CN113493780A

CN113493780A - 一种利用sumo融合表达系统制备重组肝素酶ii的方法及其所制备的sumo_肝素酶ii融合蛋白

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Publication number: CN113493780A
Application number: CN202110097134.XA
Authority: CN
Inventors: 蒋建华; 张亮; 邢岭; 吴双; 高伟
Original assignee: Shanghai Baowei Medicine Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Baowei Medicine Technology Co ltd
Priority date: 2021-01-25
Filing date: 2021-01-25
Publication date: 2021-10-12

Abstract

本发明公开了利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶II的方法及其所制备的肝素酶II，该制备方法包括下列步骤：选择来自肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)的肝素酶II序列，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，共772aa；去除信号肽序列，获得肝素酶II的DNA序列，如SEQIDNo.2；将所述肝素酶II的DNA序列插入带有N端SUMO蛋白标签的pSMART载体质粒；将正确的质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，获得融合蛋白；用SUMO蛋白酶将SUMO标签蛋白从融合蛋白上切割下来，即获得肝素酶II。本发明的优点是：提高目标蛋白质的可溶性、促进目标蛋白质的正确折叠，避免形成包涵体；降低纯化成本、提高纯化效率；SUMO蛋白标签分子量较小，对肝素酶II的酶活性影响较小，获得纯化的肝素酶II。

Description

一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶II的方法及其所制备的SUMO_肝素酶II融合蛋白

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及涉及一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶II(Heparinase II)的方法。

背景技术

肝素酶主要从一些利用肝素为碳源的细菌中分离得到，最初来源于肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)，从肝素黄杆菌中分离纯化出的肝素酶有三种，分别为肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III。肝素酶的主要作用是降解肝素，在酶降解法生产低分子肝素和超低分子肝素中有广泛应用。

目前用于低分子肝素生产的肝素酶产品主要有两种来源：一是直接从产肝素酶的微生物中发酵提取，如专利号CN102286448A记载，一种肝素黄杆菌肝素酶I、II、III的制备方法(深圳市海普瑞药业股份有限公司)；二是通过基因工程技术构建重组肝素酶工程菌，发酵提取重组肝素酶。

直接从产肝素酶的微生物(如肝素黄杆菌等)中提取肝素酶II，发酵条件和纯化工艺相对复杂，通过菌种选育提高产量的潜力有限。

基因工程重组技术已广泛应用于蛋白质制备，在构建工程菌时，选择合适的蛋白纯化标签，与目标蛋白质形成融合蛋白，可以提高蛋白质的可溶性、屏蔽毒性蛋白、促进蛋白质的正确折叠、增强对高温和蛋白酶的耐受性。目前已有将麦芽糖结合蛋白(MBP)标签与肝素酶II形成融合蛋白等应用，如专利号CN101942024A记载，一种肝素酶Ⅱ融合蛋白及其编码基因与表达方法(清华大学、北京思清源生物科技有限公司)。

采用基因工程重组技术在大肠杆菌系统中生产肝素酶II等外源蛋白质时面临两个挑战：一是所用蛋白质表达系统的表达水平较低；二是所表达的蛋白质被错误折叠进不溶性的聚集体——包涵体中，提取和复性困难。采用可溶性蛋白标签与肝素酶II形成融合蛋白，可以显著提高重组产物的溶解性。

类似谷胱甘肽巯基转移酶标签(GST-Tag)、麦芽糖结合蛋白标签(MBP- Tag)、转录抗终止因子A标签(NusA-Tag)等融合蛋白标签，它们的分子量较大(26-55kDa)，可能会干扰目标蛋白质的正常功能，并且在表达和后续纯化过程中去除标签等环节相对降低了目标蛋白质的产率。

发明内容

为解决现有技术的缺陷和不足，本发明的目的是提供一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶II(Heparinase II)的方法，以极大地提高目标蛋白质的表达水平、稳定性和可溶性，提高目标蛋白质的活性及产率。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

根据本发明的一个方面，提供了一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶II(Heparinase II)的方法，包括下列步骤：

S01：选择来自肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)的肝素酶II序列，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，共772aa；

S02：去除信号肽序列，获得肝素酶II的DNA序列，如SEQIDNo.2；

S03：将所述肝素酶II的DNA序列插入带有N端SUMO蛋白标签的 pSMART载体质粒；

S04：将正确的质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，经发酵和纯化获得SUMO_肝素酶II融合蛋白；

S05：用SUMO蛋白酶将SUMO标签蛋白从步骤S04所述的SUMO_肝素酶 II融合蛋白上切割下来，即获得肝素酶II。

进一步地，还包括融合蛋白表达条件的优化步骤。

进一步地，所述融合蛋白的优化条件是融合蛋白在15℃以0.2mmol/l 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。

进一步地，还包括融合蛋白的纯化步骤。

进一步地，所述融合蛋白的纯化步骤采用Ni柱亲和层析方法进行分离纯化。

进一步地，所述的SUMO标签蛋白从步骤S04所述的SUMO_肝素酶II 融合蛋白上切割下来是包括下列步骤：将所述融合蛋白透析更换缓冲液，加入适量的SUMO蛋白酶，混匀后置于4℃反应过夜，水解后的融合蛋白样本用Ni柱亲和层析方法将带有6个组氨酸片段的SUMO蛋白标签(能结合到Ni柱上)与肝素酶II(不能结合到Ni柱上)分离。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种按照上述方法制备的SUMO_ 肝素酶II溶合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.3。

