CN114891776B - 双酶分层级联纳米晶体的构建及其作用pet塑料降解的方法 - Google Patents

双酶分层级联纳米晶体的构建及其作用pet塑料降解的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114891776B
CN114891776B CN202210618204.6A CN202210618204A CN114891776B CN 114891776 B CN114891776 B CN 114891776B CN 202210618204 A CN202210618204 A CN 202210618204A CN 114891776 B CN114891776 B CN 114891776B
Authority
CN
China
Prior art keywords
enzyme
mhetase
durapetase
double
nanocrystals
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210618204.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114891776A (zh
Inventor
孙彦
陈坤
董晓燕
史清洪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University
Original Assignee
Tianjin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University filed Critical Tianjin University
Priority to CN202210618204.6A priority Critical patent/CN114891776B/zh
Publication of CN114891776A publication Critical patent/CN114891776A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114891776B publication Critical patent/CN114891776B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/18—Multi-enzyme systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J11/00—Recovery or working-up of waste materials
    • C08J11/04—Recovery or working-up of waste materials of polymers
    • C08J11/10—Recovery or working-up of waste materials of polymers by chemically breaking down the molecular chains of polymers or breaking of crosslinks, e.g. devulcanisation
    • C08J11/105—Recovery or working-up of waste materials of polymers by chemically breaking down the molecular chains of polymers or breaking of crosslinks, e.g. devulcanisation by treatment with enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2367/00—Characterised by the use of polyesters obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain; Derivatives of such polymers
    • C08J2367/02—Polyesters derived from dicarboxylic acids and dihydroxy compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
    • Y02W30/00—Technologies for solid waste management
    • Y02W30/50—Reuse, recycling or recovery technologies
    • Y02W30/62—Plastics recycling; Rubber recycling

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开双酶分层级联纳米晶体的构建及其作用PET塑料降解的方法；包括基因表达及纯化带有SpyCatcher标签的MHETase，溶解于PBS缓冲液中，然后在溶液中添加CaCl2，形成杂化纳米颗粒；将带有SpyTag标签的DuraPETase通过SpyCatcher‑SpyTag间的相互作用形成稳定的共价键，从而将DuraPETase固定在纳米颗粒表面，制备得到DuraPETase@MHETase纳米晶体；构建的双酶分层级联杂化纳米材料的高比表面积可以提高底物对酶的可及性，并提高酶对自然界不利条件的耐性以及催化活性，增强酶对高结晶度PET的降解效率，从而推动酶处理PET废弃物的工业化应用进程。

Description

双酶分层级联纳米晶体的构建及其作用PET塑料降解的方法
技术领域
本发明涉及利用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)降解酶(DuraPETase)和对苯二酸单(羟乙)酯(MHET)降解酶(MHETase)构建双酶分层级联纳米晶体(DuraPETase@MHETase)的制备方法并将其应用于PET废弃物处理的方法，属于固定化酶技术领域。
背景技术
聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是现代社会广泛使用的一类塑料材料，给人类的生活带来了很大的便利。但是，大量难以分解的塑料废弃物堆弃在垃圾填埋场和海洋中，造成了严重的环境污染，已经为全球生态系统带来严重负担。另外，有研究者在人类粪便中发现了塑料微粒，塑料污染已经开始威胁到人类健康。对PET废弃物的传统处理方法包括填埋、焚烧、化学降解等需要消耗大量的能量，并经常产生额外的有毒有害的环境污染物；而生物降解法是一种高效环保的处理PET污染的新兴方法。2016年日本研究团队发现的一种新型的PET降解酶PETase，可以在常温下降解PET塑料，但效率较低(Yoshida,S.；Hiraga,K.；Takehana,T.；Taniguchi,I.；Yamaji,H.；Maeda,Y.；Toyohara,K.；Miyamoto,K.；Kimura,Y.；Oda,K.A bacterium that degrades and assimilates poly(ethyleneterephthalate).Science 2016,351,1196-1199.)。2021年中国研究团队通过计算机理性设计的方法获得的突变体DuraPETase极大地改善了酶对PET的降解性能(Cui,Y.L.；Chen,Y.C.；Liu,X.Y.；Dong,S.J.；Tian,Y.E.；Qiao,Y.X.；Mitra,R.；Han,J.；Li,C.L.；Han,X.；Liu,W.D.；Chen,Q.；Wei,W.Q.；Wang,X.；Du,W.B.；Tang,S.Y.；Xiang,H.；Liu,H.Y.；Liang,Y.；Houk,K.N.；Wu,B.Computational redesign of a PETase for plasticbiodegradation under ambient condition by the GRAPE strategy.ACSCatalysis.2021,11,1340-1350.)，但一方面，为了更快更好地处理PET污染的问题，仍需通过有效的技术手段提升酶的性能；另一方面，DuraPETase只能够将PET水解为对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯(BHET)、对苯二酸单(羟乙)酯(MHET)和对苯二甲酸(TPA)三种单体，其中BHET和MHET对PETase具有一定的产物抑制效应，而且PET的合成需要以TPA和EG为原料，因此，利用MHET降解酶(MHETase)对DuraPETase水解PET的产物进行进一步降解，不仅能够降低或消除产物抑制，促进DuraPETase降解效率，还可以为PET的合成回收所需原料。
中国专利申请号为202110803574.2的发明专利申请，公开了一种“利用两种酶协同作用降解PET塑料的方法”，是基于简单地将PET塑料放入PETase酶和MHETase酶的混合酶液中进行PET降解的方法，虽然可以完全将PET降解为TPA和EG，但两种酶之间没有形成有效的底物通道效应以促进对PET塑料的降解，因此本发明旨在通过有效的技术手段，进一步提升酶对PET的降解效率。
酶耦联形成的多酶复合体(multienzyme complexes，MECs)由于底物通道以及邻近效应机制，使各酶活性中心之间的空间距离大大缩短，生成的中间产物无需被前一个酶分子释放即可直接传递至下一个酶的活性中心，从而极大地促进了酶的协同作用，提高了催化反应效率。近年来，利用SpyTag/SpyCatcher系统构建的多酶自组装复合体越来越受到研究者的关注和应用。SpyTag与SpyCatcher自发的成键过程反应速度快，产率高，对实验条件的适应能力强，特异性好，因此SpyTag/SpyCatcher系统对于合成生物学、代谢工程、蛋白质工程、纳米生物技术以及生物医学领域具有重要的应用价值。
