CN1752212A - 基因重组技术制备pgrp(31－98)片段的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为基因重组技术制备PGRP (31－98)片段的方法，包括用pRSETc载体与PGRP (31－98)基因片段进行连接，采用NheI和HindIII双酶切位点定向克隆，以保证正确的插入连接方向；将连接有目的基因的pRSETc载体转化到广泛用于靶基因表达的大肠杆菌BL21DE3进行重组表达；将表达的PGRP (31－98)产物进行分离、纯化和鉴定。该发明克服了现有技术中用溴化氰切除表达产物上的TrpE蛋白带来的缺点，有利于大量人工制备工艺的建立和产品的稳定。
Description
技术领域
本发明涉及一种肺癌抗原的人工制备技术，具体为基因重组技术大量制备PGRP(31-98)。
背景技术
应用普通生物化学方法从肺癌组织或血清中提取PGRP(31-98)不仅繁琐，而且由于肺癌组织或血清有限从而给PGRP(31-98)的大量提取带来了一定的难度。日本学者用pATTrp载体、EcoRI和SalI两个酶切位点在大肠杆菌中表达了带有17个氨基酸的TrpE融合蛋白的PGRP(31-98)并对其进行了分离、纯化。此表达系统中由于带有TrpE蛋白较长，表达后需要用溴化氰切除。这一切除过程不仅不利于大量制备工艺的进行，而且给后续的分离、纯化带来了一定的难度同时也不利于蛋白质的稳定。国内尚未见基因重组表达制备PGRP(31-98)的文献报道。
发明内容
本发明为解决上述技术存在的缺点，提供了一种新的、既能保证PGRP(31-98)表达正确，又能较简单地进行分离、纯化的基因重组技术和方法。
用pRSETc载体与PGRP(31-98)基因片段进行连接，采用NheI和HindIII双双酶切位点定向克隆，以保证正确的插入连接方向；将连接有目的基因的pRSETc载体转化到广泛用于靶基因表达的大肠杆菌BL21DE3进行重组表达；将表达的PGRP(31-98)产物进行分离、纯化和鉴定。
与现有技术相比上述技术方案具有以下改进：1、选择pRSETc载体含有强启动子(T7启动子)，利用IPTG诱导T7聚合酶，显著提高了PGRP(31-98)目的基因的表达水平；该质粒具有一特殊的结构功能，为表达产物应用Ni柱亲和层析、快速纯化提供了方便、经济的手段。2、大肠杆菌BL21DE3不表达Ompt和Lon蛋白酶，因此表达产物比较稳定，不会被宿主菌蛋白水解酶所降解。3、pRSETc载体在BL21DE3菌株中的高效表达有利于PGRP(31-98)产物的大量制备和应用多种方法进行纯化、鉴定。
本技术方案不仅保证了PGRP(31-98)表达产物的正确、特异、稳定和高效，相对现有技术大大缩短了制备的时间；克服了现有技术中用溴化氰切除表达产物上的TrpE蛋白带来的缺点，有利于大量人工制备工艺的建立和产品的稳定。
附图说明
图1 重组质粒酶切产物琼脂糖凝胶电泳
图2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳
图3 Ni柱亲和层析纯化后的SDS-PAGE电泳
图4 高效液相色谱纯化后SDS--PAGE电泳
图5 与抗-PGRP(31-98)单克隆抗体结合的酶联免疫检测结果
具体实施方式
1、重组表达质粒的构建
载体pRSETc质粒经NheI和HindIII双酶切位点37℃双酶切，酶切产物经琼脂糖纯化后回收与纯化的PGRP(31-98)基因一定比例加入T4DNA连接酶中，16℃孵育过夜。
2、重组质粒的转化和鉴定
将上述连接产物转化到感受态大肠杆菌BL21DE3，在含氨苄的LB培养基上筛选出阳性克隆。将筛选出的阳性克隆在培养基中进行扩增培养后做如下鉴定
(1)酶切产物的鉴定
收菌，提取质粒。用限制性核酸内切酶NheI和HindIII双酶切位点37℃双酶切，酶切产物经琼脂糖电泳测定其是否含有PGRP(31-98)基因片段。
(2)PCR产物的鉴定
取1ul的菌液在25ul的PCR反应体系中进行PCR扩增。PCR扩增产物经琼脂糖电泳测定其是否含有PGRP(31-98)基因片段。
(3)PGRP(31-98)基因的测序
将大肠杆菌BL21DE3菌液进行测序，检查是否含有正确读码框架。测序结果该菌液中pRSETc质粒含有正确的PGRP(31-98)基因硷基序列。
3、重组PGRP(31-98)基因的表达和分离、纯化PGRP(31-98)基因
(1)重组PGRP(31-98)基因的表达
选取含有PGRP(31-98)基因的克隆，接种于含氨苄的LB培养基中，振荡培养后收菌。菌液经超声波裂解后，分别取上清、沉淀和全菌进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色、凝胶成象系统扫描分析结果。
(2)重组PGRP(31-98)的分离、纯化
应用Ni柱亲和层析分离、纯化重组PGRP(31-98)。用梯度洗脱液进行洗脱并收集样品待检。SDS-PAGE电泳显示经过这一分离可去除大量的杂蛋白，分子量约10.0KD左右。
应用高效液相色谱法进一步分离、纯化重组PGRP(31-98)。收集各峰待检。经SDS-PAGE电泳分析后可见目的蛋白电泳带，纯度95％以上，分子量约在10.0KD左右。
4、重组PGRP(31-98)免疫活性的测定
应用PGRP(31-98)酶联免疫检测试剂盒就重组PGRP(31-98)免疫活性进行了检测。结果表明该蛋白能够和抗-PGRP(31-98)单克隆抗体结合(图7)，定量检测浓度为1.299mg/ml。
本发明所述的方法在插入基因的两端设计了双酶切位点，保证了正确的插入方向，重组体一次完成，纯化操作简便、快速，相对现有技术大大缩短了生产制备的时间；表达产物正确、特异、稳定，纯化的重组PGRP(31-98)能与抗-PGRP(31-98)单克隆抗体发生特异反应，证明其具有良好的免疫活性，为制备各种抗体和诊断试剂盒奠定了良好的原料基础。
Claims (4)
1、在基因重组技术制备肺癌抗原PGRP(31-98)时采用pRSETc质粒。
2、在基因重组技术制备肺癌抗原PGRP(31-98)时采用大肠杆菌BL21DE3。
3、在基因重组技术制备肺癌抗原PGRP(31-98)采用NheI和HindIII双酶切位点定向克隆。
4、在制备肺癌抗原PGRP(31-98)时采用Chelating Sepharose Fast Flow Ni柱亲和层析分离、纯化重组PGRP(31-98)。
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