CN114292321A

CN114292321A - 可溶性表达eg95蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114292321A
Application number: CN202111654595.9A
Authority: CN
Inventors: 高洋; 冉智光; 赵扬扬; 赖茂林; 杨元礼; 伏刚; 王盼举; 秦世蓉; 田尚全; 杨婕
Original assignee: Chongqing Auleon Biologicals Co ltd
Current assignee: Chongqing Auleon Biologicals Co ltd
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2041-12-30
Also published as: CN114292321B

Abstract

本发明公开了一种可溶性表达EG95蛋白及其制备方法和应用，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，是在羊棘球蚴EG95基因后通过柔性连接子连接一个促溶标签而得到，其保留了完整的EG95蛋白序列，最大限度地保留了原蛋白的免疫原性，所使用的促溶标签对原蛋白影响小，不但能有效促溶，还不会对镍柱纯化或免疫等造成影响；相对于包涵体表达生产工艺的复杂性，可溶性表达简化了蛋白生产工艺，提高了生产效率，减少了多个纯化步骤带来的蛋白损失，还减少了氨氮废水的排放量；该蛋白可作为抗原用于制备羊棘球蚴病基因工程亚单位疫苗，动物试验结果证实，由其制得的疫苗具有良好的免疫效力和安全性。

Description

可溶性表达EG95蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种可溶性表达EG95蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

羊棘球蚴病俗称包虫病(Hydatidosis)，是由棘球属的细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus，EG)幼虫感染羊所引起的一种人兽共患病，是中国卫生部门规划防治的五大寄生虫病之一。包虫病主要流行于我国西部农牧区的350个县，受威胁人口约5000万，高原地区人群包虫病平均患病率为1.2％，局部高达12％以上。据农业部门推算，全国每年患包虫病的家畜在5000万头以上，因家畜死亡和脏器废弃造成的直接经济损失逾30亿元。

EG95抗原是一种膜蛋白，在大肠杆菌及酵母等菌体中表达，为难溶的包涵体，要经过变性、复性等多个步骤才能配苗，生产工艺十分复杂，中间过程抗原损失严重，尿素变性还产生大量氨氮废水，加大了环保处理难度，因此，不少学者开展了EG95抗原的可溶性表达研究。吴竞等通过截短EG95原始序列，并连接到pET载体上，实现可溶性表达(CN201510794937.5)。中国农业大学刘丹等通过抗原表位串联表达，实现EG95可溶。但是，这些方法都需要截短或截断EG95蛋白，且去除氨基酸序列较长，可能对EG95蛋白的空间结构及免疫原性造成难以预测的影响。促进蛋白的溶解还可以添加促溶标签，但传统的MBP(42KD)、NUSA(55KD)等标签，分子量都较大，可能对镍柱纯化或免疫评估造成影响。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种可溶性表达EG95蛋白，可以实现EG95完整序列的可溶性表达，保留EG95蛋白的全部免疫原性，同时不会对镍柱纯化或免疫等造成影响；目的之二在于提供该可溶性表达EG95蛋白的制备方法，目的蛋白表达量高、纯度高，生产工艺简化，安全环保；目的之三在于提供该可溶性表达EG95蛋白的用途。

经研究，本发明提供以下技术方案：

1.可溶性表达EG95蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.可溶性表达EG95蛋白的编码基因。

进一步，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.含有所述编码基因的重组表达载体。

进一步，所述重组表达载体是将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的可溶性表达EG95蛋白的编码基因克隆入pGEX-3X载体中而得到。

4.含有所述重组表达载体的工程菌。

进一步，所述工程菌是将重组表达载体转入大肠杆菌Rosseta(DE3)中得到，所述重组表达载体是将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的可溶性表达EG95蛋白的编码基因克隆入pGEX-3X载体中得到。

