CN100363497C - 基因重组技术制备pgrp(31-98)片段的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肺癌抗原的人工制备技术,具体为基因重组技术制备PGRP(31-98)片段的方法。该方法用pRSETc载体与PGRP(31-98)基因片段进行连接,采用NheI和HindIII双酶切位点定向克隆,以保证正确的插入连接方向;将连接有目的基因的pRSETc载体转化到广泛用于靶基因表达的大肠杆菌BL21DE3进行重组表达;将表达的PGRP(31-98)产物进行分离、纯化。保证了PGRP(31-98)表达产物的正确、特异、稳定和高效,相对现有技术大大缩短了制备的时间;克服了现有技术中用溴化氰切除表达产物上的TrpE蛋白带来的缺点,有利于大量人工制备工艺的建立和产品的稳定。
Description
技术领域
本发明涉及一种肺癌抗原的人工制备技术,具体为基因重组技术制备PGRP(31-98)片段的方法。
背景技术
应用普通生物化学方法从肺癌组织或血清中提取PGRP(31-98)不仅繁琐,而且由于肺癌组织或血清有限从而给PGRP(31-98)的大量提取带来了一定的难度。日本学者用pATTrp载体、EcoRI和Sa1I两个酶切位点在大肠杆菌中表达了带有17个氨基酸的TrpE融合蛋白的PGRP(31-98)并对其进行了分离、纯化。此表达系统中由于带有TrpE蛋白较长,表达后需要用溴化氰切除。这一切除过程不仅不利于大量制备工艺的进行,而且给后续的分离、纯化带来了一定的难度同时也不利于蛋白质的稳定。国内尚未见基因重组表达制备PGRP(31-98)的文献报道。
发明内容
本发明为解决上述技术存在的缺点,提供了一种新的、既能保证PGRP(31-98)表达正确,又能较简单地进行分离、纯化的基因重组技术和方法。
本发明的技术方案为:基因重组技术制备PGRP(31-98)的方法,用pRSETc载体与PGRP(31-98)基因片段进行连接,采用NheI和HindIII双酶切位点定向克隆,以保证正确的插入连接方向;将连接有目的基因的pRSETc载体转化到广泛用于靶基因表达的大肠杆菌BL21DE3进行重组表达;将表达的PGRP(31-98)产物进行分离、纯化。
与现有技术相比上述技术方案具有以下改进:1、选择pRSETc载体含有强启动子(T7启动子),利用IPTG诱导T7聚合酶,显著提高了PGRP(31-98)目的基因的表达水平;该质粒具有一特殊的结构功能,为表达产物应用Ni柱亲和层析、快速纯化提供了方便、经济的手段。2、大肠杆菌BL21DE3不表达Ompt和Lon蛋白酶,因此表达产物比较稳定,不会被宿主菌蛋白水解酶所降解。3、pRSETc载体在BL21DE3菌株中的高效表达有利于PGRP(31-98)产物的大量制备和应用多种方法进行纯化、鉴定。
本技术方案不仅保证了PGRP(31-98)表达产物的正确、特异、稳定和高效,相对现有技术大大缩短了制备的时间;克服了现有技术中用溴化氰切除表达产物上的TrpE蛋白带来的缺点,有利于大量人工制备工艺的建立和产品的稳定。
附图说明
图1为重组质粒酶切产物琼脂糖凝胶电泳测定图像。
图2为PCR产物琼脂糖凝胶电泳测定图像。
图3为Ni柱亲和层析纯化后的SDS-PAGE电泳图像。
图4为高效液相色谱纯化后SDS-PAGE电泳图像。
图1中,1:pRSETc-PGRP 2:pRSETc-PGRP
图2中,1、2:pRSETc-PGRP 3:阴性对照 4:阳性对照
图3中,1-4:Ni柱后样品 5:标准品1(胰岛素,分子量5,733D)
6:标准品2(细胞色素C,分子量12,327D)
图4中,1-8:高效液相色谱纯化后样品
9:标准品(细胞色素C,分子量12,327D)
具体实施方式
1、重组表达质粒的构建
载体pRSETc质粒经NheI和HindIII双酶切位点37℃双酶切,酶切产物经琼脂糖纯化后回收与纯化的PGRP(31-98)基因共同加入T4 DNA连接酶中,16℃孵育过夜。
2、重组质粒的转化和鉴定
将上述连接产物转化到感受态大肠杆菌BL21DE3,在含氨苄的LB培养基上筛选出阳性克隆。将筛选出的阳性克隆在培养基中进行扩增培养后做如下鉴定:
(1)酶切产物的鉴定
收菌,提取质粒。用限制性核酸内切酶NheI和HindIII双酶切位点37℃双酶切,酶切产物经琼脂糖电泳测定其是否含有PGRP(31-98)基因片段。
(2)PCR产物的鉴定
取1ul的菌液在25ul的PCR反应体系中进行PCR扩增。PCR扩增产物经琼脂糖电泳测定其是否含有PGRP(31-98)基因片段。
(3)PGRP(31-98)基因的测序
将大肠杆菌BL21DE3菌液进行测序,检查是否含有正确读码框架。测序结果该菌液中pRSETc质粒含有正确的PGRP(31-98)基因硷基序列。
3、重组PGRP(31-98)基因的表达和分离、纯化PGRP(31-98)基因
(1)重组PGRP(31-98)基因的表达
选取含有PGRP(31-98)基因的克隆,接种于含氨苄的LB培养基中,振荡培养后收菌。菌液经超声波裂解后,分别取上清、沉淀和全菌进行SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色、凝胶成象系统扫描分析结果。
(2)重组PGRP(31-98)的分离、纯化
应用Ni柱亲和层析分离、纯化重组PGRP(31-98)。用梯度洗脱液进行洗脱并收集样品待检。SDS-PAGE电泳显示经过这一分离可去除大量的杂蛋白,分子量约10.0KD左右。
应用高效液相色谱法进一步分离、纯化重组PGRP(31-98)。收集各峰待检。经SDS-PAGE电泳分析后可见目的蛋白电泳带,纯度95%以上,分子量约在10.0KD左右。
4、重组PGRP(31-98)免疫活性的测定
应用PGRP(31-98)酶联免疫检测试剂盒就重组PGRP(31-98)免疫活性进行了检测。结果表明该蛋白能够和抗-PGRP(31-98)单克隆抗体结合,定量检测浓度为1.299mg/ml。
本发明所述的方法在插入基因的两端设计了双酶切位点,保证了正确的插入方向,重组体一次完成,纯化操作简便、快速,相对现有技术大大缩短了生产制备的时间;表达产物正确、特异、稳定,纯化的重组PGRP(31-98)能与抗-PGRP(31-98)单克隆抗体发生特异反应,证明其具有良好的免疫活性,为制备各种抗体和诊断试剂盒奠定了良好的原料基础。
Claims (3)
1.一种基因重组技术制备PGRP(31-98)片段的方法,其特征在于:该方法用pRSETc载体与PGRP(31-98)基因片段进行连接,采用NheI和HindIII双酶切位点定向克隆,以保证正确的插入连接方向;将连接有目的基因的pRSETc载体转化到广泛用于靶基因表达的大肠杆菌BL21DE3进行重组表达;将表达的PGRP(31-98)产物进行分离、纯化。
2.如权利要求1所述的基因重组技术制备PGRP(31-98)片段的方法,其特征在于:经NheI和HindIII双酶切后的酶切产物是经琼脂糖纯化后回收,与纯化的PGRP(31-98)基因共同加入T4DNA连接酶中进行连接。
3.如权利要求1或2所述的基因重组技术制备PGRP(31-98)片段的方法,其特征在于:表达的PGRP(31-98)产物是经Ni柱亲和层析分离、纯化重组PGRP(31-98)。
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Enzyme immunoassay of immunoreactive progastrin-releasingpeptide(31-98) s tumor marker for small cell lung carcinorna:development evaiuation. Katsumi Aoyagi et al.CLIN.CHEM.,Vol.41 No.4. 1995 * |
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