根据本发明的再一个方面，还提供了一种按照上述方法制备的肝素酶 II。

通过本发明的技术方案，利用SUMO融合表达系统制备的重组肝素酶II，融合在目标蛋白质N端的较小的类泛素蛋白修饰物(small ubiquitin-like modifier，SUMO)标签蛋白，分子量大约11kDa，能够极大地提高目标蛋白质的稳定性和可溶性，对目标蛋白质的活性影响较小。并且，SUMO蛋白酶(SUMO Protease)是一种具有较高活性的半胱氨酸蛋白酶，它能识别SUMO标签蛋白的三级结构，而不是氨基酸序列，因此可以高效而且特异性地将SUMO标签蛋白从重组融合蛋白上切割下来，从而获得肝素酶II。

采用SUMO蛋白标签融合表达系统制备重组肝素酶II的优点：

1)提高目标蛋白质的可溶性、促进目标蛋白质的正确折叠，避免形成包涵体；

2)SUMO蛋白标签近N端有6个组氨酸片段，使融合蛋白可以用Ni柱亲和层析方法一步纯化，降低纯化成本、提高纯化效率；

3)SUMO蛋白标签分子量较小，大约11kDa，对肝素酶II的酶活性影响较小，即使不切除融合蛋白中的蛋白标签，也能得到较高活性的肝素酶 II；

4)SUMO蛋白酶能识别SUMO标签蛋白的三级结构，可以高效而且特异性地将SUMO标签蛋白从重组融合蛋白上切割下来，从而获得纯化的肝素酶II。

下面结合附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。对于所属技术领域的技术人员而言，从对本发明的详细说明中，本发明的上述和其他的目的、特征和优点将显而易见。

附图说明

图1为本发明一实施例中肝素酶II表达鉴定的SDS-PAGE电泳分析图；

图2为本发明一实施例中肝素酶II表达优化的SDS-PAGE电泳分析图；

图3为本发明一实施例中肝素酶II可溶性分析的SDS-PAGE电泳分析图；

图4为本发明一实施例中肝素酶II亲和纯化结果的SDS-PAGE电泳分析图；

图5为本发明一实施例中肝素酶II免疫印迹Western Blot的SDS- PAGE电泳分析图；

图6为本发明一实施例中肝素酶II去除标签的SDS-PAGE电泳分析图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式及实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明。

根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶II(Heparinase II)的方法，包括下列步骤：

S02：去除信号肽序列，获得肝素酶II的DNA序列，如SEQIDNo.2；

S04：将正确的质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，经发酵和纯化获得融合蛋白；

S05:用SUMO蛋白酶将SUMO标签蛋白从步骤S04所述的融合蛋白上切割下来，即获得肝素酶II。

优选的，还包括融合蛋白表达条件的优化步骤。

优选的，所述融合蛋白的优化条件是融合蛋白在15℃以0.2mmol/l异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。

优选的，还包括融合蛋白的纯化步骤。

优选的，所述融合蛋白的纯化步骤采用Ni柱亲和层析方法进行分离纯化。

优选的，所述的SUMO标签蛋白从步骤S04所述的SUMO_肝素酶II融合蛋白上切割下来是包括下列步骤：将所述融合蛋白透析更换缓冲液，加入适量的SUMO蛋白酶，混匀后置于4℃反应过夜，水解后的融合蛋白样本用Ni柱亲和层析方法将带有6个组氨酸片段的SUMO蛋白标签(能结合到 Ni柱上)与肝素酶II(不能结合到Ni柱上)分离。

根据本发明的一典型实施方式，还提供了按照上述方法制备的SUMO_ 肝素酶II融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.3。

根据本发明的一典型实施方式，还提供了一种按照上述方法制备的肝素酶II。

选择来自肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)的肝素酶II序列，共 772aa,其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，发明人经蛋白质序列分析发现，肝素酶II没有跨膜结构，第1-25个氨基酸为信号肽 (MKKQILYLIVLQQLFLCSAYA)，后747个氨基酸为肝素酶II序列。采取大肠杆菌胞内表达方式制备肝素酶II，转入工程菌的序列应预先去除信号肽序列。将肝素酶II的DNA序列如SEQIDNo.2所示，插入带有N端SUMO蛋白标签的pSMART载体质粒。将正确的质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，经SDS-PAGE验证，融合蛋白表达正常。融合蛋白由109aa的SUMO蛋白标签和747aa的肝素酶II组成，SUMO-肝素酶II 融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。

经优化，确定融合蛋白在15℃以0.2mmol/l异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 诱导表达最佳。

在融合蛋白靠近N端处设计了6个组氨酸(histidine，H)序列，工程菌发酵液去除上清液，并将菌体破碎后，采用Ni柱亲和层析方法将融合蛋白分离纯化。

将纯化后的融合蛋白样品透析更换缓冲液，加入适量的SUMO蛋白酶，混匀后置于4℃反应过夜。水解后的融合蛋白样本用Ni柱亲和层析方法将带有6个组氨酸片段的SUMO蛋白标签(能结合到Ni柱上)与肝素酶II (不能结合到Ni柱上)分离。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

实施例一

1.质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中

1.1将质粒2μL加入100μL感受态细菌中，置冰上30min；

1.2 42℃热激90s，迅速置冰中5min；加入500μL LB培养液；1.3 37℃，220rpm振摇1h，离心后全部涂布于含抗性的LB 平板，37℃倒置培养过夜。

2.表达鉴定

2.1挑取5个平板上单克隆接种于含适量抗性的4mL LB培养液的试管中；

2.2 37℃、220rpm振摇至菌体OD600为0.6-0.8；

2.3取出1mL培养物，12000g室温离心5min，弃上清，用80μL 1×PBS缓冲液重悬菌体沉淀并加入20μL的5×Loading Buffer；

2.4向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，在37℃220 rpm振摇4h，诱导融合蛋白表达；