利用PET降解酶对PET高效降解，有效治理塑料污染，仍然是一个巨大的挑战。因此，本发明拟选用纳米晶体固定化酶的方式，通过SpyTag/SpyCatcher系统将DuraPETase和MHETase进行双酶耦联，提高酶对自然界不利条件的耐性，增强对高结晶度PET的降解效率，从而推进酶的工业化应用进程。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于克服现有技术的不足，进而提供一种简单高效的双酶级联固定化系统的构建方法，并将其应用于PET薄膜的处理，从而推动酶处理PET废弃物的工业化应用进程。本发明提出了利用SpyTag/SpyCatcher系统构建双酶分层级联纳米晶体的方法，该方法得到的固定化双酶体系能够保持甚至提高酶活并大幅度地增强稳定性，制备过程简单易行、成本低廉、生物相容性好，更适合工业化应用。
本发明公开一种利用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)降解酶(DuraPETase)和对苯二酸单(羟乙)酯(MHET)降解酶(MHETase)构建双酶分层级联纳米晶体(DuraPETase@MHETaseHybrid Nanocrystals)的制备方法；包括基因表达及纯化带有SpyCatcher标签的MHETase，并将其溶解于PBS缓冲液中，然后在溶液中添加适当浓度的CaCl2，使其形成杂化纳米颗粒；将带有SpyTag标签的DuraPETase通过SpyCatcher-SpyTag间的相互作用形成稳定的共价键，从而将DuraPETase固定在纳米颗粒表面，制备得到DuraPETase@MHETase纳米晶体；纳米粒子表面的Ca2+能够对两种酶的活性有一定的积极作用，另外，构建的双酶分层级联杂化纳米材料的高比表面积可以提高底物对酶的可及性，而纳米级基质缩短传质距离，从而实现双酶级联的底物通道效应，并提高酶对自然界不利条件的耐性以及催化活性，增强酶对高结晶度PET的降解效率，从而推动酶处理PET废弃物的工业化应用进程。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种利用PET降解酶和MHET降解酶构建双酶分层级联纳米晶体(DuraPETase@MHETase)的制备方法，包括以下步骤：
(1)首先构建双酶分层级联纳米晶体所需的融合蛋白DuraPETase-SpyTag和MHETase-SpyCatcher的表达载体和菌株，并进行蛋白表达及纯化，表达载体DuraPETase-SpyTag-pET22b(+)和MHETase-SpyCatcher-pColdⅡ的核苷酸序列分别见SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；
(2)将CaCl2水溶液加入纯化的MHETase-SpyCatcher蛋白的PBS缓冲液中；
(3)将所述(2)所得混合液进行离心，收集沉淀；
(4)将所述沉淀使用过膜水清洗至不再有蛋白脱落后溶解于PBS缓冲液中，得到MHETase杂化纳米晶体；
(5)将所述MHETase杂化纳米晶体与DuraPETase-SpyTag蛋白溶液混合；
(6)将所述混合液孵育，使DuraPETase-SpyTag通过与MHETase-SpyCatcher及Ca2+之间的共价及配位相互作用包封于MHETase杂化纳米晶体表面；
(7)将所述(6)所得混合液进行离心，收集沉淀，用过膜水洗至不再有蛋白脱落后溶解于PBS缓冲液中，得到DuraPETase@MHETase双酶级联杂化纳米晶体。
优选的，所述步骤(2)反应体系中Ca2+终浓度为10.0–20.0mM，MHETase-SpyCatcher蛋白浓度为0.2–0.4mg/mL，反应时间为6–36h。
优选的，所述步骤(2)、(4)和(7)中PBS缓冲液浓度为10-15mM磷酸缓冲液，20-30mMNaCl，pH 7.5。
优选的，所述步骤(3)和(7)离心转速为8000-9000rpm，时间为10-15min，温度为4℃。
优选的，所述步骤(4)中MHETase杂化纳米晶体的粒径为1-2μm。
优选的，所述步骤(5)中MHETase-SpyCatcher酶浓度为0.2–0.4mg/mL；
优选的，所述步骤(6)中DuraPETase-SpyTag终浓度为0.2–0.4mg/mL。
优选的，所述步骤(6)中孵育温度为4℃，时间为1-2h。
优选的，所述步骤(7)中DuraPETase@MHETase双酶级联纳米晶体的粒径为1.5-2μm，这种双酶纳米晶体主要是由数百个纳米晶瓣堆叠而成的纳米晶体状结构，DuraPETase主要位于纳米晶体的外层，MHETase位于内层。
优选的，所述步骤(7)中DuraPETase@MHETase双酶级联杂化纳米晶体中蛋白DuraPETase-SpyTag与MHETase-SpyCatcher的摩尔比为0.25-1.56：1。
本发明的目标酶包括但不限于PET降解酶和MHET降解酶。
本发明提供了上述DuraPETase@MHETase双酶分层级联杂化纳米晶体在PET薄膜降解方面的应用。
(1)使用双酶级联杂化纳米晶体对直径为6mm的PET薄膜进行降解，比游离酶具有更高的PET降解性能，并且可以将PET完全降解为其合成原料TPA，有助于原料再生及经济循环的实现。
(2)本发明利用标签融合肽SpyTag/SpyCatcher系统的共价相互作用，将PET降解酶和MHET降解酶分层固定于磷酸钙纳米晶体上，合成的DuraPETase@MHETase双酶纳米晶体制备过程简单易行、成本低廉、生物相容性好，对保持酶结构、提升酶活性具有重要意义。
经实验证明，DuraPETase@MHETase双酶纳米晶体结构分布均匀，晶体直径约为1.5μm，由数百个纳米晶瓣堆叠而成，其比表面积、孔体积和平均孔径大小分别为26.38m2/g、0.17cm3/g和25.07nm，具有高的比表面积与多孔结构。DuraPETase@MHETase双酶纳米晶体能够很好地稳定酶蛋白结构，所得固定化酶具有比游离酶体系更高的催化可溶性底物(BHET)的酶活性和显著增强的热稳定性和pH稳定性，利于适应复杂的酶催化环境，利于在多种自然条件下对PET的降解。
另外，在对PET薄膜的降解应用方面，纳米晶体固定化酶在40和50℃条件下均表现出比游离体系更高的PET降解性能，DuraPETase@MHETase纳米晶体的PET降解性能在40℃、6d时为游离酶的9.7倍，50℃、6d时为游离酶的5.2倍。
与中国专利申请号为202110803574.2的发明专利相比，本发明构建的双酶级联纳米晶体具有更优的对PET的降解效率，且可以把PET完全降解为TPA和EG，用于PET材料的再合成，在PET废弃物处理以及PET经济循环领域将有广阔的应用前景。
附图说明
图1为DuraPETase-SpyTag-pET22b(+)的质粒图谱；
图2为MHETase-SpyCatcher-pColdⅡ的质粒图谱；
图3为MHETase杂化纳米晶体的扫描电镜照片；
图4为不同DuraPETase-SpyTag与MHETase-SpyCatcher摩尔比条件下游离酶与纳米晶体固定化酶在不同温度下降解BHET的酶活性对比图，其中，(a)30℃，(b)40℃，(c)50℃；
图5为DuraPETase@MHETase双酶纳米晶体的扫描电镜和透射电镜照片，其中，(a)扫描电镜，(b)透射电镜；
图6为不同温度和pH对固定化酶和游离酶降解BHET酶活性的影响，其中，(a)温度，(b)pH；
图7为固定化酶与游离酶在40和50℃、pH 7.0和9.0的稳定性，其中，(a)40℃，(b)50℃，(c)pH 7.0，(d)pH 9.0；
图8为固定化酶与游离酶在40和50℃降解PET薄膜的产物积累量，其中，(a)40℃，(b)50℃；
图9为固定化酶与游离酶在40和50℃降解PET薄膜10d的扫描电镜照片，其中，(a)40℃，(b)50℃；
图10为DuraPETase@MHETase双酶级联杂化纳米晶体的制备过程。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。实施例所描述的内容仅用于说明本发明，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
若未特别指明，本发明实施例中所用的实验试剂和材料等均可市售获得，若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：
菌株构建、蛋白表达及纯化
设计引物，通过PCR的方法将SpyTag基因(核苷酸序列见SEQ ID NO：1)克隆至DuraPETase基因(核苷酸序列见SEQ ID NO：2)的C末端，得到融合基因DuraPETase-SpyTag；将SpyCatcher基因(核苷酸序列见SEQ ID NO：3)克隆至MHETase基因(核苷酸序列见SEQ IDNO：4)的C末端，得到融合基因MHETase-SpyCatcher，使用NdeⅠ和XhoⅠ限制性内切酶对两种融合基因进行消化，通过琼脂糖凝胶电泳及琼脂糖凝胶回收试剂盒进行DNA片段回收；将pET-22b(+)和pColdⅡ(均为Takara公司购买)两种表达载体使用NdeⅠ和XhoⅠ限制性内切酶进行消化，通过琼脂糖凝胶电泳及琼脂糖凝胶回收试剂盒进行DNA片段回收。将所得DNA片段通过T4 DNA Ligase进行连接，构建重组蛋白表达载体DuraPETase-SpyTag-pET22b(+)(核苷酸序列见SEQ ID NO：5，质粒图谱如图1)和MHETase-SpyCatcher-pColdⅡ(核苷酸序列见SEQ ID NO：6，质粒图谱如图2)。
重组蛋白表达载体构建成功并测序完全正确后，通过化学转化法分别转入表达宿主BL21(DE3)和pShuffle T7感受态细胞(均为Takara公司购买)，然后对重组蛋白表达菌株通过IPTG诱导表达，利用金属离子螯合层析(IMAC)法进行初步纯化，然后通过尺寸排阻色谱(SEC)对蛋白进一步纯化并除盐，将纯化后的蛋白DuraPETase-SpyTag和MHETase-SpyCatcher保存于50mM Na2HPO4-HCl，100mM NaCl，pH 7.0缓冲液中用于后续实验。
实施例2：
