转化用质粒
技术领域
本发明涉及用于制作转化厌氧菌的、具有包含在厌氧菌中发挥功能的分泌信号肽的表达盒且为非穿梭质粒的转化用质粒,所述转化厌氧菌作为实体瘤等缺氧疾病治疗用基因转运载体是有用的。此外,本发明涉及包含由用该转化用质粒转化了的厌氧菌构成的基因转运载体、含有该基因转运载体的药物组合物和含有该基因转运载体的缺氧疾病治疗剂。
进而,本发明还涉及对制作该缺氧疾病治疗用转化厌氧菌有用的、包含编码新的分泌信号肽的碱基序列的DNA片段。
背景技术
近些年来,治疗恶性肿瘤的方法中,将转化厌氧菌用作基因转运载体的方法已经引起了注意,例如,已经提出了使用转化的梭菌(Clostridium)将能把抗肿瘤物质前药转变为抗肿瘤物质的酶的硝基还原酶的表达基因转运至肿瘤位置的方法等(参见专利文献1至3)。
进而,还在讨论用侵袭性厌氧菌例如沙门氏菌、肠侵袭性大肠杆菌、李斯特菌(Listeria)、志贺氏菌(Shigella)等,通过对肿瘤细胞的RNA干扰(RNAinterfering,RNAi),转运能消灭与缺氧疾病因子有关的基因或阻碍其表达的核酸(siRNAs;小型干扰RNAS(small interfering RNAs)、短链干扰RNAS(short interfering RNAs)或小发夹RNAS(short hairpin RNAs))的表达基因的方法(参见专利文献4至6)。
但是,这些微生物都是将致病菌变异为低毒性的微生物,不能否认其有可能进行反向变异而恢复为原来的致病菌,发挥有害性,进而,由于局域运动性、侵袭性,因此不仅在疾病组织而且在正常组织也发挥作用,可能产生全身性的副作用症状等,存在安全性方面的问题。
本发明人等着眼于存在于人肠道内而形成菌群的非致病性的肠内细菌、已知是极其安全的兼性厌氧性细菌的双歧杆菌,开发了使用该双歧杆菌的转化体菌的恶性肿瘤的治疗方法。
于是,开发了转化了的长双歧杆菌105A,使得其表达能将5-氟尿嘧啶(以下称为5-FU)的前药5-氟胞嘧啶(以下称为5-FC)转变为5-FU的酶—胞嘧啶脱氨酶(以下称为CD)(参见专利文献7、8)。
该转化体双歧杆菌具有在将其通过静脉内的方式给予实体瘤动物模型时,在低氧状体的缺氧疾病组织中特异性地建群、增殖,而在没有缺氧环境下的正常组织中迅速消失的特点。(参照非专利文献1、2)
进而,该转化体双歧杆菌还具有即时静脉给药时也不显示抗原性的特点,可以期待其作为极其优异的恶性肿瘤治疗剂。
这些转化体双歧杆菌由于是使用大肠杆菌-双歧杆菌的穿梭质粒pBLES100-S-eCD、pAV001-HU-eCD-M968等被转化,因此横向转移到大肠杆菌时,可能在该大肠杆菌中复制。为了解决该课题,本发明人等进行了质粒的改良,开发了不具有在大肠杆菌中发挥功能的复制起点的非穿梭质粒pBifiCD(参照专利文献9)。
另一方面,这些非穿梭质粒由于不具有分泌信号,这些转化体双歧杆菌没能将表达了的CD分泌到菌体外。
因此,需要开发在双歧杆菌中发挥功能,可以将表达蛋白等分泌到菌体外的分泌信号肽。
作为双歧杆菌的分泌蛋白,报道了例如青春双歧杆菌的淀粉酶、短双歧杆菌的SeC1、SeC2、SeC3等,还报道了导入有这些分泌信号的质粒。
例如,报道了导入有青春双歧杆菌的淀粉酶的分泌信号肽基因的、用大肠杆菌-双歧杆菌的穿梭质粒pYBamy59转化了的长双歧杆菌MG1。(参照非专利文献3)
另外,还报道了导入有短双歧杆菌SeC2的分泌信号肽和成纤维细胞生长因子2(FGF2)的融合基因的、用大肠杆菌-双歧杆菌的穿梭质粒pESH86、pESH87等转化了的短双歧杆菌UCC2003等。(参照非专利文献4)
另外,还报道了包含来自双歧杆菌属细菌的启动子以及信号序列、特别是BL1181基因产物的信号或aMyB基因产物的信号序列的表达盒,实际上确认了在短双歧杆菌以及长双歧杆菌中表达蛋白的显著的分泌(专利文献10)。
但是,上述的质粒均为大肠杆菌-双歧杆菌的穿梭质粒,而对于如本发明这样的、是不具有在大肠杆菌中发挥功能的复制起点的非穿梭质粒且具有在双 歧杆菌中发挥功能的分泌信号的质粒,还是未知的。另外,这些分泌信号都还不明确是否在确认了的菌株以外的菌株中发挥功能,推测转化了的菌的目的蛋白的分泌量也少。因此,期待开发出可以发挥优异的分泌功能的、实用性高的分泌信号肽。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:美国专利第6416754号
专利文献2:美国专利第6652849号
专利文献3:美国专利公开2003/0103952号公报
专利文献4:日本特表2008-519002号公报
专利文献5:日本特开2008-92956号公报;国际公开WO2006-066048号公报
专利文献6:国际公开WO2008-091375号公报
专利文献7:日本特开2002-97144号公报
专利文献8:国际公开WO2007-136107号公报
专利文献9:国际公开WO2009-128272号公报
专利文献10:国际公开WO2010-126073号公报
非专利文献
非专利文献1:Yazawa et al,,Cancer Gene Ther.,7,269-274(2000)
非专利文献2:Yazawa et al.,Breast Cancer Res.Treat.,66,165-170(2001)
非专利文献3:Seong et al.,Biotechnology Letters,2006,Vol.28:pp 163-168
非专利文献4:Shkoporov et al.,Biotechnology Letters,2008 Vol.30:pp1983-1988
发明概述
技术问题
本发明的课题是提供用于制作转化厌氧菌的转化用质粒、用该转化用质粒转化了的转化厌氧菌、包含该转化厌氧菌的基因转运载体、含有该基因转运载体的药物组合物以及含有该转化厌氧菌的缺氧疾病治疗剂,所述转化用质粒是具有在厌氧菌中发挥功能的分泌信号且不具有在该厌氧菌以外的菌中发挥功 能的复制起点的非穿梭质粒。
另外,本发明的另一个课题是,提供包含由该转化用质粒转化了的转化厌氧菌的基因转运载体、含有该基因转运载体的药物组合物以及含有该耐性菌的缺氧疾病治疗剂。
再另外,本发明的另一个课题是,提供在例如长双歧杆菌105A等中发挥功能的新的分泌信号。
问题解决方法
本发明人等,之前,制作了插入有表达具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白中的CD的基因的质粒pBLES100-S-eCD、pAV001-HU-eCD-M968等。发现并报道了:使用其重组的专性厌氧菌,例如长双歧杆菌105A/pBLES 100-S-eCD、长双歧杆菌105A/pAV001-HU-eCD-M968等可以期待作为有用的恶性肿瘤的治疗剂。(专利文献7、8)
上述专利文献7、8的转化菌的制作中所用的质粒pBLES100-S-eCD和pAV001-HU-eCD-M968均是大肠杆菌-双歧杆菌的穿梭质粒,因此其横向转移到大肠杆菌时,可能在该大肠杆菌中被复制。
但是,使用转化基因转运载体的实体瘤的治疗方法中,非常重要的是,所用的基因转运载体的转化基因不向该基因转运载体以外的、致病菌或好氧性或者兼性厌氧菌横向转移,进而即使发生了横向转移也不在该菌中复制。因此,需要不具有转化菌以外的菌中发挥功能的复制起点的、即在转化菌以外的菌中不相互复制的非穿梭质粒。
本发明者人等为了解决该课题,进行了质粒的改良,开发出了不具有在大肠杆菌中发挥功能的复制起点的非穿梭质粒pBifiCD。(专利文献9)
另一方面,这些质粒由于都是不具有分泌信号的转化用质粒,因此使用其重组的转化菌不将表达的CD分泌到菌体外,CD表达量不直接反映CD酶活性、即药效的问题依然存在。
进而,在不是CD这样的将前药转变为抗肿瘤物质的酶而是产生抗肿瘤性蛋白、核酸等的菌的情况下,需要使所产生的抗肿瘤物质放出到菌体外,因此,需要在缺氧疾病组织中增殖后,杀死破坏菌。因此得出结论:具有在专性厌氧菌、特别是双歧杆菌中发挥功能的分泌信号的转化用质粒是更好的。于是进行潜心 研究,从而完成了本发明。
即,本发明涉及
<1>转化用质粒,是用于制作转化厌氧菌的质粒,其具有包含在厌氧菌中发挥功能的分泌信号的表达盒,并且是非穿梭质粒。
<2>如<1>所述的质粒,其中厌氧菌是双歧杆菌。
<3>如<1>或<2>所述的转化用质粒,其中分泌信号肽来自双歧杆菌。
<4>如<3>所述的转化用质粒,其中分泌信号肽来自长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。
<5>如<1>至<4>中任一项所述的转化用质粒,其中分泌信号是由序列号6~28的碱基序列或其序列的1个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列的任一种所示的DNA。
<6>如<5>所述的转化用质粒,其中分泌信号是由序列号6、7、8、9、12、14、15、17、21、25或28的碱基序列或其序列的1个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列。
<7>如<6>所述的转化用质粒,其中分泌信号是由序列号8或25的碱基序列的任一种所示的DNA或其单核苷酸多态性。
<8>如<1>至<7>中任一项所述的转化用质粒,其中编码表达盒所含的启动子的基因是由序列号29~44的启动子区域的碱基序列或者序列号45的碱基序列或其序列的1个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列的任一种所示的DNA。
<9>如<8>所述的转化用质粒,其中表达盒所含的启动子基因是由序列号35的启动子区域的碱基序列或者序列号45的碱基序列或其序列的1个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列的任一种所示的DNA。
<10>如<1>至<9>中任一项所述的转化用质粒,其中表达盒所含的终止子基因是由序列号46的碱基序列或其序列的1个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列的任一种所示的DNA。
<11>如<1>至<10>中任一项所述的转化用质粒,其中表达盒所含的靶基因是编码荧光蛋白的基因。
<12>如<1>至<10>中任一项所述的转化用质粒,其中表达盒所含的靶基因是编码具有抗肿瘤活性的蛋白的基因。
<13>如<12>所述的转化用质粒,其中具有抗肿瘤活性的蛋白是选自干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)-α、淋巴毒素(LT)-β、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、白血病抑制因子(LIF)、T细胞活化共刺激因子B7(CD80)和B7-2(CD86)、KIT配体、制瘤素M等细胞因子,以及内皮抑制素、血管抑制素(angiostatin)、三环(kringle)1、三环2、三环3、三环4、三环5等血管发生抑制物质中的一种。
<14>如<13>所述的转化用质粒,其中具有抗肿瘤活性的蛋白是肿瘤坏死因子(TNF)-α或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)中的任一者。
<15>如<1>至<10>中任一项所述的转化用质粒,其中靶基因是是编码具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白的基因。
<16>如<15>所述的转化用质粒,其中具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白是选自胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶和β-葡糖醛酸糖苷酶中的一种。
<17>如<1>至<10>中任一项所述的转化用质粒,其中靶基因是是编码具有缺血性疾病治疗活性的蛋白的基因。
<18>如<17>所述的转化用质粒,其中具有缺血性疾病治疗活性的蛋白是选自成纤维细胞生长因子2(FGF2)、内皮细胞生长因子(ECGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)等具有血管生成促进活性的蛋白中的一种。
<19>如<1>至<10>中任一项所述的转化用质粒,其中靶基因是是具有缺氧疾病治疗活性的核酸。
<20>如<19>所述的转化用质粒,其中具有缺氧疾病治疗活性的核酸是与选自成纤维细胞生长因子2(FGF2)、内皮细胞生长因子(ECGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)等中的至少一种肿瘤细胞增殖因子有关的siRNAs。
<21>如<1>至<20>中任一项所述的转化用质粒(pBifi-SP3B-TNF alpha),其包含由序列号5的碱基序列或其序列的1个或多个碱基缺失、置换或增添后 的序列的任一种所示的DNA序列。
<22>基因转运载体,包含用<1>至<21>中任一项所述的转化用质粒转化厌氧菌。
<23>如<22>所述的基因转运载体,其中所述厌氧菌是非致病性的肠内细菌。
<24>如<22>或<23>所述的基因转运载体,其中所述厌氧菌是双歧杆菌。
<25>如<24>所述的基因转运载体,其中所述双歧杆菌是选自青春双歧杆菌、埃氏双岐杆菌、动物双歧杆菌、星状双歧杆菌、双歧双歧杆菌、牛双歧杆菌、短双歧杆菌、链状双歧杆菌、小猪双歧杆菌、棒状双歧杆菌、兔双歧杆菌、寓齿双歧杆菌、齿双歧杆菌、没食子双歧杆菌、鸡肠双歧杆菌、球双歧杆菌、印度双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、奇异双歧杆菌、乳双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、利拜洛拉姆双歧杆菌(ビフイドバクテリウム·リベロラム)、长双歧杆菌、大双歧杆菌、瘤胃双歧杆菌、最小双歧杆菌、摩恩格里艾恩斯双歧杆菌(ビフイドバクテリウム·モンゴリエンス)、帕鲁布罗拉姆双歧杆菌(ビフイドバクテリウム·パルブロラム)、假小链双歧杆菌、假长双歧杆菌、萨伊库拉埃罗胡拉姆双歧杆菌(ビフイドバクテリウム·サイクラエロフイラム)、小鸡双歧杆菌、瘤胃双歧杆菌、反刍双歧杆菌、波伦亚双歧杆菌、苏卡鲁道维伊双歧杆菌(ビフイドバクテリウム·スカルドヴイ)、细长双歧杆菌、猪双歧杆菌、Thermacidophilum双歧杆菌和嗜热双歧杆菌中的1种。
<26>如<25>所述的基因转运载体,其中所述双歧杆菌是长双歧杆菌。
<27>如<22>至<26>中任一项所述的基因转运载体,它能够在缺氧环境中的肿瘤组织中生长,并且能够表达、分泌至少一种对缺氧疾病的诊断或治疗有用的蛋白或核酸。
<28>如<27>所述的基因转运载体,其中对缺氧疾病的诊断有用的蛋白是荧光蛋白。
<29>如<27>所述的基因转运载体,其中对缺氧疾病的治疗有用的蛋白是具有抗肿瘤活性的蛋白。
<30>如<28>所述的基因转运载体,其中具有抗肿瘤活性的蛋白是选自干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、 IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)-α、淋巴毒素(LT)-β、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、白血病抑制因子(LIF)、T细胞活化共刺激因子B7(CD80)和B7-2(CD86)、KIT配体、制瘤素M等细胞因子,以及内皮抑制素、血管抑制素(angiostatin)、三环(kringle)1、三环2、三环3、三环4、三环5等血管发生抑制物质中的一种。
<31>如<27>所述的基因转运载体,其中对缺氧疾病的治疗有用的蛋白是具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白。
<32>如<31>所述的基因转运载体,其中具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白是选自胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶和β-葡糖醛酸糖苷酶中的1种。
<33>如<27>所述的基因转运载体,其中对缺氧疾病的治疗有用的核酸是与缺氧疾病因子有关的siRNAs。
<34>如<33>所述的基因转运载体,其中与缺氧疾病因子有关的siRNAs是与选自成纤维细胞生长因子2(FGF2)、内皮细胞生长因子(ECGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)等中的至少一种肿瘤细胞增殖因子有关的siRNAs。
<35>药物组合物,包含<22>至<34>中任一项所述的基因转运载体。
<36>编码来自长双歧杆菌的分泌信号肽的DNA。
<37>如<36>所述的编码分泌信号肽的DNA,其包含由序列号6~28的碱基序列或其序列的1个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列的任一种所示的DNA序列。
<38>由<36>或<37>所述的DNA编码的分泌信号肽。
<39>包含<36>或<37>所述的DNA的转化用质粒。
<40>如<39>所述的转化用质粒,它进一步包含编码对缺氧疾病的诊断或治疗有用的蛋白或核酸的DNA。
<41>如<40>所述的转化用质粒,其中对缺氧疾病的诊断有用的蛋白是荧光蛋白。
<42>如<40>所述的转化用质粒,其中对缺氧疾病的治疗有用的蛋白是具有抗肿瘤活性的蛋白。
<43>如<42>所述的转化用质粒,其中具有抗肿瘤活性的蛋白是选自干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)-α、淋巴毒素(LT)-β、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、白血病抑制因子(LIF)、T细胞活化共刺激因子B7(CD80)和B7-2(CD86)、KIT配体、制瘤素M等细胞因子,以及内皮抑制素、血管抑制素(angiostatin)、三环(kringle)1、三环2、三环3、三环4、三环5等血管发生抑制物质中的一种。
<44>如<40>所述的转化用质粒,其中对缺氧疾病的治疗有用的蛋白是具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白。
<45>如<44>所述的转化用质粒,其中具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白是选自胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶和β-葡糖醛酸糖苷酶中的1种。
<46>如<40>所述的转化用质粒,其中对缺氧疾病的治疗有用的核酸是与缺氧疾病因子有关的siRNAs。
<47>如<46>所述的转化用质粒,其中与缺氧疾病因子有关的siRNAs是与选自成纤维细胞生长因子2(FGF2)、内皮细胞生长因子(ECGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)等中的至少一种肿瘤细胞增殖因子有关的siRNAs。
<48>基因转运载体,其为用<39>至<47>中任一项所述的转化用质粒转化了的厌氧菌。
<49>如<48>所述的基因转运载体,其中所述厌氧菌是双歧杆菌。
<50>如<49>所述的基因转运载体,其中所述双歧杆菌是选自青春双歧杆菌、埃氏双岐杆菌、动物双歧杆菌、星状双歧杆菌、双歧双歧杆菌、牛双歧杆菌、短双歧杆菌、链状双歧杆菌、小猪双歧杆菌、棒状双歧杆菌、兔双歧杆菌、寓齿双歧杆菌、齿双歧杆菌、没食子双歧杆菌、鸡肠双歧杆菌、球双歧杆菌、印度双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、奇异双歧杆菌、乳双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、利拜洛拉姆双歧杆菌(ビフイドバクテリウム·リベロラム)、长双歧杆菌、大双歧杆菌、瘤胃双歧杆菌、最小双歧杆菌、摩恩格里艾恩斯双歧杆菌(ビフイ ドバクテリウム·モンゴリエンス)、帕鲁布罗拉姆双歧杆菌(ビフイドバクテリウム·パルブロラム)、假小链双歧杆菌、假长双歧杆菌、萨伊库拉埃罗胡拉姆双歧杆菌(ビフイドバクテリウム·サイクラエロフイラム)、小鸡双歧杆菌、瘤胃双歧杆菌、反刍双歧杆菌、波伦亚双歧杆菌、苏卡鲁道维伊双歧杆菌(ビフイドバクテリウム·スカルドヴイ)、细长双歧杆菌、猪双歧杆菌、Thermacidophilum双歧杆菌和嗜热双歧杆菌中的1种。
<51>如<50>所述的基因转运载体,其中所述双歧杆菌是长双歧杆菌。
<52>药物组合物,包含<48>至<51>中任一项所述的基因转运载体。
发明的效果
本发明的质粒具有具有分泌信号的表达盒且是非穿梭质粒,是对于制作实体瘤等缺氧疾病治疗用转化厌氧菌来说有用的新型质粒。本发明的质粒不具有在转化菌以外菌中发挥功能的复制起点,是在转化菌以外的菌中不相互复制的非穿梭质粒,因此是非常安全的载体。
用本发明的转化用质粒转化了的厌氧菌进行缺氧疾病组织特异性地建群、增殖,在该疾病组织,可以产生、分泌具有缺氧疾病治疗活性的蛋白或核酸,作为缺氧疾病治疗剂是非常有用的,可以期待其成为高品质的基因转运载体。
进而,本发明的新型分泌信号,如上所述,除了插入到质粒中以外,通过将其直接组入厌氧菌的基因组,也可以制作对缺氧疾病治疗有用的、转化厌氧菌。
附图说明
[图1]图1是表示分泌型GFP表达质粒(pSPxA-GFP)的构建概要的工序图。
[图2]图2是表示分泌型GFP表达质粒(pSPxB-GFP)的构建概要的工序图。
[图3]图3是表示分泌型GFP表达质粒(pSec2-GFP)的构建概要的工序图。
[图4]图4是表示B.longum 105A/pSP3B-GFP、B.longum105A/pSP7B-GFP、B.longum 105A/pSP23B-GFP、B.longum 105A/pSP7A-GFP以及B.longum 105A/pSec2-GFP的免疫印迹的结果的图。图中,C表示细胞内蛋白质提取物的条带,T表示培养上清浓缩物的条带,纵轴的数值表示分子量 (kDa)。
[图5]图5是表示分泌型TNFα表达质粒(pSPxA-TNF alpha)的构建概要的工序图。
[图6]图6是表示分泌型TNFα表达质粒(pSPxB-TNF alpha)的构建概要的工序图。
[图7]图7是表示分泌型TNFα表达质粒(pSec2-TNF alpha)的构建概要的工序图。
[图8]图8是表示B.longum 105A/pSP1B-TNF alpha、B.longum105A/pSP3B-TNF alpha、B.longum 105A/pSP4B-TNF alpha、B.longum105A/pSP7B-TNF alpha、B.longum 105A/pSP12B-TNF alpha、B.longum105A/pSP 16B-TNF alpha、B.longum 105A/pSP23B-TNF alpha、B.longum105A/pSP7A-TNF alpha以及B.longum 105A/pSec2-TNF alpha的免疫印迹的图。图中、C表示细胞内蛋白提取物的条带,T表示培养上清浓缩物的条带,S表示培养上清的条带,纵轴的数值表示分子量(kDa)。
[图9]图9是表示B.longum 105A以及B.longum 105A/pTNF3的免疫印迹の结果的图。纵轴的数值表示分子量(kDa)。
[图10]图10是表示质粒pBifi-SP3B-TNF alpha构建的概要的工序图。
[图11]图11是表示Bifidobacterium longum 105A/pBifiSP3B-TNF alphaの免疫印迹的图。条带1的分子量标准从下往上分别是20、30、40、50、60以及80kDa。
[图12]图12是表示TNFα表达质粒(pTNF3)的构建概要的工序图。
[图13]图13是表示具有不含插入物的蛋白表达单元的mock质粒(pBEshuttle)的构建概要的工序图。
[图14]图14是表示TNFα的细胞毒性试验的结果的曲线图。
[图15]图15是表示分泌型TNFα表达质粒B.longum 105A/pSP3B-TNFalpha以及B.breve/pSP3B-TNF alpha的、小鼠的in vivo抗肿瘤效果测定实验中的肿瘤体积的经日变化的结果的曲线图。
[图16]图16是表示分泌型TNFα表达质粒B.longum 105A/pSP3B-TNFalpha的、阿霉素并用下的小鼠的in vivo抗肿瘤效果测定实验中的肿瘤体积的经日变化的结果的曲线图。
[图17]图17是表示非分泌型人类IL-18表达质粒phIL18mut-His的构建概要的工序图。
[图18]图18是表示分泌型人类IL-18表达质粒pSP3B-hIL18mut的构建概要的工序图。
本申请说明书中所说的非穿梭质粒的意思是,具有仅在转化对象的厌氧菌中发挥功能的复制起点、不具有在其以外的菌中发挥功能的复制起点、在转化厌氧菌和转化厌氧菌以外的菌中不相互复制的质粒。
本申请说明书中所说的分泌信号的意思是,包含编码分泌信号肽的碱基序列的DNA片段(有时也简称为分泌信号肽基因)。
本申请说明书中,编码具有抗肿瘤活性的蛋白的DNA、编码具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白的DNA、以及编码具有缺血性疾病治疗活性的蛋白的DNA等,有时也称为“编码目的蛋白的DNA”。
本申请说明书中所说的“siRNAs”包括被称作小型干扰RNA(small interfering RNA)或短链干扰RNA(short interfering RNA)的siRNA以及、在靶细胞内被切割酶(Dicer)等酶切断而成为siRNA的短链发夹RNA(short hairpin RNA、SHRNA)。另外,有时也包括siRNA修饰体和siRNA复合体而进行总称。
本申请说明书中所说的“表达盒”是指包含启动子、编码表达蛋白的基因(靶基因)、终止子等表达单元、进而还可以包含任意其他的有用单元的、用于使特定蛋白或肽片段表达的一套基因。作为其他的有用单元,可以举出例如编码分泌信号等信号肽的基因、编码标识蛋白的基因等。
本发明涉及用于制作转化厌氧菌的质粒,该转化用质粒具有包含在厌氧菌中发挥功能的分泌信号的表达盒,且是非穿梭质粒。
作为在实体瘤、缺血性疾病等疾病部位处于厌氧环境下的疾病(以下、称为缺氧疾病)的治疗中所用的转化基因转运载体,从安全性的观点考虑,需要使非致病性的。
进而,仅在处于厌氧状态的疾病组织等中建群、增殖,而在非厌氧状态的正常的组织中不建群、增殖的专性厌氧菌是更优选的。
本发明者人等对使用作为专性厌氧菌的双歧杆菌的恶性肿瘤的治疗方法就行了反复研究,开发了组入了将前药5-FC转变为抗肿瘤物质5-FU的酶 的CD的基因的质粒转化了的长双歧杆菌105A。(专利文献7、8)
对于这些转化体双歧杆菌,确认了:在以静脉内方式给予缺氧疾病的实体瘤模型动物时,在处于低酸素状态的缺氧疾病组织中特异性地建群、增殖,而在非低酸素状态的正常组织中迅速消失。(参照非专利文献1、2)
但是,上述专利文献7、8的转化体双歧杆菌由于是使用菌-双歧杆菌的穿梭质粒pBLES100-S-eCD、pAV001-HU-eCD-M968等转化的,因此在横向转移到大肠杆菌时,有可能在该大肠杆菌中复制。
因此,本发明人等,为了解决该课题,进行了质粒的改良,开发了不具有在大肠杆菌中发挥功能的复制起点的非穿梭质粒pBifiCD。(专利文献9)
使用这些转化菌的恶性肿瘤的治疗方法,即酶-前药疗法(CD-5-FC疗法)中,为了尽量降低抗肿瘤物质5-FU的副作用,希望抗肿瘤物质5-FU肿瘤组织特异性地发挥作用,因此本发明人等,为了使产生的CD不分泌到菌体外,将被摄入菌体内的5-FC转变为5-FU而排出到菌体外,仅在肿瘤组织发挥5-FU的抗肿瘤作用,从而对这些转化体双歧杆菌均用不具有分泌信号的质粒进行了转化。
这些用不具有分泌信号的质粒转化了的双歧杆菌,从在处于低酸素状态的缺氧疾病组织中特异性地建群、增殖的特征和酶CD停留于在缺氧疾病组织中特异性地建群、增殖了菌的内部的特征这两方面,具有可以消除抗肿瘤物质5-FU的全身的副作用的优点,但另一方面,同时发现了以下问题:5-FU的生成量并不是转化体双歧杆菌所产生的CD量,而与摄入菌体内的5-FC的量相关,所产生的CD的酶功能不能充分发挥。
另外,在不是CD这样的将前药转变为抗肿瘤物质的酶而是产生抗肿瘤性蛋白、核酸等的菌的情况下,为了使所产生的抗肿瘤物质放出到菌体外,需要在缺氧疾病组织中增殖后,杀死破坏菌。
为了解决这些问题,着手开发在厌氧菌、优选非致病性的专性厌氧菌中发挥功能、具有使产生的活性物质分泌的分泌信号的质粒,开发了对该质粒制作有用的、至少在厌氧菌中发挥功能、表现出优异的表达蛋白的分泌作用的分泌信号肽。
另外,使用转化基因转运载体的实体瘤等的治疗方法中,如上所述,非常重要的是,所用的基因转运载体的转化基因不向该基因转运载体以外的、致病 菌或好氧性或者兼性厌氧菌中横向转移,进而,即使横向转移了也不在该菌中复制。
因此,对于上述具有分泌信号的质粒,优选是不具有在转化菌以外的菌中发挥功能的复制起点的非穿梭质粒。
本发明的质粒是转化厌氧菌制作用的质粒,是具有包含至少在厌氧菌中发挥功能的分泌信号的表达盒的质粒。而且是不具有在转化菌以外的菌中发挥功能的复制起点、在转化菌以外的菌中不相互复制的非穿梭质粒。
更具体地,是至少在双歧杆菌中发挥功能、具有含有优异的分泌作用的分泌信号的表达盒、而且、不具有在转化菌以外的菌中发挥功能的复制起点、在转化菌以外的菌中不相互复制的转化厌氧菌制作用的质粒。
本发明的转化用质粒是的特征是:通过使用该质粒,能够表达任意的目的蛋白或核酸,进而可以制作通过表达盒所含的分泌信号肽的作用发挥优异的实用性高的分泌功能的转化厌氧菌。
进而,本发明的转化用质粒的特征是:是不具有在转化菌以外的菌中发挥功能的复制起点、在转化菌以外的菌中不相互复制的非穿梭质粒载体。
至今,作为在厌氧菌、特别是双歧杆菌中发挥功能的信号肽,报道有例如青春双歧杆菌的淀粉酶、短双歧杆菌的SeC1、SeC2、SeC3等,还报道了导入有它们的分泌信号的质粒。但是,推测这些质粒转化了的双歧杆菌的目的蛋白质的分泌量少。
而且,克隆该青春双歧杆菌的淀粉酶的分泌信号以及启动子区域,将它们与编码UV优化绿色荧光蛋白变异体(GFPUv;CLONTECH Laboratories,Inc.)的基因组合而制作质粒,对于用该质粒转化的长双歧杆菌,确认其表达蛋白(GFP)的分泌功能,结果没有显示GFP的分泌功能,推定该分泌信号肽不可以分泌任意的目的蛋白。
进而,至今报道的将表达蛋白分泌到菌体外的转化厌氧菌制作用的质粒载体是将来自大肠杆菌的质粒和来自转化菌的质粒融合后的、在大肠杆菌和转化菌双方中发挥功能的穿梭载体,没有报道过仅在大肠杆菌以外的转化菌中发挥功能的转化用质粒。
本发明的转化用质粒所具有的在厌氧菌中发挥功能的分泌信号肽,只要是至少在厌氧菌中发挥功能的分泌信号肽则可以使用任意的分泌信号肽,优选在 双歧杆菌中发挥功能的分泌信号肽。从对转化菌的毒性、功能性的观点考虑,更优选来自双歧杆菌的分泌信号肽,进一步优选来自长双歧杆菌菌的分泌信号肽。作为来自长双歧杆菌菌的分泌信号肽,例如,可以例示出由序列号6~28的任一碱基序列或其1个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列表示的DNA编码的分泌信号肽等。这些之中,从高分泌功能的角度考虑,优选由序列号6、7、8、9、12、14、15、17、21、25或28的任一碱基序列或其1个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列表示的DNA编码的分泌信号肽,更优选由序列号8或25的任一碱基序列或其1个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列表示的DNA编码的分泌信号肽。
另外,作为本发明的转化用质粒所具有的、表达盒中的启动子,只要是在厌氧菌中发挥功能、作为分泌信号肽的启动子来发挥功能,则可以使任意的启动子,例如可以举出与来自双歧杆菌的分泌信号肽的上游相邻的启动子(promoter X)或编码在双歧杆菌中发挥功能的组织蛋白样DNA结合蛋白的基因的启动子(HU promoter)等。具体地,可以举出由序列号29~44的任一个所表示的碱基序列的启动子区域的DNA以及序列号45所表示的碱基序列或其1个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列的DNA编码的启动子。在这些之中,优选由序列号35所表示的碱基序列的启动子区域的DNA或者其单核苷酸多态性编码的启动子或HU启动子,更优选HU启动子,尤其优选由序列号45的碱基序列或其1个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列所表示的DNA编码的启动子。
进而,作为本发明的转化用质粒所具有的终止子,只要是在双歧杆菌中发挥功能、作为分泌信号肽的终止子发挥功能,则可以是任意的终止子,优选编码在双歧杆菌中发挥功能的组织蛋白样DNA结合蛋白的基因的终止子(HUterminator),特别是序列号46的碱基序列或其1个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列所表示的DNA是尤其优选的。
这里,本发明中所说的“一碱基变异体”的意思是至少1处的碱基发生了变异的单核苷酸多态性(以下称为SNP),不仅包括1处的SNP,还包括多处的SNP。因此,能够与“1个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列”相互替换。
作为编码本发明的转化用质粒所具有的分泌的目的蛋白或核酸的基因(即靶基因),例如,只要是编码荧光蛋白的基因、编码具有抗肿瘤活性的蛋白的 基因、编码具有缺血性疾病治疗活性的蛋白的基因、编码具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白的基因等基因,则可以任意使用。
作为荧光蛋白,可以举出各种绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)等。
另外,作为具有抗肿瘤活性的蛋白,可以举出例如细胞因子,作为具体的细胞因子可以举出,例如干扰素(IFN)-α、β和γ,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-1α、1β、2、3、4、6、7、10、12、13、15、18、肿瘤坏死因子(TNF)-α、淋巴毒素(LT)-β、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、白血病抑制因子(LIF)、T-细胞活化共刺激因子B7(CD80)和B7-2(CD86)、KIT配体和制瘤素M等。
另外,还可以举出内皮抑制素、血管抑制素(angiostatin)和三环(kringle)1、2、3、4和5等血管发生抑制物质。
作为具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白,可以举出胞嘧啶脱氨酶(以下称为CD),其是将5-氟胞嘧啶(以下称为5-FC)转变为抗肿瘤活性物质5-氟尿嘧啶(以下称为5-FU)的酶;硝基还原酶,其是将5-氮杂环丙基-2,4-二硝基苯甲酰胺(以下称为CB1945)转变为抗肿瘤活性烷化剂的酶;1型单纯疱疹病毒胸苷激酶(以下称为HSV1-TK),其是将更昔洛韦转变为抗肿瘤活性代谢产物的酶;以及β-葡糖醛酸糖苷酶,其是将葡糖醛酸化的抗肿瘤活性物质转变为抗肿瘤活性物质的酶;等。
进而,作为具有缺血性疾病治疗活性的蛋白,可以举出具有对缺血性疾病治疗有用的血管新生促进活性的蛋白,具体地,可以举出成纤维细胞生长因子2(FGF2)、内皮细胞生长因子(ECGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)等。
这些蛋白的序列在各种各样的生物中是已知的,基于其序列信息利用PCR法、人工基因合成等公知的方法,从而可以获得编码目的蛋白的DNA。
另外,作为具有处于厌氧环境下的疾病的治疗活性的核酸,可以举出与缺氧疾病因子有关的siRNAs,更具体地,可以举出与成纤维细胞生长因子2(FGF2)、内皮细胞生长因子(ECGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)等肿瘤细胞增殖因子有关的siRNAs。
同样地,这些核酸的序列也是已知的,基于其序列信息利用PCR法等公知的方法就可以获得。
本发明的质粒例如可以如下来制作。
例如,按照通常的方法,在具有在转化菌和转化菌以外的菌例如大肠杆菌中分别发挥功能的复制起点的穿梭质粒中,插入至少在双歧杆菌中发挥功能的分泌信号及其启动子基因,在其下游插入至少1种编码对所期望的缺氧疾病的诊断或治疗有用的蛋白的基因或核酸(靶基因),进而,在其下游插入在厌氧菌中发挥功能的终止子基因,从而可以制作穿梭质粒。
进而,按照希望,从该穿梭质粒中除去转化菌以外的菌的复制起点,从而可以制作非穿梭质粒。
需要说明的是,各工程中的操作可以根据文献记载等的公知的方法来进行。
本发明的缺氧疾病治疗用基因转运载体可以通过用上述本发明的转化用质粒按照基因工程学领域公知的方法将要转化的任意厌氧菌进行转化来制作。
用本发明的转化用质粒转化了的厌氧菌由于是用于实体瘤等缺氧疾病的治疗剂的物质,因此必须是专性厌氧性其是非致病性的,如果是梭菌或沙门氏菌(Salmonella)等致病性菌,则非致病性化后的菌即可,另外,如果是乳酸杆菌等兼性厌氧菌,则突变为专性厌氧性后的菌即可。
优选可以举出非致病性的厌氧性细菌,更优选可以举出非致病性的肠内细菌,其中特别优选双歧杆菌属细菌。
作为双歧杆菌属细菌,可以举出例如青春双歧杆菌、埃氏双岐杆菌、动物双歧杆菌、星状双歧杆菌、双歧双歧杆菌、牛双歧杆菌、短双歧杆菌、链状双歧杆菌、小猪双歧杆菌、棒状双歧杆菌、兔双歧杆菌、寓齿双歧杆菌、齿双歧杆菌、没食子双歧杆菌、鸡肠双歧杆菌、球双歧杆菌、印度双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、奇异双歧杆菌、乳双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、利拜洛拉姆双歧杆菌(ビフイドバクテリウム·リベロラム)、长双歧杆菌、大双歧杆菌、瘤胃双歧杆菌、最小双歧杆菌、摩恩格里艾恩斯双歧杆菌(ビフイドバクテリウム·モンゴリエンス)、帕鲁布罗拉姆双歧杆菌(ビフイドバクテリウム·パルブロラム)、假小链双歧杆菌、假长双歧杆菌、萨伊库拉埃罗胡拉姆双歧杆菌(ビフイドバクテリウム·サイクラエロフイラム)、小鸡双歧杆菌、瘤胃双歧杆菌、反刍 双歧杆菌、波伦亚双歧杆菌、苏卡鲁道维伊双歧杆菌(ビフイドバクテリウム·スカルドヴイ)、细长双歧杆菌、猪双歧杆菌、Thermacidophilum双歧杆菌和嗜热双歧杆菌等,尤其优选长双歧杆菌。
这些菌均为市售或可以容易从保藏机构获得的。例如,长双歧杆菌ATCC-15707、双歧双歧杆菌ATCC-11863、婴儿双歧杆菌ATCC-15697等可以容易地从ATCC(美国模式培养物保藏中心(The American Type Culture Collection))获得。
另外,对各菌的菌株没有特别限定,例如,对于长双歧杆菌的菌株,可以举出长双歧杆菌105-A株、长双歧杆菌aE-194B株、长双歧杆菌BS-601株、长双歧杆菌M101-2株,其中长双歧杆菌105-A株是优选的。
对于短双歧杆菌的菌株,例如可以举出短双歧杆菌标准株(JCM1192)、短双歧杆菌aS-1株、短双歧杆菌I-53-8W株,其中,短双歧杆菌标准株、短双歧杆菌aS-1株是优选的。
对于婴儿双歧杆菌的菌株については,例如可以举出婴儿双歧杆菌标准株(JCM1222)、婴儿双歧杆菌I-10-5株,其中,婴儿双歧杆菌标准株、婴儿双歧杆菌I-10-5株是优选的。
另外,对于乳双歧杆菌的菌株,例如可以举出乳双歧杆菌标准株(JCM1210)。
本发明的基因转运载体是包含通过本发明的转化用质粒转化了的上述厌氧菌的基因转运载体,是可以在处于厌氧环境下的组织内生长、且可以表达具有目标活性的蛋白、进而不会向转化菌以外的特别是致病性或好氧性菌或者兼性厌氧菌横向转移的基因转运载体。
本发明的基因转运载体的制作可以按照市售的实验教科书中记载的方法来进行,例如,基因手册(讲谈社)、高木康敬编著的基因操作实验法(讲谈社)、分子·克隆(Molecular Cloning)科尔德斯普林实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)(1982)、分子·克隆第2版(Molecular C1oning,2nd ed.)科尔德斯普林实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)(1989)、酶学方法(Methods in Enzymol.),194(1991)。
本发明的药物组合物只要含有本发明的基因转运载体则没有特别限制。另外,本发明的缺氧疾病治疗剂只要含有本发明的基因转运载体则没有特别限 制。
另外,本发明的药物组合物、缺氧疾病治疗剂也可以含有2种以上的本发明的基因转运载体。
进而,本发明的药物组合物、缺氧疾病治疗剂可以与含有本发明的基因转运载体以外的缺氧疾病治疗效果的化合物的药物组合物、厌氧性疾病治疗剂组合使用。
另外,本发明的药物组合物、缺氧疾病治疗剂在不妨碍本发明效果的范围内,还可以含有本发明的基因转运载体以外的任意成分。作为这样的任意成分,例如可以举出药理学上允许的载体、赋形剂、稀释剂等。
本发明的药物组合物、缺氧疾病治疗剂的剂型没有特别限制,例如可以举出含有本发明的基因转运载体的液体制剂或者固体制剂。液体制剂可以通过对本发明的基因转运载体的厌氧菌的培养液进行精制,根据需要向其中加入适当的生理盐水或者液体替换品或药物添加剂,并填装到安瓿、小瓶等来制造。另外,固体制剂可以通过向液体试剂添加合适的保护剂,用其填装安瓿、小瓶等,并且然后冻干或L-干燥而产生,或通过向液体试剂添加合适的保护剂,将其冻干或L-干燥,并且然后用其填装安瓿、小瓶等而产生。作为本发明的药物组合物、缺氧疾病治疗剂的给药方法,口服给药和肠胃外给药两者都是可以的,但肠胃外给药是优选的,例如可以进行静脉内注射、皮下注射、局部输注或脑室内给药,并且静脉内注射是最优选的。
本发明的药物组合物、缺氧疾病治疗剂的基因转运载体的给药量没有特殊限定,只要其对于在疾病位置生长和表达有效治疗剂量的活性蛋白是足够的量,但是,从经济观点和尽量避免副作用的观点出发,剂量优选地在能获得所需的治疗效果的范围内尽可能地小。
本发明的药物组合物、缺氧疾病治疗剂中的基因转运载体的给药量根据疾病的严重程度和患者的体重、年龄或性别适当选择,并且可以根据改善程度适当增加或减少。
例如,当将本发明的缺氧疾病治疗剂用作实体瘤治疗剂时,根据厌氧菌自身表现出的抗肿瘤活性、具有所使用的厌氧菌产生的抗肿瘤活性的蛋白等的种类、转变自抗肿瘤物质前体的抗肿瘤物质的有效治疗剂量、所使用的厌氧菌产生的活性蛋白的量等来适当地确定剂量
具体地,例如在静脉内给药的情况下,因为需要降低由于大量细菌引起的栓塞风险,所以优选将以尽可能低浓度的注射用制剂分为多次注射或用适当的液体代替品稀释注射并且通过连续输注给药。例如,在成人的情况下,将每天106~1012cfu每千克体重的本发明的厌氧菌的菌体分为1至多次、连续或适当间隔地进行给药,并且持续1天至多天。更具体地,每成人直接给予1mL至1000mL含有104~1010cfu/mL的本发明的厌氧菌的菌体,或用适当的液体代替品稀释,分为每天一次至多次进行给药,并且持续1天至连续几天
另外,在涉及直接对疾病组织直接给药的局部给药的情况下,因为需要细菌细胞在整个疾病组织中尽可能多地建群和增殖,所以在疾病组织的多个位置给予高浓度注射是可取得。例如,在成人的情况下,每天一次或多次给予106cfu至1012cfu每千克体重的本发明的双歧杆菌的菌体,视情况连续或间隔地进行给药,并且按照需要持续1天至多天。更具体地,每成人直接地给予1mL至1000mL含有104cfu/mL至1010cfu/mL的本发明的双歧杆菌的菌体直接地,优选每天一次至多次,并且按照需要连续地持续1天至几天。
当在治疗期间观察到疾病组织中的细菌已消失,则首先暂停治疗,然后以如以上相似的方式给予细菌。
需要说明的是,本发明中的“X和Y组合而成”X和Y在不同配置(configuration)的情况以及X和Y在相同配置的情况(例如含有X和Y的配置)。当X和Y在不同配置时,X和Y可以各自另外含有其他成分。
本发明的药物组合物、缺氧疾病治疗剂可以应用于厌氧环境下的疾病、优选各种实体瘤。作为实体瘤,可以举出大肠癌、脑瘤、头颈癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、胰腺癌、胰岛细胞癌、绒毛膜癌、结肠癌、肾细胞癌、肾上腺皮质癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、睾丸肿瘤、卵巢癌、子宫癌、甲状腺癌、恶性类癌瘤、皮肤癌、恶性黑色素瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、成神经细胞瘤、维尔姆斯肿瘤(Wilm’s tumor)、成视网膜细胞瘤、黑色素瘤和鳞癌等。
另外,在缺氧环境中的其他疾病的实例包括缺血性疾病,例如心肌梗死或闭塞性动脉硬化,以及下肢缺血性疾病,例如伯格病(Buerger’s disease)。
另外,本发明也还包含对于在特别是上述的质粒、基因转运载体或药物组合物中的使用有用的新型分泌信号肽。本发明人等首先,为了发现在双歧杆菌 中发挥功能、表现出优异的表达蛋白的分泌作用的分泌信号肽,进行了上述转化体双歧杆菌的亲代菌株长双歧杆菌105A的基因组解析,选出了25种具有分泌信号且推测是不具有膜贯通区域的分泌蛋白的蛋白。25种蛋白中,分泌信号与启动子相邻的是16种,分泌信号不与启动子相邻的是9种。
精确检查25种蛋白编码区域的碱基序列,对于25种分泌蛋白质中推测为不完全的蛋白编码序列(CDS)的3个(No.17、18、20)后的22个(No.1~16、19、21~25),如下进行分泌信号以及推定为启动子的区域的克隆。
对于分泌信号与启动子相邻的16种蛋白,克隆该启动子(promoter X)以及推定为分泌信号(以下、SPxA)的区域,将它们与编码UV优化绿色荧光蛋白变异体(GFPUv;CLONTECH Laboratories,Inc.)的基因和在上述专利文献7~9记载的质粒制作中使用的双歧杆菌的组织蛋白样肽(HU)的终止子(HU terminator)组合,制作质粒,对于用该质粒(pSPxA)转化了的双歧杆菌,确认表达蛋白(GFP)的分泌功能。
另外,对于包括分泌信号不与启动子相邻的剩余9种蛋白的全部22种蛋白,克隆不含启动子区域的分泌信号(以下、SPxB)区域,与上述双歧杆菌的组织蛋白样肽(HU)的启动子(HU promoter)、编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因以及上述双歧杆菌的组织蛋白样肽(HU)的终止子(HU terminator)组合,制作质粒,与上述同样地,对于用该质粒(pSPxB)转化了的双歧杆菌,确认表达蛋白(GFP)的分泌功能。
结果是,在12种质粒(pSP7A-GFP,pSP12A-GFP,pSP1B-GFP,pSP2B-GFP,pSP3B-GFP,pSP4B-GFP,pSP7B-GFP,pSP9B-GFP,pSP10B-GFP,pSP12B-GFP,pSP16B-GFP,pSP23B-GFP)中确认到分泌倾向,在4种质粒(pSP7A-GFP,pSP3B-GFP,pSP7B-GFP,pSP23B-GFP)中确认到优异的表达蛋白的分泌功能。
另外,除此之外,在该长双歧杆菌105A的基因组解析中,进行了与报道在短双歧杆菌中分泌的SeC2的基因(Laura E.MacConaill et al.,Applied and Environmental Microbiology,2003 Vol.69:pp6994-7001)在氨基酸水平上同源性高的碱基序列的蛋白的检索,对于其分泌信号肽,进行了研究。即,将该分泌编码信号肽的基因和上述双歧杆菌的组织蛋白样肽(HU)的启动子(HU promoter)基因组合而进行克隆,将它们与编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因 以及上述双歧杆菌的组织蛋白样肽(HU)的终止子(HU terminator)组合而制作质粒,与上述同样地,对于用该质粒(pSeC2-GFP)转化了的双歧杆菌,确认表达蛋白(GFP)的分泌功能,结果确认了优异的表达蛋白的分泌功能。
接下来,对于上述确认了分泌倾向的13种质粒,制作插入了编码别的目的蛋白的人类TNF-α的基因来代替编码GFP的基因的质粒,用这些质粒转化双歧杆菌,确认其表达蛋白分泌功能。
结果是,在9种质粒(pSP7A-TNFα,pSP1B-TNFα,pSP3B-TNFα,pSP4B-TNFα,pSP7B-TNFα,pSP12B-TNFα,pSP16B-TNFα,pSP23B-TNFα,pSeC2B-TNFα)中显示分泌功能,在2种质粒(pSP3B-TNFα,pSP23B-TNFα)中确认了特别优异的表达蛋白的分泌功能。
进而,制作从这些质粒中除去了在双歧杆菌以外的菌中发挥功能的复制起点、例如pUC ORI的质粒。于是,对于用该质粒转化了的双歧杆菌看,确认表达蛋白的分泌功能,结果确认到除去了在双歧杆菌以外的菌中发挥功能的复制起点pUC ORI的质粒也同样地能够发挥优异的表达蛋白的分泌功能。
这样,发现了至少在双歧杆菌中发挥功能、优异的表达蛋白的分泌作用的新型分泌信号肽。
如上所述,本发明的分泌信号肽由于具有优异的分泌活性,且能在非致病性专性厌氧菌双歧杆菌中发挥功能,因此特别适用于上述质粒、基因转运载体或药物组合物。因此,包含本发明的新型分泌信号肽作为分泌信号肽的、所有形式的上述质粒、基因转运载体或药物组合物也包括在本发明中。
实施例
以下,借助制造例及实施例更具体地说明本发明,但是本发明的技术范围不局限于这些实施例。
参考例1:分泌信号的in Silico筛选
针对由Bifidobacterium longum 105A的全基因组序列推定的全翻译区域的1941个氨基酸序列,进行使用PrediSi的信号肽预测,推定188个信号肽。预测时,使用了Gram Positive Bacteria的参数组。
推测的188个信号肽之中,选定不具有膜贯通区域的25个作为候选分泌蛋白质。该推定分泌蛋白质编码区域示于表1。
[表1]
表1候选分泌蛋白的基因组上的位置和方向
制造例1:分泌型GFP表达质粒(pSPxA-GFP)的构建
构建通过候选信号肽的启动子使分泌型GFP表达的质粒。概要示于图1。
具体如下。
制备插入物
上述25个候选分泌蛋白质之中,关于其基因位于操纵子的最前头的16种(表1NO.1~16),如下所述通过PCR法扩增含启动子区域的推定信号肽部分及其下游部分的60~90个碱基。
在翻译起始点的300Bp上游设计forward primer,在编码信号肽的DNA的60~90Bp下游设计reverse primer。以长双歧杆菌105A的基因组DNA30NG作为模板,用2×Phusion Flash PCR Master mix(FINNZYMES)进行PCR。
PCR的程序是:98℃下10秒之后,98℃下1秒、55℃下5秒、72℃下9秒,进行30个循环,在72℃下进行1分钟。各信号肽的PCR引物示于表2.1。各引物的5’侧的15个碱基具有与以下所示载体相同的序列。
[表2]
表2.1信号肽扩增时的引物(SPxA)
用2%琼脂糖凝胶(1×TBE BUFFeR、含有溴化乙锭)对PCR产物的一部进行解析,确认是推定的尺寸的单一条带。
不是单一条带的情况下,将退火温度从55℃变更为60℃,再次进行PCR。
用PCR产物精制试剂盒(QIAquick PCR purification kit,QIAGEN)精制PCR产物,通过吸光光度计对精制PCR产物量进行定量。
将该含自身的启动子区域的信号肽片段作为信号肽xA(SPxA)(x=1~16)。
制备载体
如下制备SPxA克隆用载体。制备的概要情况示于图1。利用BaMHI及ECO147I(均为Fermentas)将质粒pAmyB-GFPuv载体(图1、上段的右图;序列号1)完全分解。反应条件按照酶的使用说明书。通过0.8%精制用琼脂糖凝胶(1×TBE BUFFeR、含有溴化乙锭)电泳将消化后的质粒分离,切出约4.2kBp的大片段(Large fragment),用来自凝胶的DNA提取试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit,QIAGEN)从琼脂糖凝胶提取和精制DNA。用0.8%琼脂糖凝胶(1×TBE BUFFeR、含有溴化乙锭)将精制DNA片段(载体)和DNA浓度标记一起进行电泳,估计其浓度。
需要说明的是,pAmyB-GFPuv载体中的GFPuv编码序列是为了双歧杆菌用而优化了(GenScript)密码子后的序列。
Recombination反应
将上述制备的载体和插入物以1:3~10的摩尔比进行混合,通过重组反应进行连结(CloneEZ Kit,GenScript)。反应条件按照说明书。
大肠杆菌的转化
使用上述Recombination反应液2μL进行大肠杆菌TOP10 chemically Competent Cell(生命技术日本株式会社)的转化,涂布在LB(75μG/ML壮观霉素含有)平板上后在37℃培养一夜。转化条件按照说明书。
对转化后的大肠杆菌菌落用LB(75μG/ML壮观霉素含有)液体培养基在37℃培养一夜,从其中提取质粒(QIAprep Spin Miniprep Kit,凯杰株式会社)。确定该质粒的插入物序列,质粒名称命名为、pSPxA-GFP(x=1~16)。
双歧杆菌的转化
使用3~5μL从上述转化后的大肠杆菌提取的质粒DNA,通过电穿孔系统(Gene Pulser II,Bio-Rad Laboratories,Inc.)进行双歧杆菌长双歧杆菌105A的转化。电击后,将800μl的IMR液体培养基和50μl包含维生素C的液体的混合物立刻添加到小杯,将其回收在灭菌后的2mL微型管中。每个管进行相同的操作,并且将这些2mL管开盖并置于干燥器中。使用真空泵去除干燥器中的空气,并将干燥器充入二氧化碳。重复该操作3次,以便用二氧化碳代替干燥器中的空气,并然后将干燥器置于设定为37°C的孵育箱中并保温3小时。
将保温后的各菌悬浊液充分混合后,量取其100μL,分别涂抹在2片IMR琼脂培养基(75μG/ML 含有SPCM)上。将这些平板与去氧/二氧化碳气体产生剂(AnaeroPack(R)-Anaero,Mitsubishi Gas Chemical Company)共同置于密封容器内,并在设定为37°C的孵育箱内培养2天。
制造例2:分泌型GFP表达质粒(pSPxB-GFP)的构建
构建通过双歧杆菌的组织蛋白样启动子(HU启动子)使分泌型GFP表达的质粒。概要情况示于图2。具体如下。
制备插入物
上述25个候选分泌蛋白质之中,对于除去了推测为不完全的蛋白编码序列(CDS)的3个(NO.17、18、20)后的22个(NO.1~16、19、21~25),通过PCR法对含推定信号肽编码部分及其下游60~90碱基的DNA片段进行扩增。
在翻译起始点设计forward primer,在编码信号肽的DNA的60~90Bp下游设计reverse primer。各信号肽的PCR引物示于表2.2。各引物的5’侧的15个碱基具有与以下所示载体相同的序列。
[表3-1]
表2.2信号肽扩增时的引物(SPx)
[表3-2]
与上述制造例1同样地进行PCR,制备的PCR产物设为SPx(x=1~16、19、21~25)。
制备载体
如下所述地制备SPx克隆用载体。制备的概要示于图2。用HINDIII(Fermentas)将质粒pScHuGFPuv载体(图2、上段的右图;序列号2)完全分解。反应条件按照酶的使用说明书。通过0.8%精制用琼脂糖凝胶(1×TBEBUFFeR、含有溴化乙锭)电泳对消化后的质粒进行分离,切出约4.6kBp的直链DNAD片段,用来自凝胶的DNA提取试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit,QIAGEN)从琼脂糖凝胶提取和精制DNA。用0.8%琼脂糖凝胶(1×TBEBUFFeR、含有溴化乙锭)将精制DNA片段(载体)和DNA浓度标记一起进行电泳,估计其浓度。
需要说明的是,pScHuGFPuv载体中的GFPuv编码序列是为了双歧杆菌用而优化(GenScript)了密码子后的序列。
Recombination反应
将上述制备的载体和插入物以1:3~10的摩尔比进行混合,通过重组反应进行连结(CloneEZ Kit,GenScript)。反应条件按照说明书。
大肠杆菌的转化
使用上述Recombination反应液2μL进行大肠杆菌TOP10chemically Competent Cell(生命技术日本株式会社)的转化,涂布在LB(75μG/ML壮观霉素含有)平板上后在37℃培养一夜。转化条件按照说明书。
将转化后的大肠杆菌菌落用LB(75μG/ML壮观霉素含有)液体培养基在37℃培养一夜,从其中提取质粒(QIAprep Spin Miniprep Kit,凯杰株式会社)。确定该质粒的插入物序列,质粒名称命名为pSPxB-GFP(x=1~16、19、21~25)。
双歧杆菌的转化
通过与上述制造例1同样的方法进行双歧杆菌的转化。
制造例3:分泌型GFP表达质粒(pSec2-GFP)的构建
以短双歧杆菌UCC2003报道分泌肽Sec2(Laura E.MacConaill et al.,Applied and Environmental Microbiology,2003 Vol.69:pp6994-7001)。从长双歧杆菌105A的基因组序列检索与Sec2同源性高的序列,将它的分泌信号与GFP的编码序列相连。用制造例2的质粒pScHuGFPuv载体构建通过Hu启动子使其表达的质粒。概要情况示于图3。具体如下。
制备插入物
在长双歧杆菌105A的Sec2基因的翻译起始点设计Sec2-F1引物、在信号肽编码序列的123Bp下游设计Sec2-R2引物。引物序列示于表2.3。各引物的5’侧的15个碱基具有与以下所示载体相同的序列。
[表4]
表2.3信号肽扩增时的引物(Sec2)
与上述制造例1同样地进行PCR,制备的PCR产物为Sec2。
制备载体
使用质粒pScHuGFPuv载体(图3、上段的右图;序列号2)与上述制造例2同样地进行制备。
Recombination反应
将上述制备的载体和插入物以1:10的摩尔比进行混合,通过重组反应进行连结(CloneEZ Kit,GenScript)。反应条件按照说明书。
大肠杆菌的转化
使用上述Recombination反应液2μL进行了大肠杆菌TOP10 chemically Competent Cell(生命技术日本株式会社)的转化。转化条件按照说明书。
将转化后的大肠杆菌菌落用LB(75μG/ML壮观霉素含有)液体培养基在37℃培养一夜,从其中提取质粒(QIAprep Spin Miniprep Kit,凯杰株式会社)。确定该质粒的插入物序列,质粒名称命名为pSec2-GFP(序列号3)。
双歧杆菌的转化
通过与上述制造例1同样的方法进行双歧杆菌的转化。
实施例1:重组双歧杆菌的GFP蛋白表达
将制造例1~3中得到的重组双歧杆菌(长双歧杆菌105A/pSPxA-GFP(x=1~16)、长双歧杆菌105A/pSPxB-GFP(x=1~16、19、21~25)及长双歧杆菌105A/pSec2-GFP)的甘油保存菌在APS-2S-2.5SE(75μG/ML壮观霉素)液体培养基中进行1%接种,在37℃厌氧培养24小时(活性化培养液)。
接下来,在每APS-2S-2.5SE(75μG/ML壮观霉素)液体培养基20ML添加有1M磷酸钠缓冲液(pH6.8)4ML的培养基中,进行活性化培养液0.5% 接种。将其在37℃厌氧培养18小时。
使用该培养液如下制备培养上清及细胞内蛋白。
将培养液离心分离后、回收培养上清。该培养上清中的蛋白用三氯醋酸(TCA)沉淀、用丙酮洗净后,溶解在、电泳用缓冲液中,将培养上清中的蛋白浓缩。另外,如下所述地提取细胞内蛋白。将培养液1ML与4ML的PBS混合,以12,000RpM、5分钟、4℃的条件离心分离后,除去上清,在该沉淀中加入5ML的PBS,悬浊、离心分离,除去上清,该操作进行2次。在洗净后的菌体中加入PBS使总量为1ML后,通过超声波处理使菌体破碎。将其离心分离后回收上清,将其作为细胞内提取物。
对野生株长双歧杆菌105A也进行同样的操作,作为阴性对照。GFP蛋白的阳性对照使用的是recombinant GFPuv(Clontech公司)。
用12.5%Tris-Glycine凝胶(ATTO株式会社,e-PAGEL)对上述培养上清浓缩物(培养液1ML相当)、细胞内蛋白质提取物(培养液7.5μL相当)进行电泳。将其用iBlot Transfer Device(Invitrogen)转印到PVDF膜(Invitrogen、iBlot Transfer Stacks)上。对印迹结束后的膜进行封闭后,一次抗体中使用家兔GFP抗体(Clontech,A.v.peptide Antibody Living Colors)、二次抗体中使用anti-Rabbit IgG HRP Conjugate(Santa Cruz Biotechnology)进行反应,通过ECLAdvance Western Blotting Detection Kit(GE Healthcare)使其发光。用图像分析器(Fluor S Max,Bio-Rad公司)对其进行解析。
结果是,在13种菌(长双歧杆菌105A/pSP1B-GFP、长双歧杆菌105A/pSP2B-GFP、长双歧杆菌105A/pSP3B-GFP、长双歧杆菌105A/pSP4B-GFP、长双歧杆菌105A/pSP7B-GFP、长双歧杆菌105A/pSP9B-GFP、长双歧杆菌105A/pSP10B-GFP、长双歧杆菌105A/pSP12B-GFP、长双歧杆菌105A/pSP16B-GFP、长双歧杆菌105A/pSP23B-GFP、长双歧杆菌105A/pSP7A-GFP、长双歧杆菌105A/pSP12A-GFP、长双歧杆菌105A/pSec2-GFP)中确认了分泌倾向。进行2次同样的试验,对于5种(长双歧杆菌105A/pSP3B-GFP、长双歧杆菌105A/pSP7B-GFP、长双歧杆菌105A/pSP23B-GFP、长双歧杆菌105A/pSP7A-GFP、长双歧杆菌105A/pSec2-GFP)确认了特别显著的分泌作用(图4)。
制造例4:分泌型TNF alpha表达双歧杆菌的制作(pSPxA-TNF alpha及pSPxB-TNF alpha)
质粒载体pTNF1的构建
将人类TNFα(Accession No.X01394)的编码序列进行密码子优化使其为双歧杆菌用,以插入pUC57载体中的质粒(委托GenScript公司合成)作为模板,用TNF-F1引物及TNF-R1引物(表3)进行以TNFα编码区域作为靶标的PCR(PrimeSTAR(R)HS Premix,TaKaRa BIO株式会社)。通过精制将PCR产物精制(QIAquick PCR purificaton Kit,凯杰)精制后、用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳,切出约0.7kBp的DNA片段。通过该凝胶提取DNA(QIAquick Gel Extraction Kit,凯杰)作为插入物。
[表5]
表3质粒载体pTNF1的构建用引物
另外,如下所述地制备载体。在质粒pCDshuttle(专利文献9;WO2009/128272A1)10μG中加入制限酶FastDigest Bsp119I,FastDigest Pst I,FastDigest Nde I,FastDigestAcl I(Fermentas社)各10μL,在37℃加温4.5小时,将质粒完全分解。用0.8%琼脂糖凝胶对其进行电泳,切出约3.9kBp的DNA片段。通过该凝胶提取DNA(QIAquick Gel Extraction Kit,凯杰),作为载体。
对于上述载体20NG及插入物36NG用CloneEZ Kit(GenScript公司)进行末端序列的重组。具体按照CloneEZ Kit的产品说明书。用该DNA2μL进行大肠杆菌TOP10chemically Competent Cell(生命技术日本株式会社)的转化。转 化条件按照说明书。
将转化后的大肠杆菌菌落用LB(75μG/ML壮观霉素含有)液体培养基在37℃培养一夜,从其中提取质粒(QIAprep Spin Miniprep Kit,凯杰株式会社)。将该质粒设为pTNF1(图5、上段的右图;序列号4)。
将质粒pSPxA-GFP及pSPxB-GFP的GFP部分替换为TNF alpha的质粒pSPxA-TNF alpha及pSPxB-TNF alpha的构建概要分别示于图5及图6。
以质粒pTNF1作为模板,用TNFvec F1引物及TNFvec R1引物(表4)进行PCR(PrimeSTAR(R)HS Premix,TaKaRa BIO株式会社),取得约3.8kbp的PCR产物,将其作为载体。
[表6]
表4 pSPxA-TNF alpha及pSPxB-TNF alpha构建用载体引物
另外,以在实施例1中显示出分泌倾向的质粒pSPxA-GFP(x=7、12)或pSPxB-GFP(x=1~4,7,9,10,12,16,23)作为模板,用表5的引物进行插入物的PCR扩增(PrimeSTAR(R)HS Premix,TaKaRa BIO株式会社),将其作为插入物。
[表7]
表5pSPxA-TNF alpha、pSPxB-TNF alpha及
用In-Fusion TM Advantage PCR Cloning Kit(TaKaRa BIO株式会社)使上述载体100NG与插入物40NG连结。用该DNA2μL进行大肠杆菌TOP10 chemically Competent Cell(生命技术日本株式会社)的转化。转化条件按照说明书。
将转化后的大肠杆菌菌落用LB(75μG/ML壮观霉素含有)液体培养基在37℃培养一夜,从其中提取质粒(QIAprep Spin Miniprep Kit,凯杰株式会社)。确定该质粒的全序列,质粒名称命名为、pSP7A-TNF alpha,pSP12A-TNF alpha,pSP1B-TNF alpha,pSP2B-TNF alpha,pSP3B-TNF alpha,pSP4B-TNF alpha,pSP7B-TNF alpha,pSP9B-TNFalpha,pSP 10B-TNF alpha,pSP12B-TNF alpha,pSP16B-TNF alpha,pSP23B-TNF alpha。
利用双歧杆菌的pSPxA-TNF alpha及pSPxB-TNF alpha进行的转化
利用与制造例1同样的方法,用质粒pSPxA-TNF alpha及pSPxB-TNF alpha进行长双歧杆菌105A的转化。
参考例2:质粒pTNF3的构建
构建在来自双歧杆菌的HU启动子下游配置有成熟人类TNFα编码序列的穿梭载体(双歧杆菌-大肠杆菌)。概要示于图12。具体如下。
制备插入物
合成将人类TNFα(Accession No:X01394、第153号至第854号的未成熟TNFα编码序列)的密码子优化为双歧杆菌用后的人工DNA、其上游及下游配置有来自双歧杆菌的HU启动子及HU终止子的质粒:human_TNFalpha_in pUC57(委托GenScript商业合成)。
以质粒human TNFalpha_in_pUC571NG作为模板,将TNFα的编码区域的成熟TNFα部分用PrimeSTAR(R)HS Premix(TaKaRa BIO株式会社)进行PCR扩增。引物使用的是TNF F3引物及TNF R1引物,各引物的5’侧15个碱基配置为与载体的末端相同的序列(表6)。PCR的程序是:98℃下10秒、60℃下5秒、72℃下30秒,进行30个循环后,72℃下进行30秒。
将PCR产物的一部与DNA浓度标记一起用2%琼脂糖凝胶(1×TBEBUFFeR、含有溴化乙锭)进行电泳,确认是约0.5kBp的单一条带,并且估计其浓度。
制备载体
以质粒pCDshuttle 1NG作为模板,通过PrimeSTAR(R)HS Premix(TaKaRa BIO株式会社)PCR扩增载体骨架。引物使用的是pCDshuttle F1引物及pCDshuttle R1引物,使各引物的5’侧15个碱基为与插入物的末端相同的序列(表6)。PCR的程序是:98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下4分钟,进行30个循环后,72℃下进行30秒。
将PCR产物的一部与DNA浓度标记一起用0.8%琼脂糖凝胶(1×TBEBUFFeR、含有溴化乙锭)进行电泳,确认是约3.9kBp的单一条带,并且估计其浓度。
[表8]
表6 pTNF3构建引物
克隆
对于上述载体100NG及插入物50NG用In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit(TaKaRa BIO株式会社)进行末端序列的重组。此时,将Cloning Enhancer(TaKaRa BIO株式会社)也加入反应液,插入物及载体中所含的模板质粒的分解也同时进行。具体按照In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit的产品说明书。
使用上述In-Fusion反应液2μL进行大肠杆菌TOP10 chemically Competent Cell(Invitrogen社)的转化。转化条件按照说明书。将转化后的大肠杆菌菌落用LB(75μG/ML壮观霉素含有)液体培养基在37℃培养一夜,从其中提取质粒(QIAprep Spin Miniprep Kit、凯杰株式会社)。确定该质粒的全序列,设为pTNF3(序列号51)。
双歧杆菌的转化
使用质粒pTNF3通过与制造例1同样的方法进行长双歧杆菌105A的转化。
制造例5:分泌型TNFα表达双歧杆菌的制作(pSec2-TNF alpha)
将质粒pSec2-GFP的GFP部分替换为TNF alpha后的质粒pSec2-TNFalpha的构建概要示于图7。
制备载体
利用BaMHI、BCUI及PSTI(均为Fermentas)将质粒pCDshullte完全分解。反应条件按照酶的使用说明书。通过1%精制用琼脂糖凝胶(1×TBEBUFFeR、含有溴化乙锭)电泳将消化后的质粒分离,切出约3.4kBp的大片段,利用DNA提取试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit,QIAGEN)从琼脂糖凝胶提取和精制DNA。用0.8%琼脂糖凝胶(1×TBE BUFFeR、含有溴化乙锭)将精制DNA片段(载体)与DNA浓度标记一起进行电泳,估计其浓度。
制备插入物
以质粒pSec2-GFP作为模板,用Sec2_out1 primer及Sec2a_R1 primer(表5)对含Hu启动子的Sec2信号肽编码序列进行PCR扩增(PCR产物1)。另外,以质粒pTNF1作为模板,用Sec2a_F1 primer及TNF_out1 primer(表5)对含Hu终止子的TNF alpha的编码序列进行PCR扩增(PCR产物2)。用PCR产物精制试剂盒(QIAquick PCR purification kit,凯杰株式会社)精制PCR产物1及2后,通过吸光度测定估计PCR产物量。将PCR产物1及PCR产物2等摩尔量混合。在该PCR产物混合溶液1NG、2×PCR Solution PrimeSTAR HS(TaKaRa BIO株式会社)中加入0.1×TE缓冲液,使其达到49μL。该溶液放置于热循环仪中,以98℃10秒、72℃36秒作为1个循环,进行5个循环反应,将2个PCR片段连结。进而,在其中加入Sec2_out1引物及TNF_out1引物,以98℃10秒、55℃5秒、72℃70秒作为1个循环,反应25循环反应后,进行72℃30秒的延伸反应,对连结PCR产物进行扩增。
用1%精制用琼脂糖凝胶(1×TBE BUFFeR、含有溴化乙锭)电泳将其分离,切出约1.2kBp的片段,用DNA提取试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit,QIAGEN)从琼脂糖凝胶提取和精制DNA。用BaMHI及BCUI将精制DNA片段完全分解。反应条件按照酶的使用说明书。用1%精制用琼脂糖凝胶(1×TBE BUFFeR、含有溴化乙锭)电泳将消化后的质粒分离,切出约1.2kBp的DNA片段,用DNA提取试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit,QIAGEN)从琼脂糖凝胶提取和精制DNA。用0.8%琼脂糖凝胶(1×TBE BUFFeR、含有 溴化乙锭)将精制DNA片段(插入物)与DNA浓度标记一起进行电泳,估计其浓度。
连接
上述载体及插入物以1:3(摩尔比)进行混合,连接(Rapid DNA LigationKit、Fermentas)。具体按照产品说明书进行。
大肠杆菌的转化
用上述连接反应液2μL进行大肠杆菌TOP10chemically Competent Cell(生命技术日本株式会社)的转化。转化条件按照说明书。
将转化后的大肠杆菌菌落用LB(75μG/ML壮观霉素含有)液体培养基在37℃培养一夜,从其中提取质粒(QIAprep Spin Miniprep Kit,凯杰株式会社)。对该质粒的插入物部分进行全序列的确定,确认没有PCR错误,将质粒名称命名为pSec2-TNF alpha。
利用双歧杆菌的pSec2-TNF alpha进行的转化
采用与制造例1同样的方法,用质粒pSec2-TNF alpha进行长双歧杆菌105A的转化。
实施例2:重组双歧杆菌的TNF alpha蛋白表达
将制造例4及制造例5中得到的重组双歧杆菌(长双歧杆菌105A/pSPxA-TNF alpha(x=7,12)、长双歧杆菌105A/pSPxB-TNF alpha(x=1~4,7,9,10,12,16,23)及长双歧杆菌105A/pSec2-TNF alpha的甘油保存菌在APS-2S-2.5SE(75μG/ML壮观霉素)液体培养基中进行1%接种,在37℃24小时厌氧培养(活性化培养液)。
接下来,在每APS-2S-2.5SE(75μG/ML壮观霉素)液体培养基20ML中添加有1M磷酸钠缓冲液(pH6.8)4ML的培养基中,进行活性化培养液0.5%接种。将其在37℃厌氧培养18小时。
将培养液离心分离后、回收培养上清。该培养上清中的蛋白用三氯醋酸(TCA)沉淀、用丙酮洗净后,溶解在、电泳用缓冲液中,将培养上清中的蛋白浓缩。
另外,如下所述地提取细胞内蛋白。将培养液1ML与4ML的PBS混合, 以12,000RpM、5分钟、4℃的条件离心分离后,除去上清,在该沉淀中加入5ML的PBS,悬浊、离心分离,除去上清,该操作进行2次。在洗净后的菌体中加入PBS使总量为1ML后进行超声波处理,将菌体破碎。将其离心分离后,回收上清,将其作为细胞内提取物,供于免疫印迹解析。
对野生株长双歧杆菌105A也进行同样的操作,作为阴性对照。TNF alpha的阳性对照中使用的是人类重组TNF alpha(PEPRO TECH,INC.)。
用16%Tris-Glycine凝胶(Invitrogen)对上述培养上清(培养液7.5μL相当)、培养上清浓缩物(培养液1ML相当)、细胞内蛋白质提取物(培养液7.5μL相当)进行电泳。这里,对于以下的样品,如下调整向凝胶的施用量。将培养液0.15μL相当的SP3B-TNF alpha的上清、0.15μL相当的SP16B-TNF alpha的细胞内提取物、0.75μL相当的SP23B-TNF alpha的细胞内提取物、20μL及100μL相当的同培养上清浓缩物供于电泳。用iBlot Transfer Device(Invitrogen)将其转印到PVDF膜(Invitrogen、iBlot Transfer Stacks)上。将印迹结束后的膜封闭后,一次抗体中使用anti-human TNF-alpha(goat)(R&D Systems)、二次抗体中使用anti-Goat IgG HRP Conjugate(Santa Cruz Biotechnology),进行反应,用ECL Advance Western Blotting Detection Kit(GE Healthcare)使其发光。用图像分析器(Fluor S Max,Bio-Rad公司)对其进行解析。解析结果示于图8。
结果是,对于9种(长双歧杆菌105A/pSP1B-TNF alpha、长双歧杆菌105A/pSP3B-TNF alpha、长双歧杆菌105A/pSP4B-TNF alpha、长双歧杆菌105A/pSP7B-TNF alpha、长双歧杆菌105A/pSP12B-TNF alpha、长双歧杆菌105A/pSP16B-TNF alpha、长双歧杆菌105A/pSP23B-TNF alpha、长双歧杆菌105A/pSP7A-TNF alpha、长双歧杆菌105A/pSec2-TNF alpha)确认了分泌,2种(长双歧杆菌105A/SP3B-TNF alpha及长双歧杆菌105A/SP23B-TNF alpha)的向培养上清的表达特别强。
参考例3:TNFα非分泌型的菌长双歧杆菌105A/pTNF 3的分泌确认
将参考例2中得到的长双歧杆菌105A/pTNF3和野生株的长双歧杆菌105A甘油保存菌在APS-2S-2.5SE(75μG/ML壮观霉素)液体培养基中进行1%接种,在37℃厌氧培养24小时(活性化培养液)。将活性化培养液0.5%接种到在APS-2S-2.5SE液体培养基20ML中添加有1M磷酸钠缓冲液(pH6.8) 4ML的培养基(75μG/ML壮观霉素)中。将其在37℃厌氧培养18小时。这里,野生株用不添加壮观霉素的培养基培养。将该培养液离心分离,回收培养上清。另外,如下制备细胞内提取物。培养液1ML用PBS缓冲液洗净后,将菌体用PBS缓冲液悬浊,使其为1ML,进行超声波破碎。将其离心分离后,回收其上清,将其作为细胞内提取物。
将由野生株得到的试样作为阴性对照。阳性对照使用的是来自人类的重组TNF alpha(PEPRO TECH,INC.)。用15%聚丙烯酰胺凝胶(ATTO株式会社)对上述培养上清(培养液7.5μL相当)、细胞内提取物(培养液0.075μL相当)进行电泳。用iBlot Transfer Device(Invitrogen)将其转印到PVDF膜(Invitrogen、iBlotTransfer Stacks)上。封闭印迹结束后的膜后,一次抗体中使用anti-human TNF-alpha(goat)(R&D Systems)、二次抗体中使用anti-Goat IgG HRP Conjugate(Santa Cruz Biotechnology),进行反应,用ECL Advance Western Blotting Detection Kit(GE Healthcare)使其发光。用图像分析器(Fluor S Max,Bio-Rad公司)对其进行解析。解析结果示于图9。
结果是,比较长双歧杆菌105A/pTNF3和野生株的长双歧杆菌105A的细胞内提取物时,长双歧杆菌105A/pTNF3中确认到TNFα的表达的条带,野生株的长双歧杆菌105A中没能确认到。由此可知,用质粒pTNF3转化了的菌株正常表达TNFα。但是,比较两者的培养上清的话,任一方的培养上清中都没有确认到TNFα,可知TNFα不从长双歧杆菌105A/pTNF3分泌到细胞外。
制造例6:pBifi-SP3B-TNF的构建
构建从制造例4中得到的质粒pSP3B-TNF alpha(大肠杆菌―双歧杆菌穿梭载体)中除去了在大肠杆菌中的复制起点的质粒pBifi-SP3B-TNF。构建的概要示于图10。
pUCori除去片段的制备
在从重组大肠杆菌TOP10/pSP3B-TNF alpha(穿梭载体)提取的质粒2.4μG中加入BaMHI及BGLII,在37℃消化。通过利用0.8%精制用琼脂糖凝胶的电泳将其分离し,切出约3.8kBp的DNA片段。从切出的凝胶中提取和精制DNA(QIAquick Gel Extraction Kit、QIAGEN),通过吸光度测定来测定DNA浓度。
pUCori除去片段的自身连接
用6根管进行上述pUCori除去片段的自身连接。每1根管,用pUCori除去片段50NG在50μL的反应体系中于22℃进行5分钟自身连接(RAPID DNA LIGATION KIT,Fermentas)后,在65℃加热5分钟,使Ligase失活。将连接反应液6根集中到1根,利用Proteinase K进行蛋白的分解,接着利用苯酚·氯仿提取进行除蛋白后,进行乙醇沉淀。DNA的溶解在10μL的0.1×TE条件下进行。
双歧杆菌的转化
用上述连接反应后の精制物150NG(5μL)进行长双歧杆菌105A感受态细胞的转化(电穿孔法、Gene PulserII、Bio-Rad株式会社)。电击后,将800μl的IMR液体培养基和50μl维生素C添加液的混合物立刻添加到小杯,将其回收在灭菌后的2mL微型管中。将该管开盖并置于干燥器中。使用真空泵脱气后充入二氧化碳。重复该操作3次使得用二氧化碳代替干燥器中的空气后,将干燥器置于设定为37°C的孵育箱中并保温3小时。
将保温后的各菌悬浊液充分混合后,涂抹在IMR琼脂培养基(75μG/ML含有SPCM)上。将这些平板与去氧/二氧化碳气体产生剂(AnaeroPack(R)-Anaero,Mitsubishi Gas Chemical Company)共同置于密封容器内,并在设定为37°C的孵育箱内培养2天。
转化体的确认以及重组双歧杆菌的甘油保存菌的制作
将在上述IMR琼脂培养基(75μG/ML含有SPCM)上形成的重组体候选菌落在BL-BS琼脂培养基(含壮观霉素的BL琼脂培养基、但不含马脱纤维血)上画线,与去氧/二氧化碳气体产生剂(AnaeroPack(R)-Anaero,三菱化学株式会社)一同放入密闭容器,在37℃培养1天。将画线培养的双歧杆菌用APS-2S-2.5SE(75μG/ML壮观霉素)液体培养基在37℃厌氧培养1天,由此提取质粒DNA(QIAprep Spin Miniprep Kit,凯杰株式会社)。提取DNA作为模板,用Check引物F1(AAD9盒上)及Check引物R2(HU启动子上)进行PCR扩增,用琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物的大小。引物序列示于表7。PCR引物的位置示于图10。确认了PCR产物尺寸为约0.5kBp,pUC ori片段被除去。由此确认了该重组双歧杆菌是从质粒pSP3B-TNF alpha除去了pUC ori的质粒,具有pBifi-SP3B-TNF alpha。
[表9]
表7穿梭及非穿梭载体的确认用引物
将BL-BS琼脂培养基上的画线培养物接种在APS-2S-2.5SE(75μG/ML壮观霉素)液体培养基上,在37℃厌氧培养24小时。在该培养液中混合甘油溶液达到最终浓度20%,作为甘油保存菌。
质粒pBifi-SP3B-TNF的碱基序列确定
用APS-2S-2.5SE(75μG/ML壮观霉素)液体培养基厌氧培养长双歧杆菌105A/pBifi-SP3B-TNF甘油保存菌。通过离心分离从培养液回收菌体,用30MMGTA buffer悬浊后,进行N-乙酰胞壁质酶处理。进而,进行Proteinase K (凯杰株式会社)处理后,用质粒DNA精制试剂盒进行精制(QIAprep Spin Miniprep Kit,QIAGEN)。用该质粒DNA确定全碱基序列,确认了不含pUCori(序列号5)。
实施例3:重组双歧杆菌的TNF alpha蛋白分泌确认
将制造例6中得到的长双歧杆菌105A/pBifi-SP3B-TNF alpha甘油保存菌在APS-2S-2.5SE(75μG/ML壮观霉素)液体培养基中进行1%接种,在37℃厌氧培养24小时(活性化培养液)。将活性化培养液0.5%接种到在APS-2S-2.5SE(75μG/ML壮观霉素)液体培养基20ML中添加有1M磷酸钠缓冲液(pH6.8)4ML的培养基中。将其在37℃厌氧培养18小时。将该培养液离心分离,回收培养上清。另外,如下制备细胞内提取物。用PBS洗净培养液1ML后,用PBS悬浊,使其成为1ML,进行超声波破碎。将其离心分离后,回收其上清,将其作为细胞内提取物。对于作为穿梭载体的长双歧杆菌105A/pSP3B-TNF alpha及野生株长双歧杆菌105A(野生株)也进行同样的操 作。但是,野生株用不添加壮观霉素的培养基培养。将从野生株得到的试样作为阴性对照。阳性对照使用的是来自人类的重组TNF alpha(PEPRO TECH,INC.)。
对上述培养上清(培养液0.75μL相当)、细胞内蛋白质提取物(培养液1.5μL相当)用15%聚丙烯酰胺凝胶(ATTO株式会社)进行电泳。用iBlot Transfer Device(Invitrogen)将其转印到PVDF膜(Invitrogen、iBlot Transfer Stacks)上。封闭印迹结束后的膜后,一次抗体中使用anti-human TNF-alpha(goat)(R&DSystems)、二次抗体中使用anti-Goat IgG HRP Conjugate(Santa Cruz Biotechnology),进行反应,用ECL Advance Western Blotting Detection Kit(GE Healthcare)使其发光。用图像分析器(Fluor S Max,Bio-Rad公司)对其进行解析。解析结果示于图11。
实施例4:pBifi-SP3B-TNF alpha及pSP3B-TNF中的大肠杆菌转化
用制造例6中得到的质粒(pBifi-SP3B-TNF alpha及pSP3B-TNF alpha)进行大肠杆菌TOP10株的转化。
按照大肠杆菌TOP10感受态细胞(生命技术日本株式会社)的产品说明书进行转化,在LB(75μG/ML壮观霉素含有)琼脂培养基上各100μL地涂布2片,在37℃培养一夜。菌落仅在导入了穿梭载体pSP3B-TNF alpha的情况下形成(266CFU及226CFU),导入了pBifi-SP3B-TNF alpha的大肠杆菌在选择培养基上没有形成菌落。
参考例4:质粒pBEshuttle的构建
作为具有不含插入物的蛋白表达单元的mock载体,如下构建pBEshuttle。概要示于图13。
片段的制备
以质粒pCDshuttle 5NG作为模板,用PrimeSTAR(R)HS Premix(TaKaRa BIO株式会社)对2个PCR片段A及B进行扩增。PCR片段A扩增中使用MCS F1引物及TNFvec R1引物,PCR片段B的扩增中使用pUC ori F2引物及MCS R1引物(表8)。
设计为PCR片段A扩增用引物的5’侧15个碱基具有与PCR片段B的末 端相同的序列,PCR片段B扩增用引物的5’侧15个碱基具有与PCR片段A的末端相同的序列。
PCR的程序是:98℃10秒、55℃5秒、72℃X秒(PCR片段A扩增:X=3分20秒、PCR片段B扩增:X=35秒),进行30个循环后,在72℃进行30秒。
用琼脂糖凝胶(1×TBE buffer,含有溴化乙锭。PCR产物A用:0.8%琼脂糖凝胶、PCR产物B用:2%琼脂糖凝胶)将PCR产物的一部分与DNA浓度标记一起进行电泳,确认是单一条带(PCR产物A:约3.3kBp、PCR产物B:约0.6kBp),并且估计其浓度。
[表10]
表8 pBEshuttle的构建用引物
克隆
用In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit(TaKaRa BIO株式会社)对上述PCR产物A 100NG及PCR产物B 35NG进行末端序列的重组。此时,Cloning Enhancer(TaKaRa BIO株式会社)也加入反应液中,插入物及载体中所含的模板质粒的分解也同时进行。具体按照In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit的产品说明书。
使用上述In-Fusion反应液2μL进行大肠杆菌TOP10 chemically Competent Cell(Invitorogen社)的转化。转化条件按照说明书。将转化后的大肠杆菌菌落用LB(75μG/ML壮观霉素含有)液体培养基在37℃培养一夜,从其中提取质粒(QIAprep Spin Miniprep Kit、凯杰株式会社)。确定该质粒的全序列,设为pBEshuttle(序列号50)。
双歧杆菌的转化
采用与制造例1同样的方法,用质粒pBEshuttle进行长双歧杆菌105A的转化。
制造例7:重组双歧杆菌B.breve/pSP3B-TNF alpha的制作
按照与制造例1的、双歧杆菌的转化同样的方法,利用质粒pSP3B-TNFalpha进行短双歧杆菌JCM1192的转化。
实施例5:重组双歧杆菌的TNFα蛋白的表达量确认
将参考例4中得到的长双歧杆菌105A/pBEshuttle、制造例4中得到的长双歧杆菌105A/pSP3B-TNF alpha、制造例6中得到的长双歧杆菌105A/pBifiSP3B-TNF alpha及制造例7中得到的B.breve/pSP3B-TNF alpha甘油保存菌在APS-2S-2.5SE(75μG/ML壮观霉素)液体培养基中进行1%接种,在37℃厌氧培养24小时(活性化培养)。将活性化培养液0.5%接种到在APS-2S-2.5SE液体培养基20ML中添加有1M磷酸钠缓冲液(pH6.8)4ML的培养基(75μG/ML壮观霉素)中。将其在37℃厌氧培养18小时。将该培养液离心分离,回收培养上清。对于培养上清,通过ELISA法(Quantikine Human TNF alpha/TNFSF 1A Immunoassay,R&D Systems,Inc.)测定培养上清中的TNFα量。测定结果示于表9。
[表11]
表9
长双歧杆菌105A/pSP3B-TNF alpha、长双歧杆菌105A/pBifiSP3B-TNFalpha以及B.breve/pSP3B-TNF alpha均观察到在培养上清中分泌TNFα,但长 双歧杆菌105A/pBEshuttle中没有观察到。
实施例6:在重组双歧杆菌中分泌的TNFα蛋白的生理活性和抗HTNFα抗体中使用的生理活性的中和
待测菌的培养及培养上清的制备
将参考例4中得到的长双歧杆菌105A/pBEshuttle、制造例4中得到的长双歧杆菌105A/pSP3B-TNF alpha及制造例6中得到的长双歧杆菌105A/pBifiSP3B-TNF alpha甘油保存菌在APS-2S-2.5SE(75μG/ML壮观霉素)液体培养基中进行1%接种,在37℃厌氧培养24小时(活性化培养)。将活性化培养液0.5%接种到在APS-2S-2.5SE液体培养基20ML中添加了1M磷酸钠缓冲液(pH6.8)4ML的培养基(75μG/ML壮观霉素)中。将其在37℃厌氧培养18小时。该将培养液离心分离,回收培养上清。
TNFα的细胞毒性试验
RHTNFα的生理活性和中和是通过调查作为TNFα的生理活性的由TNFα受体介导的细胞毒性来判定的。使用人类乳癌细胞株的KPL-1细胞作为待测细胞。KPL-1细胞是用DMEM培养基(添加有10%(v/v)FBS及0.1%(v/v)盘尼西林(50000U/ML)·链霉素(50MG/ML)液的DMEM培养基)在37℃、5%CO2的条件下培养的。将该细胞1×104个/孔接种在96孔平板上,在37℃、5%CO2培养24小时,得到融合的细胞。从该细胞吸引除去旧的培养基,以80μL/孔添加添加有放线菌素D的10%(v/v)FBS及0.1%盘尼西林(50000U/ML)·链霉素(50MG/ML)液添加DMEM培养基,以使重新成为终浓度5μG/ML放线菌素D。接下来,作为测定试样以10μL/孔添加双歧杆菌用培养基(APS-2S-2.5SE培养基),作为RHTNFα标准品以10μL/孔添加制备为100NG/ML的rhTNF alpha、长双歧杆菌105A/pBEshuttle培养上清5倍稀释液、长双歧杆菌105A/pSP3B-TNF alpha培养上清5倍稀释液及长双歧杆菌105A/pBifiSP3B-TNF alpha培养上清5倍稀释液。ここに、为了测定RHTNFα生理活性的中和能力测定,向其中添加抗HTNFα抗体(anti-human TNF alpha,R&D Systems、0.0125~0.1MG/ML)、正常山羊IGG(normal Goat IgG,R&D Sytems、0.0125~0.1MG/ML)及添加有10%(v/v)FBS及0.1%(v/v)盘尼西林(50000U/ML)·链霉素(50MG/ML)液的DMEM培养基各 10μL/孔。将该平板在37℃、5%CO2的条件下培养48小时。
细胞毒性的测定是:使用Cell Counting Kit-8(DOJINDO),将该液以10μL/孔添加到各孔中后,进而,在4小时37℃、5%CO2的条件下孵育,测定波长450NM和630NM时的吸光度(以630NM作为参照波长)。解析结果示于图14。由此,重组菌长双歧杆菌105A/pSP3B-TNF alpha及长双歧杆菌105A/pBifiSP3B-TNF alpha的培养上清对KPL-1细胞显示细胞毒性,并且通过抗TNFα抗体而被中和,因此确认是被分泌到培养上清中的重组HTNFα是具有生理活性的物质。
实施例7:长双歧杆菌105A/pSP3B-TNF alpha以及B.breve/pSP3B-TNFalpha的抗肿瘤效果测定
测定了制造例4中制作的长双歧杆菌105A/pSP3B-TNF alpha以及制造例7中制作的B.breve/pSP3B-TNF alpha的抗肿瘤效果。
(1)移植肿瘤细胞的培养
人类乳癌细胞株的KPL-1细胞是用添加有10%(v/v)FBS及0.1%(v/v)盘尼西林(50000U/ML)·链霉素(50MG/ML)液的DMEM培养基在37℃、5%CO2的条件下培养的。
在形成融合的时刻,用1×PBS(-)洗净后加入1×胰蛋白酶-EDTA而剥离细胞,将通过离心操作(1000转/5分钟)回收的细胞用DMEM培养基适当稀释并传代培养。
在移植实验中,使用第五代细胞。将未被台盼蓝染色的成活细胞数目通过Thoma血细胞计数器(Thoma 0.1mm deep ERMA,东京)进行计数,并且通过将它们在汉克溶液(Hanks’solution)中悬浮来将细胞数调整为2.5×106细胞/mL。
(2)荷瘤裸小鼠制作和肿瘤体积的测定
将制备的KPL-1细胞悬浊液0.2ML移植到裸小鼠的右前肢背部侧的皮下(5×105个/小鼠)。
移植后,使用测径仪,通过测量肿瘤的尺寸(大直径、小直径、厚度),根据下文的公式来测定肿瘤的体积。
肿瘤体积(mm3)=大直径(mm)×小直径(mm)×厚度(mm)/2
(3)分组以及组构成
选择24只具有80~135mm3级别的肿瘤体积的KPL-1荷瘤裸小鼠,分为平均肿瘤体积程度相同的3组(1组8只)。将这一天设为第0天。
试验组构成如表10所示。即,第一组:无处理组、第二组:长双歧杆菌105A/pSP3B-TNF alpha给药组、第三组:B.breve/pSP3B-TNF alpha给药组。
[表12]
表10:组构成
(4)菌的培养及给药用菌液的制备
菌的培养
将制造例4中制作的双歧杆菌长双歧杆菌105A/pSP3B-TNF alpha及制造例7中得到的B.breve/pSP3B-TNF alpha的甘油保存菌在APS-2S-2.5SE(75μG/ML壮观霉素)液体培养基中进行1%接种,在37℃23.5小时厌氧培养(活性化培养液)。接下来,将活性化培养液的1%接种到APS-2S-2.5SE(75μG/ML壮观霉素)液体培养基20ML中,在37℃厌氧培养18小时(本培养液)。
给药用培养活菌的制备(长双歧杆菌105A/pSP3B-TNF alpha)
用吸量管量取上述得到的本培养液10ML,加入到40ML装有充分冷却后 的PBS缓冲液的锥形管中,通过倒转混合使其稳定混合后,用冷却至4℃的离心机以8000RpM离心10分钟。离心后,除去上清并加入新的PBS缓冲液40ML,通过涡流使其稳定混合。该操作重复4次,进行菌体的洗涤。将洗涤后的菌体悬浮在5ML的PBS缓冲液中,将其作为给药用培养活菌。
给药用培养活菌的制备(B.breve/pSP3B-TNF alpha)
用吸量管量取上述得到的本培养液10ML,加入到40ML装有充分冷却后的PBS缓冲液的锥形管中,通过倒转混合使其稳定混合后,用冷却至4℃的离心机以8000RpM离心10分钟。离心后,除去上清并加入新的PBS缓冲液40ML,通过涡流使其稳定混合。该操作重复4次,进行菌体的洗涤。将洗涤后的菌体悬浮在10ML的PBS缓冲液中,将其作为给药用培养活菌。
(5)菌以及麦芽糖的给药
菌的给药
将每只小鼠0.2ML的各培养活菌(第二组:B.lonum 105A/pSP3B-TNF alpha、第三组:B.breve/pSP3B-TNF alpha)以1日2次(AM/PM)、每周2次(Day1,4,8,11)的频率经2周静脉内给予第二组以及第三组。培养活菌是以总给药容量1.6ML、B.lonum 105A/pSP3B-TNF alpha总给药菌数3.1×109CFU/小鼠、B.breve/pSP3B-TNF alpha总给药菌数4.8×109CFU/小鼠进行给予的。给药活菌数如下测定。
活菌数测定
