CN107574138A - 一株大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

一株大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株及其构建方法与应用，所述大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株，即Escherichia coliNissle 1917(Tum‑5),保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2017345。该抗肿瘤靶向工程菌含有抗肿瘤分泌表达载体pET28a‑Pvhb‑SUMO‑Tum 5，能可溶性表达和分泌性表达肿瘤抑素Tumstatin的抗肿瘤血管生成活性区域Tum‑5。本发明还包括所述大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法与在制备抗肿瘤药物中的应用。该株抗肿瘤靶向工程菌对荷B16黑色素瘤C57BL/6小鼠的肿瘤抑制率高达52.95%。

Description

一株大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一株大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株及其构建方法与在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

细菌用于癌症治疗具有悠久的历史。虽然细菌治疗肿瘤的临床机制尚不清楚，但是细菌在治疗某些疾病，特别是治疗癌症方面起着非常重要的作用。传统化疗和放疗治疗通常不能完全消除肿瘤，这归因于实体瘤中肿瘤厌氧微环境的肿瘤细胞。大多数哺乳动物正常组织中的氧浓度为而在肿瘤组织中，坏死区边界处的基质附近正常浓度逐渐降低至缺氧状态(O₂<0.02％)。一系列研究表明，癌症治疗基因的肿瘤靶向表达可能是癌症治疗中有效和安全的方法。许多细菌，如沙门氏菌、大肠杆菌、梭菌、双歧杆菌和李斯特菌能够优先在肿瘤中积累。

肠道益生菌Escherichia coli Nissle 1917(EcN)已经在多个国家被用来治疗腹泻和结肠炎溃疡(Gut.2004；53(11):1617-23)。Stritzker J等研究表明，EcN可以在肿瘤低氧区域特异性定殖(Int J Med Microbiol.2007；297(3):151-62)。基于实体瘤组织的缺氧微环境和 EcN定殖的特点，应用EcN作为传输载体传送抗肿瘤活性蛋白至肿瘤区，在未来癌症治疗中将是一个有前景的肿瘤治疗途径。

细菌治疗肿瘤存在一定的缺陷：使用活菌直接治疗患者时，由于某些细菌的致病性和靶向性差可能会导致机体产生严重的感染或治疗效果差，经济性也欠佳。因此，构建安全性好和靶向性高的抗肿瘤靶向工程菌株已成为细菌治疗肿瘤亟需解决的问题。

大肠杆菌EcN虽然对实体瘤具有高度靶向性，能在肿瘤低氧区域特异性定殖，可作为传输载体传送抗肿瘤活性蛋白至肿瘤区域；但是真核抗肿瘤蛋白在原核细菌中表达时存在困难：蛋白可溶性表达情况欠佳、容易形成包涵体蛋白、难以获得具有正常空间结构的活性蛋白。所以，真核抗肿瘤蛋白如何实现在原核细胞中的有效表达也是细菌治疗肿瘤应用中需要解决的难点。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，克服现有技术存在的上述缺陷，在大肠杆菌中高效表达真核抗肿瘤蛋白Tum-5，提供一株肿瘤靶向性较高、经济性较好和安全性高的大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株及其构建方法与在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案如下。

本发明之大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株，即Escherichia coli Nissle 1917(Tum-5),缩写为EcN(Tum-5),于2017年6月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2017345。

本发明之大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法如下：

(一)利用PCR拼接获得Tum-5基因

根据GenBank中登录的登记号为AF258351.1的Homo sapiens 的Tumstatin蛋白的基因序列，查找出编码Tum-5蛋白所对应的核苷酸序列，设计2条以上的寡核苷酸链，便于进行PCR拼接以获得 Tum-5基因；

(二)Tum-5诱导表达载体的构建及鉴定；

(三)Tum-5蛋白的诱导表达、纯化及鉴定；

(四)大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株EcN(Tum-5)的构建；

(五)EcN在荷瘤小鼠体内的定殖情况分析；

(六)大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株EcN(Tum-5)的抗肿瘤分析；

(七)细菌的安全性检测。

所述大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株能可溶性表达和分泌性表达肿瘤抑素Tumstatin的抗肿瘤血管生成活性区域Tum-5，并能特异性地靶向肿瘤低氧区域。