2.5取出0.5mL培养物，12000g室温离心5min，弃上清，用80μL 1×PBS缓冲液重悬菌体沉淀并加入20μL的5×Loading Buffer；

2.6进行12％SDS-PAGE分析，表达鉴定结果如图1所示，其中M：蛋白质分子量标记(Protein Marker)，1：诱导前样品，2：诱导后样品Ⅰ，3：诱导后样品Ⅱ，4：诱导后样品Ⅲ，5：诱导后样品Ⅳ，6：诱导后样品Ⅴ。

3.表达优化

3.1挑取划线平板上单克隆接种于13支含适量抗性的4mL LB培养液的试管中；

3.2 37℃、220rpm振摇至菌体OD600为0.6-0.8；

3.3取出0.4mL培养物，12000g室温离心5min，弃上清，用80μL 1×PBS缓冲液重悬菌体沉淀加入20μL的5×Loading Buffer；

3.4向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度分别为0.2mM与1mM，分别在37℃和15℃220rpm振摇4h和16h，诱导融合蛋白表达；

3.5取出0.2mL培养物，12000g室温离心5min，弃上清，用80μL 1×PBS缓冲液重悬菌体沉淀加入20μL的5×Loading Buffer。

3.6进行SDS-PAGE分析,表达优化结果如图2所示，其中

M：蛋白质分子量标记(Protein Marker)；

1：未诱导样品；

2-4：37℃、1.0mM IPTG诱导后样品；

5-7：37℃、0.2mM IPTG诱导后样品；

8-10：15℃、1.0mM IPTG诱导后样品；

11-13：15℃、0.2mM IPTG诱导后样品。

4.可溶性分析

取37℃诱导后菌液和15℃诱导后菌液2mL，12000g室温离心5min，弃上清，用1mL的Buffer A(20mM Tris，300mM NaCl，10％Glycerol， pH8.0)重悬离心后沉淀，超声波破碎(Φ3，15％，2s/8s，10min)，上清沉淀分别制样，进行12％SDS-PAGE分析，15℃诱导下，融合蛋白均可溶，可溶性分析结果如图3所示，其中

M：蛋白质分子量标记(Protein Marker)；

1：未诱导样品；

2：诱导后样品；

3：37℃、1.0mM IPTG诱后沉淀样；

4：37℃、1.0mM IPTG诱后上清样；

5：37℃、0.2mM IPTG诱后沉淀样；

6：37℃、0.2mM IPTG诱后上清样；

7：15℃、1.0mM IPTG诱后沉淀样；

8：15℃、1.0mM IPTG诱后上清样；

9：15℃、0.2mM IPTG诱后沉淀样；

10：15℃、0.2mM IPTG诱后上清样。

5.放大表达与亲和纯化

5.1取最优克隆保种菌接种至含合适抗生素的1L LB培养基中， 37℃220rpm振摇至OD600＝0.6～0.8，加入终浓度为0.2mM IPTG后， 15℃220rpm振摇16h。

5.2利用8000rpm离心10min，弃去上清，收集所有菌体。

5.3使用Buffer A(20mM Tris，300mM NaCl，10％Glycerol， pH8.0)重悬菌体，超声破碎(Φ10，15％，2s/8s，30min)。16000rpm 离心10min，收集上清。

5.4在上清中加入2mL Ni-NTA，混匀后4℃孵育1h。

5.5将孵育物加入空柱管，收集流出液。

5.6分别以Buffer B(20mM Tris，300mM NaCl，10％Glycerol， 20mM Imidazole，pH8.0)与Buffer C(20mM Tris，300mM NaCl， 10％Glycerol，40mM Imidazole，pH8.0)清洗填料，收集清洗液。

5.7利用Buffer D(20mM Tris，300mM NaCl，10％Glycerol， 500mM Imidazole，pH8.0)洗脱，收集洗脱液。

5.8SDS-PAGE电泳检测，亲和纯化结果如图4所示，其中

M：蛋白质标记Protein Marker；

1：破碎后沉淀；

2：破碎后上清；

3：Ni-NTA孵育后流出液；

4：Buffer B清洗样；

5：Buffer C清洗样；

6：Buffer D洗脱样。

6.洗脱样免疫印迹(Western Blot)分析

6.1SDS-PAGE

电泳样品：预染色的蛋白质分子量标记(Protein Marker)， Buffer D洗脱样

电泳条件：200V，60min

6.2半干式电转印

a.在电泳的正在进行的时候，将PVDF膜切出与凝胶一样大小，并剪去一个小角，帮助判断方向，放置在甲醇中浸泡30s，后转移到电转液中；

b.薄滤纸和厚滤纸切出比凝胶略大一些，各两张，置转移缓冲液浸泡；

c.电泳完成后，将胶的浓缩胶切除，放置在电转液中。按照厚滤纸，薄滤纸，NC膜，胶，薄滤纸，厚滤纸顺序放置在电转仪平面上。

d.每层之间的气泡要全部去除。可以用手轻轻按住一端，再用50mL 离心管轻轻在上层往一边移动去除气泡，再将手换一端，离心管往另外一端去除气泡；

e.将电转仪链接到仪器上设置，30V，蛋白小于50KDa，用 30mins；蛋白大于50KDa，用45mins。

6.3膜的封闭和抗体孵育及最终处理

a.洗转印膜：室温用1×PBST漂洗5min共3次,在加入任何溶液的时候都不得在膜上加入，沿盒子的角缓慢加入，以免将膜上结合的物质冲掉，摇床转速40rpm。

b.将PBST倒掉，放入5％脱脂奶粉的封闭液内，摇床调到最低转速，室温封闭2h。

c.室温用1×PBST漂洗5min，共3次.

d.加入抗体(1：2000到5％脱脂奶粉中)，孵育1h，使用后回收到-20℃。

e.室温用1×PBST漂洗5min，共3次。f.缓慢加入少量ECL 液，能将膜全部覆盖，静置2min后拍照，如图5所示，其中，M：蛋白质标记Protein Marker样本Sample：BufferD洗脱样。

7.去除标签蛋白

7.1将洗脱样全部透析至Buffer A(20mM Tris，300mM NaCl，pH 8.0)中。

7.2透析完成后，在融合蛋白中加入适量的SUMO蛋白酶(SUMO Protease)，混匀后，放置于4℃反应过夜。

7.3将反应完成后的产物，加入Ni-NTA纯化柱中，缓慢上样，收集流出液。

7.4利用Buffer A(20mM Tris，300mM NaCl，pH 8.0)清洗纯化柱。

7.5利用Buffer D(20mM Tris，300mM NaCl，500mM Imidazole， pH 8.0)洗脱。

7.6SDS-PAGE电泳，如图6所示，其中

M：蛋白质分子量标记(Protein Marker)

1：酶切反应前样品

2：酶切反应后样品

3：酶切后过柱流出样(肝素酶II)

4：酶切后过柱清洗样

5：酶切后过柱洗脱样(SUMO蛋白标签)。

综上，将正确的质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，经SDS-PAGE验证，融合蛋白表达正常。各优化条件下，融合蛋白均表达明显，且融合蛋白在15℃诱导温度下可溶性更好，选择15℃下0.2mM IPTG诱导，Ni-NTA纯化后去除标签得到无融合标签的目的蛋白肝素酶II。

当然，本发明还可有其他实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，所属技术领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明的权利要求的保护范围。

SEQ ID No.1:

肝素酶II(Heparinase II)的氨基酸序列：

MKRQLYLYVIFVVVELMVFTTKGYSQTKADVVWKDVDGVSMPIPPKTHPRLYLREQQVPD LKNRMNDPKLKKVWADMIKMQEDWKPADIPEVKDFRFYFNQKGLTVRVELMALNYLMTKD PKVGREAITSIIDTLETATFKPAGDISRGIGLFMVTGAIVYDWCYDQLKPEEKTRFVKAF VRLAKMLECGYPPVKDKSIVGHASEWMIMRDLLSVGIAIYDEFPEMYNLAAGRFFKEHLV ARNWFYPSHNYHQGMSYLNVRFTNDLFALWILDRMGAGNVFNPGQQFILYDAIYKRRPDG QILAGGDVDYSRKKPKYYTMPALLAGSYYKDEYLNYEFLKDPNVEPHCKLFEFLWRDTQL GSRKPDDLPLSRYSGSPFGWMIARTGWGPESVIAEMKVNEYSFLNHQHQDAGAFQIYYKG PLAIDAGSYTGSSGGYNSPHNKNFFKRTIAHNSLLIYDPKETFSSSGYGGSDHTDFAAND GGQRLPGKGWIAPRDLKEMLAGDFRTGKILAQGFGPDNQTPDYTYLKGDITAAYSAKVKE VKRSFLFLNLKDAKVPAAMIVFDKVVASNPDFKKFWLLHSIEQPEIKGNQITIKRTKNGD SGMLVNTALLPDAANSNITSIGGKGKDFWVFGTNYTNDPKPGTDEALERGEWRVEITPKK AAAEDYYLNVIQIADNTQQKLHEVKRIDGDKVVGVQLADRIVTFSKTSETVDRPFGFSVV GKGTFKFVMTDLLPGTWQVLKDGKILYPALSAKGDDGALYFEGTEGTYRFLR SEQ ID No.2:

肝素酶II(Heparinase II)DNA：

CAAACAAAAGCAGACGTAGTATGGAAAGACGTAGACGGAGTAAGCATGCCAATACCACCA AAAACACACCCAAGACTATACCTAAGAGAACAACAAGTACCAGACCTAAAAAACAGAATG AACGACCCAAAACTAAAAAAAGTATGGGCAGACATGATAAAAATGCAAGAAGACTGGAAA CCAGCAGACATACCAGAAGTAAAAGACTTCAGATTCTACTTCAACCAAAAAGGACTAACA GTAAGAGTAGAACTAATGGCACTAAACTACCTAATGACAAAAGACCCAAAAGTAGGAAGA GAAGCAATAACAAGCATAATAGACACACTAGAAACAGCAACATTCAAACCAGCAGGAGAC ATAAGCAGAGGAATAGGACTATTCATGGTAACAGGAGCAATAGTATACGACTGGTGCTAC GACCAACTAAAACCAGAAGAAAAAACAAGATTCGTAAAAGCATTCGTAAGACTAGCAAAA ATGCTAGAATGCGGATACCCACCAGTAAAAGACAAAAGCATAGTAGGACACGCAAGCGAA TGGATGATAATGAGAGACCTACTAAGCGTAGGAATAGCAATATACGACGAATTCCCAGAA ATGTACAACCTAGCAGCAGGAAGATTCTTCAAAGAACACCTAGTAGCAAGAAACTGGTTC TACCCAAGCCACAACTACCACCAAGGAATGAGCTACCTAAACGTAAGATTCACAAACGAC CTATTCGCACTATGGATACTAGACAGAATGGGAGCAGGAAACGTATTCAACCCAGGACAA CAATTCATACTATACGACGCAATATACAAAAGAAGACCAGACGGACAAATACTAGCAGGA GGAGACGTAGACTACAGCAGAAAAAAACCAAAATACTACACAATGCCAGCACTACTAGCA GGAAGCTACTACAAAGACGAATACCTAAACTACGAATTCCTAAAAGACCCAAACGTAGAA CCACACTGCAAACTATTCGAATTCCTATGGAGAGACACACAACTAGGAAGCAGAAAACCA GACGACCTACCACTAAGCAGATACAGCGGAAGCCCATTCGGATGGATGATAGCAAGAACA GGATGGGGACCAGAAAGCGTAATAGCAGAAATGAAAGTAAACGAATACAGCTTCCTAAAC CACCAACACCAAGACGCAGGAGCATTCCAAATATACTACAAAGGACCACTAGCAATAGAC GCAGGAAGCTACACAGGAAGCAGCGGAGGATACAACAGCCCACACAACAAAAACTTCTTC AAAAGAACAATAGCACACAACAGCCTACTAATATACGACCCAAAAGAAACATTCAGCAGC AGCGGATACGGAGGAAGCGACCACACAGACTTCGCAGCAAACGACGGAGGACAAAGACTA CCAGGAAAAGGATGGATAGCACCAAGAGACCTAAAAGAAATGCTAGCAGGAGACTTCAGA ACAGGAAAAATACTAGCACAAGGATTCGGACCAGACAACCAAACACCAGACTACACATAC CTAAAAGGAGACATAACAGCAGCATACAGCGCAAAAGTAAAAGAAGTAAAAAGAAGCTTC CTATTCCTAAACCTAAAAGACGCAAAAGTACCAGCAGCAATGATAGTATTCGACAAAGTA GTAGCAAGCAACCCAGACTTCAAAAAATTCTGGCTACTACACAGCATAGAACAACCAGAA ATAAAAGGAAACCAAATAACAATAAAAAGAACAAAAAACGGAGACAGCGGAATGCTAGTA AACACAGCACTACTACCAGACGCAGCAAACAGCAACATAACAAGCATAGGAGGAAAAGGA AAAGACTTCTGGGTATTCGGAACAAACTACACAAACGACCCAAAACCAGGAACAGACGAA GCACTAGAAAGAGGAGAATGGAGAGTAGAAATAACACCAAAAAAAGCAGCAGCAGAAGAC TACTACCTAAACGTAATACAAATAGCAGACAACACACAACAAAAACTACACGAAGTAAAA AGAATAGACGGAGACAAAGTAGTAGGAGTACAACTAGCAGACAGAATAGTAACATTCAGC AAAACAAGCGAAACAGTAGACAGACCATTCGGATTCAGCGTAGTAGGAAAAGGAACATTC AAATTCGTAATGACAGACCTACTACCAGGAACATGGCAAGTACTAAAAGACGGAAAAATACTATACCCAGCACTAAGCGCAAAAGGAGACGACGGAGCACTATACTTCGAAGGAACAGAAGGAACATACAGATTCCTAAGATAG

SEQ ID No.3:

SUMO-肝素酶II融合蛋白的氨基酸序列(SUMO-Heparinase II)： MGHHHHHHMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKR QGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGQGSQTKADVVWKDVDGVSMP IPPKTHPRLYLREQQVPDLKNRMNDPKLKKVWADMIKMQEDWKPADIPEVKDFRFYFNQKGLT VRVELMALNYLMTKDPKVGREAITSIIDTLETATFKPAGDISRGIGLFMVTGAIVYDWCYDQL KPEEKTRFVKAFVRLAKMLECGYPPVKDKSIVGHASEWMIMRDLLSVGIAIYDEFPEMYNLAA GRFFKEHLVARNWFYPSHNYHQGMSYLNVRFTNDLFALWILDRMGAGNVFNPGQQFILYDAIY KRRPDGQILAGGDVDYSRKKPKYYTMPALLAGSYYKDEYLNYEFLKDPNVEPHCKLFEFLWRD TQLGSRKPDDLPLSRYSGSPFGWMIARTGWGPESVIAEMKVNEYSFLNHQHQDAGAFQIYYKG PLAIDAGSYTGSSGGYNSPHNKNFFKRTIAHNSLLIYDPKETFSSSGYGGSDHTDFAANDGGQ RLPGKGWIAPRDLKEMLAGDFRTGKILAQGFGPDNQTPDYTYLKGDITAAYSAKVKEVKRSFL FLNLKDAKVPAAMIVFDKVVASNPDFKKFWLLHSIEQPEIKGNQITIKRTKNGDSGMLVNTAL LPDAANSNITSIGGKGKDFWVFGTNYTNDPKPGTDEALERGEWRVEITPKKAAAEDYYLNVIQ IADNTQQKLHEVKRIDGDKVVGVQLADRIVTFSKTSETVDRPFGFSVVGKGTFKFVMTDLLPG TWQVLKDGKILYPALSAKGDDGALYFEGTEGTYRFLR。

序列表

<110> 上海宝维医药技术有限公司

<120> 一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶II的方法及其所制备的SUMO_肝素酶II融合蛋白

<130> 2020

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 772

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Met Lys Arg Gln Leu Tyr Leu Tyr Val Ile Phe Val Val Val Glu Leu

1 5 10 15

Met Val Phe Thr Thr Lys Gly Tyr Ser Gln Thr Lys Ala Asp Val Val

20 25 30

Trp Lys Asp Val Asp Gly Val Ser Met Pro Ile Pro Pro Lys Thr His

35 40 45

Pro Arg Leu Tyr Leu Arg Glu Gln Gln Val Pro Asp Leu Lys Asn Arg

50 55 60

Met Asn Asp Pro Lys Leu Lys Lys Val Trp Ala Asp Met Ile Lys Met

65 70 75 80

Gln Glu Asp Trp Lys Pro Ala Asp Ile Pro Glu Val Lys Asp Phe Arg

85 90 95

Phe Tyr Phe Asn Gln Lys Gly Leu Thr Val Arg Val Glu Leu Met Ala

100 105 110

Leu Asn Tyr Leu Met Thr Lys Asp Pro Lys Val Gly Arg Glu Ala Ile

115 120 125

Thr Ser Ile Ile Asp Thr Leu Glu Thr Ala Thr Phe Lys Pro Ala Gly

130 135 140

Asp Ile Ser Arg Gly Ile Gly Leu Phe Met Val Thr Gly Ala Ile Val

145 150 155 160

Tyr Asp Trp Cys Tyr Asp Gln Leu Lys Pro Glu Glu Lys Thr Arg Phe

165 170 175

Val Lys Ala Phe Val Arg Leu Ala Lys Met Leu Glu Cys Gly Tyr Pro

180 185 190

Pro Val Lys Asp Lys Ser Ile Val Gly His Ala Ser Glu Trp Met Ile

195 200 205

Met Arg Asp Leu Leu Ser Val Gly Ile Ala Ile Tyr Asp Glu Phe Pro

210 215 220

Glu Met Tyr Asn Leu Ala Ala Gly Arg Phe Phe Lys Glu His Leu Val

225 230 235 240

Ala Arg Asn Trp Phe Tyr Pro Ser His Asn Tyr His Gln Gly Met Ser

245 250 255

Tyr Leu Asn Val Arg Phe Thr Asn Asp Leu Phe Ala Leu Trp Ile Leu

260 265 270

Asp Arg Met Gly Ala Gly Asn Val Phe Asn Pro Gly Gln Gln Phe Ile

275 280 285

Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Lys Arg Arg Pro Asp Gly Gln Ile Leu Ala

290 295 300

Gly Gly Asp Val Asp Tyr Ser Arg Lys Lys Pro Lys Tyr Tyr Thr Met

305 310 315 320

Pro Ala Leu Leu Ala Gly Ser Tyr Tyr Lys Asp Glu Tyr Leu Asn Tyr

325 330 335

Glu Phe Leu Lys Asp Pro Asn Val Glu Pro His Cys Lys Leu Phe Glu

340 345 350

Phe Leu Trp Arg Asp Thr Gln Leu Gly Ser Arg Lys Pro Asp Asp Leu

355 360 365

Pro Leu Ser Arg Tyr Ser Gly Ser Pro Phe Gly Trp Met Ile Ala Arg

370 375 380

Thr Gly Trp Gly Pro Glu Ser Val Ile Ala Glu Met Lys Val Asn Glu

385 390 395 400

Tyr Ser Phe Leu Asn His Gln His Gln Asp Ala Gly Ala Phe Gln Ile

405 410 415

Tyr Tyr Lys Gly Pro Leu Ala Ile Asp Ala Gly Ser Tyr Thr Gly Ser

420 425 430

Ser Gly Gly Tyr Asn Ser Pro His Asn Lys Asn Phe Phe Lys Arg Thr

435 440 445

Ile Ala His Asn Ser Leu Leu Ile Tyr Asp Pro Lys Glu Thr Phe Ser

450 455 460

Ser Ser Gly Tyr Gly Gly Ser Asp His Thr Asp Phe Ala Ala Asn Asp

465 470 475 480

Gly Gly Gln Arg Leu Pro Gly Lys Gly Trp Ile Ala Pro Arg Asp Leu

485 490 495

Lys Glu Met Leu Ala Gly Asp Phe Arg Thr Gly Lys Ile Leu Ala Gln

500 505 510

Gly Phe Gly Pro Asp Asn Gln Thr Pro Asp Tyr Thr Tyr Leu Lys Gly

515 520 525

Asp Ile Thr Ala Ala Tyr Ser Ala Lys Val Lys Glu Val Lys Arg Ser

530 535 540

Phe Leu Phe Leu Asn Leu Lys Asp Ala Lys Val Pro Ala Ala Met Ile

545 550 555 560

Val Phe Asp Lys Val Val Ala Ser Asn Pro Asp Phe Lys Lys Phe Trp

565 570 575

Leu Leu His Ser Ile Glu Gln Pro Glu Ile Lys Gly Asn Gln Ile Thr

580 585 590

Ile Lys Arg Thr Lys Asn Gly Asp Ser Gly Met Leu Val Asn Thr Ala

595 600 605

Leu Leu Pro Asp Ala Ala Asn Ser Asn Ile Thr Ser Ile Gly Gly Lys

610 615 620

Gly Lys Asp Phe Trp Val Phe Gly Thr Asn Tyr Thr Asn Asp Pro Lys

625 630 635 640

Pro Gly Thr Asp Glu Ala Leu Glu Arg Gly Glu Trp Arg Val Glu Ile

645 650 655

Thr Pro Lys Lys Ala Ala Ala Glu Asp Tyr Tyr Leu Asn Val Ile Gln

660 665 670

Ile Ala Asp Asn Thr Gln Gln Lys Leu His Glu Val Lys Arg Ile Asp

675 680 685

Gly Asp Lys Val Val Gly Val Gln Leu Ala Asp Arg Ile Val Thr Phe

690 695 700

Ser Lys Thr Ser Glu Thr Val Asp Arg Pro Phe Gly Phe Ser Val Val

705 710 715 720

Gly Lys Gly Thr Phe Lys Phe Val Met Thr Asp Leu Leu Pro Gly Thr

725 730 735

Trp Gln Val Leu Lys Asp Gly Lys Ile Leu Tyr Pro Ala Leu Ser Ala

740 745 750

Lys Gly Asp Asp Gly Ala Leu Tyr Phe Glu Gly Thr Glu Gly Thr Tyr

755 760 765

Arg Phe Leu Arg

770

<210> 2

<211> 2244

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

caaacaaaag cagacgtagt atggaaagac gtagacggag taagcatgcc aataccacca 60

aaaacacacc caagactata cctaagagaa caacaagtac cagacctaaa aaacagaatg 120

aacgacccaa aactaaaaaa agtatgggca gacatgataa aaatgcaaga agactggaaa 180

ccagcagaca taccagaagt aaaagacttc agattctact tcaaccaaaa aggactaaca 240

gtaagagtag aactaatggc actaaactac ctaatgacaa aagacccaaa agtaggaaga 300

gaagcaataa caagcataat agacacacta gaaacagcaa cattcaaacc agcaggagac 360

ataagcagag gaataggact attcatggta acaggagcaa tagtatacga ctggtgctac 420

gaccaactaa aaccagaaga aaaaacaaga ttcgtaaaag cattcgtaag actagcaaaa 480

atgctagaat gcggataccc accagtaaaa gacaaaagca tagtaggaca cgcaagcgaa 540

tggatgataa tgagagacct actaagcgta ggaatagcaa tatacgacga attcccagaa 600

atgtacaacc tagcagcagg aagattcttc aaagaacacc tagtagcaag aaactggttc 660

tacccaagcc acaactacca ccaaggaatg agctacctaa acgtaagatt cacaaacgac 720

ctattcgcac tatggatact agacagaatg ggagcaggaa acgtattcaa cccaggacaa 780

caattcatac tatacgacgc aatatacaaa agaagaccag acggacaaat actagcagga 840

ggagacgtag actacagcag aaaaaaacca aaatactaca caatgccagc actactagca 900

ggaagctact acaaagacga atacctaaac tacgaattcc taaaagaccc aaacgtagaa 960

ccacactgca aactattcga attcctatgg agagacacac aactaggaag cagaaaacca 1020

gacgacctac cactaagcag atacagcgga agcccattcg gatggatgat agcaagaaca 1080

ggatggggac cagaaagcgt aatagcagaa atgaaagtaa acgaatacag cttcctaaac 1140

caccaacacc aagacgcagg agcattccaa atatactaca aaggaccact agcaatagac 1200

gcaggaagct acacaggaag cagcggagga tacaacagcc cacacaacaa aaacttcttc 1260

aaaagaacaa tagcacacaa cagcctacta atatacgacc caaaagaaac attcagcagc 1320

agcggatacg gaggaagcga ccacacagac ttcgcagcaa acgacggagg acaaagacta 1380

ccaggaaaag gatggatagc accaagagac ctaaaagaaa tgctagcagg agacttcaga 1440

acaggaaaaa tactagcaca aggattcgga ccagacaacc aaacaccaga ctacacatac 1500

ctaaaaggag acataacagc agcatacagc gcaaaagtaa aagaagtaaa aagaagcttc 1560

ctattcctaa acctaaaaga cgcaaaagta ccagcagcaa tgatagtatt cgacaaagta 1620

gtagcaagca acccagactt caaaaaattc tggctactac acagcataga acaaccagaa 1680

ataaaaggaa accaaataac aataaaaaga acaaaaaacg gagacagcgg aatgctagta 1740

aacacagcac tactaccaga cgcagcaaac agcaacataa caagcatagg aggaaaagga 1800

aaagacttct gggtattcgg aacaaactac acaaacgacc caaaaccagg aacagacgaa 1860

gcactagaaa gaggagaatg gagagtagaa ataacaccaa aaaaagcagc agcagaagac 1920

tactacctaa acgtaataca aatagcagac aacacacaac aaaaactaca cgaagtaaaa 1980

agaatagacg gagacaaagt agtaggagta caactagcag acagaatagt aacattcagc 2040

aaaacaagcg aaacagtaga cagaccattc ggattcagcg tagtaggaaa aggaacattc 2100

aaattcgtaa tgacagacct actaccagga acatggcaag tactaaaaga cggaaaaata 2160

ctatacccag cactaagcgc aaaaggagac gacggagcac tatacttcga aggaacagaa 2220

ggaacataca gattcctaag atag 2244

<210> 3

<211> 856

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Met Gly His His His His His His Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln

1 5 10 15

Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile

20 25 30

Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys

35 40 45

Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln

50 55 60

Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile

65 70 75 80

Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile

85 90 95

Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Gln Gly Ser Gln Thr Lys

100 105 110

Ala Asp Val Val Trp Lys Asp Val Asp Gly Val Ser Met Pro Ile Pro

115 120 125

Pro Lys Thr His Pro Arg Leu Tyr Leu Arg Glu Gln Gln Val Pro Asp

130 135 140

Leu Lys Asn Arg Met Asn Asp Pro Lys Leu Lys Lys Val Trp Ala Asp

145 150 155 160

Met Ile Lys Met Gln Glu Asp Trp Lys Pro Ala Asp Ile Pro Glu Val

165 170 175

Lys Asp Phe Arg Phe Tyr Phe Asn Gln Lys Gly Leu Thr Val Arg Val

180 185 190

Glu Leu Met Ala Leu Asn Tyr Leu Met Thr Lys Asp Pro Lys Val Gly

195 200 205

Arg Glu Ala Ile Thr Ser Ile Ile Asp Thr Leu Glu Thr Ala Thr Phe

210 215 220

Lys Pro Ala Gly Asp Ile Ser Arg Gly Ile Gly Leu Phe Met Val Thr

225 230 235 240

Gly Ala Ile Val Tyr Asp Trp Cys Tyr Asp Gln Leu Lys Pro Glu Glu

245 250 255

Lys Thr Arg Phe Val Lys Ala Phe Val Arg Leu Ala Lys Met Leu Glu

260 265 270

Cys Gly Tyr Pro Pro Val Lys Asp Lys Ser Ile Val Gly His Ala Ser

275 280 285

Glu Trp Met Ile Met Arg Asp Leu Leu Ser Val Gly Ile Ala Ile Tyr

290 295 300

Asp Glu Phe Pro Glu Met Tyr Asn Leu Ala Ala Gly Arg Phe Phe Lys

305 310 315 320

Glu His Leu Val Ala Arg Asn Trp Phe Tyr Pro Ser His Asn Tyr His

325 330 335

Gln Gly Met Ser Tyr Leu Asn Val Arg Phe Thr Asn Asp Leu Phe Ala

340 345 350

Leu Trp Ile Leu Asp Arg Met Gly Ala Gly Asn Val Phe Asn Pro Gly

355 360 365

Gln Gln Phe Ile Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Lys Arg Arg Pro Asp Gly

