CN111518737A - 一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株构建及体外诱导方法 - Google Patents

一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株构建及体外诱导方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株构建及体外诱导方法，包括如下步骤：(1)合成目的基因；(2)以合成目的基因为模板进行PCR扩增；(3)提纯目的基因；(4)把目的基因插入质粒中，获得重组质粒；(5)把重组质粒转化至大肠杆菌，构建超声响应工程菌株。本发明的优点包括：工程菌株具有超声诱导蛋白表达的性能，诱导精度高，诱导深度大，可在时间与空间上控制诱导蛋白表达；该细菌诱导蛋白表达量多，肿瘤靶向性好。该细菌在超声辐照下，在肿瘤原位高效表达治疗蛋白，具有良好的抗肿瘤疗效。

Description

一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株构建及体外诱导方法
技术领域
本发明涉及工程菌株构建及体外诱导技术领域，尤其涉及一种抗肿瘤靶向的工程菌株构建及体外诱导技术。
背景技术
细菌用于肿瘤治疗具有悠久的历史，许多特定种类的细菌经过基因工程改造后，可作为抗肿瘤的药物载体装载蛋白药物。与常规的药物载体相比，细菌具有以下优势：细菌可主动靶向低氧、富营养、免疫抑制的肿瘤微环境，进入机体后能突破肿瘤血管限制与间质高压的阻力，在肿瘤深部定植并增殖。因此，通过合成生物学方法将编码治疗分子的基因插入细菌中，治疗基因的肿瘤靶向表达可能是实现肿瘤靶向治疗的新方法。目前细菌肿瘤疗法已进入临床试验阶段。为增强细菌治疗肿瘤的安全性与有效性，构建一种具备精确可控的抗肿瘤靶向工程菌株是目前细菌治疗肿瘤亟需解决的问题。
大肠杆菌作为哺乳动物肠道内的正常菌群成员之一，具有良好的体内安全性。大肠杆菌是一种存在于细胞外的细菌，更易于被抗生素所清除，不需要进行复杂的减毒改造即可投入使用；而且，基于其兼性厌氧的特性，大肠杆菌可在有氧和缺氧条件下生存，在定植于肿瘤组织并增殖的过程中，大肠杆菌既可在肿瘤坏死区域富集，又可在肿瘤边缘区域生长。Zhang等研究表明，大肠杆菌MG1655具有良好的肿瘤靶向性(Nat Commun.2018,26；9(1):1680)，应用该细菌作为药物递送载体，可有效传递治疗蛋白至肿瘤区域。
虽然细菌可携带编码治疗分子的基因靶向到达肿瘤部位。但是，如何通过精确可控的方法诱导细菌在肿瘤原位表达治疗蛋白亦是增强抗肿瘤效应的关键。目前细菌诱导表达的方式包括化学诱导及物理刺激。常用的化学诱导方式包括异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside，IPTG)、乳糖、阿拉伯糖等，这些诱导方式在体内表达的效率并不高。物理诱导方式则包括光诱导、热诱导等，然而光诱导在体内应用时面临穿透性不足的问题。传统的热诱导方式在温度控制方面精准性不足，容易引起周边组织损伤。
超声属于物理刺激，其中高强度聚焦超声(High intensity focusedultrasound,HIFU)可通过控制声压等参数，对组织产生稳定的热效应。HIFU具有聚焦性，可通过焦点控制精准促使靶区局部温度升高。此外，与光刺激相比，HIFU具有较强的组织穿透力，组织穿透深度可达到5-10cm。使用HIFU控制细菌在肿瘤原位表达治疗蛋白，是一种精确可控、靶向性好、穿透性大的方法。所以，设计构建一株超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株，并将其采用适当的诱导表达方法来应用于抗肿瘤治疗，对细菌介导肿瘤治疗领域的发展具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法及其体外诱导表达IFN-γ的方法，以解决如何提高抗肿瘤靶向工程菌株安全有效表达治疗蛋白的问题。
本发明将提供一种肿瘤靶向性高、超声响应性佳、治疗效果好的抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法，主要思路为将具有热敏感性的IFN-γ表达质粒导入大肠杆菌MG1655，超声的热效应可控制细菌内的真核抗肿瘤蛋白IFN-γ在肿瘤局部定向表达。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)合成目的基因；
(2)以合成目的基因为模板进行PCR扩增；
(3)提纯目的基因；
(4)把目的基因插入质粒中，获得重组质粒；
(5)把重组质粒转化至大肠杆菌，构建超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株。
优选地，所述步骤(1)的操作是根据大肠杆菌的表达特性对IFN-γ基因序列进行同源密码子优化，合成目的基因。
优选地，所述步骤(2)PCR扩增的一对引物中引入酶切位点序列SmaI及SalI，引物序列如下：
上游引物：CCCGGGATGAACGCTACACACTG；
下游引物：CAGCTGTCAGCAGCGACTCCTTT。
优选地，所述步骤(2)PCR反应条件是：98℃变性30s，诱导DNA模板双链解开；再在退火温度58℃下持续30s，使寡核苷酸引物分别结合到单链DNA模板的3’与5’端；72℃下延伸1min；35个循环。
优选地，所述步骤(4)的操作是将基因片段使用双酶切方法插入到热敏感质粒pBV220的多克隆位点中。
优选地，所述步骤(4)的详细操作是：在反应体系中分别加入SmaI及SalI核酸内切酶各1μl，Buffer 2μl，热敏感质粒pBV2201μg，无菌水补充总反应体积至20μl，在37℃反应90min，得到双酶切线性化质粒载体；
将4μl扩增获得的目的基因与1μl线性化质粒载体、0.5μl T4DNA连接酶、1μl DNA连接酶缓冲液、3.5μl ddH2O在无菌离心管中轻轻混合震荡，于16℃水浴过夜，得到重组质粒即IFN-γpBV 220质粒。
优选地，所述步骤(5)的大肠杆菌是大肠杆菌MG1655。
优选地，所述步骤(5)的详细操作过程是：取-80℃保存的大肠杆菌MG1655菌种，使用划线法接种于LB固体培养板中，37℃培养过夜；从LB固体培养板上挑取单克隆菌落接种至含有3ml LB液体培养基的离心管中，37℃下摇晃培养过夜；吸取30μl菌液加入3ml LB液体培养基中，在摇床中以220rpm转速、37℃震荡培养，培养至菌液OD600值达到0.5时，将菌液取出在冰上静置15min；取1ml菌液于4℃，5000rpm离心5min；吸取上清液，加入200μl预冷0.1M CaCl2重悬，离心后加入50μl预冷的CaCl2重悬菌体，得到感受态菌液，放置于4℃备用；在上述感受态菌液中加入5μl构建的重组质粒即IFN-γpBV 220质粒混合冰浴30min；然后将该混合溶液转到42℃水浴热激90s，再冰浴2min；再将菌液涂于含氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜后在LB固体培养板上挑取单克隆菌落，接种至5ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养过夜，将含有IFN-γpBV 220质粒的菌液接种于含氨苄青霉素的LB固体培养板上，得到超声响应工程菌株。
一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株体外诱导方法，步骤如下：取过夜培养的超声响应型细菌，离心收集定量至OD600＝0.5；将菌液加入到96孔板，每孔加入200μl菌液；将拟辐照的孔板置于高强度聚焦超声(HIFU)焦点处，HIFU参数为40V，960Hz，连续波；温度稳定于45.0～45.9℃之间，辐照时间为10min；辐照后孔板放入细菌培养箱37℃培养。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1)构建的细菌具有超声诱导蛋白表达的性能，诱导精度高，诱导深度大，可在时间与空间上控制诱导蛋白表达。
2)构建的细菌诱导蛋白表达量多。
3)构建的细菌的肿瘤靶向性好。
4)构建的细菌在超声辐照下，在肿瘤原位高效表达治疗蛋白，具有良好的抗肿瘤疗效。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1是37℃和45℃条件下热诱导细菌表达荧光蛋白mCherry的实验图；
图2是超声响应型细菌诱导原理图；
图3是水浴加热诱导时长对荧光蛋白的信号强度影响实验图；
图4是超声辐照细菌后不同时间点表达荧光蛋白mCherry的实验图；
图5是超声及水浴加热的方法对荧光蛋白表达影响实验图；
图6是HIFU辐照诱导实验组和未经HIFU诱导的对照组菌液中IFN-γ蛋白含量对比图；
图7是HIFU组和未处理对照组小鼠及其一侧的内脏实验图；
图8是HIFU辐照与未经HIFU辐照的乳腺癌细胞存活率实验结果图；
图9是活/死细胞染色实验图；
图10是超声响应型细菌的肿瘤靶向性整体实验图；
图11是超声响应型细菌的肿瘤靶向性局部实验图；
图12是不同治疗方式处理的卵巢癌小鼠肿瘤生长曲线图；
图13是不同治疗方式处理的卵巢癌小鼠体重统计图；
图14是不同治疗方式处理的卵巢癌小鼠肿瘤生长状态实验图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例一、IFN-γ/mCherry超声响应表达质粒的构建
通过查阅文献与GenBank获取得到IFN-γ的基因序列，根据大肠杆菌MG1655的表达特性对该基因序列进行同源密码子优化，并合成IFN-γ基因序列。以合成的IFN-γ基因序列为模板，使用软件设计PCR引物，并在一对引物中引入热敏感质粒pBV220上对应的酶切位点序列(SmaI及SalI)，引物序列如下：
上游引物为:CCCGGGATGAACGCTACACACTG；(下划线对应的序列是酶切位点序列SmaI)；
下游引物为:CAGCTGTCAGCAGCGACTCCTTT；(下划线对应的序列是酶切位点序列SalI)。
在PCR反应管中分别加入相应PCR反应体系(
Figure BDA0002419029780000051
HS DNA Polymerase,R010A)。首先在98℃变性30s，诱导DNA模板双链解开；再在退火温度58℃下持续30s，使寡核苷酸引物分别结合到单链DNA模板的3’与5’端；72℃下延伸1min；4种dNTP在高保真DNA聚合酶的作用下根据碱基互补配对原则沿引物从5’端延伸向3’端合成DNA产物。PCR反应进行35个循环后收集扩增得到的IFN-γ基因序列，通过凝胶电泳与胶回收试剂盒获取提纯目的基因片段。
将IFN-γ基因序列使用双酶切方法插入到热敏感质粒pBV220的多克隆位点中。反应体系中分别加入SmaI及SalI核酸内切酶各1μl，Buffer 2μl，热敏感质粒pBV2201μg，无菌水补充总反应体积至20μl，在37℃反应90min，得到双酶切线性化质粒；
将4μl扩增获得的目的基因片段与1μl线性化质粒载体、0.5μl T4DNA连接酶、1μlDNA连接酶缓冲液、3.5μl ddH2O在无菌离心管中轻轻混合震荡，于16℃水浴过夜，得到重组质粒即IFN-γpBV 220质粒。将制备得的重组质粒转化至BL21感受态细胞中，进行菌落PCR筛选、酶切验证及一代测序验证，确定IFN-γ目的基因片段已插入质粒载体。同时为了便于验证细菌表达蛋白的效率，我们将质粒上的IFN-γ基因序列更换为mCherry荧光报告基因，使用同样的方法构建了mCherry表达pBV220表达载体即mCherry pBV 220质粒。
实施例二、超声响应型细菌的构建
取-80℃保存的大肠杆菌MG1655菌种，使用划线法接种于LB固体培养板中，37℃培养过夜。从LB固体培养板上挑取单克隆菌落接种至含有3ml LB液体培养基的离心管中，37℃下摇晃培养过夜。吸取30μl菌液加入3ml LB液体培养基中，在摇床中以220rpm转速、37℃震荡培养，培养至菌液OD600值达到0.5时，将菌液取出在冰上静置15min；取1ml菌液于4℃，5000rpm离心5min；吸取上清液，加入200μl预冷0.1M CaCl2重悬，离心后加入50μl预冷的CaCl2重悬菌体，制备得感受态菌液放置于4℃备用。在上述感受态菌液中加入5μl实施例一构建的IFN-γ/mCherry pBV 220质粒混合冰浴30min。然后将该混合溶液转到42℃水浴热激90s，再冰浴2min。再将菌液涂于含氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜后在平板上挑取单克隆菌落，接种至5ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养过夜，将含有重组质粒的菌液接种于含氨苄青霉素的LB固体培养板，得到超声响应型细菌株。
实施例三、超声响应型细菌表达mCherry的验证
1)热诱导细菌表达荧光蛋白mCherry
挑取单克隆菌落的表达mCherry的超声响应型细菌，加入LB液体培养基于37℃细菌培养箱中过夜培养。取过夜培养的超声响应型细菌，离心收集定量至OD600＝0.5。分别取20ml OD600＝0.5的菌液加入两个小培养皿中，两个小培养皿分别放入37℃与45℃恒温水浴锅中加热20min，随后再放入37℃细菌培养箱过夜培养。采用小动物活体成像IVIS系统观察过夜培养的菌液，以评估加热诱导细菌表达荧光蛋白mCherry的效率。结果如图1所示，当水浴温度达到45℃时，细菌成功表达mCherry荧光蛋白；而菌液的处理温度为37℃时，并未观察到明显的荧光信号。诱导原理如图2所示，基于pR-pL热敏启动子的IFN-γ/mCherrypBV220质粒，在常温下(37℃)目的基因的表达被遏制，而温度上升到45℃时则会启动目的基因(IFN-γ/mCherry)的表达，这证实了超声响应型细菌的热敏表达特性。并发现随着水浴加热诱导时间的增加，如图3所示，细菌中荧光蛋白的表达也随之增强。当加热时间为25min时，细菌mCherry荧光蛋白的信号强度达到最高，可见超声响应型细菌的可控性。
2)超声诱导细菌表达荧光蛋白mCherry
取过夜培养的超声响应型细菌，离心收集定量至OD600＝0.5。将菌液加入到96孔板，每孔加入200μl菌液。将拟辐照的孔板置于高强度聚焦超声(HIFU)焦点处，HIFU参数为40V，960Hz，连续波。辐照时使用红外热成像仪实时监测菌液的温度变化，当温度达到45℃时调整HIFU参数，使温度稳定于45.0～45.9℃之间，辐照时间为10min。辐照后孔板放入细菌培养箱37℃培养。分别在培养不同时间点(1h、2h、3h、4h、5h、6h、12h、24h)使用小动物荧光成像IVIS系统对细菌mCherry蛋白的表达情况进行观察。结果如图4所示，在培养6h以上时能观察到荧光蛋白的表达信号强度随时间增强。
另外为了验证超声具有精准聚焦的特点，可精确控制升温的靶点。本实验将菌液注满96孔板，分别采用超声及水浴加热的方法诱导荧光蛋白表达。如图5所示的荧光成像结果可见超声诱导组只有经过超声辐照的孔板内菌液表达荧光信号，呈“H”型；而水浴加热组难以精确控制加热范围，所有孔板菌液均表达出荧光信号，而且与超声诱导组相比，水浴组的荧光蛋白表达强度较弱，该结果说明了与热诱导相比，HIFU诱导具有精确的聚焦特性。
实施例四、超声响应型细菌表达IFN-γ的验证
取过夜培养的表达IFN-γ的超声响应型细菌，离心收集定量至OD600＝0.5。设置高强度聚焦超声(HIFU)辐照诱导实验组和未经HIFU辐照诱导的对照组，使用HIFU辐照处理HIFU辐照诱导实验组，HIFU辐照方法如前所述。HIFU辐照后，两个实验组均正常30℃，200rpm培养。培养12h后，菌液离心，弃沉淀，收集上清液，进行ELISA法检测IFN-γ蛋白表达量。
ELISA检测IFN-γ蛋白的方法如下：
1.加样：100μl/孔加入不同浓度的标准品溶液与样品，100μl/孔加入Dilution作为空白对照组。
2.加抗体：50μl/孔加入Antibody工作液，混匀后盖上封板膜，37℃温育90min。
3.洗板：在滤纸上扣去孔内液体，300μl/孔加入1×Washing buffer，停留1min后扣去液体，重复4次。
4.加酶：100μl/孔加入HRP工作液，盖上封板膜37℃温育30min。重复洗板。
5.显色：100μl/孔加入TMB，37℃温育5-30min，根据孔内颜色深浅判定终止反应，100μl/孔加入Stop solution终止反应。终止反应后10min，使用450nm波长进行读值。使用标准品的读值构建标准曲线，再通过样品的OD值计算出样品中的IFN-γ蛋白浓度。如图6所示，为两个实验组菌液中IFN-γ蛋白含量对比图，HIFU辐照诱导实验组的细菌培养上清液中IFN-γ蛋白含量为58.02±1.95pg/ml，而未经HIFU诱导的对照组的细菌培养上清液中IFN-γ蛋白含量为9.26±1.60pg/ml，HIFU辐照诱导实验组的IFN-γ蛋白浓度比未经HIFU辐照诱导的对照组高出6.26倍。
实施例五、超声响应型细菌的体内超声响应特性验证
本实施例使用正常Balb/C小鼠验证超声响应型细菌的体内表达情况，分为HIFU组和未处理对照组，结果如图7中上面两只小鼠及其一侧的内脏实验图所示，HIFU响应型细菌注入体内后，使用HIFU定点辐照HIFU组小鼠肝脏，该组小鼠肝脏可见显著的荧光信号表达，而其他未经HIFU辐照的器官均未荧光信号；结果如图7中下面两只小鼠及其一侧的内脏实验图所示，未处理对照组则无明显荧光信号表达。实验结果证明了HIFU诱导具有体内深度诱导的优势。
实施例六、超声响应型细菌表达IFN-γ杀伤乳腺癌细胞的体外实验
使用CCK-8法检测超声响应型细菌的细胞毒性作用。将培养至对数生长期的鼠源乳腺癌4T1细胞接种在96孔板上，每孔细胞悬液体积为100μl，细胞数量为1×104个，置于5％CO2细胞培养箱37℃培养24h。按表达mCherry的细菌、表达IFN-γ蛋白的细菌及其不同浓度、以及细菌是否经过辐照处理分组，设置表达IFN-γ蛋白细菌的浓度分别为107、108、109、1010CFU/ml，每组设置5个复孔。如上文方法收集，收集经过HIFU辐照的细菌上清液，将不同浓度的表达IFN-γ蛋白超声响应型细菌上清液加入到对应的细胞培养孔板中，每孔100μl；各实验组分别添加相应的细菌后置于细胞培养箱孵育6h；吸去原培养基，使用无菌PBS洗涤两次，添加含有10％CCK-8溶液的100μl DMEM培养基孵育30min。使用酶标仪测量在450nm的光密度(OD)。未经处理的对照组OD值为ODsample，样品处理组的OD值为OD control。细胞存活率的计算公式＝(ODsample/ODcontrol)×100％。如图8所示，为经过HIFU辐照与未经HIFU辐照的实验结果，因上清液中含有表达IFN-γ蛋白的细菌，经过HIFU辐照后表达IFN-γ蛋白，所以该类实验组乳腺癌细胞存活率与未经HIFU辐照的对照组以及含有表达mCherry细菌的实验组的存活率相比要大幅度降低。
实施例七、活/死细胞染色验证超声响应型细菌的细胞毒性作用
用活/死细胞染色试剂盒(CalceinAM/PI)检测超声响应型细菌表达IFN-γ的细胞毒性作用。钙黄素AM(CalceinAM)是一种可对活细胞进行荧光标记的优良染色试剂，其能够轻易穿透活细胞膜。CalceinAM在活细胞中存留并发出绿色荧光信号。而在死细胞或细胞膜受损的细胞来说，碘化丙啶(PI)可以进入细胞，发出红色荧光信号，因此通过细胞中绿色/红色荧光信号比例，可以反映出细胞的活力状态。将培养至对数生长期的鼠源乳腺癌4T1细胞接种在96孔板上，每孔细胞悬液体积为100μl，细胞数量为1×104个，置于5％CO2细胞培养箱37℃培养24h。收集经过HIFU辐照的细菌上清液，设置细菌浓度分别为107、108、109、1010CFU/ml，将不同浓度的超声响应型细菌上清液加入到细胞培养孔板中，每孔100μl。孵育6h后，根据试剂盒(贝博/BestBio,BB-4126)提供的方法进行活/死细胞染色。使用预冷PBS洗涤细胞2遍，每孔加入100μL按试剂盒配好的混合工作液，放入培养箱孵育30min，吸出染色工作液终止孵育，在荧光显微镜下观察细胞荧光信号表达。如图9所示，在对照组中，基本所有细胞均表现绿色荧光，几乎没有红色荧光存在，表明未经处理时，细胞均为活细胞。随着添加的上清液细菌浓度增加，活细胞(绿色荧光)比例逐渐减少，而死细胞(红色荧光)比例逐渐上升，结果表明超声响应型细菌上清液中含有的IFN-γ对肿瘤细胞具有明显的抑制作用。
实施例八、卵巢癌移植瘤小鼠模型构建
取位于对数生长期的ID8卵巢癌细胞，使用含EDTA的0.25％胰蛋白酶消化离心收集，添加无血清DMEM培养基重悬，调整细胞密度为1×107个/ml。选用鼠龄4～6周的健康雌性Balb/C小鼠，体重约15～20g。使用注射器吸取100μl细胞悬液，缓慢注射入小鼠的背部右侧大腿处皮下。种瘤后3天开始测量小鼠肿瘤体积，待肿瘤体积达到100mm3时开始进行体内实验。
实施例九、超声响应型细菌的肿瘤靶向性实验
取处于对数生长期的表达IFN-γ的超声响应型细菌，调整细菌浓度为1×109CFU/ml，5000rpm常温离心10min，使用PBS洗涤2次，收集细菌。按每ml细菌中加入10μl DiR溶液的比例往细菌中加入DiR溶液，37℃孵育45min，将标记好的细菌1500rpm离心5min，移除上清液，使用PBS洗涤3次，至上清液澄清透明。使用200μl PBS重悬经DiR标记的HIFU响应型细菌，经尾静脉缓慢注射入实施例八得到的荷瘤小鼠体内，分别于1h、2h、3h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、72h等不同时间点，采用小动物活体成像IVIS系统观察细菌在小鼠体内分布与肿瘤聚集量，定量分析肿瘤区域的荧光成像信号，结果如图10和图11所示，随着时间变化，小鼠肿瘤区域荧光信号增强，肿瘤以外的其他区域荧光信号逐渐渐弱，甚至消失。
实施例十、超声响应型细菌治疗卵巢癌的体内实验
选取实施例八获得的荷瘤小鼠，分组及其处理过程如下：
IFN-γMG1655+HIFU组：
使用无菌PBS重悬1×108CFU/ml超声响应型细菌，经尾静脉注射入荷瘤小鼠体内。24h后采用小动物气体麻醉系统对小鼠进行麻醉，使用HIFU装置对小鼠肿瘤进行辐照，HIFU焦点聚焦于小鼠肿瘤中心，调节参数为40V，连续波，辐照10min。辐照过程中采用近红外温度成像仪实时观察肿瘤区域温度上升情况，调整HIFU的开/关状态以使肿瘤区域温度稳定在45.0℃～45.9℃之间。每隔7天对荷瘤小鼠进行治疗，治疗期间每2天记录小鼠体重，检测瘤体的长径和短径，计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线；
Control组：仅注射与超声响应型细菌菌液等量的生理盐水；
HIFU组：仅超声处理，超声处理方法同IFN-γMG1655+HIFU组；
MG1655组：仅注射与超声响应型细菌菌液等量的大肠杆菌MG1655，方法同IFN-γMG1655+HIFU组；
IFN-γMG1655组：仅注射超声响应型细菌菌液，方法同IFN-γMG1655+HIFU组。
待Control组小鼠死亡或肿瘤体积达到2000mm3时，处死所有小鼠，收集小鼠外周血、肿瘤及各器官，绘制小鼠肿瘤生长曲线。结果如图12所示，随着时间的增长，各实验小组的小鼠体内肿瘤体积均会增长；明显的，IFN-γMG1655+HIFU组的肿瘤体积增长比其他实验组都缓慢，且最终肿瘤体积很小，远远小于400mm3,其他实验组的肿瘤体积虽然比Control组的体积小，但是未到5天已经生长速度明显加快，肿瘤体积都远远比MG1655+HIFU组的大；如图13所示，各处理组的小鼠体重无明显差异；如图14所示，明显地看出不同实验组的肿瘤生长状态，MG1655+HIFU组的肿瘤生长受到明显抑制，没有随着时间的增长发生明显的变化，其他实验组的肿瘤均有明显的体积及形态变化。
综上，本发明的技术效果包括：
(1)超声/热敏质粒载体构建：构建了基于pR-pL热敏启动子的IFN-γ表达质粒，在常温下(37℃)目的基因的表达被遏制，而温度上升到45℃时则会启动目的基因(IFN-γ/mCherry)的表达。
(2)随着水浴加热诱导时间的增加，细菌中荧光蛋白的表达也随之增强。当加热时间为25min时，细菌mCherry荧光蛋白的信号强度达到最高。说明超声响应型细菌具有热敏表达特性。
(3)超声响应型细菌具有体外超声响应特性，在经过HIFU辐照后，细菌同样可表达荧光蛋白，且随着辐照后孵育时间增加，荧光蛋白的表达量也不断升高。HIFU具有精准聚焦的特点，可精确控制升温的靶点。与HIFU组相比，水浴组的荧光蛋白表达强度较弱，该结果说明了与热诱导相比，HIFU诱导具有精确的聚焦特性。
(4)超声响应型细菌具有体内超声响应特性，HIFU诱导具有体内深度诱导的优势。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Figure BDA0002419029780000141
序列表
<110> 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院）
<120> 一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株构建及体外诱导方法
<130> 2020
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
cccgggatga acgctacaca ctg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
cagctgtcag cagcgactcc ttt 23

Claims (9)

1.一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法，其特征在于：
包括如下步骤：
(1)合成目的基因；
(2)以合成目的基因为模板进行PCR扩增；
(3)提纯目的基因；
(4)把目的基因插入质粒中，获得重组质粒；
(5)把重组质粒转化至大肠杆菌，构建超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株。
2.根据权利要求1所述的一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法，其特征在于：
所述步骤(1)的操作是根据大肠杆菌的表达特性对IFN-γ基因序列进行同源密码子优化，合成目的基因。
3.根据权利要求1所述的一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法，其特征在于：
所述步骤(2)PCR扩增的一对引物中引入酶切位点序列SmaI及SalI，引物序列如下：
上游引物：CCCGGGATGAACGCTACACACTG；
下游引物：CAGCTGTCAGCAGCGACTCCTTT。
4.根据权利要求1所述的一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法，其特征在于：
所述步骤(2)PCR反应条件是：98℃变性30s，诱导DNA模板双链解开；再在退火温度58℃下持续30s，使寡核苷酸引物分别结合到单链DNA模板的3’与5’端；72℃下延伸1min；35个循环。
5.根据权利要求1所述的一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法，其特征在于：
所述步骤(4)的操作是将基因片段使用双酶切方法插入到热敏感质粒pBV220的多克隆位点中。
6.根据权利要求5所述的一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法，其特征在于：
所述步骤(4)的详细操作是：在反应体系中分别加入SmaI及SalI核酸内切酶各1μl，Buffer 2μl，热敏感质粒pBV2201μg，无菌水补充总反应体积至20μl，在37℃反应90min，得到双酶切线性化质粒载体；
将4μl扩增获得的目的基因与1μl线性化质粒载体、0.5μl T4 DNA连接酶、1μl DNA连接酶缓冲液、3.5μl ddH2O在无菌离心管中轻轻混合震荡，于16℃水浴过夜，得到重组质粒即IFN-γpBV220质粒。
7.根据权利要求1所述的一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法，其特征在于：
所述步骤(5)的大肠杆菌是大肠杆菌MG1655。
8.根据权利要求7所述的一种超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株的构建方法，其特征在于：
所述步骤(5)的详细操作过程是：取-80℃保存的大肠杆菌MG1655菌种，使用划线法接种于LB固体培养板中，37℃培养过夜；从LB固体培养板上挑取单克隆菌落接种至含有3mlLB液体培养基的离心管中，37℃下摇晃培养过夜；吸取30μl菌液加入3ml LB液体培养基中，在摇床中以220rpm转速、37℃震荡培养，培养至菌液OD600值达到0.5时，将菌液取出在冰上静置15min；取1ml菌液于4℃，5000rpm离心5min；吸取上清液，加入200μl预冷0.1M CaCl2重悬，离心后加入50μl预冷的CaCl2重悬菌体，得到感受态菌液，放置于4℃备用；在上述感受态菌液中加入5μl构建的重组质粒即IFN-γpBV 220质粒混合冰浴30min；然后将该混合溶液转到42℃水浴热激90s，再冰浴2min；再将菌液涂于含氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜后在LB固体培养板上挑取单克隆菌落，接种至5ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养过夜，将含有IFN-γpBV 220质粒的菌液接种于含氨苄青霉素的LB固体培养板上，得到超声响应工程菌株。
9.一种如权利要求1-8任一所述的超声响应的抗肿瘤靶向工程菌株体外诱导方法，其特征在于：
步骤如下：取过夜培养的超声响应型细菌，离心收集定量至OD600＝0.5；将菌液加入到96孔板，每孔加入200μl菌液；将拟辐照的孔板置于高强度聚焦超声(HIFU)焦点处，HIFU参数为40V，960Hz，连续波；温度稳定于45.0～45.9℃之间，辐照时间为10min；辐照后孔板放入细菌培养箱37℃培养。
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