本发明利用GenBank数据库查找Tum-5基因序列，利用PCR拼接获得了Tum-5全长序列，将Tum-5克隆到四个不同的表达载体上后，转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。蛋白可溶性分析结果表明，Tum-5蛋白在SUMO标签、IF2标签存在的情况下，以部分可溶的形式存在。

进一步，步骤(四)中，所述构建的步骤是，将低氧启动子Pvhb、 SUMO促溶标签、抗血管生成因子Tum-5，通过重叠PCR技术获得包含三段基因序列的PCR产物，再利用酶切连接的方法将该PCR产物连接到载体pET-28a，电击转化Escherichia coli Nissle 1917，即得到大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株EcN(Tum-5)。

将本发明的大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌EcN(Tum-5)发酵后菌体和培养液上清进行SDS-PAGE检测和Western blot检测，结果表明， Tum-5已成功在EcN中实现可溶性表达和分泌性表达。

将野生型EcN注射于荷B16黑色素瘤C57BL/6小鼠后，活体成像系统观察到EcN能特异性地在实体瘤区域定殖，其它器官中的细菌能及时被动物机体清除。免疫组化结果表明，Tum-5蛋白成功在实体瘤中表达。

用本发明方法构建的大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌EcN(Tum-5)治疗荷黑色素瘤小鼠，结果表明，该抗肿瘤靶向工程菌能显著地抑制肿瘤的生长，对C57BL/6荷瘤小鼠的肿瘤抑制率高达52.95％，且对正常小鼠基本无毒性作用。

本发明大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株具备以下优点：

1、携带低氧表达载体pET28a-Pvhb-SUMO-Tum 5，能可溶性表达和分泌表达抗血管生成因子Tum-5；

2、本发明大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌EcN(Tum-5)能将抗血管生成因子Tum-5传递至实体瘤，并能高效表达该活性蛋白，发挥良好的抗肿瘤疗效。

微生物保藏情况说明

本发明之大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌，即Escherichia coli Nissle 1917(Tum-5),缩写为EcN(Tum-5)，于2017年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCCTCC，地址：中国武汉武汉大学保藏)，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2017345。

附图说明

图1是拼接含Tum-5基因序列的PCR产物电泳图谱；

图2是大肠杆菌GB2005中四种诱导表达载体的构建及鉴定图谱；

图3是SDS-PAGE检测Tum-5蛋白的可溶性表达图谱；

图4是SDS-PAGE检测Tum-5的脱盐产物图谱；

图5是Western Blot检测Tum-5蛋白图谱；

图6是Tum-5蛋白肽段FTTMPFLFCNVNDVCNFASR二级质谱图；

图7是重组质粒pET28a-Pvhb-SUMO-Tum 5的构建流程图；

图8是PCR扩增Pvhb和SUMO-Tum 5片段图谱；

图9是重叠PCR扩增Pvhb-SUMO-Tum 5片段图谱；

图10是E.coli Top10中pET28a-Pvhb-SUMO-Tum 5的PCR鉴定图谱；

图11是SDS-PAGE检测SUMO-Tum 5蛋白在本发明工程菌中的表达情况图谱；

图12是Western blot检测SUMO-Tum 5蛋白在工程菌中的表达情况图谱；

图13是小动物活体成像系统观察EcN在荷黑色素瘤C57BL/6小鼠中的定位情况图谱；

图14是EcN在荷B16黑色素瘤C57BL/6小鼠脏器的分布情况图谱；

图15是免疫组化检测Tum-5在小鼠肿瘤组织中的表达情况图谱；

图16是抗肿瘤靶向菌EcN(Tum-5)对荷黑色素瘤C57BL/6小鼠肿瘤大小和重量的影响图谱；

图17是利用HE染色观察细菌对小鼠肿瘤和肝肾脾的影响图谱以及 CD31在不同处理的小鼠肿瘤组织中的表达情况图谱。

图18是抗肿瘤靶向菌EcN(Tum-5)对荷黑色素瘤C57BL/6小鼠体重和肝肾脾的重量影响图谱。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。

(一)利用PCR拼接获得Tum-5基因

本发明所用菌株和质粒如表1所示，所用引物如表2所示。

表1 本发明所用菌株和质粒

表2 本发明所用引物

首先以Tum 5-M为模板，Tum 5-A-F和Tum 5-A-R为上下游引物，进行第一轮PCR,获得138bp的片段；再以该138bp的片段为模板，Tum 5-B-F和Tum 5-B-R为引物，进行第二轮PCR，获得214 bp的片段；接下来以该214bp的片段为模板，Tum 5-C-F和Tum 5-C-R 为引物，进行第三轮PCR，获得258bp的片段；最后以该258bp的片段为模板，Tum 5-F-Nco I或Tum 5-F-Bam H I和Tum 5-R-Xho I为引物，PCR获得282bp的Tum-5基因片段(如图1所示)；

扩增反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。 PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测；

(二)Tum-5诱导表达载体的构建及鉴定

将Tum-5PCR产物与不同载体分别经双酶切后16℃连接过夜，构建以下四个表达载体：pET-28a-Tum 5，pET-22b-Tum 5，pSmart-I-Tum 5(载体上含有SUMO促溶标签蛋白)，pSmart-II-Tum 5(载体上含有IF2 domain I促溶标签蛋白)；具体步骤如下：

将含有载体的大肠杆菌接种于20mL LB培养基中，37℃培养过夜后利用碱裂解法提取质粒。将PCR产物和质粒pET-28a、pET-22b 分别进行Nco I、Xho I双酶切或将PCR产物和pSmart-I、pSmart-II 经Bam H I、Xho I双酶切。按Tum-5片段与相应的载体连接过夜后热转E.Coli GB2005，涂布含卡那霉素(50μg/mL)或氨苄霉素(100 μg/ml)的LB固体平板，37℃倒置培养过夜。从平板上挑取转化子接种到液体培养基培养后，对重组质粒进行PCR鉴定、双酶切鉴定 (如图2所示)，挑取阳性转化子送至上海生物工程有限公司(以下简称“上海生工”)进行测序鉴定；

(三)目的蛋白的诱导表达、纯化及鉴定

1、Tum-5蛋白的可溶性分析

将测序正确的重组质粒电转入E.coli BL21(DE3),获得诱导表达菌株，分别命名为BL21(DE3)/pET-28a-Tum 5，BL21 (DE3)/pET-22b-Tum 5，BL21(DE3)/pSmart-I-Tum 5，BL21(DE3)/ pSmart-II-Tum 5。将上述四种菌株37℃培养过夜活化后，按1％v/v 接种量转接到20ml LB液体培养基，37℃培养1.5-2h后待OD600 值达到0.4-0.6，加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG，另设不加IPTG 作为对照，诱导4h后离心收集菌体，用双蒸水将菌体洗涤3次后加入适量的Ni-Native-0缓冲液(pH 8.0)重悬，200W、3s、3s冰浴超声处理99次，12000rpm，20min离心收集菌体超声后的上清和沉淀，分别取样进行SDS-PAGE检测，以确定Tum-5在pET-28a，pET-22b， pSmart-I，pSmart-II这四个载体上的可溶性表达情况(如图3所示)；

2、重组Tum-5蛋白的纯化

将IPTG诱导表达后的菌体加入适量的Ni-Native-0后超声破碎离心收集上清液，用0.22μm滤膜过滤上清液后进行Ni-NTA柱纯化。去除柱中的20％的无水乙醇，用5-10倍柱体积的无菌水冲洗 Ni柱；用5-10倍柱体积的Ni-Native-0平衡Ni柱，放置待用；将过滤后的蛋白上柱，盖上盖子，静置20min让蛋白与Ni柱充分结合；收集上样前的蛋白和流穿蛋白，以便进行SDS-PAGE确定蛋白的挂柱情况；分别用5倍柱体积的Ni-Native-20、50、100、250、500咪唑的结合缓冲液洗脱，收集各管洗脱液，SDS-PAGE检测；通过 SDS-PAGE结果可以判断蛋白被洗脱下来的合适的咪唑浓度；收集目的蛋白洗脱液通过透析除盐，用超滤离心管将透析后的蛋白浓缩，利用SDS-PAGE和Western blot检测Tum-5蛋白的脱盐产物(如图4 和图5所示)，并用Bradford法测定蛋白，-80℃保存；

3、Tum-5蛋白的鉴定

用手术刀在SDS-PAGE胶上切下目的条带进行胶内酶解，所获得的酶解肽段利用串联质谱正离子模式检测，并采用Sequest搜索引擎进行蛋白质数据库搜索匹配的肽段(如图6所示)。

(四)低氧表达载体的构建

以pSmart-I-Tum 5质粒DNA为模板，SUMO-F和Tum 5-R-Xho I为引物扩增SUMO-Tum5片段(如图8所示)；以pET-Pvhb-asp (本实验室保存)为模板，VHB-F-Apa I和VHB-R-SUMO为引物扩增Pvhb片段(如图8所示)；回收SUMO-Tum 5和Pvhb片段，以此为模板，以VHB-F-ApaI和Tum 5-R-Xho I为引物，采用重叠PCR 扩增得到Pvhb-Pvhb-SUMO-Tum 5片段(如图9所示)。扩增程序为： 94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸10min(质粒构建流程图如图7所示)。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测；

将回收后的Pvhb-SUMO-Tum 5 PCR产物与pET-28a经过Apa I+Xho I双酶切后，用T4 DNA ligase 16度连接过夜，热转E.Coli GB2005。将连接产物涂布于含Kan(50μg/mL)的LB平板，37℃倒置培养过夜。挑取转化子提取质粒，用Bgl II+Xho I进行酶切鉴定以获取阳性转化子(如图10所示)，并送去上海生工测序；

(五)构建表达Tum-5的肿瘤靶向菌

取-80℃保藏的E.coli Nissle1917从菌保液中划线至LB固体培养基上，挑取单克隆到LB液体培养基中培养后，转接40μl到1.5ml Ep管中，37℃，850rpm震荡培养2h，提前预冷电转杯和无菌水； 4℃，8000rpm离心5min收集菌体，用预冷的无菌水将菌体洗涤 3次后，留100μl无菌水重悬菌体，加入5μl的 pET28-Pvhb-SUMO-Tum 5质粒吹打混匀后吸出加入预冷的电转杯中，1250v电击。用1ml LB液体培养基洗涤电转杯，转入Ep管中， 37℃复苏1h，离心收集菌体，涂布于卡那霉素平板(50μg/mL)， 37℃培养过夜。挑取转化子，提质粒酶切鉴定，获得阳性转化子EcN (Tum-5)；

(六)Tum-5蛋白在EcN中的可溶性表达和分泌性表达分析

将EcN(Tum-5)在LB培养基中培养过夜，按2％v/v接种量转接到新鲜的LB液体培养基，培养10h后，8000rpm离心10min，得到此工程菌菌体和上清，取1ml菌体用双蒸水洗涤后进行 SDS-PAGE分析；以EcN和EcN(pET-28a)为对照，离心收集的菌体用双蒸水洗涤3次后，重悬在PBS(pH 7.4)中，超声破碎菌体后离心分别获得菌体沉淀和菌体上清；细菌培养上清液加入3倍体积的含 10％的TCA的丙酮沉淀蛋白，用90％的丙酮洗涤沉淀，加入5×SDSloading buffer制备样品(如图11所示)；通过Western blot检测Tum-5 在EcN中的可溶表达和分泌表达情况(如图12所示)；