5.利用所述工程菌制备可溶性表达EG95蛋白的方法，包括以下步骤：将工程菌按1％接种量接入含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、150r/min振荡培养至OD_600nm值达0.6，加入IPTG至终浓度为0.25mM，37℃、150r/min振荡条件下诱导表达6h，得发酵菌液；将发酵菌液离心，沉淀用Buffer A洗涤后，按照重量体积比为1:10加入Buffer A，以超声功率300W、每工作3s间歇3s的方式超声破碎120min，离心，取上清液，用Ni²⁺-NTA亲和层析系统纯化，得到可溶性表达EG95蛋白；

所述Ni²⁺-NTA亲和层析系统所用的平衡缓冲液为Buffer A，杂蛋白洗液为BufferB，目的蛋白洗液为Buffer C；所述Buffer A是取NaCl 29.22g、1M pH8.0 Tris-HCl 20mL，加水定容至1000mL制得；Buffer B是取NaCl 29.22g、1M pH8.0 Tris-HCl 20mL、咪唑1.7g，加水定容至1000mL制得；Buffer C是取NaCl 29.22g、1M pH8.0 Tris-HCl 20mL、咪唑34g，加水定容至1000mL制得。

6.可溶性表达EG95蛋白在制备羊棘球蚴病基因工程亚单位疫苗中的应用。

7.以可溶性表达EG95蛋白为抗原的羊棘球蚴病基因工程亚单位疫苗。

本发明的有益效果在于：

1)本发明提供了一种可溶性表达EG95蛋白，是在羊棘球蚴EG95基因后通过柔性连接子连接一个促溶标签而得到，其保留了完整的EG95蛋白序列，最大限度地保留了原蛋白的免疫原性，而且所使用的促溶标签的分子量仅7.9KD，体积小，对原蛋白的影响小，不但能有效促溶，还不会对镍柱纯化或免疫等造成影响。

2)本发明提供了一种可溶性表达EG95蛋白的制备方法，相对于包涵体表达生产工艺的复杂性，可溶性表达简化了蛋白生产工艺，提高了生产效率，减少了多个纯化步骤带来的蛋白损失，不使用尿素则减少了氨氮废水的排放量，减少了环保压力。

3)本发明的可溶性表达EG95蛋白可用于制备羊棘球蚴病基因工程亚单位疫苗，动物试验结果证实，以本发明的可溶性表达EG95蛋白为抗原制得的羊棘球蚴病基因工程亚单位疫苗具有良好的免疫效力和安全性。

4)本发明不但促进了EG95蛋白的工业升级，也可能应用到其它难以溶解的膜蛋白上，为膜蛋白的研究提供重要的学术参考价值。

附图说明

图1为本发明pGEX-EG95(KR)的PCR扩增鉴定图，其中M为DNA Marker DL2000，1和2为重组表达载体PCR扩增产物。

图2为本发明pGEX-EG95(KR)目的蛋白表达的SDS-PAGE电泳分析结果图，其中M为蛋白Marker，1为诱导前菌体，2为诱导后菌体，3为超声破碎后的上清液。

图3为本发明pGEX-EG95(KR)目的蛋白纯化的SDS-PAGE电泳分析结果图，其中M为蛋白Marker，1和2为纯化蛋白。

图4为本发明pGEX-EG95(KR)目的蛋白纯化样品的Western-Blot鉴定结果图，其中M为蛋白Marker，1为纯化蛋白。

图5为对照pGEX-EG95目的蛋白表达的SDS-PAGE电泳分析结果图，其中M为DNAMarker DL2000，1为沉淀，2为上清液。

图6为对照pET32a-SUMO-EG95目的蛋白表达的SDS-PAGE电泳分析结果图，其中M为蛋白Marker，1为上清液，2为沉淀。

图7为对照pET32a-SUMO-EG95目的蛋白纯化的SDS-PAGE电泳分析结果图，其中M为蛋白Marker，1为纯化蛋白。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件进行。

实施例1可溶性表达EG95蛋白的制备

基因设计：截取羊棘球蚴EG95基因(Genebank：AY421719.1)中第9-471位核苷酸序列，其后依次加入柔性连接子的核苷酸序列和促溶标签7F的核苷酸序列，最后加入TAA终止密码子，即得EG95(KR)基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，包括完整EG95蛋白序列、柔性连接子和促溶标签7F，将其命名为EG95(KR)。