MHETase杂化纳米晶体的合成
将120μLCaCl2水溶液加入2880μL MHETase蛋白的PBS缓冲液(10mM磷酸缓冲液，20mM NaCl，pH 7.5)中，4℃条件下静置，离心(8000rpm，10min)，分别收集沉淀和上清液，沉淀用过膜水洗三次后溶解于缓冲液中并测定其MHET降解活性，上清液通过测定其蛋白含量后计算负载率。
将构建的MHETase杂化纳米晶体用过膜水洗三次，然后利用溅射涂布机进行喷金后，通过场发射扫描电子显微镜(SEM)对MHETase杂化纳米晶体的结构进行表征。
如图3所示，当固定化时间为6h时，纳米晶体结构初步形成，其直径大小为1.20±0.08μm，随着固定化时间的延长，纳米晶体整体结构的大小逐渐增加，12h和18h时纳米晶体直径分别增加至1.31±0.20μm和1.61±0.12μm。当固定化时间增加为24–36h时，纳米晶体的直径继续增加，且呈现逐渐堆积的趋势，可能会增加酶分子之间的空间位阻，进而引起酶活性的损失。另外，当固定化时间为12h时纳米晶体活性最高，因此纳米晶体直径太大或太小均对酶活性不利。随着Ca2+浓度以及酶浓度的增加，纳米晶体整体结构均显示出直径逐渐增大的趋势，并且各纳米晶体晶瓣的大小先增加后减小，且浓度越大，晶瓣堆积越明显，从而引起酶分子之间的空间位阻效应，降低酶活性。
实施例3：
DuraPETase@MHETase双酶级联杂化纳米晶体的合成条件优化
DuraPETase@MHETase双酶级联杂化纳米晶体的制备过程如图10，首先将制备好的MHETase杂化纳米晶体与DuraPETase-SpyTag蛋白溶液混合，4℃条件下孵育1h，使DuraPETase-SpyTag通过与MHETase-SpyCatcher及Ca2+之间的共价及配位相互作用包封于MHETase杂化纳米晶体表面；8000rpm离心10min，收集沉淀，用过膜水洗三次后溶解于缓冲液中，获得DuraPETase@MHETase双酶级联杂化纳米晶体，并测定水洗上清液中的DuraPETase-SpyTag蛋白浓度，从而定量DuraPETase@MHETase双酶级联杂化纳米晶体中DuraPETase-SpyTag与MHETase-SpyCatcher的浓度及摩尔比。
对制备的DuraPETase-SpyTag与MHETase-SpyCatcher的摩尔比为0.25：1、0.66：1、0.90：1、1.23：1和1.56：1的纳米晶体进行酶学性能检测，DuraPETase能够催化BHET生成MHET，紧接着MHETase能够催化MHET生成TPA，对各双酶纳米晶体在30–50℃条件下的BHET降解活性进行测定，并与相同酶浓度的游离单、双酶进行比较。如图4，在所有温度下，双酶的酶活性均显著高于单游离酶DuraPETase-SpyTag的活性，表明MHETase-SpyCatcher酶的加入促进了对中间产物MHET的降解，降低了MHET对DuraPETase-SpyTag的产物抑制效应。另外，当DuraPETase-SpyTag与MHETase-SpyCatcher的摩尔比低于1.56时，DuraPETase@MHETase纳米晶体的酶活性高于游离双酶，说明此时纳米晶体双酶底物通道效应促进了对中间产物的及时降解，从而提高了酶活性，且当温度为40℃时(图4b)，DuraPETase@MHETase纳米晶体的酶活性最高为游离酶的1.6倍。但是当DuraPETase-SpyTag与MHETase-SpyCatcher的摩尔比为1.56时，DuraPETase@MHETase纳米晶体的酶活性低于游离双酶，可能是由于纳米晶体表面的DuraPETase-SpyTag过多导致空间位阻效应，且产生的中间产物不能及时被MHETase-SpyCatcher降解造成的。
实施例4：
DuraPETase@MHETase双酶级联杂化纳米晶体表征
对构建的DuraPETase@MHETase杂化纳米晶体使用SEM和场发射透射电子显微镜(TEM)进行形貌观察、记录。如图5a，SEM结果显示，双酶纳米晶体的直径为1.5-2μm，其中，DuraPETase主要吸附于DuraPETase@MHETase纳米晶体的外层；TEM结果(图5b)中晶体的层状突起表明，这种双酶纳米晶体是由数百个纳米晶瓣堆叠而成的纳米晶体状结构，从而使固定于其上的DuraPETase-SpyTag与MHETase-SpyCatcher两种酶实现分层固定化，利于双酶级联催化反应的进行。
实施例5：
温度和pH对DuraPETase@MHETase双酶级联杂化纳米晶体活性的影响
测定反应温度为30、40、50℃的酶活性，测定pH为6.0、7.0、8.0、9.0的酶活性。
为了测定各酶的热稳定性，将各酶液于40和50℃条件下分别保温2、4、6、8和10h，迅速冷却至室温后，测定其在50℃条件下对BHET的残余降解活力，以未保温处理的酶的活力为100％，进行热稳定性分析；为了测定各酶的pH稳定性，将各酶液于pH 7.0和9.0条件下于4℃分别保温2、4、6、8和10h，然后测定其在50℃条件下对BHET的残余降解活力，以未处理的酶的活力为100％，进行pH稳定性分析。
随着温度的升高，三种酶降解BHET生成的产物总浓度也随之增加，且纳米酶显示出比其它两种游离酶更高的酶活性(图6a)。但是，当温度由50℃升高至60℃时，产物MHET的浓度显著增加，而TPA的浓度大大降低，说明中间产物MHET大量积累，不能被MHETase-SpyCatcher所降解，表明MHETase-SpyCatcher不能耐受高温条件。同样地，当反应pH由8.0升高至9.0时(图6b)，MHET也有大量积累，说明MHETase-SpyCatcher不能耐受较高pH条件。另外，pH8.0时各酶显示出最高的产物浓度，说明两种酶均在该条件下达到最适反应。
对DuraPETase@MHETase杂化纳米晶体和游离双酶的热稳定性和pH稳定性进行测定，结果如图7所示。在40℃条件下孵育10h后，DuraPETase@MHETase杂化纳米晶体残余酶活力为93.5％，而相同条件下游离双酶的残余酶活力为87.4％(图7a)。50℃孵育10h后，DuraPETase@MHETase杂化纳米晶体残余酶活力为80.0％(图7b)，可能是由于贮藏过程中活性位点的破坏和酶的泄漏造成的。热稳定性测定结果表明，双酶杂化纳米晶体比游离双酶显示出更好的耐热性，这有利于酶在PET的长时间降解过程中保持更高的酶活力。
两种pH条件下(图7c-d)，纳米晶体结构的pH稳定性均高于游离酶，表明在含Ca2+的PBS缓冲液中生物矿化后，酶的pH稳定性提高。与游离多酶相比，DuraPETase@MHETase杂化纳米晶体pH稳定性的提高可能是由于在酸性或碱性溶液中，在多层晶体状结构的保护下酶活性中心结构变化不大，表明DuraPETase@MHETase杂化纳米晶体对环境的适应性更强，利于在多种自然条件下对PET的降解。
实施例6：
DuraPETase@MHETase双酶级联杂化纳米晶体的PET薄膜降解性能
为了测定DuraPETase@MHETase双酶级联杂化纳米晶体以及游离双酶对PET薄膜的降解性能，首先将直径为6mm的PET薄膜(Goodfellow)置于300μL 50mM Gly-NaOH,pH9.0的缓冲液中，然后加入一定量的酶液，将反应体系分别置于40和50℃，180rpm条件下，待反应完成后，加入等体积100％的甲醇，将反应液于85℃加热10min以终止反应，13000rpm离心10min，上清液使用0.22μm的微孔有机滤膜过滤后，取20μL通过高效液相色谱(HPLC,Agilent)检测MHET和TPA的生成量，每个反应做三个平行，取测定结果的平均值并计算标准误差，并以不加酶液的反应体系作为对照。
如图8a，40℃时，产物中基本没有MHET的积累，说明固定化和游离酶均可以将PET薄膜完全降解为TPA。两种温度条件下，纳米晶体固定化酶体系均表现出比游离酶更高的PET降解性能，这归功于固定化酶体系提升的酶活性、热稳定性和pH稳定性。另外，40℃条件下固定化酶比游离酶体系的PET降解性能的提升倍数明显高于50℃(图8b)条件下的提升倍数，这可能是由于50℃条件下MHETase的稳定性降低，从而导致中间产物MHET的积累，进而抑制了两种酶的活性，这也进一步说明双酶级联体系构建的必要性，以减轻甚至解除产物抑制效应。
实施例7：
PET薄膜降解完成后，使用1％SDS、20％甲醇和去离子水清洗30min并自然晾干，然后利用溅射涂布机进行喷金后，通过场发射扫描电子显微镜(SEM)进行观察并记录。
通过SEM对DuraPETase@MHETase纳米晶体(DuP@M)与其游离酶(DuP-M)在40和50℃条件下降解10d后的PET薄膜进行表征，如图9，以未加酶液处理的PET薄膜为对照。PET薄膜经过两种酶降解后表面发生了明显的形貌变化，特别是50℃条件下纳米晶体固定化酶降解的PET薄膜表面明显被腐蚀，观察到大量的孔洞。可以看出，在相同温度(40和50℃)和时间(10d)条件下，固定化酶对PET薄膜的降解效果均优于游离酶。另外，与中国专利申请号为202110803574.2的发明专利对PET薄膜的降解结果相比，PET薄膜表面被降解的痕迹更加明显，效果更优。
因此，证明本发明构建的DuraPETase@MHETase双酶分层级联纳米晶体体系对促进酶的PET降解具有重要作用，并且可将PET完全降解为其合成原料TPA，有助于原料再生及经济循环的实现。
序列表
<110> 天津大学
<120> 双酶分层级联纳米晶体的构建及其作用PET塑料降解的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcgcatattg tgatggtgga tgcgtataaa ccgaccaaa 39
<210> 2
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacccgtatg cgcgcggccc gaacccgacc gcggcgagcc tggaagcgag cgcgggcccg 60
tttaccgtgc gcagctttac cgtgagccgc ccgagcggct atggcgcggg caccgtgtat 120
tatccgacca acgcgggcgg caccgtgggc gcgattgcga ttgtgccggg ctataccgcg 180
cgtcagagca gcattaaatg gtggggcccg cgcctggcga gccatggctt tgtggtgatt 240
accattgata ccaacagcac ctttgattat ccgagtagcc gcagcagtca gcagatggcg 300
gcgctgcgcc aagtggcgag cctgaacggc gatagcagta gcccgattta tggcaaagtg 360
gataccgccc gcatgggtgt gatgggccat agcatgggcg gtggcgcgag cctgcgtagc 420
gcggcgaaca acccgagcct gaaagcggcg attccgcaag cgccgtggga tagtcagacc 480
aactttagca gcgtgaccgt gccgaccctg atttttgcct gtgaaaacga tagcattgcg 540
ccggtgaaca gccatgcgct gccgatttat gatagcatga gccgcaacgc gaaacagttt 600
ctggaaatta acggcggcag ccatagctgc gcgaacagcg gcaacagcaa ccaagcgctg 660
attggcaaaa aaggcgtggc gtggatgaaa cgctttatgg ataacgatac ccgctatagc 720
acctttgcgt gcgaaaaccc aaacagcacc gcggtgagcg attttcgcac cgccaactgc 780
agc 783
<210> 3
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgatggttg atacactttc aggcctttca tcagaacagg ggcagagcgg cgatatgaca 60
attgaagaag attcagctac acatattaaa ttctccaaac gtgacgaaga tggcaaagaa 120
cttgctggcg ctacaatgga acttcgcgat tcatcaggca agacgatatc aacatggatt 180
tcagatggcc aggttaaaga tttctactta tatcctggca aatatacatt tgttgaaaca 240
gctgctcctg atggctatga agttgctaca gctattacat ttaccgtcaa cgaacagggc 300
caggttaccg taaacggcaa agctacaaag ggagacgctc atatt 345
<210> 4
<211> 1752
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtggtggca gcaccccgct gccactccca caacaacagc caccgcaaca agaaccacca 60
ccgccaccag ttccactggc cagtcgtgcc gcgtgtgaag ccctcaaaga cggcaacggt 120
gacatggtgt ggccgaatgc cgcgacggtt gttgaagttg cggcgtggcg tgatgccgcg 180
ccggcgaccg ccagtgcggc cgcgctccca gaacattgtg aagtgagcgg cgccattgcc 240
aagcgtacgg gtatcgatgg ctacccgtac gagatcaagt tccgcctccg tatgccggcc 300
gagtggaatg gccgcttttt tatggaaggc ggcagtggca ccaacggtag tctgagcgcc 360
gcgacgggta gtatcggtgg tggtcaaatc gcgagcgccc tcagtcgcaa ctttgccacc 420
atcgccacgg atggcggcca cgataatgcc gttaacgaca acccggatgc gctgggtacg 480
gttgccttcg gtctcgatcc acaagcccgc ctcgacatgg gctacaacag ttacgatcaa 540
gttacgcaag ccggtaaagc cgcggttgcc cgcttttacg gtcgcgcggc cgacaagagc 600
tacttcatcg gttgcagcga aggcggccgt gaaggtatga tgctgagcca gcgcttcccg 660
agtcactacg atggcatcgt tgcgggtgcc ccgggctatc agctgccaaa agcgggtatt 720
agcggtgcgt ggaccaccca aagtctggcg ccagcggccg ttggtctcga tgcccaaggc 780
gttccgctca tcaacaagag ctttagcgac gccgatctgc atctgctgag ccaagccatt 840
ctgggcacgt gcgatgcgct ggatggtctg gcggacggta tcgtggacaa ctaccgcgcg 900
tgccaagccg cctttgatcc ggcgacggcc gcgaatccag ccaatggtca agcgctgcag 960
tgtgttggcg ccaaaaccgc cgattgtctg agcccggttc aagttacggc catcaaacgc 1020
gccatggccg gcccagttaa tagcgcgggt accccgctgt acaatcgttg ggcgtgggat 1080
gccggtatga gcggtctgag tggtaccacg tacaaccaag gctggcgtag ttggtggctg 1140
ggcagcttca acagcagtgc gaataatgcg cagcgtgtga gcggctttag cgcccgtagc 1200
tggctggttg acttcgcgac cccgccagaa ccaatgccga tgacccaagt tgcggcccgc 1260
atgatgaaat tcgacttcga tatcgatccg ctgaagatct gggcgaccag cggtcagttt 1320
acccaaagca gcatggactg gcacggcgcg acgagtaccg atctggccgc cttccgtgat 1380
cgcggtggca agatgattct gtaccacggc atgagcgacg ccgcctttag cgcgctggat 1440
accgccgatt actacgaacg tctgggtgcg gccatgccgg gcgcggcggg ttttgcccgt 1500
ctgtttctgg tgccgggcat gaaccactgt agtggtggcc cgggcaccga tcgcttcgat 1560
atgctgacgc cactggttgc gtgggttgaa cgcggtgaag ccccagacca gatcagcgcg 1620
tggagcggta cgccgggcta cttcggtgtt gcggcccgta cgcgtccact gtgcccatat 1680
ccacagatcg cccgctacaa aggcagcggc gatatcaata ccgaagcgaa cttcgcgtgc 1740
gcggccccac cg 1752
<210> 5
<211> 6207
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600
gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660
ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720
agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780
agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840
tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900
tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960
cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1020
aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080
tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140
tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200
ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260
ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320
cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1380
gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440
actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500
aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560
caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620
aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680
accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740
aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800
ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860
agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920
accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980
gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040
tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100
cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160
cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220
cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400
gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460
tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520
cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580
gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640
gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700
catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760
tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820
ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880
tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940
ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000
aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060
gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120
tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 3180
acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 3240
cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300
cccgtggggc cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg 3360
gaccagtgac gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc 3420
cgatcatcgt cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg 3480
gcacctgtcc tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca 3540
tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag 3600
atcccggtgc ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 3660
tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 3720
gcggtttgcg tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc 3780
tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc 3840
cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct 3900
tcggtatcgt cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta 3960
atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg 4020
atgccctcat tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct 4080
tcccgttccg ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga 4140
cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc 4200
aatgcgacca gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg 4260
ttgatgggtg tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct 4320
tccacagcaa tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt 4380
tgcgcgagaa gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc 4440
gacaccacca cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc 4500
gacggcgcgt gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc 4560
gccagttgtt gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact 4620
ttttcccgcg ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga 4680
taagagacac cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc 4740
ctgaattgac tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg 4800
atggtgtccg ggatctcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag 4860
tagtaggttg aggccgttga gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc 4920
gcccaacagt cccccggcca cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat 4980
gagcccgaag tggcgagccc gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc 5040
aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggatcgagat 5100
ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc 5160
cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acatatgaac ccgtatgcgc 5220
gcggcccgaa cccgaccgcg gcgagcctgg aagcgagcgc gggcccgttt accgtgcgca 5280
gctttaccgt gagccgcccg agcggctatg gcgcgggcac cgtgtattat ccgaccaacg 5340
cgggcggcac cgtgggcgcg attgcgattg tgccgggcta taccgcgcgt cagagcagca 5400
ttaaatggtg gggcccgcgc ctggcgagcc atggctttgt ggtgattacc attgatacca 5460
acagcacctt tgattatccg agtagccgca gcagtcagca gatggcggcg ctgcgccaag 5520
tggcgagcct gaacggcgat agcagtagcc cgatttatgg caaagtggat accgcccgca 5580
tgggtgtgat gggccatagc atgggcggtg gcgcgagcct gcgtagcgcg gcgaacaacc 5640
cgagcctgaa agcggcgatt ccgcaagcgc cgtgggatag tcagaccaac tttagcagcg 5700
