CN102234640A - 重组小分子泛素样修饰物蛋白酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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CN102234640A CN2010101539247A CN201010153924A CN102234640A CN 102234640 A CN102234640 A CN 102234640A CN 2010101539247 A CN2010101539247 A CN 2010101539247A CN 201010153924 A CN201010153924 A CN 201010153924A CN 102234640 A CN102234640 A CN 102234640A
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Abstract

本发明公开了一种重组小分子泛素样修饰物蛋白酶及其制备方法和应用。该重组蛋白酶由GST标签、ULP1P序列和多聚His标签组成，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。本发明重组SUMO蛋白酶识别完整的SUMO标签蛋白序列，并能高效地把SUMO从融合蛋白上切割下来，与EK和TEV等蛋白酶的识别位点相比，该酶切反应有很高的特异性，且在较宽范围的反应环境体系中保持较高的活力。本发明重组SUMO蛋白酶不但具有多聚His标签，便于融合蛋白切割后的亲和层析纯化，还有谷胱甘肽转移酶GST标签，方便蛋白酶的纯化，也增强了酶的稳定性。

Description

重组小分子泛素样修饰物蛋白酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种重组蛋白酶，尤其涉及一种重组小分子泛素样修饰物蛋白酶及其制备方法，本发明还涉及该重组蛋白酶作为工具酶应用于重组蛋白的切割和纯化，属于重组蛋白酶领域。
背景技术
小分子泛素样修饰物(small ubiquitin-related modifier，SUMO)蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶超家族的成员之一，在真核生物体内主要行使两种生理功能：(1)切除SUMO前体C-末端的几个氨基酸残基，以暴露C-末端的Gly-Gly残基使之成为具修饰、转运等功能的成熟SUMO；(2)将SUMO与目的蛋白偶合物水解成SUMO和目的蛋白，这个过程称为去SUMO化。研究资料显示，各种SUMO蛋白酶都含有一个约200aa左右保守的C-末端ULP结构域，该结构域具有催化活性；不同的SUMO蛋白酶有不同的N-末端结构域，正是这种差异将不同的SUMO蛋白酶定位于细胞的不同部分。
在酿酒酵母中有两种SUMO蛋白酶：小分子泛素样特异性蛋白酶1(Ubiquitin-like-specific protease 1，Ulp1)和小分子泛素样特异性蛋白酶2(Ubiquitin-like-specific protease 2，Ulp2)。Ulp1位于核孔复合体(nuclearpore complex)，其主要功能是：(1)将Smt3(SUMO在酿酒酵母中的同源物)C-末端序列(-GGATY)处理成成熟形式(-GG)；(2)将Smt3从被修饰蛋白的赖氨酸ε-氨基上解开，Ulp1以上这些重要功能在酵母G2-M细胞周期进程中是必需的，缺失Ulp1表达的酵母不能生存。Ulp2则主要位于细胞核内，不对SUMO前体进行酶切，似乎对一套特别的SUMO-底物蛋白偶合物去SUMO化，缺乏Ulp2对酵母不致命，但是Ulp2在维持酵母正常的形态、核分裂、胞质分裂，以及对DNA损伤的修复中是必需的。
酿酒酵母中的Ulp1是由621氨基酸残基组成的蛋白质多肽。至少含有两个结构域，一个是保守的C-端蛋白酶折叠区域(432～621aa)；另一个是保守性弱的N-端结构域(1～432aa)。通过序列相似性对比、结构预测和选择性的蛋白水解实验发现，Ulp1中第403aa到621aa活性片段Ulp1p表现出具有全长的Ulp1酶切活性，并能够水解以α-氨基连接的SUMO-目的蛋白偶合物。
研究人员利用Ulp1p与SUMO/Smt3相互作用的晶体结构发现了Ulp1p对SUMO/Smt3的识别主要依据底物的三级结构，而不像其它蛋白酶只识别特定的氨基酸序列；Ulp1p的水解活性对SUMO/Smt3-蛋白偶合物具有高效性和特异性，这些独特的优点使得Ulp1可以作为一种新的工具酶用于重组蛋白的切割和纯化。
