CN114456992B - “自体裂解”沙门氏菌菌株、其制备方法及其在肿瘤治疗中的应用 - Google Patents

“自体裂解”沙门氏菌菌株、其制备方法及其在肿瘤治疗中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114456992B
CN114456992B CN202011221994.1A CN202011221994A CN114456992B CN 114456992 B CN114456992 B CN 114456992B CN 202011221994 A CN202011221994 A CN 202011221994A CN 114456992 B CN114456992 B CN 114456992B
Authority
CN
China
Prior art keywords
strain
therapy
cancer
bacterial
combination
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011221994.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114456992A (zh
Inventor
刘陈立
王作伟
曾正阳
盛方芊
董宇轩
卢伟琪
郭旋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Original Assignee
Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS filed Critical Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority to CN202011221994.1A priority Critical patent/CN114456992B/zh
Publication of CN114456992A publication Critical patent/CN114456992A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114456992B publication Critical patent/CN114456992B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/255—Salmonella (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia

Abstract

本发明涉及一种基因工程菌，具体是敲除dapA或dapE基因的沙门氏菌菌株及其在肿瘤治疗中的应用，以及制备所述基因工程沙门氏菌菌株的方法。

Description

“自体裂解”沙门氏菌菌株、其制备方法及其在肿瘤治疗中的 应用
技术领域
本发明涉及生物工程和肿瘤治疗领域，具体而言涉及一种“自体裂解”沙门氏菌菌株、其制备方法及其在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
癌症是全世界范围内引起死亡的主要原因。与正常细胞比较癌细胞具有无限增殖、可转化和易转移等特点。癌细胞除了分裂失控外(能进行多极分裂)，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到其他器官。癌症治疗发展史表明，传统癌症治疗方法如手术治疗、化学疗法、放射线疗法、激素疗法、骨髓/干细胞移植等治疗手段，均具有一定的缺陷，如手术治疗存在易复发且部分肿瘤存在不易手术等问题；化疗和放疗会对患者产生严重的副反应而导致治疗不能有效进行；激素疗法容易增加人体脂肪量，减少肌肉量。这将会影响到血糖水平，增加糖尿病风险；骨髓/干细胞移植配型难，容易出现免疫排斥反应等。
癌症治疗难点源于其病因复杂多变，不仅存在机体基因水平的变化，还有外界环境的改变也是癌症发展的重要因素之一。应用传统方法治疗肿瘤过程中会对正常组织器官产生严重的毒性，且会使癌细胞产生多重耐药性、不能完全清除癌细胞。
近年来，多项研究发现，基因治疗、无创伤射频治疗癌症方法、胰岛素增强治疗、饮食治疗和细菌治疗不仅可以阻止癌细胞产生多重耐药性，同时也增强传统疗法的疗效。其中细菌疗法是一种很有希望克服传统治疗方法缺点的癌症治疗手段。
利用活细菌治疗癌症的历史可以追溯到150多年前。1868年德国内科医生W.
Bush首次应用细菌治疗无法通过手术方法治疗的肉瘤，患者在接受治疗的一周内肿瘤体积缩小一半同时颈部淋巴结体积变小。然而不幸的是该患者于9天后死于细菌感染引起的败血症。1883年德国外科医生Friedrich Fehleisen鉴定出丹毒是酿脓链球菌感染引起的。随后，Friedrich Fehleisen和来自纽约医院外科医生Willian B Coley分别独立开展实验证明酿脓链球菌可以使患者肿瘤消退。然而由于实验结果很难重复和不符合当时临床标准，因此结果备受争议。1935年Connell观测到来自梭状杆菌酶的滤液可以使转移瘤消退。1947年科学家首次注射溶组织梭菌的孢子给移植肉瘤的小鼠，观测到癌细胞溶解和肿瘤组织消退。然而由于细菌引起的急性毒性反应，小鼠存活率很低。1959年卡介苗(减毒牛结核分枝杆菌)成功用于癌症免疫治疗。2002年减毒的沙门氏菌VNP20009(msbB-,purI-)进行了Ⅰ期临床试验，结果显示该菌株可以在肿瘤组织定植，但是对于肿瘤治疗效果不明显(Toso,J.F.等人Phase I Study of the Intravenous Administration of AttenuatedSalmonella typhimurium to Patients With Metastatic Melanoma.20,142-152,doi:10.1200/jco.2002.20.1.142(2002))。
虽然VNP20009并没有取得良好的临床结果，但鉴于沙门氏菌的免疫调节功能，研究者认为可以通过多种改造方式或许能使沙门氏菌适合于肿瘤治疗。沙门氏菌需要进行改造的原因在于野生型沙门氏菌具有毒性，可以引起发热、呕吐、腹泻及腹部绞痛等症状，严重可以引起菌血症危及生命。伴随着分子生物学技术飞速发展，可以通过不同策略改造沙门氏菌使其适合应用于肿瘤治疗。可以敲除沙门氏菌与毒力相关基因、通过构建营养缺陷型菌株、基因回路调控细菌生长等，促使减毒菌株早日用于肿瘤治疗。
在鼠伤寒沙门氏菌用于小鼠肿瘤模型治疗测试时发现，野生型沙门氏菌菌株或者营养缺陷型沙门氏菌菌株(例如：SL7207)在体内增殖速率远远大于机体清除速率，从而导致细菌在小鼠体内大量增殖，引起严重的菌血症，产生致死副反应(Yu,B.等人.Explicithypoxia targeting with tumor suppression by creating an"obligate"anaerobicSalmonella Typhimurium strain.Sci Rep 2,436,doi:10.1038/srep00436(2012).)。
因此，需要能够有良好抑制肿瘤生长能力和更加安全的沙门氏菌菌株。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明的目的是提供一种“自体裂解”沙门氏菌菌株、其制备方法及其在肿瘤治疗中的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种通过敲除兼性厌氧菌代谢通路上必需基因，从而获得在有氧与无氧条件下均无法生长菌株的方法，所述的菌株应用于体内肿瘤治疗时，可以抑制肿瘤生长和减小肿瘤体积。
在本发明的一个方面，在所述方法中，所述兼性厌氧细菌是沙门氏菌属物种(Salmonella)。
在本发明的一个方面，在所述方法中，所述菌株在体外培养时培养基中需要额外添加2,6-二氨基庚二酸(别名：2,6-二氨基蒲桃酸；2,6-Diaminopimelic acid)或其类似物。
在本发明的一个方面，在所述方法中，所述肿瘤和癌症包括血癌(慢性白血病、急性白血病)，骨癌，淋巴癌(非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)，肠癌(结肠癌、直肠癌)，肝癌，胃癌，盆腔癌(子宫颈癌、卵巢恶性肿瘤、子宫内膜癌、卵巢癌)，肺癌，乳腺癌，胰腺癌，膀胱癌，前列腺癌等。
在本发明的一个方面，在所述方法中，所述细菌是伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)。
在本发明的一个方面，在所述方法中，所述兼性厌氧细菌是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。
在本发明的一个方面，在所述方法中，所述兼性厌氧沙门氏菌菌株包括来源于人、鸡、狗、牛等。
在本发明的一个方面，在所述方法中，所述兼性厌氧细菌菌属包括：肠杆菌科细菌(大肠杆菌、肺炎杆菌、变形杆菌、肠杆菌、伤寒杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等)，葡萄球菌属，链球菌属，肺炎球菌，炭疽杆菌和白喉杆菌等。
在本发明的一个方面，提供了一种按照以上所述方法制备的菌株。
在本发明的一个方面，提供了一种基因工程的沙门氏菌菌株，所述菌株中敲除dapA或dapE基因。
在本发明的一个方面，提供了一种上述菌株的细菌疗法。
在本发明的一个方面，所述细菌疗法与其他癌症治疗方法联合应用，联合应用的治疗方法包括但不局限于手术、放疗、化疗等。
在本发明的一个方面，所述其他癌症治疗方法联合应用包括：(a)该菌株的细菌疗法联合手术疗法；(b)该菌株的细菌疗法联合放射治疗；(c)该菌株的细菌疗法联合化学药物：化疗药物包括烷化剂(尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥等)，抗代谢药(去氧氟尿苷、多西氟鸟啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、氟鸟苷、替加氟、吉西他滨、卡莫氟、羟基脲、甲氨蝶呤、优福定、安西他滨等)，抗肿瘤抗生素(放线菌素、阿柔比星、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星等)，植物类抗癌药物(伊立替康、三尖杉酯碱、羟基喜树碱、长春瑞宾、紫杉醇、泰索帝、拓扑替康、长春新碱、长春地辛、长春碱等)，激素(阿他美坦、阿那曲唑、安鲁米特、来曲唑、福美坦、甲他孕酮、他莫昔芬等)免疫抑制剂及其他抗癌药物如门冬酰胺酶、卡铂、顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂澳杀、米托蒽醌、丙卡巴肼等；(d)该菌株的细菌疗法联合生物治疗；(e)该菌株的细菌疗法联合中医中药治疗。
在本发明的一个方面，提供了上述菌株在体外诱导表达药物或者作为载体携载药物中的应用，所述药物用于治疗癌症。
在本发明的一个方面，在本发明的应用中，所述药物包括：(a)表达具有癌症治疗效果的蛋白物质或者多肽物质；(b)表达具有癌症治疗效果的RNA；(c)作为载体携载经修饰的RNA药物。
通过本发明的“自体裂解”沙门氏菌菌株、其制备方法及其在肿瘤治疗中的应用，能够获得有良好抑制肿瘤生长能力和更加安全的沙门氏菌菌株。
附图说明
图1中的A至D是本发明实施方式的SL7207(ΔdapA)菌株和SL7207(ΔdapE)菌株构建电泳图。
图2A至图2D：图2A和2B是本发明实施方式的SL7207(ΔdapA)菌株体外实验结果，图2A是该菌株在有氧条件下培养1-10天的照片，图2B是该菌株在厌氧条件下培养的照片；图2C和图2D是本发明实施方案的SL7207(ΔdapE)菌株体外实验结果，图2C是该菌株在有氧条件下培养72h的照片，图2D是该菌株在厌氧条件下培养24h的照片。
图3A至图3C是本发明实施方式的SL7207(ΔdapA)菌株体内实验结果。
图4A至图4C是本发明实施方式的SL7207(ΔdapE)菌株体内实验结果。
具体实施方式
尽管可以对本发明进行各种修改并且本发明可以具有各种形式，但是下面将详细说明和解释具体实例。然而，应当理解的是，这些并不旨在将本发明限制于特定的公开内容，并且本发明包括其所有修改、等同物或替代物而不脱离本发明的精神和技术范围。
在下文中，将更详细地解释根据本发明具体实施方式的“自体裂解”沙门氏菌菌株、其制备方法及其在肿瘤治疗中的应用。
在鼠伤寒沙门氏菌用于小鼠肿瘤模型治疗测试时发现，野生型沙门氏菌菌株或者营养缺陷型沙门氏菌菌株(例如：SL7207)在体内增殖速率远远大于机体清除速率，从而导致细菌在小鼠体内大量增殖，引起严重的菌血症，产生致死副反应。对此，本发明构建的在有氧与厌氧条件下均无法存活的鼠伤寒沙门氏菌菌株，通过尾静脉注射到荷瘤小鼠体内，一天时间内99％细菌被机体清除。在该菌株应用于肿瘤治疗时，发现其具有长期抑制肿瘤增长的能力，小鼠存活率显著增加。说明本发明在保留细菌抗肿瘤能力的基础上，同时也提高了安全性。
dapA或dapE基因是细菌体内赖氨酸代谢通路上关键基因，参与细菌细胞壁合成。当该基因被敲除后，细菌无法合成二氨基庚二酸(DAP)，细菌无法形成完整细胞壁，细菌内外渗透压不平衡，导致细菌无法存活。本发明利用基因工程技术敲除DAP(二氨基庚二酸)代谢通路上必需基因dapA或dapE，获得在有氧与厌氧条件下均无法存活的鼠伤寒沙门氏菌菌株。
通过构建在短时间内容易被机体清除菌株，减弱因细菌在体内长期存留而对荷瘤小鼠产生的毒副作用，使改造菌株更加安全可靠，且不影响细菌治疗肿瘤效果。
在本发明的一个或多个实施方式中，提供了通过从兼性厌氧菌中敲除代谢通路上必需基因，从而获得在有氧与无氧条件下均无法生长菌株的方法，所述的菌株应用于体内肿瘤治疗时，可以抑制肿瘤生长和减小肿瘤体积。
所述兼性厌氧菌可以为来自肠杆菌科细菌(大肠杆菌、肺炎杆菌、变形杆菌、肠杆菌、伤寒杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等)，葡萄球菌属，链球菌属，肺炎球菌，炭疽杆菌和白喉杆菌等中任一个细菌菌属中的任意菌种。
所述兼性厌氧沙门氏菌菌株来源不限，只要是兼性厌氧即可，例如包括来源于人、鸡、狗、牛等的兼性厌氧沙门氏菌菌株。
所述兼性厌氧细菌是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。
所述代谢通路上必需基因例如为改为dapA、dapB、dapD、argD、dapE、dapF、murE、murF、lysA等，优选为dapF、dapA、dapE基因。特别是dapA或dapE基因。
当代谢通路上必需基因dapA或dapE基因被敲除时，所述在有氧与无氧条件下均无法生长菌株在体外培养时培养基中需要额外添加2,6-二氨基庚二酸(别名：2,6-二氨基蒲桃酸；2,6-Diaminopimelic acid)或其类似物。
本发明的在有氧与无氧条件下均无法生长菌株在应用于体内肿瘤治疗时，可以抑制肿瘤生长和减小肿瘤体积。
所述肿瘤癌症包括血癌(慢性白血病、急性白血病)，骨癌，淋巴癌(非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)，肠癌(结肠癌、直肠癌)，肝癌，胃癌，盆腔癌(子宫颈癌、卵巢恶性肿瘤、子宫内膜癌、卵巢癌)，肺癌，乳腺癌，胰腺癌，膀胱癌，前列腺癌等。
本发明还提供了利用本发明的在有氧与无氧条件下均无法生长菌株治疗癌症的细菌疗法。
所述癌症包括血癌(慢性白血病、急性白血病)，骨癌，淋巴癌(非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)，肠癌(结肠癌、直肠癌)，肝癌，胃癌，盆腔癌(子宫颈癌、卵巢恶性肿瘤、子宫内膜癌、卵巢癌)，肺癌，乳腺癌，胰腺癌，膀胱癌，前列腺癌等。
本发明的治疗癌症的细菌疗法可以与其他癌症治疗方法联合应用。
联合应用的所述其他癌症治疗方法包括但不局限于手术、放疗、化疗等。
本发明的治疗癌症的细菌疗法与所述其他癌症治疗方法的联合应用包括：(a)该菌株的细菌疗法联合手术疗法；(b)该菌株的细菌疗法联合放射治疗；(c)该菌株的细菌疗法联合化学药物：化疗药物包括烷化剂(尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥等)，抗代谢药(去氧氟尿苷、多西氟鸟啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、氟鸟苷、替加氟、吉西他滨、卡莫氟、羟基脲、甲氨蝶呤、优福定、安西他滨等)，抗肿瘤抗生素(放线菌素、阿柔比星、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星等)，植物类抗癌药物(伊立替康、三尖杉酯碱、羟基喜树碱、长春瑞宾、紫杉醇、泰索帝、拓扑替康、长春新碱、长春地辛、长春碱等)，激素(阿他美坦、阿那曲唑、安鲁米特、来曲唑、福美坦、甲他孕酮、他莫昔芬等)免疫抑制剂及其他抗癌药物如门冬酰胺酶、卡铂、顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂澳杀、米托蒽醌、丙卡巴肼等；(d)该菌株的细菌疗法联合生物治疗；(e)该菌株的细菌疗法联合中医中药治疗。
本发明的在有氧与无氧条件下均无法生长菌株还可以用于在体外诱导表达药物或者作为载体携载药物，以进行癌症治疗。
在本发明的实施方式中，可以携带在所述载体中的药物包括：(a)表达具有癌症治疗效果的蛋白物质或者多肽物质；(b)表达具有癌症治疗效果的RNA；(c)作为载体携载经修饰的RNA药物。
实施例：
提供以下非限制性实施例。
实施例1：构建SL7207(ΔdapA)菌株和SL7207(ΔdapE)菌株
应用λ-red同源重组技术构建SL7207(ΔdapA)菌株和SL7207(ΔdapE)菌株，具体步骤如下：
(1)以表1所示的引物通过PCR扩增获得
dapA-Up-HR-loxp-KnaR-loxp-dapA-Down-HR(HR:Homologous recombinationarm)同源重组片段、dapE-Up-HR-loxp-KnaR-loxp-dapE-Down-HR(HR:Homologousrecombination arm)同源重组片段1；
(2)制备SL7207电转化感受态细胞，通过电转化方式将pSim6质粒转入到SL7207菌株；
(3)制备SL7207(pSim6)菌株的电转化感受态细胞，42℃诱导15min。将(1)中获得的目的片段转入到SL7207(pSim6)菌株，30℃、LB固体平板(氨苄霉素+卡那霉素+DAP)过夜培养；
(4)菌落PCR鉴定出发生重组的阳性克隆；
(5)SL7207(ΔdapA)-loxp-KnaR-loxp-pSim6菌株和SL7207(ΔdapE)-loxp-KnaR-loxp-pSim6菌株在37℃，LB(卡那霉素+DAP)液体培养基中过夜培养，丢失掉pSim6质粒，获得SL7207(ΔdapA)-loxp-KnaR-loxp菌株和SL7207(ΔdapE)-loxp-KnaR-loxp菌株；
(6)制备SL7207(ΔdapA)-loxp-KnaR-loxp和SL7207(ΔdapE)-loxp-KnaR-loxp电转化感受态细胞，通过电转化方式将Cre-705质粒转入到两株目标菌株，通过loxp与loxp发生同源重组，去掉卡那霉素抗性基因。最终获得SL7207(ΔdapA)菌株和SL7207(ΔdapE)菌株。本发明实施方式的SL7207(ΔdapA)菌株和SL7207(ΔdapE)菌株构建电泳图如图1所示。
表1
实施例2：SL7207(ΔdapA)体外表征
表征：测试时用含有卡那霉素抗性的SL7207(ΔdapA)菌株。
有氧条件下表征：挑取3个单克隆，分别重悬到10μl LB培养基中。将5μl细菌重悬液加入到含有卡那霉素的LB(DAP+)培养基中，剩下5μl细菌重悬液加入到含有卡那霉素的LB(DAP-)培养基中。空气摇床中(37℃，220rpm)培养24小时后取出样品拍照。将LB(DAP+)培养基中生长起来的细菌，以1：100比例重新接种到含有卡那霉素的LB(DAP+)、LB(DAP-)培养基中，培养24小时，拍照，连续10天不间断转接培养。
厌氧条件下表征：挑取3个单克隆加入到含有卡那霉素的LB(DAP+)培养基中。空气摇床中(37℃，220rpm)过夜培养。将过夜培养的菌液放入厌氧培养箱，以1：100比例进行转接。取20μl菌液加入到2ml含有卡那霉素的LB(DAP+)培养基中；取20μl菌液加入到2ml含有卡那霉素的LB(DAP-)培养基中，3个重复。测量转接后样品的初始OD600值。厌氧箱中，37℃，静置培养24h。测量培养24h后样品的OD600值。
实验结果(如图2A和2B所示)：
(1)有氧条件下：该菌株在LB(DAP+)、LB(DAP-)培养基中不间断培养10天，在LB(DAP+)培养基中可以生长；在LB(DAP-)培养基中无法生长(图2A)。
(2)厌氧条件下：该菌株在LB(DAP+)培养基与LB(DAP-)培养基中培养24h。该菌株在LB(DAP+)培养基可以生长；LB(DAP-)培养基中无法生长(图2B)。
实验结论：通过对该菌株在有氧与厌氧条件下的测试表明，成功将兼性厌氧菌株SL7207改造成为在有氧与厌氧条件下均无法生长菌株。
实施例3：SL7207(ΔdapA)体内表征
C57BL/6小鼠皮下接种1×106小鼠膀胱癌细胞(MB49)，建立小鼠膀胱癌皮下瘤模型。实验分为三组，PBS组、SL7207菌株组、SL7207(ΔdapA)组。尾静脉接种1×107个细菌。检测细菌在荷瘤小鼠正常组织器官与肿瘤里分布、肿瘤体积变化、小鼠体重变化、小鼠生存率。实验结果(如图4A至图4C)：
(1)细菌在荷瘤小鼠体内分布(图3A)：7天内小鼠正常组织器官就可以清除该菌株。SL7207组，7天内细菌在正常组织与肿瘤内快速繁殖，最终小鼠在7天内小鼠全部死亡。
(2)肿瘤体积变化(图3B)：与PBS组比较，该菌株在实验周期内对肿瘤有抑制作用。
(3)小鼠体重变化(图3B)：与PBS组比较，SL7207组小鼠体重下降较多；该菌株组别小鼠体重下降较少。
(4)小鼠生存率(图3C)：实验周期内，SL7207组小鼠7天内全部死亡；PBS组与该菌株组别小鼠均无死亡。
实验结论：实验周期内，(1)荷瘤小鼠在7天内就能将体内细菌清除干净；(2)该菌株具有抑制肿瘤效果；(3)注射该菌株的小鼠体重与PBS组比较没有很显著下降，说明该菌株毒性相对比较小，提高了安全性。
实施例4：SL7207(ΔdapE)体外表征
表征：测试时用含有卡那霉素抗性的SL7207(ΔdapE)菌株。
有氧条件下表征：挑取3个克隆加入到2ml含有卡那霉素的LB(DAP+)培养基中。空气摇床中(37℃，220rpm)过夜培养。第二天以1：100比例进行转接。取20μl加入到2ml卡那霉素LB(DAP+)培养基中；20μl加入到2ml卡那霉素LB(DAP-)培养基中，3个重复。培养72h时，观察菌株生长情况并且拍照。
厌氧条件下表征：挑取3个单克隆加入到含有卡那霉素的LB(DAP+)培养基中。空气摇床中(37℃，220rpm)过夜培养。将过夜培养的菌液放入厌氧培养箱，以1：100比例进行转接。取20μl菌液加入到2ml含有卡那霉素的LB(DAP+)培养基中；取20μl菌液加入到2ml含有卡那霉素的LB(DAP-)培养基中，3个重复。测量转接后样品的初始OD600值。厌氧箱中，37℃，静置培养24h。测量培养24h后样品的OD600值。
实验结果(如图2C与2D)：
(1)有氧条件下：该菌株在LB(DAP+)、LB(DAP-)培养基中培养72h，在LB(DAP+)培养基中可以生长；在LB(DAP-)培养基中无法生长(图2C)。
(2)厌氧条件下：该菌株在LB(DAP+)培养基与LB(DAP-)培养基中培养24h。该菌株在LB(DAP+)培养基可以生长；LB(DAP-)培养基中无法生长(图2D)。
实验结论：通过对该菌株在有氧与厌氧条件下的测试表明，成功将兼性厌氧菌株SL7207改造成为在有氧与厌氧条件下均无法生长菌株。
实施例5：SL7207(ΔdapE)体内表征
C57BL/6小鼠皮下接种1×106小鼠膀胱癌细胞(MB49)，建立小鼠膀胱癌皮下瘤模型。实验分为两组，PBS组和SL7207(ΔdapE)组。尾静脉接种1×107个细菌。检测细菌在荷瘤小鼠正常组织器官与肿瘤里分布、肿瘤体积变化、小鼠体重变化、小鼠生存率。实验结果(如图4A至图4C)：
(1)肿瘤体积变化(图4A)：与PBS组比较，该菌株在实验周期内对肿瘤有抑制作用。
(2)小鼠体重变化(图4B)：与PBS组比较，注射该菌株小鼠体重无明显变化。
(3)小鼠生存率(图4C)：实验周期内,PBS组与该菌株组别小鼠均无死亡。
实验结论：实验周期内，(1)该菌株具有抑制肿瘤效果；(2)注射该菌株的小鼠体重与PBS组比较没有很显著下降，说明该菌株毒性相对比较小，提高了安全性。

Claims (6)

1.一种细菌菌株在制备用于治疗体内膀胱癌的药物中的应用，所述细菌菌株是通过敲除鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的dapA或dapE基因而获得的在有氧与无氧条件下均无法生长的菌株，所述体内膀胱癌治疗抑制肿瘤生长和减小肿瘤体积。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述鼠伤寒沙门氏菌菌株来源于人、鸡、狗、牛。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述菌株在体外培养时培养基中需要额外添加2,6-二氨基庚二酸。
4.根据权利要求1所述的应用，其中，所述药物与其他癌症治疗方法联合应用，联合应用的治疗方法包括手术、放疗、化疗。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述其他癌症治疗方法联合应用包括：(a)该菌株的细菌疗法联合手术疗法；(b)该菌株的细菌疗法联合放射治疗；(c)该菌株的细菌疗法联合化学药物：化疗药物包括烷化剂，抗代谢药，抗肿瘤抗生素，植物类抗癌药物，激素，免疫抑制剂及其他抗癌药物；(d)该菌株的细菌疗法联合生物治疗；(e)该菌株的细菌疗法联合中医中药治疗。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，
所述烷化剂包括尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥；
所述抗代谢药包括去氧氟尿苷、多西氟鸟啶、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、氟鸟苷、替加氟、吉西他滨、卡莫氟、羟基脲、甲氨蝶呤、优福定、安西他滨；
所述抗肿瘤抗生素包括放线菌素、阿柔比星、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星；
所述植物类抗癌药物包括伊立替康、三尖杉酯碱、羟基喜树碱、长春瑞宾、紫杉醇、泰索帝、拓扑替康、长春新碱、长春地辛、长春碱；
所述激素包括阿他美坦、阿那曲唑、安鲁米特、来曲唑、福美坦、甲地孕酮、他莫昔芬；
所述免疫抑制剂及其他抗癌药物，包括门冬酰胺酶、卡铂、顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、米托蒽醌、丙卡巴肼。
CN202011221994.1A 2020-11-05 2020-11-05 “自体裂解”沙门氏菌菌株、其制备方法及其在肿瘤治疗中的应用 Active CN114456992B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011221994.1A CN114456992B (zh) 2020-11-05 2020-11-05 “自体裂解”沙门氏菌菌株、其制备方法及其在肿瘤治疗中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011221994.1A CN114456992B (zh) 2020-11-05 2020-11-05 “自体裂解”沙门氏菌菌株、其制备方法及其在肿瘤治疗中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114456992A CN114456992A (zh) 2022-05-10
CN114456992B true CN114456992B (zh) 2024-04-19

Family

ID=81404791

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011221994.1A Active CN114456992B (zh) 2020-11-05 2020-11-05 “自体裂解”沙门氏菌菌株、其制备方法及其在肿瘤治疗中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114456992B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104471057A (zh) * 2012-05-04 2015-03-25 香港大学 经修饰的细菌和它们用于治疗癌症或肿瘤的用途
CN108660148A (zh) * 2018-05-29 2018-10-16 奇元科技（武汉）有限公司 一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法及其应用
WO2020172462A1 (en) * 2019-02-22 2020-08-27 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Tumor-navigating, self-eradicating, trail-armed salmonella for precision cancer therapy

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3844276A2 (en) * 2018-08-28 2021-07-07 Actym Therapeutics, Inc. Engineered immunostimulatory bacterial strains and uses thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104471057A (zh) * 2012-05-04 2015-03-25 香港大学 经修饰的细菌和它们用于治疗癌症或肿瘤的用途
CN108660148A (zh) * 2018-05-29 2018-10-16 奇元科技（武汉）有限公司 一种基于基因改造益生菌表达外源药物的方法及其应用
WO2020172462A1 (en) * 2019-02-22 2020-08-27 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Tumor-navigating, self-eradicating, trail-armed salmonella for precision cancer therapy

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bin Yu等.Explicit hypoxia targeting with tumor suppression by creating an ‘‘obligate’’ anaerobic Salmonella Typhimurium strain.《SCIENTIFIC REPORTS》.2016,摘要，第2页左栏第4段. *
Explicit hypoxia targeting with tumor suppression by creating an ‘‘obligate’’ anaerobic Salmonella Typhimurium strain;Bin Yu等;《SCIENTIFIC REPORTS》;摘要，第2页左栏第4段 *
Immunotherapy with engineered bacteria by targeting the STING pathway for anti-tumor immunity;Daniel S. Leventhal等;《Nature Communications》;摘要 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114456992A (zh) 2022-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2844736B1 (en) Modified bacteria and uses thereof for treatment of cancer or tumor
US9198950B2 (en) Recombinant bacterium comprising a toxin/antitoxin system
CN102741407B (zh) 转化用质粒
Huang et al. Alteration of the gut microbiome and immune factors of grass carp infected with Aeromonas veronii and screening of an antagonistic bacterial strain (Streptomyces flavotricini)
CN104837506A (zh) 免疫调节性小细胞及使用方法
KR20100134765A (ko) 혐기성 질환을 위한 치료제
CN101155911A (zh) 5-氟尿嘧啶耐受菌及其制备方法
CN109153706B (zh) 源自乳酸菌的p8蛋白质及其的抗癌用途
Tirandaz et al. Efficient tumor targeting by anaerobic butyrate-producing bacteria
ES2260985B1 (es) Procedimiento de regulacion de la expresion de proteinas heterologas controladas por derivados salicilicos en microorganismos asociados a organismos superiores.
CN114438111B (zh) Pp2严格厌氧沙门氏菌菌株构建及其在肿瘤治疗方面应用
CN114456992B (zh) “自体裂解”沙门氏菌菌株、其制备方法及其在肿瘤治疗中的应用
CN116426406B (zh) 一种唾液联合乳杆菌dy802及其应用
WO2022094865A1 (zh) "自体裂解"沙门氏菌菌株、其制备方法及其在肿瘤治疗中的应用
KR20140107954A (ko) 약독화된 박테리아와 ＩＬ－１β를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물
WO2022094847A1 (zh) 工程细菌的细胞裂解液及其在肿瘤治疗中的应用
WO2022094864A1 (zh) 构建严格厌氧沙门氏菌的方法，所构建的严格厌氧沙门氏菌及其应用
CN114525295A (zh) 构建严格厌氧沙门氏菌的方法，所构建的严格厌氧沙门氏菌及其应用
CN114522184A (zh) 工程细菌的细胞裂解液及其在肿瘤治疗中的应用
WO2022094867A1 (zh) Pp2严格厌氧沙门氏菌菌株构建及其在肿瘤治疗方面应用
CN115717120A (zh) 可控生长工程菌及其构建方法和应用
CN116478895B (zh) 重组鼠伤寒沙门氏菌基因工程菌hcs1、菌剂及其应用
KR101660294B1 (ko) glmS 기반의 숙주 벡터 시스템
CN107513516B (zh) 不溶血无乳链球菌WC1535△cyl及其构建和应用
WO2024019378A1 (ko) 코난토킨-g의 분비를 위한 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된 약독화 살모넬라 균주

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant