CN111548392A - 一种促溶标签及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促溶标签及其在蛋白质可溶性表达中的应用，具体地，该促溶标签的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。将该促溶标签编码基因和凝血酶识别位点插入原核表达载体中，使得促溶标签与目的蛋白融合表达，可以显著促进所表达的目的蛋白的可溶性，纯化后得到重组蛋白，用凝血酶切除标签蛋白，进而得到高纯度的目的蛋白，提高了可溶性目的蛋白的回收效率，更有利于后续的蛋白结构功能研究。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白表达纯化领域，尤其涉及一种促溶标签及其应用。
背景技术
重组蛋白表达在现代生物学技术发展中起着重要的推动作用。利用宿主实现外源性蛋白表达，为一些重要蛋白尤其是人源蛋白的结构和功能研究提供了强有力的工具。为了能够进行后续的结构功能研究，所获得的重组蛋白必须可溶、稳定、正确折叠以及具有生物活性。然而，实际研究中，这些往往成为获得一个理想重组蛋白的障碍。重组蛋白表达的可溶性成为首要解决的问题。因此很多促溶标签被用于促进重组蛋白的可溶性表达。
目前常用的促溶标签有麦芽糖接合蛋白(MBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白A(TrxA)、小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)、转录终止/抗终止因子(NusA)等，这些标签都存在一定缺陷，比如MBP和NusA标签自身分子量过大，可能会影响蛋白结构和功能；GST标签促溶能力较差，易形成二聚体。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种促溶标签以及其在蛋白质可溶性表达中的应用，以解决目的蛋白在表达过程中易形成包涵体无法正确折叠的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一方面，本发明提供了一种促溶标签，所述促溶标签的氨基酸序列如序列表中SEQID NO.1所示。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述促溶标签的编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
第二方面，本发明提供了第一方面所述的促溶标签在蛋白质可溶性表达中的应用，防止蛋白质在原核细胞内表达过程中形成包涵体，使之能够正确折叠，更有利于后续蛋白质的结构和功能研究。
第三方面，本发明提供了一种融合蛋白表达载体，包含目的蛋白编码基因和促溶标签的编码基因，所述促溶标签为本发明第一方面所述的促溶标签，所述促溶标签的编码基因位于所述目的蛋白编码基因的上游。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述融合蛋白表达载体还包含6×His和凝血酶识别位点。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述凝血酶识别位点位于目的蛋白编码基因与所述促溶标签的编码基因之间，以便在蛋白纯化过程中用凝血酶将重组蛋白中的His标签和促溶标签切除。
第四方面，本发明还提供了第三方面所述的融合蛋白表达载体在蛋白表达纯化中的应用，包括如下步骤：
S1、将所述融合蛋白表达载体转入表达菌株中，诱导表达；
S2、诱导后破碎菌株细胞，利用Ni离子亲和层析柱纯化，得到重组蛋白。
在以上技术方案的基础上，融合蛋白表达载体在蛋白表达纯化中的应用还包括步骤S3，用凝血酶切除所述重组蛋白中的His标签和促溶标签，得到纯的目的蛋白。
本发明的促溶标签及其应用相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明在大肠杆菌中发现一种分子量为18kDa的蛋白质IF2DI，具有很高的亲水性，可在不同的宿主中表达，本发明以IF2DI作为促溶标签融合表达重组蛋白，对蛋白的结构影响小，促溶效率高，能将重组蛋白的可溶性表达率提高到90％，适用范围广；
(2)本发明表达载体可通过镍柱亲和纯化，纯化方法简单；
(3)本发明纯化后的重组蛋白能够用凝血酶去除标签部分，以获得高纯度目的蛋白。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2含有pET-28a-IF2DI-BDNF重组菌诱导后不同处理样品的SDS-PAGE电泳图，其中，1号泳道为蛋白Marker，2号泳道为破碎离心后的沉淀重悬液，3号泳道为破碎离心后的上清液，4号泳道为过柱流穿液，5号泳道为25mM咪唑洗脱蛋白液，6号泳道为150mM咪唑洗脱蛋白液，7号泳道为500mM咪唑洗脱蛋白液。
图2为实施例2含有pET-28a-BDNF重组菌诱导前后不同处理样品的SDS-PAGE电泳图，其中，1号泳道为诱导前全细胞裂解液，2号泳道为诱导后全细胞裂解液，3号泳道为破碎离心后的沉淀重悬液，4号泳道为蛋白Marker，5号泳道为破碎离心后的上清液，6号泳道为过柱流穿液，7号泳道为25mM咪唑洗脱蛋白液，8号泳道为150mM咪唑洗脱蛋白液，9号泳道为500mM咪唑洗脱蛋白液。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实验用的大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BL21(DE3)购自北京全式金公司，生长于常规的LB培养基，选择生长所用的抗生素浓度为：50μg/mL Kan。实验所用的原始质粒pET-28a(+)购自Novagen公司。质粒抽提、载体克隆和蛋白表达纯化步骤见《分子克隆实验指南》(第四版)。
实施例1、包含IF2DI促溶标签的原核表达载体的构建及阳性验证
委托生工生物公司合成IF2DI基因序列，在基因5’端引入NdeI酶切位点，3’端依次引入Thrombin酶识别位点(5’-CTGGTTCCGCGTGGATCC-3’)和BamHI酶切位点。将商业化蛋白载体pET-28a和IF2DI基因均用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切，然后用Takara公司的T4DNA连接酶将酶切后的pET-28a和IF2DI片段16℃酶连过夜，构建表达载体pET-28a-IF2DI。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，以卡那霉素抗性筛选阳性转化子。
表达载体pET-28a-IF2DI的验证：将挑选的阳性转化子扩大培养，抽提质粒DNA，经限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切后，进行琼脂凝胶电泳验证。并将双酶切验证正确的重组质粒送生工生物进行测序，验证得到正确的重组表达载体pET-28a-IF2DI。
实施例2、利用BDNF蛋白作为目的蛋白来检验本发明的可行性
S1、插入外源基因BDNF表达载体的构建
BDNF即脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor)，是大脑中含量最多的神经营养因子，它广泛分布于中枢神经系统内，在中枢神经系统发育过程中对神经元的存活、分化、生长发育起着重要作用，本发明用BDNF蛋白作为目的蛋白来检验本发明的可行性。根据蛋白质序列由生工生物公司合成BDNF全基因序列，然后用BamHI和XhoI双酶切然后连入pET-28a-IF2DI载体，测序验证，确定BDNF基因插入到pET-28a-IF2DI载体上，最终得到表达载体pET-28a-IF2DI-BDNF。同时，构建表达载体pET-28a-BDNF作为对照，BDNF基因插入相同酶切位点。
S2、外源融合蛋白的表达
将重组质粒pET-28a-IF2DI-BDNF和pET-28a-BDNF分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到两种重组大肠杆菌BL21(DE3)。将培养过夜的两种重组大肠杆菌BL21(DE3)按照1:100的体积比分别接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至对数中期后，加终浓度为0.1mM的IPTG于16℃条件下诱导表达16h。
S3、目的蛋白的纯化
收集融合表达菌液和对照菌液，超声波破碎细胞至菌液清亮，超高速离心并收集上清，上样于Ni离子亲和层析柱纯化融合蛋白IF2DI-BDNF，依次用25mM咪唑和150mM咪唑漂洗柱子，以去除杂蛋白，最后使用500mM咪唑洗脱融合蛋白。分别取离心后的沉淀重悬液和上清液以及不同浓度咪唑洗脱后蛋白液，用12％的SDS-PAGE分别分析含有pET-28a-IF2DI-BDNF和pET-28a-BDNF重组质粒的重组菌中BDNF蛋白可溶性表达量的差异。实验结果如图1和图2所示，含有pET-28a-IF2DI-BDNF的重组菌中可产生相对量更多的可溶性蛋白IF2DI-BDNF(34.1KD)，说明促溶标签IF2DI促进了大肠杆菌中表达的外源蛋白BDNF的正确折叠，增强了可溶性蛋白的表达比例；而含有pET-28a-BDNF的重组菌中可溶性目的蛋白(13.5KD)的表达量很少，因为BDNF基因在大肠杆菌中高效表达形成了不可溶的包涵体。
向最后收集的蛋白液中加入凝血酶，室温孵育20min，切割纯化的重组蛋白，再利用分子筛层析分离目的蛋白BDNF、6×His标签和IF2DI标签，最终得到纯的目的蛋白。
以上实验结果证明IF2DI促溶标签能够帮助外源融合蛋白正确折叠，提高可溶性外源蛋白的表达量，是蛋白表达纯化的理想工具。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 一种促溶标签及其应用
<120> 武汉菲恩生物科技有限公司
<130> 2020-1-3
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 158
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 1
Met Thr Asp Val Thr Ile Lys Thr Leu Ala Ala Glu Arg Gln Thr Ser
1 5 10 15
Val Glu Arg Leu Val Gln Gln Phe Ala Asp Ala Gly Ile Arg Lys Ser
20 25 30
Ala Asp Asp Ser Val Ser Ala Gln Glu Lys Gln Thr Leu Ile Asp His
35 40 45
Leu Asn Gln Lys Asn Ser Gly Pro Asp Lys Leu Thr Leu Gln Arg Lys
50 55 60
Thr Arg Ser Thr Leu Asn Ile Pro Gly Thr Gly Gly Lys Ser Lys Ser
65 70 75 80
Val Gln Ile Glu Val Arg Lys Lys Arg Thr Phe Val Lys Arg Asp Pro
85 90 95
Gln Glu Ala Glu Arg Leu Ala Ala Glu Glu Gln Ala Gln Arg Glu Ala
100 105 110
Glu Glu Gln Ala Arg Arg Glu Ala Glu Glu Ser Ala Lys Arg Glu Ala
115 120 125
Gln Gln Lys Ala Glu Arg Glu Ala Ala Glu Gln Ala Lys Arg Glu Ala
130 135 140
Ala Glu Gln Ala Lys Arg Glu Ala Ala Glu Lys Asp Lys Val
145 150 155
<210> 2
<211> 474
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
atgacagatg taacgattaa aacgctggcc gcagagcgac agacctccgt ggaacgcctg 60
gtacagcaat ttgctgatgc aggtatccgg aagtctgctg acgactctgt gtctgcacaa 120
gagaaacaga ctttgattga ccacctgaat cagaaaaatt caggcccgga caaattgacg 180
ctgcaacgta aaacacgcag cacccttaac attcctggta ccggtggaaa aagcaaatcg 240
gtacaaatcg aagtccgcaa gaaacgcacc tttgtgaaac gcgatccgca agaggctgaa 300
cgccttgcag cggaagagca agcgcagcgt gaagcggaag agcaagcccg tcgtgaggca 360
gaagaatcgg ctaaacgcga ggcgcaacaa aaagctgaac gtgaggccgc agaacaagct 420
aagcgtgaag ctgctgaaca agcgaaacgt gaagctgcgg aaaaagacaa agtg 474
Claims (8)
1.一种促溶标签，其特征在于：所述促溶标签的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的促溶标签，其特征在于：所述促溶标签的编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1所述的促溶标签在蛋白质可溶性表达中的应用。
4.一种融合蛋白表达载体，包含目的蛋白编码基因和促溶标签的编码基因，其特征在于：所述促溶标签为权利要求1所述的促溶标签，所述促溶标签的编码基因位于所述目的蛋白编码基因的上游。
5.如权利要求4所述的融合蛋白表达载体，其特征在于：所述融合蛋白表达载体还包含6×His和凝血酶识别位点。
6.如权利要求5所述的融合蛋白表达载体，其特征在于：所述凝血酶识别位点位于目的蛋白编码基因与所述促溶标签的编码基因之间。
7.权利要求5所述的融合蛋白表达载体在蛋白表达纯化中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将所述融合蛋白表达载体转入表达菌株中，诱导表达；
S2、诱导后破碎菌株细胞，利用Ni离子亲和层析柱纯化，得到重组蛋白。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：还包括步骤S3，用凝血酶切除所述重组蛋白中的His标签和促溶标签，得到纯的目的蛋白。
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