所用的宿主菌可为苏云金芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或短芽孢杆菌等。
本发明的基因工程菌的制备方法包括以下步骤：
(1)以芽孢杆菌的基因组DNA为模板。根据公开的编码壳聚糖酶的基因序列设计引物，通过聚合酶链式反应(下文称为PCR)来获得编码壳聚糖酶的DNA片段(下文称为csn)及信号肽编码DNA序列；
(2)将上述通过PCR获得的两种DNA片段与使用相应酶切位点酶切后的穿梭表达载体的片段连接，来获得融合csn和信号肽编码DNA序列的重组质粒，通过例如序列测定来验证重组质粒的真实性和准确性。
(3)将DNA片段插入到穿梭表达载体，可以通过例如PCR时在目标DNA片段的两端引入合适的酶切位点，然后分别酶切目标DNA片段和载体，再在例如连接酶的作用下，将酶切后的目标DNA片段以及载体片段连接形成重组质粒；或者通过先将两种DNA片段插入到中间载体例如pMD18-T Vector中，再通过酶切而获得具有所期望的酶切粘端的DNA片段，将这两种DNA片段连接能与之匹配的穿梭表达载体酶切片段，构建壳聚糖酶重组质粒。
(4)将上述重组质粒通过电转化方法转入芽孢杆菌宿主菌，转化有上述重组质粒的芽孢杆菌成为高效表达和分泌重组壳聚糖酶的基因工程菌。在适宜培养条件下表达和分泌重组壳聚糖酶，并通过简单分离纯化可得到高纯度的重组壳聚糖酶。
上述基因工程菌制备重组壳聚糖的方法包括以下步骤：
(1)将重组菌单菌落接种于培养基例如Luria-Bertani培养基(以下称为LB培养基)中，在37℃，200rpm条件下震荡培养12-14h。根据重组质粒所携带的抗生素标记基因，培养基中加入相对应的抗生素，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、潮霉素、四环霉素等。
(2)从步骤(1)的细菌培养物中取菌液转接到新鲜培养基中，接种量优选为2％，继续在37℃，200rpm条件下震荡培养。
(3)当菌液的OD600为1.7-1.9时，重组壳聚糖酶分泌至胞外的量达到最大。OD600是指细菌培养液在600nm波长处的吸光值。
(4)通过例如离心等方法得到上清液，简单醇沉及亲和层析后，在1-4℃下保存备用。
上述得到的上清液可直接加入高分子量壳聚糖溶液中，于37℃下水解壳聚糖生产低分子量壳聚糖和壳寡糖。
实施例1
本发明提供了一种基因工程的制备方法和重组壳聚糖酶的制备方法：
1.一种基因工程菌的制备方法：
(1)csn与Apr sp+pro基因片段的克隆
根据美国国家生物技术信息中心的GenBank所公布的芽孢杆菌壳聚糖酶基因序列设计引物(称为P)，并在5’端融合信号肽Apr sp+pro的编码DNA序列，以芽孢杆菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应条件如图1所示，得到csn和Apr sp+pro的融合基因片段。
P-F(5’→3’)：GGATCCGCGGGACTGAATAAAGAT(SEQ ID No.3)；
P-R(5’→3’)：CTGCAGTTTGATTACAAAATTACC(SEQ ID No.4)；
引物P的5’端含有Pst I酶切位点，3’端含有BamH I酶切位点。
将上述PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，得到大小约为726bp，如图2所示。经序列测定证实，上述基因片段具有如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的核苷酸序列。将信号肽编码基因Apr sp连接csn，即获得csn与Apr sp+pro的融合基因片段。
(2)壳聚糖酶穿梭表达质粒的构建
将上述融合基因片段分别连接至pMD18-T载体，使用CaCl2转化法转入大肠杆菌DH5α，转化子提取质粒进行双酶切、PCR验证及测序验证后，挑取验证正确的转化子单菌落进行培养后提取质粒，得到重组质粒pMD18-T-csn。
用Pst I/BamH I对pMD18-T-csn进行双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳并回收大小约726bp的酶切片段。穿梭表达载体以相同酶双酶切与回收。将上述回收的两个片段在T4 DNA连接酶的作用下进行连接并导入芽孢杆菌中，得到基因工程菌BM103，其于2021年12月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究生，保藏编号为CGMCC24021，分类命名为枯草芽孢杆菌，拉丁名为Bacillus subtilis。
上述的基因工程菌在含有卡那霉素(Kan)的LB平板上筛选阳性克隆子，进行双酶切验证、PCR验证，得到约7728bp大小的片段。对重组质粒进行测序，测序结果表明读码框正确。即得到重组壳聚糖酶分泌表达质粒pBE2RS-csn。
2.将基因工程菌BM103进行培养制备重组壳聚糖酶的方法：
挑取BM103单菌落，接种于含有50μg/mL Kan的LB培养基中，200rpm，37℃培养12h后，以2％接种量接种于新鲜的LB培养基扩大培养，直至OD600达到1.8。培养物8000×g离心10min收集上清，4℃条件下经简单乙醇沉淀，沉淀物用PBS重悬，离心去上清再次用溶解缓冲液重悬后进行亲和层析，取样用SDS-PAGE分析，结果如图3所示，表达并分泌至胞外的蛋白分子量约为29kDa，与重组壳聚糖酶大小吻合，胞内表达壳聚糖酶对照无条带。
实施例2
本实施例提供了重组壳聚糖酶在酶解壳聚糖中的应用：
将实施例1重组菌培养后的上清液于4℃，8000×g离心10min，取上清后，加入60％-80％的乙醇醇沉。于4℃，8000×g离心10min后弃上清，离心沉淀用PBS重悬，离心去上清再次用溶解缓冲液重悬，采用镍柱纯化试剂盒进行亲合层析，用100-600mM的咪唑梯度洗脱，然后将纯化后的壳聚糖酶样品冻干。
购买商品化壳聚糖，其平均分子量1×105Da。称取1g壳聚糖于60mL水中，并加入1％的乙酸，用氢氧化钠调节pH至5.5后加水定容到100mL，即配置成浓度10g/L的溶液。将壳聚糖酶按1:62(w/v)的量加入上述壳聚糖溶液中，于37℃恒温水浴锅中反应，反应2h后，产物的相对分子量降低至1.6×103Da。根据壳寡糖标准品构建的校正曲线及产物凝胶色谱检测结果如图4所示，凝胶色谱的出峰位置为壳聚糖酶解产物，分子量约1.6kDa。
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海应用技术大学
<120> 一种基因工程菌的制备方法、基因工程菌及重组壳聚糖酶
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 726
<212> DNA
<213> 壳聚糖酶(csn)
<400> 1
gcgggactga ataaagatca aaagcgccgg gcggaacagc tgacaagtat ctttgaaaac 60
ggcacaacgg agatccaata tggatatgta gagcgattgg atgacgggcg aggctataca 120
tgcggacggg caggctttac aacggctacc ggggatgcat tggaagtagt ggaagtatac 180
acaaaggcag ttccgaataa caaactgaaa aagtatctgc ctgaattgcg ccgtctggcc 240
aaggaagaaa gcgatgatac aagcaatctc aagggattcg cttctgcctg gaagtcgctt 300
gcaaatgata aggaatttcg cgccgctcaa gacaaagtaa atgaccattt gtattatcag 360
cctgccatga aacgatcgga taatgccgga ctaaaaacag cattggcaag agctgtgatg 420
tacgatacgg ttattcagca tggcgatggt gatgaccctg actcttttta tgccttgatt 480
aaacgtacga acaaaaaagc gggcggatca cctaaagacg gaatagacga gaagaagtgg 540
ttgaataaat tcttggacgt acgctatgac gatctgatga atccggccaa tcatgacacc 600
cgtgacgaat ggagagaatc agttgcccgt gtggacgtgc ttcgctctat cgccaaggag 660
aacaactata atctaaacgg accgattcat gttcgttcaa acgagtacgg taattttgta 720
atcaaa 726
<210> 2
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaagaaac cgttggggaa aattgtcgca agcaccgcac tactcatttc tgttgctttt 60
agttcatcga tcgcatcggc tgctgaagaa gcaaaagaaa aatatttaat tggctttaat 120
gagcaggaag ctgtcagtga gtttgtagaa caagtagagg caaatgacga ggtcgccatt 180
ctctctgagg aagaggaagt cgaaattgaa ttgcttcatg aatttgaaac gattcctgtt 240
ttatccgttg agttaagccc agaagatgtg gacgcgcttg aactcgatcc agcgatttct 300
tatattgaag aggatgcaga agtaacgaca 330
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggatccgcgg gactgaataa agat 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgcagtttg attacaaaat tacc 24

Claims (10)

1.一种基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：通过PCR反应将编码壳聚糖酶的csn基因和信号肽编码DNA序列融合，得到融合后的基因片段；所述csn基因的序列如SEQ ID No.1所示，所述信号肽编码DNA序列如SEQ IDNo.2所示；
步骤2：将融合后的基因片段插入穿梭表达载体中，得到重组表达质粒；
步骤3：将重组表达质粒转化入宿主菌中，即得所述的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的穿梭表达载体为大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭表达载体，所述大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭表达载体为pJKK502、pSUGV4、pBE2RS、pGDVM或pHT304。
3.如权利要求1所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述步骤3中的宿主菌为芽孢杆菌属细菌，所述的芽孢杆菌属细菌为Bacillus cereus、Bacillus circulans、Bacillus subtilis或Bacillus thuringiensis。
4.权利要求1～3中任意一项所述的基因工程菌的制备方法制备所得的基因工程菌。
5.权利要求1～3中任意一项所述的基因工程菌的制备方法制备所得的基因工程菌在制备重组壳聚糖酶中的应用。
6.一种基因工程菌BM103，其特征在于，所述的基因工程菌BM103于2021年12月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC24021，分类命名为枯草芽孢杆菌，拉丁名为Bacillus subtilis。
7.一种重组壳聚糖酶，其特征在于，所述的重组壳聚糖酶中包含由SEQ ID No.1所示的csn基因编码的蛋白质G，所述的蛋白质G由SEQ ID No.2所示的基因片段编码的信号肽分泌表达。
8.如权利要求7所述的重组壳聚糖酶，其特征在于，通过以下步骤制得：
步骤1：将权利要求6所述的基因工程菌BM103接种于LB培养基中培养，得到细菌培养液；
步骤2：将步骤1所得的细菌培养液接种于新鲜的LB培养基中，得到培养液；
步骤3：将步骤2所得的培养液离心分离后收集上清液，依次经过醇沉和亲和层析，即得纯化的重组壳聚糖酶。
9.如权利要求8所述的重组壳聚糖酶，其特征在于，所述步骤1中的培养条件为：在37℃、200rpm条件下振荡培养12-14h。
10.如权利要求8所述的的重组壳聚糖酶，其特征在于，所述步骤2中的培养条件为：在37℃、200rpm条件下振荡培养，直至培养液的OD600值达到1.7-1.9。
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