基因序列合成：委托生工生物工程(上海)有限公司合成EG95(KR)基因并将其连接到pUC57载体上，构建pUC57-EG95(KR)重组表达载体。

目的片段PCR扩增：以pUC57-EG95(KR)重组表达载体为模板，采用pUC57通用引物(引物序列见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)扩增EG95(KR)基因，扩增条件为：94℃3min，然后94℃30s、56℃30s、72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

重组表达载体的构建：用Xba I及Xho I对EG95(KR)基因PCR扩增产物进行双酶切，回收目的DNA片段，与经相同酶切的pGEX-3X载体连接。连接参照TakaRa公司DNA连接试剂盒(DNA Ligation Kit)使用说明进行，反应体系和方法如下：pGEX-3X双酶切回收产物2.5μL，EG95(KR)基因双酶切回收产物7.5μL，DNA Ligation Kit Solution 1 10μL，混匀后16℃反应120分钟。取10μL连接产物，加入200μL大肠杆菌DH5a感受态细胞，进行重组表达载体的转化。取200μL转化产物，涂布含100μg/mL AMP的LB琼脂平板，平板置37℃温箱中培养18小时，筛选阳性克隆，培养后提取重组表达载体。所得重组表达载体以pGEX-3X通用引物(引物序列见SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)进行PCR扩增鉴定，结果如图1所示，重组表达载体PCR扩增产物与883bp的目的DNA片段大小相符。将重组表达载体PCR扩增产物委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序，测序结果显示，与目的DNA片段序列相符。说明成功构建了重组表达载体pGEX-EG95(KR)。

重组表达工程菌的构建：将重组表达载体pGEX-EG95(KR)转入宿主菌Rosseta(DE3)感受态细胞。取200μL转化产物，涂布含100μg/mL AMP的LB琼脂平板，平板置37℃温箱中培养18小时。挑取平板单菌落，分别接种于10mL AMP+LB培养基，置37℃摇床，振荡培养过夜，得原始菌液。取原始菌液1mL，按1％接种量转接100mL含100μg/mL AMP的LB液体培养基，置37℃摇床，150r/min振荡培养至菌液OD₆₀₀nm值约0.6。取1mL菌液置Ep管中，3000r/min离心1分钟，获得诱导前菌体，-20℃冻存作为对照样品备用。于剩余菌液中加入适量IPTG诱导蛋白表达，置37℃摇床，150r/min振荡培养6小时。取菌液1mL置Ep管中，3000r/min离心1分钟，获得诱导后菌体。通过SDS-PAGE电泳分析诱导前、后菌体目的蛋白的表达情况(结果见图2)，通过蛋白表达筛选阳性单菌落。将筛选出的阳性单菌落分别接入100mL含100μg/mLAMP的LB液体培养基，置37℃摇床，150r/min振荡培养10h，所得菌液与50％甘油按1:1混合进行保种。

蛋白表达：取保存的重组表达工程菌，按1％接种量转接100mL含100μg/mL AMP的LB液体培养基，置37℃摇床，150r/min振荡培养8h，再按1％接种量转接3000mL含100μg/mLAMP的LB液体培养基，当菌液OD_600nm值达0.6左右时，于培养物中加入终浓度为0.25mM的IPTG诱导蛋白表达，置37℃摇床，150r/min振荡培养6小时。所得培养液于4℃、6000rpm离心15min，收集沉淀，用Buffer A(取NaCl 29.22g、1M pH8.0 Tris-HCl 20mL，加去离子水定容至1000mL即得)洗涤1次，再按照重量体积比(g:mL)为1:10加入10倍体积的Buffer A，超声破碎，超声条件：功率300W，每工作3s间歇3s，共120min；最后4℃、12000rpm离心15min，收集上清液。通过SDS-PAGE电泳分析上清液中目的蛋白的表达情况，结果如图2所示，超声破碎后的上清液中有目的蛋白EG95(KR)表达，说明实现了EG95蛋白的可溶性表达。

蛋白纯化：将前述收集的上清液通过Ni-NTA Superflow Cartridges His亲和层析柱(简称Ni柱)进行纯化。先以10倍柱体积Buffer A平衡镍柱；再将上清液上样，上样流速为1mL/min；接着以5倍柱体积的Buffer B(取NaCl 29.22g、1M pH8.0 Tris-HCl 20mL、咪唑1.7g，加去离子水定容至1000mL即得)冲洗杂质，流速1.5mL/min；最后以Buffer C(取NaCl29.22g、1M pH8.0 Tris-HCl 20ml、咪唑34g，加去离子水定容至1000mL即得)洗脱目的蛋白，流速1.5mL/min。取纯化样品，以Bradford法测定总蛋白含量。通过SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的纯化情况，结果如图3所示，纯化获得53.5KD的目的蛋白EG95(KR)，说明目的蛋白能够通过Ni柱有效纯化。取纯化蛋白EG95(KR)进行Western blot检测，使用已确认的羊包虫阳性血清作一抗，兔抗羊IgG作二抗，结果见图4，表明该蛋白有很好的免疫原性。

利用https://protein-sol.manchester.ac.uk/网站，对本发明设计的可溶性表达Eg95蛋白序列及含有其它促溶标签的EG95蛋白序列进行可溶性计算。结果见表1，重组表达载体pET43.1a-EG95和pET32a-MBP-EG95的蛋白可溶性计算值较大，但NUSA和MBP标签大小已经远大于EG95蛋白(16.6KD)，可能对免疫造成巨大干扰；pGEX-3X-EG95和pET32a-EG95的蛋白可溶性计算值较小；7F标签的大小略小于SUMO标签，但其促溶能力较SUMO更强，连接到pGEX-3X载体上，可溶性计算值达到0.482，远高于pGEX-SUMO-EG95(0.331)。

表1蛋白可溶性数值

重组表达载体	载体	促溶标签	标签大小	可溶性计算值
					pGEX-EG95(KR)	pGEX-3X	7F	7.9KD	0.482
pGEX-EG95	pGEX-3X	GST	26KD	0.258
					pET32a-EG95	pET32a	Trx	11.6KD	0.392
pET43.1a-EG95	pET43.1a	NUSA	55KD	0.677
					pET32a-MBP-EG95	pET32a	MBP	42KD	0.474
pET32a-SUMO-EG95	pET32a	SUMO	11.5KD	0.504
					pGEX-SUMO-EG95	pGEX-3X	SUMO	11.5KD	0.331

为了比较不同促溶标签的效果，本发明同时选取pGEX-EG95和pET32a-SUMO-EG95作为对照。重组表达载体pGEX-EG95是将羊棘球蚴EG95基因(Genebank：AY421719.1)中第9-471位核苷酸序列克隆入pGEX-3X载体中而得到。但pGEX-3X载体自身含有的GST标签无法有效对EG95蛋白促溶，pGEX-EG95目的蛋白表达的SDS-PAGE电泳分析结果图如图5所示，可见超声破碎后的上清液中没有目的蛋白，目的蛋白是以包涵体的形式存在于沉淀中。

重组表达载体pET32a-SUMO-EG95是将SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列(其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，包括完整EG95蛋白序列、柔性连接子和促溶标签SUMO)克隆入pET32a载体中而得到。pET32a-SUMO-EG95目的蛋白表达的SDS-PAGE电泳分析结果图如图6所示，可见超声破碎后的上清液中没有目的蛋白，目的蛋白是以包涵体的形式存在于沉淀中，未能实现EG95蛋白的可溶性表达。表达蛋白采用包涵体蛋白方法纯化，目的蛋白纯化的SDS-PAGE电泳分析结果图如图7所示，纯化获得47.8KD的目的蛋白SUMO-EG95。

实施例2羊棘球蚴基因工程亚单位疫苗的制备

将实施例1获得的纯化蛋白EG95(KR)与Quil A佐剂混合并冻干，临用前用羊棘球蚴基因工程亚单位疫苗专用稀释液配制成每1mL含75μg EG95(KR)蛋白和1mg Quil A的羊棘球蚴病基因工程亚单位疫苗。

同时，将对照纯化蛋白SUMO-EG95与Quil A佐剂混合并冻干，临用前用羊棘球蚴基因工程亚单位疫苗专用稀释液配制成每1mL含75μg SUMO-EG95蛋白和1mg Quil A的羊棘球蚴病基因工程亚单位疫苗。

疫苗免疫效力检测：试验山羊随机分成3个试验组：EG95(KR)疫苗组、SUMO-EG95疫苗组和佐剂对照组，每组10只；EG95(KR)疫苗组和SUMO-EG95疫苗组每只羊颈部皮下注射1mL上述配制好的对应羊棘球蚴病基因工程亚单位疫苗，佐剂对照组注射含有相同佐剂剂量的稀释液；首免后28天，以相同剂量相同方式加强免疫一次。观测各组动物在免疫后是否有明显不良反应。各组动物在首免前以及首免后14天、28天，二免后14天分别采血，分离血清，ELISA检测抗体。

观测结果显示，各组动物在免疫后未见明显不良反应，说明本发明制备的EG95(KR)疫苗具有安全性。免疫血清ELISA检测结果见表2，可见本发明制备的EG95(KR)疫苗对羊具有良好的免疫效力，而SUMO-EG95疫苗组免疫抗体数值比较弱，可能SUMO标签对EG95免疫有一定影响。

表2抗体检测结果

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 重庆澳龙生物制品有限公司

<120> 可溶性表达EG95蛋白及其制备方法和应用

<141> 2021-12-30

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagctgtgcc tgatcctgtt cgcgaccagc gttctggcgc aggaatacaa aggtatgggt 60

gttgaaaccc gtaccaccga aaccccgctg cgtaaacact tcaacctgac cccggttggc 120

tcccaaggta ttcgcctgag ctgggaagtt cagcacctgt ccgatctgaa aggcaccgac 180

atcagcctga aagctgtgaa cccttccgat cctctggtat acaaacgtca gactgcgaaa 240

ttcagcgatg gtcagctgac catcggcgaa ctgaaaccga gcaccctgta caaaatgacc 300

gttgaagcgg ttaaagcaaa gaaaacaatc ctgggtttca ccgttgatat cgaaaccccg 360

cgtgcgggta aaaaagaaag caccgtcatg accagcggca gcgcgctgac cagcgcgatc 420

gcgggcttcg ttttcagctg catcgtggtt gttctgaccg gtggcggtgg ttccggtggt 480

ggtggctctg gcggtggtgg cagcgattat aaagatgacg atgacaaaga ttataaagac 540

gacgatgaca aagattacaa agatgacgac gataaagatt acaaggacga cgacgacaaa 600

gactacaaag acgatgatga taaggactac aaagacgacg acgacaaaga ttataaagac 660

gacgatgata aacaccacca ccaccaccat catcatcacc actaa 705

<210> 2

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Leu Cys Leu Ile Leu Phe Ala Thr Ser Val Leu Ala Gln Glu Tyr

1 5 10 15

Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys

20 25 30

His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg Leu Ser Trp

35 40 45

Glu Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp Ile Ser Leu Lys

50 55 60

Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln Thr Ala Lys

65 70 75 80

Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu

85 90 95

Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr Ile Leu Gly

100 105 110

Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Arg Ala Gly Lys Lys Glu Ser Thr

115 120 125

Val Met Thr Ser Gly Ser Ala Leu Thr Ser Ala Ile Ala Gly Phe Val

130 135 140

Phe Ser Cys Ile Val Val Val Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

165 170 175

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

180 185 190

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

195 200 205

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

210 215 220

His His His His His His His His His His

225 230

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agcggataac aatttcacac agga 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gggctggcaa gccacgtttg gtg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgggagctg catgtgtcag agg 23

<210> 7

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgtcggact cagaagtcaa tcaagaagct aagccagagg tcaagccaga agtcaagcct 60

gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat ggatcttcag agatcttctt caagatcaaa 120

aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa gcgttcgcta aaagacaggg taaggaaatg 180

gactccttaa gattcttgta cgacggtatt agaattcaag ctgatcagac ccctgaagat 240

ttggacatgg aggataacga tattattgag gctcacagag aacagattgg tggtggtggt 300

ggctctggtg gtggtggctc tggtggtggt ggctctcagc tgtgcctgat cctgttcgcg 360

accagcgttc tggcgcagga atacaaaggt atgggtgttg aaacccgtac caccgaaacc 420

ccgctgcgta aacacttcaa cctgaccccg gttggctccc aaggtattcg cctgagctgg 480

gaagttcagc acctgtccga tctgaaaggc accgacatca gcctgaaagc tgtgaaccct 540

tccgatcctc tggtatacaa acgtcagact gcgaaattca gcgatggtca gctgaccatc 600

ggcgaactga aaccgagcac cctgtacaaa atgaccgttg aagcggttaa agcaaagaaa 660

acaatcctgg gtttcaccgt tgatatcgaa accccgcgtg cgggtaaaaa agaaagcacc 720

gtcatgacca gcggcagcgc gctgaccagc gcgatcgcgg gcttcgtttt cagctgcatc 780

gtggttgttc tgacc 795

<210> 8

<211> 265

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro

1 5 10 15

Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser

20 25 30

Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu

35 40 45

Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg

50 55 60

Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp

65 70 75 80

Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile

85 90 95

Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gln Leu Cys Leu Ile Leu Phe Ala Thr Ser Val Leu Ala Gln Glu Tyr

115 120 125

Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys

130 135 140

His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg Leu Ser Trp

145 150 155 160

Glu Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp Ile Ser Leu Lys

165 170 175

Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln Thr Ala Lys

180 185 190

Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu

195 200 205

Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr Ile Leu Gly

210 215 220

Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Arg Ala Gly Lys Lys Glu Ser Thr

225 230 235 240

Val Met Thr Ser Gly Ser Ala Leu Thr Ser Ala Ile Ala Gly Phe Val

245 250 255

Phe Ser Cys Ile Val Val Val Leu Thr

260 265

Claims

1.可溶性表达EG95蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的可溶性表达EG95蛋白的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2所述编码基因的重组表达载体。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的可溶性表达EG95蛋白的编码基因克隆入pGEX-3X载体中得到。

6.含有权利要求4所述重组表达载体的工程菌。

7.如权利要求6所述的工程菌，其特征在于，将重组表达载体转入大肠杆菌Rosseta(DE3)中得到，所述重组表达载体是将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的可溶性表达EG95蛋白的编码基因克隆入pGEX-3X载体中得到。

8.利用权利要求7所述工程菌制备可溶性表达EG95蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：将工程菌按1％接种量接入含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、150r/min振荡培养至OD_600nm值达0.6，加入IPTG至终浓度为0.25mM，37℃、150r/min振荡条件下诱导表达6h，得发酵菌液；将发酵菌液离心，沉淀用Buffer A洗涤后，按照重量体积比为1g:10mL加入Buffer A，以超声功率300W、每工作3s间歇3s的方式超声破碎120min，离心，取上清液，用Ni²⁺-NTA亲和层析系统纯化，得到可溶性表达EG95蛋白；

所述Ni²⁺-NTA亲和层析系统所用的平衡缓冲液为Buffer A，杂蛋白洗液为Buffer B，目的蛋白洗液为Buffer C；所述Buffer A是取NaCl 29.22g、1M pH8.0 Tris-HCl 20mL，加水定容至1000mL制得；Buffer B是取NaCl 29.22g、1M pH8.0 Tris-HCl 20mL、咪唑1.7g，加水定容至1000mL制得；Buffer C是取NaCl 29.22g、1M pH8.0 Tris-HCl 20mL、咪唑34g，加水定容至1000mL制得。

9.权利要求1所述的可溶性表达EG95蛋白在制备羊棘球蚴病基因工程亚单位疫苗中的应用。

10.以权利要求1所述可溶性表达EG95蛋白为抗原的羊棘球蚴病基因工程亚单位疫苗。