370 375 380

Gln Ile Leu Ala Gly Gly Asp Val Asp Tyr Ser Arg Lys Lys Pro Lys

385 390 395 400

Tyr Tyr Thr Met Pro Ala Leu Leu Ala Gly Ser Tyr Tyr Lys Asp Glu

405 410 415

Tyr Leu Asn Tyr Glu Phe Leu Lys Asp Pro Asn Val Glu Pro His Cys

420 425 430

Lys Leu Phe Glu Phe Leu Trp Arg Asp Thr Gln Leu Gly Ser Arg Lys

435 440 445

Pro Asp Asp Leu Pro Leu Ser Arg Tyr Ser Gly Ser Pro Phe Gly Trp

450 455 460

Met Ile Ala Arg Thr Gly Trp Gly Pro Glu Ser Val Ile Ala Glu Met

465 470 475 480

Lys Val Asn Glu Tyr Ser Phe Leu Asn His Gln His Gln Asp Ala Gly

485 490 495

Ala Phe Gln Ile Tyr Tyr Lys Gly Pro Leu Ala Ile Asp Ala Gly Ser

500 505 510

Tyr Thr Gly Ser Ser Gly Gly Tyr Asn Ser Pro His Asn Lys Asn Phe

515 520 525

Phe Lys Arg Thr Ile Ala His Asn Ser Leu Leu Ile Tyr Asp Pro Lys

530 535 540

Glu Thr Phe Ser Ser Ser Gly Tyr Gly Gly Ser Asp His Thr Asp Phe

545 550 555 560

Ala Ala Asn Asp Gly Gly Gln Arg Leu Pro Gly Lys Gly Trp Ile Ala

565 570 575

Pro Arg Asp Leu Lys Glu Met Leu Ala Gly Asp Phe Arg Thr Gly Lys

580 585 590

Ile Leu Ala Gln Gly Phe Gly Pro Asp Asn Gln Thr Pro Asp Tyr Thr

595 600 605

Tyr Leu Lys Gly Asp Ile Thr Ala Ala Tyr Ser Ala Lys Val Lys Glu

610 615 620

Val Lys Arg Ser Phe Leu Phe Leu Asn Leu Lys Asp Ala Lys Val Pro

625 630 635 640

Ala Ala Met Ile Val Phe Asp Lys Val Val Ala Ser Asn Pro Asp Phe

645 650 655

Lys Lys Phe Trp Leu Leu His Ser Ile Glu Gln Pro Glu Ile Lys Gly

660 665 670

Asn Gln Ile Thr Ile Lys Arg Thr Lys Asn Gly Asp Ser Gly Met Leu

675 680 685

Val Asn Thr Ala Leu Leu Pro Asp Ala Ala Asn Ser Asn Ile Thr Ser

690 695 700

Ile Gly Gly Lys Gly Lys Asp Phe Trp Val Phe Gly Thr Asn Tyr Thr

705 710 715 720

Asn Asp Pro Lys Pro Gly Thr Asp Glu Ala Leu Glu Arg Gly Glu Trp

725 730 735

Arg Val Glu Ile Thr Pro Lys Lys Ala Ala Ala Glu Asp Tyr Tyr Leu

740 745 750

Asn Val Ile Gln Ile Ala Asp Asn Thr Gln Gln Lys Leu His Glu Val

755 760 765

Lys Arg Ile Asp Gly Asp Lys Val Val Gly Val Gln Leu Ala Asp Arg

770 775 780

Ile Val Thr Phe Ser Lys Thr Ser Glu Thr Val Asp Arg Pro Phe Gly

785 790 795 800

Phe Ser Val Val Gly Lys Gly Thr Phe Lys Phe Val Met Thr Asp Leu

805 810 815

Leu Pro Gly Thr Trp Gln Val Leu Lys Asp Gly Lys Ile Leu Tyr Pro

820 825 830

Ala Leu Ser Ala Lys Gly Asp Asp Gly Ala Leu Tyr Phe Glu Gly Thr

835 840 845

Glu Gly Thr Tyr Arg Phe Leu Arg

850 855

Claims

1.一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶II的方法，其特征在于，包括下列步骤：

S01：选择来自肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)的肝素酶II序列，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，共772aa；

S02：去除信号肽序列，获得肝素酶II的DNA序列，如SEQ ID No.2；

S03：将所述肝素酶II的DNA序列插入带有N端SUMO蛋白标签的pSMART载体质粒；

S05：用SUMO蛋白酶将SUMO标签蛋白从步骤S04所述的SUMO_肝素酶II融合蛋白上切割下来，即获得肝素酶II。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括融合蛋白表达条件的优化步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白的优化条件是融合蛋白在15℃以0.2mmol/l异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。

4.根据权利要求1-3所述的方法，其特征在于，还包括融合蛋白的纯化步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白的纯化步骤采用Ni柱亲和层析方法进行分离纯化。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的SUMO标签蛋白从步骤S04所述的SUMO_肝素酶II融合蛋白上切割下来是包括下列步骤：将所述融合蛋白透析更换缓冲液，加入适量的SUMO蛋白酶，混匀后置于4℃反应过夜，水解后的融合蛋白样本用Ni柱亲和层析方法将带有6个组氨酸片段的SUMO蛋白标签(能结合到Ni柱上)与肝素酶II(不能结合到Ni柱上)分离。

7.权利要求1-5任一项所述的方法制备的SUMO_肝素酶II融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3。

8.权利要求1-5任一项所述的方法制备的肝素酶II。