tgaccgtgcc gaccctgatt tttgcctgtg aaaacgatag cattgcgccg gtgaacagcc 5760
atgcgctgcc gatttatgat agcatgagcc gcaacgcgaa acagtttctg gaaattaacg 5820
gcggcagcca tagctgcgcg aacagcggca acagcaacca agcgctgatt ggcaaaaaag 5880
gcgtggcgtg gatgaaacgc tttatggata acgatacccg ctatagcacc tttgcgtgcg 5940
aaaacccaaa cagcaccgcg gtgagcgatt ttcgcaccgc caactgcagc ggcggtggcg 6000
gcagcgcgca tattgtgatg gtggatgcgt ataaaccgac caaactcgag caccaccacc 6060
accaccactg agatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca 6120
ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt 6180
tgctgaaagg aggaactata tccggat 6207
<210> 6
<211> 6510
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaggaatggt gtggccgatt aatcataaat atgaaaaata attgttgcat cacccgccaa 60
tgcgtggctt aatgcacatc aaattgtgag cggataacaa tttgatgtgc tagcgcatat 120
ccagtgtagt aaggcaagtc ccttcaagag ttatcgttga tacccctcgt agtgcacatt 180
cctttaacgc ttcaaaatct gtaaagcacg ccatatcgcc gaaaggcaca cttaattatt 240
aagaggtaat acaccatgaa tcacaaagtg catcatcatc atcatcatat gggtggtggc 300
agcaccccgc tgccactccc acaacaacag ccaccgcaac aagaaccacc accgccacca 360
gttccactgg ccagtcgtgc cgcgtgtgaa gccctcaaag acggcaacgg tgacatggtg 420
tggccgaatg ccgcgacggt tgttgaagtt gcggcgtggc gtgatgccgc gccggcgacc 480
gccagtgcgg ccgcgctccc agaacattgt gaagtgagcg gcgccattgc caagcgtacg 540
ggtatcgatg gctacccgta cgagatcaag ttccgcctcc gtatgccggc cgagtggaat 600
ggccgctttt ttatggaagg cggcagtggc accaacggta gtctgagcgc cgcgacgggt 660
agtatcggtg gtggtcaaat cgcgagcgcc ctcagtcgca actttgccac catcgccacg 720
gatggcggcc acgataatgc cgttaacgac aacccggatg cgctgggtac ggttgccttc 780
ggtctcgatc cacaagcccg cctcgacatg ggctacaaca gttacgatca agttacgcaa 840
gccggtaaag ccgcggttgc ccgcttttac ggtcgcgcgg ccgacaagag ctacttcatc 900
ggttgcagcg aaggcggccg tgaaggtatg atgctgagcc agcgcttccc gagtcactac 960
gatggcatcg ttgcgggtgc cccgggctat cagctgccaa aagcgggtat tagcggtgcg 1020
tggaccaccc aaagtctggc gccagcggcc gttggtctcg atgcccaagg cgttccgctc 1080
atcaacaaga gctttagcga cgccgatctg catctgctga gccaagccat tctgggcacg 1140
tgcgatgcgc tggatggtct ggcggacggt atcgtggaca actaccgcgc gtgccaagcc 1200
gcctttgatc cggcgacggc cgcgaatcca gccaatggtc aagcgctgca gtgtgttggc 1260
gccaaaaccg ccgattgtct gagcccggtt caagttacgg ccatcaaacg cgccatggcc 1320
ggcccagtta atagcgcggg taccccgctg tacaatcgtt gggcgtggga tgccggtatg 1380
agcggtctga gtggtaccac gtacaaccaa ggctggcgta gttggtggct gggcagcttc 1440
aacagcagtg cgaataatgc gcagcgtgtg agcggcttta gcgcccgtag ctggctggtt 1500
gacttcgcga ccccgccaga accaatgccg atgacccaag ttgcggcccg catgatgaaa 1560
ttcgacttcg atatcgatcc gctgaagatc tgggcgacca gcggtcagtt tacccaaagc 1620
agcatggact ggcacggcgc gacgagtacc gatctggccg ccttccgtga tcgcggtggc 1680
aagatgattc tgtaccacgg catgagcgac gccgccttta gcgcgctgga taccgccgat 1740
tactacgaac gtctgggtgc ggccatgccg ggcgcggcgg gttttgcccg tctgtttctg 1800
gtgccgggca tgaaccactg tagtggtggc ccgggcaccg atcgcttcga tatgctgacg 1860
ccactggttg cgtgggttga acgcggtgaa gccccagacc agatcagcgc gtggagcggt 1920
acgccgggct acttcggtgt tgcggcccgt acgcgtccac tgtgcccata tccacagatc 1980
gcccgctaca aaggcagcgg cgatatcaat accgaagcga acttcgcgtg cgcggcccca 2040
ccgggtgggg gtgggagtgg aggcggcggg agcgcgatgg ttgatacact ttcaggcctt 2100
tcatcagaac aggggcagag cggcgatatg acaattgaag aagattcagc tacacatatt 2160
aaattctcca aacgtgacga agatggcaaa gaacttgctg gcgctacaat ggaacttcgc 2220
gattcatcag gcaagacgat atcaacatgg atttcagatg gccaggttaa agatttctac 2280
ttatatcctg gcaaatatac atttgttgaa acagctgctc ctgatggcta tgaagttgct 2340
acagctatta catttaccgt caacgaacag ggccaggtta ccgtaaacgg caaagctaca 2400
aagggagacg ctcatattta actcgaggga tccgaattca agcttgtcga cctgcagtct 2460
agataggtaa tctctgctta aaagcacaga atctaagatc cctgccattt ggcggggatt 2520
tttttatttg ttttcaggaa ataaataatc gatcgcgtaa taaaatctat tattattttt 2580
gtgaagaata aatttgggtg caatgagaat gcgcaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg 2640
tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta 2700
agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg 2760
gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc ataaaattgt 2820
aaacgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa 2880
ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagcccg agatagggtt 2940
gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa 3000
agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac ccaaatcaag 3060
ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt 3120
tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg 3180
agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc 3240
cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgta ctatggttgc tttgacgtat gcggtgtgaa 3300
ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gtcaggtggc acttttcggg 3360
gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc 3420
tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta 3480
ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg 3540
ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg 3600
gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac 3660
gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg 3720
acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt 3780
actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg 3840
ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac 3900
cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt 3960
gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag 4020
caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc 4080
aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc 4140
ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta 4200
tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg 4260
ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga 4320
ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac 4380
ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 4440
tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 4500
cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 4560
taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 4620
gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc 4680
acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 4740
ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 4800
ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 4860
cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 4920
aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 4980
gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 5040
gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 5100
gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atagtcatgc 5160
cccgcgccca ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc 5220
ccggtgccta atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc 5280
agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 5340
gtttgcgtat tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga 5400
ttgcccttca ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc 5460
agcaggcgaa aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg 5520
gtatcgtcgt atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg 5580
gcgcgcattg cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg 5640
ccctcattca gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc 5700
cgttccgcta tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc 5760
agacgcgccg agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat 5820
gcgaccagat gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg 5880
atgggtgtct ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc 5940
acagcaatgg catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc 6000
gcgagaagat tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac 6060
accaccacgc tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac 6120
ggcgcgtgca gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc 6180
agttgttgtg ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt 6240
tcccgcgttt tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa 6300
gagacaccgg catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg 6360
aattgactct cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg 6420
gtgtccggga tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag 6480
taggttgagg ccgttgagca ccgccgccgc 6510

Claims (2)

1.双酶分层级联纳米晶体的构建方法；其特征是，包括如下步骤：
（1）首先构建双酶分层级联纳米晶体所需的融合蛋白DuraPETase-SpyTag和MHETase-SpyCatcher的表达载体和菌株，并进行蛋白表达及纯化；
（2）将CaCl2水溶液加入MHETase-SpyCatcher蛋白的PBS缓冲液中，静置；其中，Ca2+终浓度为10.0 – 20.0 mM，MHETase-SpyCatcher蛋白浓度为0.2 –0.3 mg/mL，反应时间为6 –18h，反应温度为4°C；
（3）将所得混合液进行离心，收集沉淀；
（4）将所述沉淀用过膜水清洗后溶解于PBS缓冲液中，得到MHETase杂化纳米晶体；
（5）将所构建的MHETase纳米晶体与DuraPETase-SpyTag酶混合；
（6）将混合液孵育，使DuraPETase-SpyTag通过与MHETase-SpyCatcher及Ca2+之间的共价及配位相互作用包封于MHETase杂化纳米晶体表面；
（7）然后进行离心，收集沉淀，用过膜水洗后溶解于PBS缓冲液中，得到DuraPETase@MHETase双酶分层级联杂化纳米晶体；所述DuraPETase@MHETase双酶分层级联杂化纳米晶体中DuraPETase-SpyTag与MHETase-SpyCatcher的摩尔比为0.25：1~1.23：1。
2.权利要求1所述构建方法制备得到的DuraPETase@MHETase双酶分层级联杂化纳米晶体在PET薄膜降解以及PET废弃物处理方面的应用。