现有的用于从融合蛋白中切割SUMO的蛋白酶主要存在着特异性较差、稳定低、不能在较宽范围的反应环境体系中保持高活力等缺陷，有待改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种特异性好、稳定性高、能在较宽范围的反应环境体系中保持高活力的重组小分子泛素样修饰物蛋白酶；
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种制备上述重组小分子泛素样修饰物蛋白酶的方法；
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种重组小分子泛素样修饰物蛋白酶，由GST标签、ULP1P序列和多聚His标签组成，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示；
GST标签内含2个二硫键，提高了整个重组蛋白酶的稳定性；多聚His标签和SUMO拥有相同标签，利于切割后蛋白纯化，减少蛋白损失。
编码该重组小分子泛素样修饰物蛋白酶的核苷酸序列为SEQ IDNO：1所示；含有该核苷酸序列的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞也当然属于本发明的保护范畴之内。
本发明还提供一种制备上述重组小分子泛素样修饰物蛋白酶的方法，包括：将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列与原核或真核表达载体可操作性的相连接，得到重组表达载体；将该重组表达载体转化到宿主细胞中，诱导蛋白表达，收集，纯化，即得。
其中，本发明通过大量的试验发现，当采用低温慢速(温度为20℃，转速为55r/min)，IPTG浓度为0.05mmol/L的条件下过夜诱导，相比于常温和常速的诱导表达条件，可显著提高重组蛋白的可溶性及产量。
本发明重组SUMO蛋白酶识别完整的SUMO(Small Ubiquitin-likeModifier)标签蛋白序列，能高效地把SUMO从融合蛋白上切割下来。与EK和TEV等蛋白酶的识别位点相比，由于其识别序列长，所以SUMO蛋白酶酶切反应有很高的特异性，且在较宽范围的反应环境体系中保持较高的活力，例如温度(4-30℃)、pH(5.5-9.5)等。本发明重组SUMO蛋白酶不但具有多聚His标签，便于融合蛋白切割后的亲和层析纯化，还有谷胱甘肽转移酶GST标签，方便蛋白酶的纯化，也增强了酶的稳定性。
附图说明
图1重组表达质粒pGEX-6p-1-His的构建过程图。
图2低温慢速诱导条件下重组蛋白表达结果。
图3常温常速诱导条件下重组蛋白表达结果。
图4改造前Ulp1p(无GST)不同pH值酶切效果；M：蛋白质分子量标准；1-5：Ulp1p(无GST)切割融合蛋白SUMO-IL-1β的酶切缓冲液pH值分别为6，7，8，9，10；6：融合蛋白SUMO-IL-1β未经切割对照。
图5改造后Ulp1p-GST在不同pH值酶切效果；M：蛋白质分子量标准；1-5：Ulp1p-GST切割融合蛋白SUMO-IL-1β的酶切缓冲液pH值分别为6，7，8，9，10；6：融合蛋白SUMO-IL-1β未经切割对照。
图6Ulp1p改造前后在4℃下酶切效果对比；M：蛋白质分子量标准；1：融合蛋白SUMO-IL-1β未经切割对照；2：利用改造前的Ulp1p(无GST)在4℃下切割融合蛋白SUMO-IL-1β；3：利用改造后的Ulp1p-GST在4℃下切割融合蛋白SUMO-IL-1β。
图7Ulp1p改造前后在16℃下酶切效果对比；M：蛋白质分子量标准；1：融合蛋白SUMO-IL-1β未经切割对照；2：利用改造前的Ulp1p(无GST)在16℃下切割融合蛋白SUMO-IL-1β；3：利用改造后的Ulp1p-GST在16℃下切割融合蛋白SUMO-IL-1β。
图8Ulp1p改造前后在30℃下酶切效果对比；M：蛋白质分子量标准；1：融合蛋白SUMO-IL-1β未经切割对照；2：利用改造前的Ulp1p(无GST)在30℃下切割融合蛋白SUMO-IL-1β；3：利用改造后的Ulp1p-GST在30℃下切割融合蛋白SUMO-IL-1β。
图9GST-Ulp1p切割SUMO融合蛋白的SDS-PAGE电泳分析；M：蛋白质分子量标准；1：SUMO-TNFα未切割；2：SUMO-TNFα酶切后产物；3：SUMO-FGF-21酶切后产物；4：SUMO-FGF-21未切割；5：GST-Ulp1p；6：SUMO-IL-1β未切割；7：SUMO-IL-1β酶切后产物。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1本发明重组SUMO蛋白酶(Ulp1p-GST)的制备和纯化
1、重组表达质粒的构建
将ULP1P核苷酸序列和多聚His标签核苷酸序列连接在一起后用BamH I和Xho I进行酶切，将其亚克隆到质粒pGEX-6p-1，得到重组表达质粒pGEX-6p-1-His；其构建过程见图1.
2、转化
rosetta感受态细胞冰上融化，加入1μl重组表达质粒，冰上放置30分钟，42℃热激50秒，加入200-300μl液体LB(无AMP)，37℃摇1小时后涂板，37℃过夜培养。
3、表达
(1)活化：挑取单菌落于10-20mlLB中，37℃振摇过夜。
(2)二次活化：1/100接菌(500ml接5ml)，37℃振摇2-3小时至OD600＝0.2-0.4。
(3)诱导：
设置两组，分别按照以下诱导条件进行诱导：
试验组：IPTG(1M)：0.05mmol/l(500ml菌加25μl)；
温度为20℃；
转速：55r/min；
振摇时间：12小时；
对照组：常温常速(温度为37℃；转速为100r/min)，振摇时间：12小时；IPTG浓度为0.05mmol/L(500ml菌加25μl)；
试验组的重组蛋白的SDS-PAGE的电泳结果为图2；对照组的重组蛋白的SDS-PAGE的电泳结果为图3；从试验结果可见，采用试验组的诱导条件可显著提高蛋白的可溶性和表达产量。
(4)收菌：4℃，4000rpm，离心30分钟，用lysis buffer冲悬，再离心，弃上清，菌于-80度冻存。
4、纯化
1、手提：
(1)融菌：将菌冰上融化，加溶菌酶(500ml菌＝5-10ml lysisbuffer，1ml lysis buffer＝1mg溶菌酶)和lysis buffer后冰上放置30分钟-1小时。
(2)超声破碎：500ml菌大约20分钟；
(3)冰上柱上结合1小时，1400r离心；
(4)洗杂蛋白：每次5-6ml wash buffer，洗15遍；
(5)洗脱：每次2-3ml elution buffer，洗6遍；
(6)透析：PBS透析过夜；
2、AKTA纯化。
试验例1本发明重组SUMO蛋白酶(Ulp1p-GST)的应用效果试验
一、试验材料
1、供试样品：实施例1所制备和纯化的重组SUMO蛋白酶(Ulp1p-GST)；
2、对照样品：Ulp1p蛋白；
二、试验方法及结果
(一)、分别将等量的供试样品蛋白和Ulp1p蛋白分别置于pH值6，7，8，9，10溶液中切割底物蛋白，由表1中可以看出，Ulp1p蛋白在pH值为6，7，8，9的时候其酶切效率有明显的下降，而供试样品蛋白在6，7，8，9的时候很好的保持了酶切活性(图4、图5)。
表1不同pH值条件下对SUMO蛋白酶活性影响
  pH6   pH7   pH8   pH9   pH10
  供试样品   90.58±0.04％   89.24±0.03％   83.17±0.01％   79.31±0.05％   60.03±0.04％
  对照样品   80.52±0.03％   75.22±0.03％   70.05±0.04％   69.56±0.04％   58.32±0.03％
(二)、分别将等量的供试样品蛋白和Ulp1p蛋白分别置于温度4℃，16℃，30℃的环境中切割底物蛋白，由表2中可以看出，无标签的Ulp1p蛋白在4℃，16℃，30℃活性低于供试样品蛋白(图6、图7和图8)。
表2不同温度条件下对SUMO蛋白酶活性影响
  4℃(过夜)   16℃(5小时)   30℃(1小时)
  供试样品   89.15±0.06％   85.35±0.15％   92.26±0.04％
  对照样品   79.31±0.07％   73.26±0.12％   75.42±0.03％
(三)供试样品蛋白酶切SUMO融合蛋白的试验结果见图9。试验结果说明，本发明重组SUMO蛋白酶能高效地把SUMO从融合蛋白上切割下来。
                                    KLPI100060_2
序列表
<110>东北农业大学
<120>重组小分子泛素样修饰物蛋白酶及其制备方法和应用
<130>KLPI08078
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1368
<212>DNA
<213>Artifical sequence
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1368)
<223>
<400>1
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Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
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act cga ctt ctt ttg gaa tat ctt gaa gaa aaa tat gaa gag cat ttg   96
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
        20            25             30
tat gag cgc gat gaa ggt gat aaa tgg cga aac aaa aag ttt gaa ttg  144
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
     35             40            45
ggt ttg gag ttt ccc aat ctt cct tat tat att gat ggt gat gtt aaa  192
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
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Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65            70              75               80
atg ttg ggt ggt tgt cca aaa gag cgt gca gag att tca atg ctt gaa   288
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Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
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Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
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Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
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gtt tgt ttt aaa aaa cgt att gaa gct atc cca caa att gat aag tac    576
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
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Asp Asp Gln Val Gln Lys Ala Leu Ala Ser Arg Glu Asn Thr Gln Leu
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Tyr Ile Glu Lys Ser Thr Pro Asn Thr Val Ala Phe Asn Ser Phe Phe
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Lys Lys Thr Ile Gly Tyr Val Asp Ser Leu Ser Asn Gly Pro Asn Ala
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<211>456
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<400>2
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  130            135            140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145             150            155            160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
            165           170            175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
        180             185              190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
     195             200             205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu
  210             215             220
Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Leu Val Pro Glu Leu Asn Glu Lys Asp
225            230            235             240
Asp Asp Gln Val Gln Lys Ala Leu Ala Ser Arg Glu Asn Thr Gln Leu
           245            250             255
Met Asn Arg Asp Asn Ile Glu Ile Thr Val Arg Asp Phe Lys Thr Leu
        260            265              270
Ala Pro Arg Arg Trp Leu Asn Asp Thr Ile Ile Glu Phe Phe Met Lys
      275            280            285
Tyr Ile Glu Lys Ser Thr Pro Asn Thr Val Ala Phe Asn Ser Phe Phe
  290              295            300
Tyr Thr Asn Leu Ser Glu Arg Gly Tyr Gln Gly Val Arg Arg Trp Met
305            310            315             320
Lys Arg Lys Lys Thr Gln Ile Asp Lys Leu Asp Lys Ile Phe Thr Pro
           325              330           335
Ile Asn Leu Asn Gln Ser His Trp Ala Leu Gly Ile Ile Asp Leu Lys
         340            345            350
Lys Lys Thr Ile Gly Tyr Val Asp Ser Leu Ser Asn Gly Pro Asn Ala
     355              360            365
Met Ser Phe Ala Ile Leu Thr Asp Leu Gln Lys Tyr Val Met Glu Glu
  370             375            380
Ser Lys His Thr Ile Gly Glu Asp Phe Asp Leu Ile His Leu Asp Cys
385             390             395            400
Pro Gln Gln Pro Asn Gly Tyr Asp Cys Gly Ile Tyr Val Cys Met Asn
           405            410             415
Thr Leu Tyr Gly Ser Ala Asp Ala Pro Leu Asp Phe Asp Tyr Lys Asp
        420             425            430
Ala Ile Arg Met Arg Arg Phe Ile Ala His Leu Ile Leu Thr Asp Ala
      435            440             445
Leu Lys His His His His His His
  450             455

Claims (9)

1.一种重组小分子泛素样修饰物蛋白酶，由GST标签、ULP1P序列和多聚His标签组成。
2.按照重组小分子泛素样修饰物蛋白酶，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。
3.编码权利要求1所述重组小分子泛素样修饰物蛋白酶的核苷酸序列。
4.按照权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于：其为SEQ IDNO：1所示。
5.含有权利要求4所述核苷酸序列的重组表达载体。
6.含有权利要求5所述重组表达载体的宿主细胞。
7.一种制备权利要求2所述重组小分子泛素样修饰物蛋白酶的方法，包括：将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列与原核或真核表达载体可操作性的相连接，得到重组表达载体；将该重组表达载体转化到宿主细胞中，诱导蛋白表达，收集，纯化，即得。
8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的诱导条件包括：在诱导温度为20℃，转速为55r/min，IPTG浓度为0.05mmol/L的条件下过夜诱导。
9.权利要求1或2所述重组小分子泛素样修饰物蛋白酶作为工具酶的用途。
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