将培养的细菌液体用厌氧稀释剂稀释106倍,将其中100μl在3个BLFS平板上涂板,并在密封容器中(AneroPack rectangular jar,三菱气体化学公司),于37°C下,在恒温器中与去氧/二氧化碳生成剂共同厌氧培养3天。根据从检测到的菌落数在30至300的级别的平板,通过下文的公式计算给予的细菌数。
给药菌数(CFU)=菌落数(a)×平板涂布时的稀释率(B)×每1ML培养活菌的换算系数(C)×给药量(ML)
(a):(P1+P2+P3)/3〔3平板(P1,P2,P3)的平均菌落数〕
(B):×106〔106倍稀释〕
(C):×10〔每1个平板涂布100μL〕
麦芽糖的给药
第二、三组中,将作为菌的糖源的10%麦芽糖溶液1ML以每天2次(200MG /BODy/Day)腹腔内给予小鼠。给药期间是从培养活菌给药日至21天(Day1~21)。
(6)肿瘤增殖抑制效果的确认
对于全部的小鼠,在治疗起始前(分组时)以及治疗起始后22天,以3~4日1次的频率测定肿瘤尺寸,确认对肿瘤增殖的效果。
算出各组的小鼠的肿瘤体积的平均值±SD,以相对于对照组(第一组)的相对肿瘤体积比率〔T/C(%)〕作为指标来判定抗肿瘤效果。另外,进行第一组和第二组、第一组和第三组之间的统计学分析(2组间比较:T-TeST)。
各组的肿瘤体积(平均值±SD)示于以下的表11。
另外,此时的经日的肿瘤体积变动示于图15。
[表13]
表11:各组的评价肿瘤体积
#1):T/C(%)=第二组或第三组的平均肿瘤体积/第一组的
平均肿瘤体积×100
在B.lonum 105A/pSP3B-TNF alpha以及B.breve/pSP3B-TNF alpha任一方的给药组中,与无处理组比较,观察到显著的肿瘤体积的减少。
实施例8:长双歧杆菌105A/pSP3B-TNF alpha的抗肿瘤效果测定
对制造例4中制作的长双歧杆菌105A/pSP3B-TNF alpha在阿霉素并用中的抗肿瘤效果进行了测定。
(1)移植肿瘤细胞的培养
人类乳癌细胞株的KPL-1细胞是用添加有10%(v/v)FBS及0.1%(v/v)盘尼西林(50000U/ML)·链霉素(50MG/ML)液的DMEM培养基在37℃、5%CO2的条件下培养的。
在形成融合的时刻,用1×PBS(-)洗净后加入1×胰蛋白酶-EDTA而剥离细胞,将通过离心操作(1000转/5分钟)回收的细胞用DMEM培养基适当稀释并传代培养。
在移植实验中,使用第五代细胞。将未被台盼蓝染色的成活细胞数目通过Thoma血细胞计数器(Thoma0.1mm deep ERMA,东京)进行计数,并且通过将它们在汉克溶液(Hanks' solution)中悬浮来将细胞数调整为2.5×106细胞/mL。
(2)荷瘤裸小鼠制作和肿瘤体积的测定
将制备的KPL-1细胞悬浊液0.2ML移植到裸小鼠的右前肢背部侧的皮下(5×105个/小鼠)。移植后,使用测径仪,通过测量肿瘤的尺寸(大直径、小直径、厚度),根据下文的公式来测定肿瘤的体积。
肿瘤体积(mm3)=大直径(mm)×小直径(mm)×厚度(mm)/2
(3)分组以及组构成
选择18只具有80~120mm3级别的肿瘤体积的KPL-1荷瘤裸小鼠,分为平均肿瘤体积程度相同的3组(1组6只)。将这一天设为第0天。
试验组构成如表12所示。即,第一组:无处理组、第二组:阿霉素单独给药组、第三组:菌(长双歧杆菌105A/pSP3B-TNF alpha)+阿霉素并用给药组。
[表14]
表12:组构成
(4)菌(长双歧杆菌105A/pSP3B-TNF alpha)的培养
将制造例4中制作的双歧杆菌长双歧杆菌105A/pSP3B-TNF alpha的甘油保存菌在APS-2S-2.5SE(75μG/ML壮观霉素)液体培养基中进行1%接种,在37℃厌氧培养23.5小时(活性化培养液)。接下来,将1%的活性化培养液接种在APS-2S-2.5SE(75μG/ML壮观霉素)液体培养基20ML中,在37℃厌氧培养18小时(本培养液)。
给药用培养活菌的制备
用吸量管量取上述本培养液5ML,加入到20ML装有充分冷却后的PBS缓冲液的锥形管中,通过倒转混合使其稳定混合后,用冷却至4℃的离心机以8000RpM离心10分钟。离心后,除去上清并加入新的PBS缓冲液20ML,通过涡流使其稳定混合。该操作重复4次,进行菌体的洗涤。将洗涤后的菌体悬浮在2.5ML的PBS缓冲液中,将其作为给药用培养活菌。
(5)菌、麦芽糖以及阿霉素的给药
菌的给药
对于第三组,将每只小鼠0.2ML的培养活菌(待测药)以每天2次(AM/PM)、每周2次(Day1,5,8,12)进行静脉内给药。培养活菌是以总给药容量1.6ML、总给药菌数3.0×109CFU/小鼠进行给予的。给药活菌数如下测定。
活菌数测定
将培养的细菌液体用厌氧稀释剂稀释106倍,将其中100μl在3个BLFS平板上涂板,并在密封容器中(AneroPack rectangular jar,三菱气体化学公司),于37°C下,在恒温器中与去氧/二氧化碳生成剂共同厌氧培养3天。根据从检测到的菌落数在30至300的级别的平板,通过下文的公式计算给予的细菌数。
给药菌数(CFU)=菌落数(a)×平板涂布时的稀释率(B)×每1ML培养活菌的换算系数(C)×给药量(ML)
(a):(P1+P2+P3)/3〔3平板(P1,P2,P3)的平均菌落数〕
(B):×106〔106倍稀释〕
(C):×10〔每1个平板涂布100μL〕
麦芽糖的给药
第三组中,将作为菌的糖源的10%麦芽糖溶液1ML以每天2次(200MG/BODy/Day)腹腔内给予小鼠。给药期间是从培养活菌给药日至20天(Day1~20)。
阿霉素的给药
第二组以及第三组中,仅在初次菌给药的前日(Day0)将阿霉素溶液(1.0MG/ML)0.1ML静脉内给予小鼠。
(6)肿瘤增殖抑制效果的确认
对于全部的小鼠,在治疗起始前(分组时)以及治疗起始后21天,以3~4日1次的频率测定肿瘤尺寸,确认对肿瘤增殖的效果。
算出各组的小鼠的肿瘤体积的平均值±SD,以相对于对照组(第一组)的相对肿瘤体积比率〔T/C(%)〕作为指标来判定抗肿瘤效果。另外,为了判定分泌TNFα的本菌的抗肿瘤能力,进行第二组和第三组之间的统计学分析(2组间比较:T-TeST)。
各组的肿瘤体积(平均值±SD)示于以下的表13。
另外,此时的经日的肿瘤体积变动示于图16。
[表15]
表13:各组的评价肿瘤体积
#1):阿霉素5.0mg/kg
#2):T/C(%)=第二组或第三组的平均肿瘤体积/第一组的平均肿瘤体积×100
并用了长双歧杆菌105A/pSP3B-TNF alpha和阿霉素的组,不仅与无处理的组,而且与仅给予了阿霉素的组比较,肿瘤体积也显著减小。这也就意味着通过并用阿霉素和长双歧杆菌105A/pSP3B-TNF alpha可以提高效果。
制造例8:非分泌型人类IL-18表达双歧杆菌的制作
质粒phIL18mut-His的构建
在来自双歧杆菌的HU启动子下游仅配置人类IL-18,构建不具有分泌信号的穿梭载体(双歧杆菌-大肠杆菌)。概要示于图17。具体如下。
制备插入物
使用了配置有将人类IL-18(Accession No:NM 001562、成熟蛋白编码 区域329号至799号的碱基序列)的密码子优化为双歧杆菌用的人工DNA、在其上游及下游配置的来自双歧杆菌的HU启动子及HU终止子的质粒:humanIL18_opt_in_pUC57(委托GenScript商业合成)。人工DNA合成时,在成熟人类IL-18的7号氨基酸(E→A)及54号氨基酸(K→A)两处导入氨基酸置换,通过IL-18结合蛋白质来减少中和,在C末端附加His-Tag(成熟人类IL-18的氨基酸序列:序列号47)。
在质粒human IL18_opt_in_pUC57 2μG中添加BaMHI 25UNIT及BCUI15UNIT(酶は均为Fermentas),在37℃保温3小时使其完全分解。将消化后 的质粒用1%精制用琼脂糖凝胶(1×TBE BUFFeR、含有溴化乙锭)进行电泳,分离DNA片段。切出约1kBp的小片段,用DNA提取试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit,QIAGEN)从琼脂糖凝胶提取和精制DNA。在0.8%琼脂糖凝胶(1×TBE BUFFeR、含有溴化乙锭)中将精制DNA片段(插入物)与DNA浓度标记一起进行电泳,估计其浓度。
制备载体
用BaMHI、BCUI、PSTI、BSp119I(均为Fermentas、PSTI及BSp119I在CD上有识别部位)将质粒pCDshuttle完全分解。反应条件按照酶的使用说明书。用1%精制用琼脂糖凝胶(1×TBE BUFFeR、含有溴化乙锭)电泳将消化后的质粒分离,切出约3.4kBp的大片段,用DNA提取试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit、凯杰株式会社)从琼脂糖凝胶提取和精制DNA。用0.8%琼脂糖凝胶(1×TBE BUFFeR、含有溴化乙锭)将精制DNA片段(载体)和DNA浓度标记一起进行电泳,估计其浓度。
克隆
将上述载体及插入物以1:3(摩尔比)进行混合,连接(Rapid DNA Ligation Kit、Fermentas)。具体按照产品说明书进行。
用上述连接反应液2μL进行大肠杆菌TOP10 chemically Competent Cell(Invitorogen社)的转化。转化条件按照说明书。将转化后的大肠杆菌菌落用LB(75μG/ML壮观霉素含有)液体培养基在37℃培养一夜,从其中提取质粒(QIAprep Spin Miniprep Kit,凯杰株式会社)。该质粒名称命名为phIL18mut-His(序列号48)。
pSP3B-hIL18mut的构建
构建在来自双歧杆菌的HU启动子下游配置有与信号肽融合了的humanIL18mut的穿梭载体(双歧杆菌-大肠杆菌)。概要示于图18。具体如下。
制备插入物
以质粒phIL18mut-His 5NG作为模板,用PrimeSTAR(R)HS Premix(TaKaRa BIO株式会社)对hIL18mut编码区域进行PCR扩增。引物使用的是IL18 F2引物及IL18 R2引物,使各引物的5’侧的15个碱基为与载体的末端相同的序列(表14)。进行引物设计以使得PCR产物中不含IL-18的C末端的His-Tag。PCR的程序是:98℃10秒、55℃5秒、72℃30秒,进行30个循环后,在72℃进行30秒。
将PCR产物的一部分与DNA浓度标记一起用2%琼脂糖凝胶(1×TBE BUFFeR、含有溴化乙锭)进行电泳,确认是约0.5kBp的单一条带,并且估计其浓度。
制备载体
以质粒pSP3B-TNFalpha 5NG作为模板,用PrimeSTAR(R)HS Premix(TaKaRa BIO株式会社)对信号肽SP3及载体骨架进行PCR扩增。引物使用的是vector F3引物及vector R2引物(表14),使各引物的5’侧的15个碱基为与插入物的末端相同的序列。PCR的程序是:98℃10秒、55℃5秒、72℃4分钟,进行30个循环后,在72℃进行30秒。
将PCR产物的一部分与DNA浓度标记一起用0.8%琼脂糖凝胶(1×TBEBUFFeR、含有溴化乙锭)进行电泳,确认是约4kBp的单一条带,并且估计其浓度。
[表16]
表14pSP3B-hlL18mut的构建用引物
克隆
用In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit(TaKaRa BIO株式会社)对上述载体100NG及插入物40NG进行末端序列的重组。此时,将Cloning Enhancer(TaKaRa BIO株式会社)也加入反应液中,插入物及载体中所含的模板质粒的分解也同时进行。具体按照In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit的产品说明书。
使用上述In-Fusion反应液2μL进行大肠杆菌TOP10 chemically Competent Cell(Invitorogen社)的转化。转化条件按照说明书。将转化后的大肠杆菌菌落用LB(75μG/ML壮观霉素含有)液体培养基在37℃培养一夜,从其中提取质粒(QIAprep Spin Miniprep Kit、凯杰株式会社)。确定该质粒的全序列,设为pSP3B-hIL18mut(序列号49)。
双歧杆菌的转化
采用与制造例1同样的方法,用质粒pSP3B-hIL18mut进行长双歧杆菌105A及B.breve JCM1192的转化。
实施例9:重组双歧杆菌的人类IL-18蛋白表达
试样制备
将制造例8中得到的重组双歧杆菌:长双歧杆菌105A/pSP3B-hIL18mut及参考例4中得到的长双歧杆菌105A/pBEshuttle的甘油保存菌在APS-2S-2.5SE(75μG/ML壮观霉素)液体培养基中进行1%接种,在37℃厌氧培养24小时(活性化培养液)。接下来,将活性化培养液0.5%接种到在每20MLAPS-2S-2.5SE(75μG/ML壮观霉素)液体培养基中添加有1M磷酸钠缓冲液(pH6.8)4ML的培养基中。将其在37℃厌氧培养18小时(本培养液)。
通过与上述同样的方法,进行短双歧杆菌JCM1192/pSP3B-hIL18mut的培养。这里,本培养是培养了14小时。
在1.5ML容管取本培养液1.3ML,离心分离(14,000RpM、5分、4℃)后,回收其上清,将其作为IL-18测定用试样。
IL-18测定
用Human IL-18ELISA试剂盒(MBL)测定各上清的人类IL-18蛋白质量。结果是,长双歧杆菌105A/pSP3B-hIL18中检测为986pG/ML、短双歧 杆菌JCM1192/pSP3B-hIL18mut中检测为1632pG/ML のIL-18,mock中没有检测到。
工业上的利用性
通过将本发明的分泌信号肽导入表达单元,从而能够在不丧失生理活性的情况下使表达蛋白高效地分泌到转化菌体外。因此,本发明的载体以及用该载体转化的厌氧性微生物与以往相比,在厌氧性疾病组织中可以将治疗剂高效地供给到疾病部位,因而能够获得高的治疗效果。