(七)小鼠黑色素瘤B16荷瘤小鼠模型的建立

本研究中的动物实验严格遵守国际实验动物福利伦理标准，并在湖南师范大学动物伦理委员会监督下执行。6-8周龄的C57BL/6SPF 雌性小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。小鼠饲养于SPF 环境的动物房约3-7天使其适应新环境。培养B16细胞，待其铺满培养皿底70-80％后用0.25％胰酶消化，每皿加入2mL细胞完全培养基终止消化，1000rpm离心5min，弃上清，用PBS将细胞重复洗涤 3次以除去胎牛血清，用不含胎牛血清的细胞培养基将细胞重悬后计数，将细胞浓度调整成1×10⁶个/mL，置于冰上待用。1×10⁵/100μlB16F10细胞被注射于靠近小鼠头部右侧的背部靠腋窝位置，构建荷瘤小鼠模型。

(八)EcN(Tum-5)在荷瘤小鼠体内的定植情况分析

将过夜活化的EcN(pET-28a-LuxCDABE)转接到LB培养基培养3h后，用无菌PBS将菌体洗涤三次，将菌液用无菌PBS稀释至 5×10⁶CFU/100μl菌体；荷瘤小鼠建模10天后，当小鼠肿瘤长至约 100mm³时，将EcN(Lux)按5×10⁶/100μl的量通过腹腔注射荷瘤小鼠；在注射细菌后12h、1天、3天、4天、5天、7天不同的时间点，用异氟烷处理小鼠使其昏迷后，通过小动物活体成像系统观察细菌在小鼠体内的分布情况(如图13所示)。在1day、7day后处死小鼠，分离小鼠的肿瘤、肝、肾、脾，利用小动物活体成像系统观察细菌在各组织的分布情况(如图14所示)。

(九)工程菌的抗肿瘤分析

建模7-10天后，当小鼠肿瘤长至100mm³时，将荷瘤小鼠随机分为4组。将EcN，EcN(28a)，EcN(Tum-5)过夜活化，第二天按2％ v/v接种量转接至LB培养基，37℃培养3h，离心收集菌体，用无菌PBS洗涤菌体三次后将菌液浓度稀释至5×10⁶CFU/100μl(每0.1 个OD₆₀₀值代表1.0×10⁸CFU)。PBS组、EcN组、EcN(28a)组、EcN (Tum-5)组的小鼠每六天通过腹腔注射100μl的无菌PBS,5×10⁶ CFU/100μl EcN,5×10⁶CFU/100μl EcN(28a)，5×10⁶CFU/100μlEcN(Tum-5)。实验期间每两天对各组小鼠进行称重(称重结果如图 18B所示)，并用千分游标卡尺测量，记录小鼠肿瘤最长径和垂直最大直径(如图16所示)。

试验结束后处死老鼠，分离各组小鼠的肿瘤、肝、肾、脾后称重(称重结果如图18A所示)。各组小鼠的肿瘤组织经4％多聚甲醛固定用于H&E染色(如图17A所示)、免疫组化(如图15所示) 和免疫荧光(如图17B所示)。并根据公式计算出肿瘤体积和肿瘤抑制率，即肿瘤体积：V＝ab²/2(公式中，V表示肿瘤体积，肿瘤最长径，b为肿瘤垂直方向的最大横径，单位mm³)；肿瘤抑制率＝(对照组瘤体积-试验组瘤体积)/对照组瘤体积×100％或(对照组瘤重- 实验组瘤重)/对照组瘤重×100％(如表3所示)。

表3 荷B16黑色素瘤C57BL/6小鼠肿瘤体积和重量的比较

本发明大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌EcN(Tum-5)与现有的抗肿瘤药物相比具有以下优点：

(1)抗肿瘤效果：大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌EcN(Tum-5)对荷黑色素瘤小鼠有明显的抗肿瘤作用。试验表明，对肿瘤体积和重量的抑制率分别达到52.95％和48.43％。

(2)没有任何毒副作用：荷瘤小鼠注射大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌 EcN(Tum-5)后，与其它处理组相比，小鼠的体重、肝脾重量和组织形态学都没有任何明显的变化。

(3)对环境的安全性：大肠杆菌Nissle 1917为肠道益生菌，已用于治疗腹泻及其他胃肠道疾病，对环境是安全的。

序列表

<110> 湖南师范大学

<120>一株大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株及其构建方法与应用

<140>

<141>

<160> 3

<210> 1

<211> 261

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Tum-5全长序列

<400> 1

Ttttcttttct ttttgtaca aggaAatcaa Cgagcccacg gacaaGacct Tggaactctt 60

Ggcagctgcc tGcagcgatt tAccacaatg ccattcttat tctgcAatgt Caatgatgta 120

Tgtaattttg Catctcgaaa Tgattattca Tactggctgt

CaacaCcagc tctgatgcca 180

Atgaacatgg ctcccattac tggca gagcC Cttgagcctt

atataAgcaG atgcactgtT 240

tgtgaaggtC Ctgcgatcgc c 261

<210> 2

<211> 142

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 低氧启动子

<400> 2

TAGCTTACAG GACGCTGGGG TTAAAAGTAT TTGAGTTTTG

ATGTGGATTA AGTTTTAAGA 60

GGCAATAAAG ATTATAATAA GTGCTGCTAC ACCATACTGA

TGTATGGCAA AACCATAATA 120

ATGAACTTAA AGAGGAAGAT AT 142

<210> 3

<211> 492

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SUMO促溶标签序列

<400> 2

Atgacagatg Taacgattaa Aacgctggcc Gcagagcgac

Agacctccgt Ggaacgcctg 60

Gtacagcaat Ttgctgatgc Aggtatccgg Aagtctgctg

Acgactctgt Gtctgcacaa 120

Gagaaacaga Ctttgattga cCacctgaat Cagaaaaatt

CaggcccggA Caaattgacg 180

Ctgcaacgta Aaacacgcag Cacccttaac Attcctggta

CcggtggaaA aagcaaatCg 240

Gtacaaatcg Aagtccgcaa Gaaacgcacc Tttgtgaaac

Gcgatccgca Agaggctgaa 300

Cgccttgcag Cggaagagca Agcgcagcgt Gaagcggaag

agCaagcccg tcgtGaggca 360

Gaagaatcgg Ctaaacgcga Ggcgcaacaa Aaagctgaac

Gtgaggccgc Agaacaagct 420

Aagcgtgaag Ctgctgaaca Agcgaaacgt Gaagctgcgg

Aaaaagacaa Agtggaaaac 480

Ctgtattttc ag 492

Claims (5)

1. 一株大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株，其特征在于，该大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株（Escherichia coliNissle 1917 (Tum-5) 保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2017345。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株，其特征在于，所述大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株能可溶性表达和分泌性表达肿瘤抑素Tumstatin的抗肿瘤血管生成活性区域Tum-5，并能特异性地靶向肿瘤低氧区域。

3.一种如权利要求1所述的大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（一）利用PCR拼接获得Tum-5基因

根据GenBank中登录的登记号为 AF258351.1的Homo sapiens 的Tumstatin蛋白的基因序列，查找出编码Tum-5蛋白所对应的核苷酸序列，设计2条以上的寡核苷酸链，便于进行PCR拼接以获得Tum-5基因；

（二）Tum-5诱导表达载体的构建及鉴定；

（三）Tum-5蛋白的诱导表达、纯化及鉴定；

（四）大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株EcN (Tum-5)的构建；

（五）EcN在荷瘤小鼠体内的定殖情况分析；

（六）大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株EcN (Tum-5)的抗肿瘤分析；

（七）细菌的安全性检测。

4.如权利要求3所述的大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤（四）中，所述构建的步骤为，将低氧启动子Pvhb、SUMO促溶标签、抗血管生成因子Tum-5，通过重叠PCR技术获得包含三段基因序列的PCR产物，再利用酶切连接的方法将该PCR产物连接到载体pET-28a，电击转化Escherichia coli Nissle 1917，即得到大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株EcN (Tum-5 )。

5.如权利要求1或2所述的大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株在制备靶向抗肿瘤药物中的应用。