CN202210618204.6A 2022-05-24 2022-05-24 双酶分层级联纳米晶体的构建及其作用pet塑料降解的方法 Active CN114891776B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210618204.6A CN114891776B (zh) 2022-05-24 2022-05-24 双酶分层级联纳米晶体的构建及其作用pet塑料降解的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210618204.6A CN114891776B (zh) 2022-05-24 2022-05-24 双酶分层级联纳米晶体的构建及其作用pet塑料降解的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114891776A CN114891776A (zh) 2022-08-12
CN114891776B true CN114891776B (zh) 2024-03-12

Family

ID=82726307

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210618204.6A Active CN114891776B (zh) 2022-05-24 2022-05-24 双酶分层级联纳米晶体的构建及其作用pet塑料降解的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114891776B (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105838704A (zh) * 2016-05-16 2016-08-10 南京工业大学 一种纳米纤维生物膜固定化双酶系统及其催化合成海藻糖的方法
CN106497910A (zh) * 2016-11-18 2017-03-15 青岛啤酒股份有限公司 一种双酶共固定化方法及由该方法制备得到的固定化酶
CN106591345A (zh) * 2016-12-26 2017-04-26 华侨大学 一种重组双酶分离纯化及固定化集成的方法
WO2020055369A2 (en) * 2018-09-11 2020-03-19 Istanbul Medipol Universitesi Method for preparing recombinant petase and mhetase enzymes for use in decomposition of plastics
CN112626061A (zh) * 2020-11-30 2021-04-09 上海交通大学 一种提升级联催化体系效率的多酶有序共固定化方法
CN112877347A (zh) * 2021-01-28 2021-06-01 华南理工大学 一种多酶复合体及其构建方法和应用
CN113549244A (zh) * 2021-07-16 2021-10-26 大连海洋大学 利用两种酶协同作用降解pet塑料的方法
WO2022076380A2 (en) * 2020-10-06 2022-04-14 Board Of Regents, The University Of Texas System Mutations for improving activity and thermostability of petase enzymes

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11795483B2 (en) * 2016-12-15 2023-10-24 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Self-assembled nanoplatelet-enzyme bioconjugates providing for increased biocatalytic efficiency
KR102176506B1 (ko) * 2018-12-04 2020-11-10 경북대학교 산학협력단 재조합 PETase 생산 균주, 재조합 MHETase 생산 균주 및 이를 포함하는 PET 분해용 조성물

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105838704A (zh) * 2016-05-16 2016-08-10 南京工业大学 一种纳米纤维生物膜固定化双酶系统及其催化合成海藻糖的方法
CN106497910A (zh) * 2016-11-18 2017-03-15 青岛啤酒股份有限公司 一种双酶共固定化方法及由该方法制备得到的固定化酶
CN106591345A (zh) * 2016-12-26 2017-04-26 华侨大学 一种重组双酶分离纯化及固定化集成的方法
WO2020055369A2 (en) * 2018-09-11 2020-03-19 Istanbul Medipol Universitesi Method for preparing recombinant petase and mhetase enzymes for use in decomposition of plastics
WO2022076380A2 (en) * 2020-10-06 2022-04-14 Board Of Regents, The University Of Texas System Mutations for improving activity and thermostability of petase enzymes
CN112626061A (zh) * 2020-11-30 2021-04-09 上海交通大学 一种提升级联催化体系效率的多酶有序共固定化方法
CN112877347A (zh) * 2021-01-28 2021-06-01 华南理工大学 一种多酶复合体及其构建方法和应用
CN113549244A (zh) * 2021-07-16 2021-10-26 大连海洋大学 利用两种酶协同作用降解pet塑料的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Computational Redesign of a PETase for Plastic Biodegradation under Ambient Condition by the GRAPE Strategy;Yinglu Cui等;ACS catalysis(第11期);摘要 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114891776A (zh) 2022-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102414314A (zh) 用于生产丙酮的细胞和方法
CN111304141B (zh) 产n-乙酰-5-羟色胺的重组大肠杆菌及其构建方法和应用
CN113980991B (zh) 大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体及其构建方法和应用
KR20210154176A (ko) 표적화된 생체내 후성유전학적 억제에 의한 장기지속성 진통
CN112342231A (zh) 一种不耐热ung融合蛋白的重组载体及表达纯化方法
KR20220058461A (ko) 모노머형 스트렙타비딘을 발현하는 균주 및 비오틴화된 화합물을 포함하는 암 세포 표적용 조성물
KR102194740B1 (ko) 7-adca 제조를 위한 데아세트옥시세팔로스포린 c의 고농도 생산 재조합 아크레모니움 크리소제눔 균주의 제조방법 및 이 방법으로 제조된 균주
CN114891776B (zh) 双酶分层级联纳米晶体的构建及其作用pet塑料降解的方法
CN112725344B (zh) 密码子优化的smn1基因、腺相关病毒表达质粒及基因药物
CN115298307A (zh) 核酸调节元件的新组合及其方法和用途
KR20220058460A (ko) 모노머형 스트렙타비딘을 발현하기 위한 컨스트럭트
CN106755031B (zh) 鼠李糖脂生产质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌和应用
CN108118047A (zh) 一种双功能酶的制备方法及其在海藻糖生产中的应用
CN115247173A (zh) 构建tmprss6基因突变的缺铁性贫血猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用
CN105925610B (zh) 昆虫杆状病毒表达载体、构建方法及其应用
CN109929031A (zh) 细菌双杂交纳米抗体筛选系统及其构建方法和应用
CN113755512B (zh) 一种制备串联重复蛋白质的方法与应用
KR20220104626A (ko) 예비표적화 단백질을 발현하는 균주를 포함하는 생체 내 미생물 추적 플랫폼
CN112553177B (zh) 一种热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶变体
CN110964681B (zh) 一种利用纤维素制备金合欢烯的工程菌株及方法
CN110964680B (zh) 利用纤维素制备金合欢烯的工程菌株及方法
CN107354172B (zh) 重组表达载体及其构建方法和应用
CN115232818A (zh) 构建dok7基因突变的先天性肌无力模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用
CN115247174A (zh) 构建先天性丙种球蛋白缺乏症模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用
CN115232813A (zh) 用于构建vWF基因突变的血管性血友病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant