KR101850162B1 - 형질전환용 플라스미드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 분비 시그널, 분비 시그널을 포함하는 신규 형질전환용 플라스미드, 그 플라스미드로 형질전환된 형질전환 혐기성균, 그 혐기성균으로 이루어지는 유전자 수송 담체, 그 담체를 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다.

Description

형질전환용 플라스미드{TRANSFORMATION PLASMID}

본 발명은 고형종양 등의 혐기적질환 치료용 유전자 수송 담체로서 유용한 형질전환 혐기성균 제작에 이용되며 혐기성균에서 기능하는 분비 시그널 펩티드를 포함한 발현카세트를 가지면서 비셔틀 플라스미드인 형질전환용 플라스미드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 그 형질전환용 플라스미드로 형질전환된 혐기성균으로 이루어지는 유전자 수송 담체, 그 유전자 수송 담체를 함유하는 의약 조성물 및 그 유전자 수송 담체를 함유하는 혐기적질환 치료제에 관한 것이다.

또한 본 발명은 그 혐기적질환 치료용 형질전환균 제작에 유용한, 신규 분비 시그널 펩티드를 코딩하는 염기서열로 이루어지는 DNA 단편에 관한 것이다.

최근 악성종양의 치료방법에 있어서 형질전환 혐기성균을 유전자 수송 담체로 이용하는 방법이 주목을 받고 있으며 예를 들어 형질전환한 클로스트리듐을 이용하여 항종양물질의 프로드러그를 항종양물질로 변환하는 효소인 니트로리덕타제의 발현유전자를 종양부위에 수송하는 방법 등이 제안되어 있다(특허문헌 1∼3 참조).

그리고 침습성의 혐기성세균, 예를 들어 살모넬라균, 장침입성 대장균, 리스테리아균, 시겔라균 등을 이용하여 종양세포에 대한 RNA 간섭(RNA interfering, RNAi)에 의해 혐기적질환 인자에 관여하는 유전자를 소멸시키나 발현저해시키는 핵산(siRNAs; 소형 간섭 RNAs(small interfering RNAs), 단쇄 간섭 RNAs(short interfering RNAs) 또는 단쇄 헤어핀 RNAs(short hairpin RNAs))의 발현유전자를 수송하는 방법도 검토되고 있다(특허문헌 4∼6 참조).

그런데 이 미생물들은 모두 병원성균을 저독성으로 변이화한 것이라서 역변이화하여 원래의 병원성균으로 돌아가 유해성을 발휘할 가능성을 부정할 수 없으며, 또한 운동성, 침습성이기 때문에 질환조직에서뿐만 아니라 정상조직에서도 작용을 발현하여 전신성 부작용 증상을 일으킬 우려가 있는 등 안전성면에서 문제성이 우려된다.

본 발명자들은 인간의 장내에 존재하여 플로라를 형성하는 비병원성 장내 세균이며 매우 안전한 편성혐기성세균인 것으로 알려져 있는 비피더스균에 주목하여 이 비피더스균의 형질전환균을 이용하는 악성종양의 치료방법을 개발하였다.

그리고 항종양물질인 5-플루오로우라실(이하 5-FU라 함)의 프로드러그인 5-플루오로시토신(이하 5-FC라 함)을 5-FU로 변환하는 효소인 시토신 데아미나제(이하 CD라 함)를 발현하도록 형질전환한 비피도박테리움 롱검 105A를 개발했다(특허문헌 7, 8 참조).

이 형질전환 비피더스균은 이것을 혐기적질환의 고형종양 동물 모델에 정맥내 투여한 경우 저산소상태의 혐기적질환 조직 특이적으로 생착, 증식하고, 혐기적 환경이 아닌 정상조직에서는 빠르게 소실된다고 하는 특징을 가지고 있다(비특허문헌 1, 2 참조).

그리고 이 형질전환 비피더스균은 정맥내 투여에서도 항원성을 나타내지 않는다는 특징도 가지고 있어 매우 우수한 악성종양 치료제로서 기대할 수 있다.

이 형질전환 비피더스균들은 대장균-비피더스균의 셔틀 플라스미드인 pBLES100-S-eCD나 pAV001-HU-eCD-M968 등을 이용하여 형질전환되고 있는 점에서 대장균에 수평전이된 경우 그 대장균에서 복제된다고 하는 우려가 있었다. 그래서 본 발명자들은 이러한 과제를 해결하기 위하여 플라스미드를 개량하여 대장균에서 기능하는 복제개시점을 가지지 않는 비셔틀 플라스미드인 pBifiCD를 개발했다(특허문헌 9 참조).

한편 이 비셔틀 플라스미드들은 분비 시그널을 가지고 있지 않기 때문에 이 형질전환 비피더스균들은 발현한 CD를 균체 외로 분비할 수 없었다.

이러한 점에서 비피더스균에서 기능하고 발현단백질 등을 균체 외로 분비할 수 있는 분비 시그널 펩티드의 개발이 요구되고 있었다.

비피더스균의 분비단백으로는 예를 들어 비피도박테리움 아돌레센티스의 아밀라아제나 비피도박테리움 브레베의 Sec1, Sec2, Sec3 등이 보고되어 있고 그 분비 시그널들을 도입한 플라스미드도 보고되어 있다.

예를 들어 비피도박테리움 아돌레센티스의 아밀라아제의 분비 시그널 펩티드 유전자를 도입하고 대장균-비피더스균의 셔틀 플라스미드인 pYBamy59로 형질전환한 비피도박테리움 롱검 MG1이 보고되어 있다(비특허문헌 3 참조).

그리고 비피도박테리움 브레베의 Sec2의 분비 시그널 펩티드와 인간형 섬유아세포 증식인자(FGF-2)의 융합 유전자를 도입하고 대장균-비피더스균의 셔틀 플라스미드인 pESH86, pESH87 등으로 형질전환한 비피도박테리움 브레베 UCC2003 등도 보고되어 있다(비특허문헌 4 참조).

그리고 비피도박테리움속 세균 유래 프로모터 및 시그널 서열, 특히 BL1181 유전자 산물인 시그널 또는 amyB 유전자 산물인 시그널 서열을 포함한 발현카세트도 보고되었으며, 실제로 비피도박테리움 브레베 및 비피도박테리움 롱검에 있어서 발현단백질의 현저한 분비가 확인되었다(특허문헌 10).

그러나 상기한 플라스미드는 모두 대장균-비피더스균의 셔틀 플라스미드이며 본 발명과 같이 대장균에서 기능하는 복제개시점을 가지지 않는 비셔틀 플라스미드이면서 비피더스균에서 기능하는 분비 시그널을 가지는 플라스미드에 대해서는 아직 알려져 있지 않다. 또 이 분비 시그널들은 모두 확인된 균주 이외의 균주에서 기능할지 여부가 불분명하고 형질전환한 균의 목적단백질의 분비량도 적을 것으로 추측되었다. 그 때문에 우수한 분비 기능을 발휘시킬 수 있고 실용성이 높은 분비 시그널 펩티드의 개발도 또한 요망되고 있었다.

특허문헌 1: 미국 특허공보 제6416754호 특허문헌 2: 미국 특허공보 제6652849호 특허문헌 3: 미국 특허공개공보 2003/0103952호 특허문헌 4: 일본 특허공표공보 2008-519002호 특허문헌 5: 일본 공개특허공보 2008-92956호; 국제공개공보 WO2006-066048호 특허문헌 6: 국제공개공보 WO2008-091375호 특허문헌 7: 일본 공개특허공보 2002-97144호 특허문헌 8: 국제공개공보 WO2007-136107호 특허문헌 9: 국제공개공보 WO2009-128272호 특허문헌 10: 국제공개공보 WO2010-126073호

비특허문헌 1: Yazawa et al., Cancer Gene Therapy, Vol. 7, No. 2, 2000: pp 269-274 비특허문헌 2: Yazawa et al., Breast Cancer Research and Treatment, Vol. 66, 2001: pp 165-170 비특허문헌 3: Seong et al., Biotechnology Letters, 2006, Vol. 28: pp 163-168 비특허문헌 4: Shkoporov et al., Biotechnology Letters, 2008 Vol. 30: pp 1983-1988

본 발명의 과제는 형질전환 혐기성균 제작용의 형질전환용 플라스미드로서, 혐기성균에서 기능하는 분비 시그널을 가지면서 그 혐기성균 이외의 균에서 기능하는 복제개시점을 가지지 않는 비셔틀 플라스미드, 그 형질전환용 플라스미드로 형질전환된 형질전환 혐기성균, 그 형질전환 혐기성균으로 이루어지는 유전자 수송 담체, 그 유전자 수송 담체를 함유하는 의약 조성물 및 그 형질전환 혐기성균을 함유하는 혐기적질환 치료제를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 과제는 그 형질전환용 플라스미드로 형질전환된 형질전환 혐기성균으로 이루어지는 유전자 수송 담체, 그 유전자 수송 담체를 함유하는 의약 조성물 및 그 내성균을 함유하는 혐기적질환 치료제를 제공하는 것에 있다.

그리고 본 발명의 또 다른 과제는 예를 들어 비피도박테리움 롱검 105A 등에서도 기능을 발휘하는 신규 분비 시그널을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 앞서 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환하는 활성을 가지는 단백질 내의 CD를 발현하는 유전자를 도입한 플라스미드인 pBLES100-S-eCD, pAV001-HU-eCD-M968 등을 제작했다. 그리고 이것을 이용하여 재조합한 편성혐기성균, 예를 들어 비피도박테리움 롱검 105A/pBLES100-S-eCD, 비피도박테리움 롱검 105A/pAV001-HU-eCD-M968 등을 유용한 악성종양의 치료제로서 기대할 수 있다는 것을 알아내어 보고했다(특허문헌 7, 8).

상기 특허문헌 7, 8의 형질전환균의 제작에 이용된 플라스미드인 pBLES100-S-eCD나 pAV001-HU-eCD-M968는 모두 대장균-비피더스균의 셔틀 플라스미드인 점에서 이것이 대장균에 수평전이된 경우 그 대장균에서 복제된다는 우려가 있었다.

그러나 형질전환 유전자 수송 담체를 이용하는 고형종양의 치료방법에서는 이용하는 유전자 수송 담체의 형질전환 유전자가 그 유전자 수송 담체 이외의 병원성균 또는 호기성 혹은 통성혐기성균에 수평전이되지 않는 점, 그리고 비록 수평전이되었다고 해도 그 균에서 복제되지 않는 점이 매우 중요하다. 이 점에서 형질전환균 이외의 균에서 기능하는 복제개시점을 가지지 않는, 즉 형질전환균 이외의 균과 상호복제되지 않는 비셔틀 플라스미드일 것이 요구된다.

그래서 본 발명자들은 이러한 과제를 해결하기 위하여 플라스미드를 개량하여 대장균에서 기능하는 복제개시점을 가지지 않는 비셔틀 플라스미드인 pBifiCD를 개발하였다(특허문헌 9).

한편 이 플라스미드들은 모두 분비 시그널을 가지고 있지 않은 형질전환용 플라스미드이기 때문에 이것을 이용하여 재조합한 형질전환균은 발현한 CD를 균체 외로 분비하지 않아 CD의 발현량이 CD 효소 활성, 즉 약효에 직접 반영되지 않는다고 하는 문제가 여전히 남아 있었다.

그리고 CD와 같은 프로드러그를 항종양물질로 변환하는 효소가 아니라 항종양성 단백질이나 핵산 등을 생성하는 균의 경우에는 생성된 항종양물질을 균체 외로 방출시켜야 할 필요가 있고, 이를 위해서는 혐기적질환 조직에서 증식한 후 균을 살파괴시켜야 했다. 이러한 점에서 편성혐기성균, 특히 비피더스균에서 기능하는 분비 시그널을 가진 형질전환용 플라스미드가 보다 바람직하다는 결론에 이르렀다. 그리고 예의연구를 계속한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉 본 발명은,

[1]형질전환 혐기성균 제작용 플라스미드로서, 혐기성균에서 기능하는 분비 시그널을 포함하는 발현카세트를 가지면서 비셔틀 플라스미드인 형질전환용 플라스미드,

[2]혐기성균이 비피더스균인 [1]에 기재된 플라스미드,

[3]분비 시그널 펩티드가 비피더스균에서 유래하는 [1] 또는 [2]에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[4]분비 시그널 펩티드가 비피도박테리움 롱검균에서 유래하는 [3]에 기재된 형질전환 플라스미드,

[5]분비 시그널이 서열번호 6∼28의 염기서열 또는 그 서열 중 하나 혹은 복수의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 서열 중 어느 하나로 표시되는 DNA인 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[6]분비 시그널이 서열번호 6, 7, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 21, 25 혹은 28의 염기서열 또는 그 서열 중 하나 혹은 복수의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 서열인 [5]에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[7]분비 시그널이 서열번호 8 혹은 25의 염기서열 중 어느 하나로 표시되는 DNA 또는 그 1염기변이다형인 [6]에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[8]발현카세트에 포함되는 프로모터를 코딩하는 유전자가 서열번호 29∼44의 프로모터 영역의 염기서열 혹은 서열번호 45의 염기서열 또는 그 서열 중 하나 혹은 복수의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 서열 중 어느 하나로 표시되는 DNA인 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[9]발현카세트에 포함되는 프로모터 유전자가 서열번호 35의 프로모터 영역의 염기서열 혹은 45의 염기서열 또는 그 서열 중 하나 혹은 복수의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 서열인 [8]에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[10]발현카세트에 포함되는 터미네이터 유전자가 서열번호 46의 염기서열 또는 그 서열 중 하나 혹은 복수의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 서열로 표시되는 DNA인 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[11]발현카세트에 포함되는 표적유전자가 형광단백질을 코딩하는 유전자인 [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[12]발현카세트에 포함되는 표적유전자가 항종양 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자인 [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[13]항종양 활성을 가지는 단백질이 인터페론(IFN)-α, IFN-β, IFN-γ, 과립구 마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터류킨(IL)-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, 종양괴사인자(TNF)-α, 림프독소(LT)-β, TNF 관련 아포토시스 유발 리간드(TRAIL), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 마크로파지 콜로니 자극인자(M-CSF), 마크로파지 유주 저지인자(MIF), 백혈병 저지인자(LIF), T세포 활성화 공자극인자 B7(CD80) 및 B7-2(CD86), 키트 리간드, 온코스타틴 M 등의 사이토카인 및 엔도스타틴, 안지오스타틴, 크링글-1, 크링글-2, 크링글-3, 크링글-4, 크링글-5 등의 혈관신생 억제 물질로 이루어지는 군에서 선택되는 1종인 [12]에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[14]항종양 활성을 가지는 단백질이 종양괴사인자(TNF)-α 또는 TNF 관련 아포토시스 유발 리간드(TRAIL) 중 어느 하나인 [13]에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[15]표적유전자가 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환하는 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자인 [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[16]항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환하는 활성을 가지는 단백질이 시토신 데아미나아제, 니트로리덕타아제 및 β-글루클로니다아제로 이루어지는 군에서 선택되는 1종인 [15]에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[17]표적유전자가 허혈성질환 치료 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자인 [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[18]허혈성질환 치료 활성을 가지는 단백질이 섬유아세포 증식인자 2(FGF2), 내피세포 증식인자(ECGF), 혈관내피 증식인자(VEGF), 간실질세포 증식인자(HGF) 등의 혈관신생 촉진 활성을 가지는 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 1종인 [17]에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[19]표적유전자가 혐기적질환의 치료 활성을 가지는 핵산인 [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[20]혐기적질환의 치료 활성을 가지는 핵산이 섬유아세포 증식인자 2(FGF2), 내피세포 증식인자(ECGF), 혈관내피 증식인자(VEGF) 및 간실질세포 증식인자(HGF) 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 종양세포 증식인자에 관여하는 siRNAs인 [19]에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[21]서열번호 5의 염기서열 또는 그 서열 중 하나 혹은 복수의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 서열 중 어느 하나로 표시되는 DNA 서열을 포함하는 [1] 내지 [20] 중 어느 하나에 기재된 형질전환용 플라스미드(pBifi-SP3B-TNF alpha),

[22][1] 내지 [21] 중 어느 하나에 기재된 형질전환용 플라스미드로 형질전환된 혐기성균으로 이루어지는 유전자 수송 담체,

[23]혐기성균이 비병원성의 장내 세균인 [22]에 기재된 유전자 수송 담체,

[24]혐기성균이 비피더스균인 [22] 또는 [23]에 기재된 유전자 수송 담체,

[25]비피더스균이 비피도박테리움 아돌레센티스, 비피도박테리움 앙굴라툼, 비피도박테리움 아니말리스, 비피도박테리움 아스테로이데스, 비피도박테리움 비피둠, 비피도박테리움 보움, 비피도박테리움 브레베, 비피도박테리움 카테눌라툼, 비피도박테리움 코에리눔, 비피도박테리움 코리네포르메, 비피도박테리움 쿠니쿨리, 비피도박테리움 덴티콜렌스, 비피도박테리움 덴티움, 비피도박테리움 갈리쿰, 비피도박테리움 갈리나룸, 비피도박테리움 글로보숨, 비피도박테리움 인디쿰, 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 이노피나툼, 비피도박테리움 락티스, 비피도박테리움 락텐티스, 비피도박테리움 리베로룸, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 마그눔, 비피도박테리움 메리시쿰, 비피도박테리움 미니뭄, 비피도박테리움 몽골리엔스, 비피도박테리움 파르블로룸, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼, 비피도박테리움 슈도롱검, 비피도박테리움 사이클라에로피룸, 비피도박테리움 프로룸, 비피도박테리움 루미날레, 비피도박테리움 루미나티움, 비피도박테리움 사에쿨라레, 비피도박테리움 스카르도비, 비피도박테리움 서브타일, 비피도박테리움 수이스, 비피도박테리움 테르마시도필룸 및 비피도박테리움 테르모필룸으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종인 [24]에 기재된 유전자 수송 담체,

[26]비피도박테리움속 세균이 비피도박테리움 롱검인 [25]에 기재된 유전자 수송 담체,

[27]혐기적 환경하에 있는 종양조직 내에서 생육할 수 있고, 적어도 1종의 혐기적질환의 진단 혹은 치료에 유용한 단백질 또는 핵산을 발현하고 분비할 수 있는 [22] 내지 [26] 중 어느 하나에 기재된 유전자 수송 담체,

[28]혐기적질환의 진단에 유용한 단백질이 형광단백질인 [27]에 기재된 유전자 수송 담체,

[29]혐기적질환의 치료에 유용한 단백질이 항종양 활성을 가지는 단백질인 [27]에 기재된 유전자 수송 담체,

[30]항종양 활성을 가지는 단백질이 인터페론(IFN)-α, IFN-β, IFN-γ, 과립구 마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터류킨(IL)-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, 종양괴사인자(TNF)-α, 림프독소(LT)-β, TNF 관련 아포토시스 유발 리간드(TRAIL), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 마크로파지 콜로니 자극인자(M-CSF), 마크로파지 유주 저지인자(MIF), 백혈병 저지인자(LIF), T세포 활성화 공자극인자 B7(CD80) 및 B7-2(CD86), 키트 리간드, 온코스타틴 M 등의 사이토카인 및, 엔도스타틴, 안지오스타틴, 크링글-1, 크링글-2, 크링글-3, 크링글-4, 크링글-5 등의 혈관신생 억제 물질로 이루어지는 군에서 선택되는 1종인 [28]에 기재된 유전자 수송 담체,

[31]혐기적질환의 치료에 유용한 단백질이 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환하는 활성을 가지는 단백질인 [27]에 기재된 유전자 수송 담체,

[32]항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환하는 활성을 가지는 단백질이 시토신 데아미나아제, 니트로리덕타아제 및 β-글루클로니다아제로 이루어지는 군에서 선택되는 1종인 [31]에 기재된 유전자 수송 담체,

[33]혐기적질환의 치료에 유용한 핵산이 혐기적질환 인자에 관여하는 siRNAs인 [27]에 기재된 유전자 수송 담체,

[34]혐기적질환 인자에 관여하는 siRNAs가 섬유아세포 증식인자 2(FGF2), 내피세포 증식인자(ECGF), 혈관내피 증식인자(VEGF) 및 간실질세포 증식인자(HGF) 등으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 종양세포 증식인자에 관여하는 siRNAs인 [33]에 기재된 유전자 수송 담체,

[35][22] 내지 [34] 중 어느 하나에 기재된 유전자 수송 담체를 함유하는 의약 조성물,

[36]비피도박테리움 롱검 유래의 분비 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA,

[37]서열번호 6∼28의 염기서열 또는 그 서열 중 하나 혹은 복수의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 서열 중 어느 하나로 표시되는 DNA 서열을 포함하는 [36]에 기재된 분비 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA,

[38][36] 또는 [37]에 기재된 DNA로 코딩되는 분비 시그널 펩티드,

[39][36] 또는 [37]에 기재된 DNA를 포함하는 형질전환용 플라스미드,

[40]혐기적질환의 진단 또는 치료에 유용한 단백질 또는 핵산을 코딩하는 DNA를 더욱 포함하는 [39]에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[41]혐기적질환의 진단에 유용한 단백질이 형광단백질인 [40]에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[42]혐기적질환의 치료에 유용한 단백질이 항종양 활성을 가지는 단백질인 [40]에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[43]항종양 활성을 가지는 단백질이 인터페론(IFN)-α, IFN-β, IFN-γ, 과립구 마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터류킨(IL)-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, 종양괴사인자(TNF)-α, 림프독소(LT)-β, TNF 관련 아포토시스 유발 리간드(TRAIL), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 마크로파지 콜로니 자극인자(M-CSF), 마크로파지 유주 저지인자(MIF), 백혈병 저지인자(LIF), T세포 활성화 공자극인자 B7(CD80) 및 B7-2(CD86), 키트 리간드, 온코스타틴 M 등의 사이토카인 및 엔도스타틴, 안지오스타틴, 크링글-1, 크링글-2, 크링글-3, 크링글-4, 크링글-5 등의 혈관신생 억제 물질로 이루어지는 군에서 선택되는 1종인 [42]에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[44]혐기적질환의 치료에 유용한 단백질이 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환하는 활성을 가지는 단백질인 [40]에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[45]항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환하는 활성을 가지는 단백질이 시토신 데아미나아제, 니트로리덕타아제 및 β-글루클로니다아제로 이루어지는 군에서 선택되는 1종인 [44]에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[46]혐기적질환의 치료에 유용한 핵산이 혐기적질환 인자에 관여하는 siRNAs인 [40]에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[47]혐기적질환 인자에 관여하는 siRNAs가 섬유아세포 증식인자 2(FGF2), 내피세포 증식인자(ECGF), 혈관내피 증식인자(VEGF) 및 간실질세포 증식인자(HGF) 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 종양세포 증식인자에 관여하는 siRNAs인 [46]에 기재된 형질전환용 플라스미드,

[48][39] 내지 [47] 중 어느 하나에 기재된 형질전환용 플라스미드로 형질전환된 혐기성균인 유전자 수송 담체,

[49]혐기성균이 비피더스균인 [48]에 기재된 유전자 수송 담체,

[50]비피더스균이 비피도박테리움 아돌레센티스, 비피도박테리움 앙굴라툼, 비피도박테리움 아니말리스, 비피도박테리움 아스테로이데스, 비피도박테리움 비피둠, 비피도박테리움 보움, 비피도박테리움 브레베, 비피도박테리움 카테눌라툼, 비피도박테리움 코에리눔, 비피도박테리움 코리네포르메, 비피도박테리움 쿠니쿨리, 비피도박테리움 덴티콜렌스, 비피도박테리움 덴티움, 비피도박테리움 갈리쿰, 비피도박테리움 갈리나룸, 비피도박테리움 글로보숨, 비피도박테리움 인디쿰, 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 이노피나툼, 비피도박테리움 락티스, 비피도박테리움 락텐티스, 비피도박테리움 리베로룸, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 마그눔, 비피도박테리움 메리시쿰, 비피도박테리움 미니뭄, 비피도박테리움 몽골리엔스, 비피도박테리움 파르블로룸, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼, 비피도박테리움 슈도롱검, 비피도박테리움 사이클라에로피룸, 비피도박테리움 프로룸, 비피도박테리움 루미날레, 비피도박테리움 루미난티움, 비피도박테리움 사에쿨라레, 비피도박테리움 스카르도비, 비피도박테리움 서브타일, 비피도박테리움 수이스, 비피도박테리움 테르마시도필룸 및 비피도박테리움 테르모필룸으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종인 [49]에 기재된 유전자 수송 담체,

[51]비피도박테리움속 세균이 비피도박테리움 롱검인 [50]에 기재된 유전자 수송 담체,

[52][48] 내지 [51] 중 어느 하나에 기재된 유전자 수송 담체를 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 플라스미드는 분비 시그널을 가지는 발현카세트를 가지면서 비셔틀 플라스미드인 고형종양 등의 혐기적질환 치료용 형질전환 혐기성균 제작에 유용한 신규 플라스미드이다. 본 발명의 플라스미드는 형질전환균 이외의 균에서 기능하는 복제개시점을 가지지 않고 형질전환균 이외의 균과 상호복제되지 않는 비셔틀 플라스미드이기 때문에 매우 안전한 벡터이다.

그리고 본 발명의 형질전환용 플라스미드로 형질전환한 혐기성균은 혐기적질환 조직 특이적으로 생착, 증식하고, 그 질환조직에 있어서 혐기적질환의 치료 활성을 가지는 단백질 또는 핵산을 생성, 분비시킬 수 있고, 혐기적질환 치료제로서 매우 유용하여 고품질의 유전자 수송 담체로서 기대할 수 있다.

그리고 본 발명의 신규 분비 시그널은 상기와 같이 플라스미드에 삽입하는 것 이외에 이것을 직접 혐기성균의 게놈에 도입하는 것에 의해 혐기적질환 치료용으로서 유용한 형질전환 혐기성균을 제작할 수도 있다.

도 1은 분비형 GFP 발현 플라스미드(pSPxA-GFP)의 구축 개요를 나타내는 맵 도이다.
도 2는 분비형 GFP 발현 플라스미드(pSPxB-GFP)의 구축 개요를 나타내는 맵 도이다.
도 3은 분비형 GFP 발현 플라스미드(pSec2-GFP)의 구축 개요를 나타내는 맵 도이다.
도 4는 B. longum 105A/pSP3B-GFP, B. longum 105A/pSP7B-GFP, B. longum 105A/pSP23B-GFP, B. longum 105A/pSP7A-GFP 및 B. longum 105A/pSec2-GFP의 웨스턴 블로팅의 결과를 나타내는 도이다. 도면 중 C는 세포내 단백 추출물의 레인을, T는 배양상청 농축물의 레인을, 세로축의 수치는 분자량(kDa)을 나타낸다.
도 5는 분비형 TNFα 발현 플라스미드(pSPxA-TNF alpha)의 구축 개요를 나타내는 맵 도이다.
도 6은 분비형 TNFα 발현 플라스미드(pSPxB-TNF alpha)의 구축 개요를 나타내는 맵 도이다.
도 7은 분비형 TNFα 발현 플라스미드(pSec2-TNF alpha)의 구축 개요를 나타내는 맵 도이다.
도 8은 B. longum 105A/pSP1B-TNF alpha, B. longum 105A/pSP3B-TNF alpha, B. longum 105A/pSP4B-TNF alpha, B. longum 105A/pSP7B-TNF alpha, B. longum 105A/pSP12B-TNF alpha, B. longum 105A/pSP16B-TNF alpha, B. longum 105A/pSP23B-TNF alpha, B. longum 105A/pSP7A-TNF alpha 및 B. longum 105A/pSec2-TNF alpha의 웨스턴 블로팅을 나타내는 도이다. 도면 중 C는 세포내 단백질 추출물의 레인을, T는 배양상청 농축물의 레인을, S는 배양상청의 레인을, 세로축의 수치는 분자량(kDa)을 나타낸다.
도 9는 B. longum 105A 및 B. longum 105A/pTNF3의 웨스턴 블로팅의 결과를 나타내는 도이다. 세로축의 수치는 분자량(kDa)을 나타낸다.
도 10은 플라스미드 pBifi-SP3B-TNF alpha 구축의 개요를 나타내는 맵 도이다.
도 11은 Bifidobacterium longum 105A/pBifiSP3B-TNF alpha의 웨스턴 블로팅을 나타내는 도이다. 레인 1의 분자량 마커는 아래부터 각각 20, 30, 40, 50, 60 및 80 kDa이다.
도 12는 TNFα 발현 플라스미드(pTNF3)의 구축 개요를 나타내는 맵 도이다.
도 13은 인서트를 포함하지 않는 단백질 발현 유닛을 가지는 모크 플라스미드(pBEshuttle)의 구축 개요를 나타내는 맵 도이다.
도 14는 TNFα의 세포독성 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 15는 분비형 TNFα 발현 플라스미드 B. longum 105A/pSP3B-TNF alpha 및 B. breve/pSP3B-TNF alpha를 마우스에서 in vivo 항종양 효과 측정 실험을 했을 때 종양체적의 경일적 변화의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16은 분비형 TNFα 발현 플라스미드 B. longum 105A/pSP3B-TNF alpha를 아드리아마이신 병용하에서 마우스에서 in vivo 항종양 효과 측정 실험을 했을 때 종양체적의 경일적 변화의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 17은 비분비형 인간 IL-18 발현 플라스미드 phIL18mut-His의 구축 개요를 나타내는 맵 도이다.
도 18은 분비형 인간 IL-18 발현 플라스미드 pSP3B-hIL18mut의 구축 개요를 나타내는 맵 도이다.

본원 명세서에서 비셔틀 플라스미드라는 것은 형질전환 대상의 혐기성균에서 기능하는 복제개시점만 가지고 그 이외의 균에서 기능하는 복제개시점을 가지지 않으며, 형질전환 혐기성균과 형질전환 혐기성균 이외의 균과 상호복제되지 않는 플라스미드를 의미한다.

본원 명세서에서 분비 시그널이라는 것은 분비 시그널 펩티드를 코딩하는 염기서열로 이루어지는 DNA 단편(간단히 분비 시그널 펩티드 유전자라고 하기도 함)을 의미한다.

본원 명세서에서는 항종양 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA, 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환하는 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA 및 허혈성질환 치료 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 DNA 등을 "목적단백질을 코딩하는 DNA"라고 하기도 한다.

본원 명세서에서 "siRNAs"라는 것은 소형 간섭 RNA(small interfering RNA) 또는 단쇄 간섭 RNA(short interfering RNA)로 불리는 siRNA 및 표적세포 내에서 다이서(Dicer) 등의 효소에 의해 절단되어 siRNA가 되는 단쇄 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA)를 모두 포함하는 것을 의미한다. 또 siRNA 수식체 및 siRNA 복합체를 포함하여 총칭할 때도 있다.

본원 명세서에서 "발현카세트"라는 것은 프로모터, 발현단백질을 코딩하는 유전자(표적유전자), 터미네이터 등의 발현 유닛을 포함하고, 임의로 다른 유용한 유닛을 더 포함해도 되는, 특정 단백질 또는 펩티드 단편을 발현시키기 위한 유전자의 세트를 말한다. 다른 유용한 유닛으로는 예를 들어 분비 시그널 등의 시그널 펩티드를 코딩하는 유전자, 표지단백질을 코딩하는 유전자 등을 들 수 있다.

본 발명은 형질전환 혐기성균 제작용 플라스미드로서, 혐기성균에서 기능하는 분비 시그널을 포함하는 발현카세트를 가지면서 비셔틀 플라스미드인 형질전환용 플라스미드에 관한 것이다.

고형종양이나 허혈성질환 등 질환 부위가 혐기적 환경하에 있는 질환(이하 혐기적질환이라 함)의 치료에 이용하는 형질전환 유전자 수송 담체로는 안전성의 관점에서 비병원성일 것이 요구된다.

그리고 혐기적 상태에 있는 질환조직 등에서만 생착, 증식하고, 혐기적상태가 아닌 정상적인 조직에서는 생착, 증식하지 않는 편성혐기성균인 것이 보다 바람직하다.

본 발명자들은 먼저 편성혐기성균인 비피더스균을 이용하는 악성종양의 치료방법에 대해 연구를 거듭하여 프로드러그인 5-FC를 항종양물질인 5-FU로 변환하는 효소인 CD의 유전자를 도입한 플라스미드로 형질전환한 비피도박테리움 롱검 105A를 개발했다(특허문헌 7, 8)

이 형질전환 비피더스균들은 혐기적질환의 고형종양 모델 동물에 정맥내 투여한 경우 저산소상태에 있는 혐기적질환 조직 특이적으로 생착, 증식하고, 저산소상태가 아닌 정상조직에서는 빠르게 소실되는 것이 확인되고 있다(비특허문헌 1, 2 참조).

그러나 상기 특허문헌 7, 8의 형질전환 비피더스균은, 대장균-비피더스균의 셔틀 플라스미드인 pBLES100-S-eCD나 pAV001-HU-eCD-M968 등을 이용하여 형질전환되고 있는 점에서, 대장균에 수평전이된 경우 그 대장균에서 복제된다고 하는 우려가 있었다.

그래서 본 발명자들은 이러한 과제를 해결하기 위하여 플라스미드를 개량하여 대장균에서 기능하는 복제개시점을 가지지 않는 비셔틀 플라스미드인 pBifiCD를 개발했다(특허문헌 9)

이 형질전환균을 이용하는 악성종양의 치료방법, 즉 효소-프로드러그 요법(CD-5-FC 요법)에서는 항종양물질인 5-FU의 부작용을 가능한 한 억제하기 위해 항종양물질인 5-FU가 종양조직 특이적으로 작용하는 것이 바람직한 점에서, 본 발명자들은 생산한 CD를 균체 외로 분비하는 일 없이 균체 내에 도입된 5-FC를 5-FU로 변환하고 균체 외로 배출하여 5-FU의 항종양 작용을 종양조직에서만 발휘하도록 이 형질전환 비피더스균들을 모두 분비 시그널을 가지고 있지 않는 플라스미드로 형질전환하였다.

이 분비 시그널을 가지고 있지 않는 플라스미드로 형질전환한 비피더스균은 저산소상태에 있는 혐기적질환 조직 특이적으로 생착, 증식한다고 하는 특징과 효소인 CD가 혐기적질환 조직 특이적으로 생착, 증식한 균의 내부에 머문다고 하는 특징의 양면으로부터, 항종양물질인 5-FU의 전신적인 부작용을 해소할 수 있다고 하는 이점을 가지고 있었지만, 한편으로 5-FU의 생성량이 형질전환 비피더스균이 생산하는 CD량이 아니라 균체 내에 도입되는 5-FC량과 상관이 있어 생산된 CD의 효소 기능이 충분히 발휘되지 않는다고 하는 문제점도 동시에 찾아냈다.

그리고 CD와 같은 프로드러그를 항종양물질로 변환하는 효소가 아니라 항종양성 단백질이나 핵산 등을 생산하는 균의 경우에는 생산된 항종양물질을 균체 외로 방출시키기 위해 혐기적질환 조직에서 증식한 후 균을 살파괴해야 했다.

이러한 문제점들을 해결하기 위해 혐기성균, 바람직하게는 비병원성 편성혐기성균에서 기능하고 생산된 활성 물질을 분비시키기 위한 분비 시그널을 가지는 플라스미드의 개발에 착수하여 그 플라스미드 제작에 유용하고 적어도 혐기성균에서 기능하며 우수한 발현단백질의 분비 작용을 나타내는 분비 시그널 펩티드를 개발하였다.

그리고 형질전환 유전자 수송 담체를 이용하는 고형종양 등의 치료방법에 있어서는 상기한 바와 같이 이용하는 유전자 수송 담체의 형질전환 유전자가 그 유전자 수송 담체 이외의 병원성균 또는 호기성 혹은 통성혐기성균에 수평전이되지 않는 점, 그리고 비록 수평전이되었다고 해도 그 균에서 복제되지 않는 점도 매우 중요하다.

따라서 상기 분비 시그널을 가지는 플라스미드에 대해서는 형질전환균 이외의 균에서 기능하는 복제개시점을 가지지 않는 비셔틀 플라스미드인 것이 바람직하다.

본 발명의 플라스미드는 형질전환 혐기성균 제작용의 플라스미드로서, 적어도 혐기성균에서 기능하는 분비 시그널을 포함하는 발현카세트를 가지는 플라스미드이다. 그리고 형질전환균 이외의 균에서 기능하는 복제개시점을 가지지 않고 형질전환균 이외의 균과 상호복제되지 않는 비셔틀 플라스미드이다.

보다 구체적으로는, 적어도 비피더스균에서 기능하고 우수한 분비작용을 나타내는 분비 시그널을 가지는 발현카세트를 가지고 있으며 형질전환균 이외의 균에서 기능하는 복제개시점을 가지지 않고 형질전환균 이외의 균과 상호복제되지 않는 형질전환 혐기성균 제작용 플라스미드이다.

본 발명의 형질전환용 플라스미드는 이것을 이용함으로써 임의의 목적단백질 또는 핵산을 발현하고, 또한 발현카세트에 포함되는 분비 시그널 펩티드의 작용에 의해 우수하고 실용성이 높은 분비 기능을 발휘할 수 있는 형질전환 혐기성균을 제작할 수 있다는 점에 특징을 가지는 것이다.

그리고 본 발명의 형질전환용 플라스미드는 형질전환균 이외의 균에서 기능하는 복제개시점을 가지지 않고 형질전환균 이외의 균과 상호복제되지 않는 비셔틀 플라스미드 벡터인 점에 특징을 가지는 것이다.

지금까지 혐기성균, 특히 비피더스균에서 기능하는 시그널 펩티드로는 예를 들어 비피도박테리움 아돌레센티스의 아밀라아제나 비피도박테리움 브레베의 Sec1, Sec2, Sec3 등이 보고되어 있고, 그 분비 시그널을 도입한 플라스미드도 보고되어 있다. 그러나 이 플라스미드들로 형질전환한 비피더스균은 목적단백의 분비량이 적은 것으로 추측되었다.

게다가 그 비피도박테리움 아돌레센티스의 아밀라아제의 분비 시그널 및 프로모터 영역을 클로닝하여 이것들과 UV 최적화 녹색형광단백질 변이체(GFPuv; CLONTECH Laboratories, Inc.)를 코딩하는 유전자를 조합한 플라스미드를 제작하고 그 플라스미드를 이용하여 형질전환한 비피도박테리움 롱검균에 대해 발현단백질(GFP)의 분비 기능을 확인했더니 GFP의 분비 기능을 나타내지 않아, 이 분비 시그널 펩티드는 임의의 목적단백질을 분비할 수 있는 것은 아닌 것으로 추정되었다.

그리고 지금까지 보고되어 있는 발현단백질을 균체 외로 분비하는 형질전환 혐기성균 제작용 플라스미드 벡터는 대장균 유래의 플라스미드와 형질전환균 유래의 플라스미드를 융합한, 대장균과 형질전환균 쌍방에서 기능하는 셔틀 벡터이며, 대장균 이외의 형질전환균에서만 기능하는 형질전환용 플라스미드는 보고되지 않았다.

본 발명의 형질전환용 플라스미드가 가지는 혐기성균에서 기능하는 분비 시그널 펩티드는 적어도 혐기성균에서 기능하는 분비 시그널 펩티드라면 어떠한 것도 이용할 수 있지만, 바람직한 것은 비피더스균에서 기능하는 것이다. 형질전환균에 대한 독성이나 기능성의 관점에서 비피더스균 유래의 분비 시그널 펩티드가 보다 바람직하고, 비피도박테리움 롱검균 유래의 분비 시그널 펩티드가 더 바람직하다. 비피도박테리움 롱검균 유래의 분비 시그널 펩티드로는 예를 들어 서열번호 6∼28 중 어느 한 염기서열 또는 그 하나 혹은 복수의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 서열로 표시되는 DNA에 의해 코딩되는 분비 시그널 펩티드 등을 예시할 수 있다. 이들 중에서 분비기능이 높다는 점에서 서열번호 6, 7, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 21, 25 또는 28 중 어느 하나의 염기서열 또는 그 하나 혹은 복수의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 서열로 표시되는 DNA로 코딩되는 분비 시그널 펩티드가 바람직하고, 서열번호 8 또는 25 중 어느 하나의 염기서열 또는 그 하나 혹은 복수의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 서열로 표시되는 DNA로 코딩되는 분비 시그널 펩티드가 가장 바람직하다.

또 본 발명의 형질전환용 플라스미드가 가지는 발현카세트 내의 프로모터로는 혐기성균에서 기능하고 분비 시그널 펩티드의 프로모터로서 기능하는 것이라면 어떠한 것이어도 되고, 예를 들어 비피더스균 유래의 분비 시그널 펩티드의 상류에 인접하고 있는 프로모터(promoter X) 또는 비피더스균에서 기능하는 히스톤유사 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터(HU promoter) 등을 들 수 있다. 구체적으로는 서열번호 29∼44 중 어느 하나로 표시되는 염기서열의 프로모터 영역의 DNA 및 서열번호 45로 표시되는 염기서열 또는 그 하나 혹은 복수의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 서열의 DNA로 코딩되는 프로모터를 들 수 있다. 이들 중에서 서열번호 35로 표시되는 염기서열의 프로모터 영역의 DNA 혹은 그 1 염기변이다형으로 코딩되는 프로모터 또는 HU 프로모터가 바람직하고, HU 프로모터가 보다 바람직하며, 서열번호 45의 염기서열 또는 그 하나 혹은 복수의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 서열로 표시되는 DNA로 코딩되는 프로모터가 가장 바람직하다.

그리고 본 발명의 형질전환용 플라스미드가 가지는 터미네이터로는 비피더스균에서 기능하고 분비 시그널 펩티드의 터미네이터로서 기능하는 것이면 어떠한 것이어도 되지만, 비피더스균에서 기능하는 히스톤유사 DNA 결합 단백질을 코딩하는 유전자의 터미네이터(HU terminator)가 바람직하고, 특히 서열번호 46의 염기서열 또는 그 하나 혹은 복수의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 서열로 표시되는 DNA가 가장 바람직하다.

본 발명에서 말하는 "1염기 변이체"라는 것은 적어도 1개소의 염기가 변이한 1염기변이다형(이하 SNP라 함)을 의미하고, 1개소만에서의 SNP 뿐만 아니라 복수 개소에서의 SNP를 포함한다. 따라서 "하나 혹은 복수의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 서열"이라고 하는 것도 가능하다.

본 발명의 형질전환용 플라스미드가 가지는 분비시킬 목적의 단백질 또는 핵산을 코딩하는 유전자(즉 표적유전자)로는 예를 들어 형광단백질을 코딩하는 유전자, 항종양 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자, 허혈성질환 치료 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자, 항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환하는 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자 등의 유전자라면 어떠한 것도 이용할 수 있다.

형광단백질로는 각종 녹색형광단백질(GFP), 적색형광단백질(RFP) 등을 들 수 있다.

항종양 활성을 가지는 단백질로는 예를 들어 사이토카인을 들 수 있으며, 구체적인 사이토카인으로는 예를 들어 인터페론(IFN)-α, β, γ, 과립구 마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터류킨(IL)-1α, 1β, 2, 3, 4, 6, 7, 10, 12, 13, 15, 18, 종양괴사인자(TNF)-α, 림프독소(LT)-β, TNF 관련 아포토시스 유발 리간드(TRAIL), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 마크로파지 콜로니 자극인자(M-CSF), 마크로파지 유주 저지인자(MIF), 백혈병 저지인자(LIF), T세포 활성화 공자극인자 B7(CD80) 및 B7-2(CD86), 키트 리간드, 온코스타틴 M 등을 들 수 있다.

또 엔도스타틴, 안지오스타틴, 크링글-1, 2, 3, 4, 5 등의 혈관신생 억제 물질도 들 수 있다.

항종양물질 전구체를 항종양물질로 변환하는 활성을 가지는 단백질로는 5-플루오로시토신(이하 5-FC라 함)을 항종양 활성 물질인 5-플루오로우라실(이하 5-FU라 함)로 변환하는 효소인 시토신 데아미나아제(이하 CD라 함)나, 5-아지리디노-2,4-디니트로벤즈아미드(이하 CB1945라 함)를 항종양 활성 알킬화제로 변환하는 효소인 니트로리덕타아제나, 갠시클로비르ganciclovir를 항종양 활성 대사물로 변환하는 효소인 단순포진바이러스 1형 티미딘키나아제(이하 HSV1-TK라 함)나, 글루클로로산포합 항종양 활성 물질을 항종양 활성 물질로 변환하는 효소인 β-글루클로니다아제 등을 들 수 있다.

그리고 허혈성질환 치료 활성을 가지는 단백질로는 허혈성질환 치료에 유용한 혈관신생 촉진 활성을 가지는 단백질을 들 수 있고, 구체적으로는 섬유아세포 증식인자 2(FGF2), 내피세포 증식인자(ECGF), 혈관내피 증식인자(VEGF), 간실질세포 증식인자(HGF) 등을 들 수 있다.

이 단백질들의 서열은 여러 가지 생물에서 알려져 있으며, 그 서열정보에 기초하여 PCR법이나 인공유전자 합성 등의 공지의 수법을 이용함으로써 목적단백질을 코딩하는 DNA를 입수할 수 있다.

또한 혐기적 환경하에 있는 질환의 치료 활성을 가지는 핵산으로는 혐기적질환 인자에 관여하는 siRNAs를 들 수 있고, 보다 구체적으로는 섬유아세포 증식인자 2(FGF2), 내피세포 증식인자(ECGF), 혈관내피 증식인자(VEGF) 및 간실질세포 증식인자(HGF) 등의 종양세포 증식인자에 관여하는 siRNAs를 들 수 있다.

마찬가지로 이 핵산들의 서열도 알려져 있으며, 그 서열정보에 기초하여 PCR법 등의 공지의 수법을 이용함으로써 입수할 수 있다.

본 발명의 플라스미드는 예를 들어 이하와 같이 하여 제작할 수 있다.

예를 들어 통상의 수법에 따라 형질전환균과 형질전환균 이외의 균, 예를 들어 대장균에서 각각 기능하는 복제개시점을 가지는 셔틀 플라스미드에 적어도 비피더스균에서 기능하는 분비 시그널 및 그 프로모터 유전자와, 그 하류에 원하는 혐기적질환의 진단 또는 치료에 유용한 단백질을 코딩하는 적어도 1종의 유전자 또는 핵산(표적유전자)과, 다시 그 하류에 혐기성균에서 기능하는 터미네이터 유전자를 삽입하는 것에 의해 셔틀 플라스미드를 제작할 수 있다.

그리고 원하는 바에 따라 이 셔틀 플라스미드로부터 형질전환균 이외의 균의 복제개시점을 제거하는 것에 의해 비셔틀 플라스미드를 제작할 수 있다.

각 공정에서의 조작은 문헌기재 등의 공지의 방법에 준하여 실시할 수 있다.

본 발명의 혐기적질환 치료용 유전자 수송 담체는 형질전환할 임의의 혐기성균을 상기 본 발명의 형질전환용 플라스미드를 이용하여 유전자공학 분야의 공지의 방법에 따라 형질전환하는 것에 의해 제작할 수 있다.

본 발명의 형질전환용 플라스미드로 형질전환된 혐기성균은 고형종양 등의 혐기적질환의 치료제로 이용하는 것이므로 편성혐기성이면서 비병원성인 것이 필수이며, 클로스트리듐이나 살모넬라 등의 병원성균이더라도 비병원성화된 것이면 되고, 또 락토바실러스 등의 통성혐기성균이더라도 편성혐기성으로 변이화된 것이면 된다.

바람직하게는 비병원성 혐기성 박테리아를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 비병원성 장내 세균을 들 수 있으며, 그 중에서도 비피도박테리움속 세균이 가장 바람직하다.

비피도박테리움속세균으로는 예를 들어 비피도박테리움 아돌레센티스, 비피도박테리움 앙굴라툼, 비피도박테리움 아니말리스, 비피도박테리움 아스테로이데스, 비피도박테리움 비피둠, 비피도박테리움 보움, 비피도박테리움 브레베, 비피도박테리움 카테눌라툼, 비피도박테리움 코에리눔, 비피도박테리움 코리네포르메, 비피도박테리움 쿠니쿨리, 비피도박테리움 덴티콜렌스, 비피도박테리움 덴티움, 비피도박테리움 갈리쿰, 비피도박테리움 갈리나룸, 비피도박테리움 글로보숨, 비피도박테리움 인디쿰, 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 이노피나툼, 비피도박테리움 락티스, 비피도박테리움 락텐티스, 비피도박테리움 리베로룸, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 마그눔, 비피도박테리움 메리시쿰, 비피도박테리움 미니뭄, 비피도박테리움 몽골리엔스, 비피도박테리움 파르블로룸, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼, 비피도박테리움 슈도롱검, 비피도박테리움 사이클라에로피룸, 비피도박테리움 프로룸, 비피도박테리움 루미날레, 비피도박테리움 루미난티움, 비피도박테리움 사에쿨라레, 비피도박테리움 스카르도비, 비피도박테리움 서브타일, 비피도박테리움 수이스, 비피도박테리움 테르마시도필룸 및 비피도박테리움 테르모필룸 등을 들 수 있고, 비피도박테리움 롱검이 가장 바람직하다.

이 균들은 모두 시판중이거나 또는 기탁기관으로부터 용이하게 입수할 수 있다. 예를 들어 비피도박테리움 롱검 ATCC-15707, 비피도박테리움 비피둠 ATCC-11863, 비피도박테리움 인판티스 ATCC-15697 등은 ATCC(The American Type Culture Collection)로부터 용이하게 입수할 수 있다.

또 각 균의 주에 대해서도 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 비피도박테리움 롱검의 주에 대해서는 비피도박테리움 롱검 105-A주, 비피도박테리움 롱검 aE-194b주, 비피도박테리움 롱검 bs-601주, 비피도박테리움 롱검 M101-2주를 들 수 있고, 그 중에서도 비피도박테리움 롱검 105-A주가 바람직하다.

비피도박테리움 브레베의 주에 대해서는 예를 들어 비피도박테리움 브레베 표준주(JCM1192), 비피도박테리움 브레베 aS-1주, 비피도박테리움 브레베 I-53-8W주를 들 수 있고, 그 중에서도 비피도박테리움 브레베 표준주, 비피도박테리움 브레베 aS-1주가 바람직하다.

비피도박테리움 인판티스의 주에 대해서는 예를 들어 비피도박테리움 인판티스 표준주(JCM1222), 비피도박테리움 인판티스 I-10-5주를 들 수 있고, 그 중에서도 비피도박테리움 인판티스 표준주, 비피도박테리움 인판티스 I-10-5주가 바람직하다.

또 비피도박테리움 락텐티스의 주에 대해서는 예를 들어 비피도박테리움 락텐티스 표준주(JCM1210)를 들 수 있다.

본 발명의 유전자 수송 담체는 본 발명의 형질전환용 플라스미드로 형질전환된 상기한 혐기성균으로 이루어지는 유전자 수송 담체이며, 혐기적 환경하에 있는 조직 내에서 생육할 수 있고 목적으로 하는 활성을 가지는 단백질을 발현할 수 있으며 형질전환균 이외, 특히 병원성 또는 호기성균 혹은 통성혐기성균에 대한 수평전이의 우려가 없는 것이다.

본 발명의 유전자 수송 담체의 제작은 시판중인 실험서, 예를 들어 유전자 매뉴얼(고단샤), 다카기 야스유키 엮음 유전자조작실험법(고단샤), 몰레큘러 클로닝(Molecular Cloning) 콜드 스프링 하버 연구실(Cold Spring Harbor Laboratory)(1982), 몰레큘러 클로닝 제2판(Molecular C1oning, 2nd ed.) 콜드 스프링 하버 연구실(Cold Spring Harbor Laboratory)(1989), 메소드 인 엔자이몰로지(Methods in Enzymol.), 194(1991), 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은 본 발명의 유전자 수송 담체를 함유하고 있는 한 특별히 제한되지는 않는다. 또 본 발명의 혐기적질환 치료제는 본 발명의 유전자 수송 담체를 함유하고 있는 한 특별히 제한되지는 않는다.

또 본 발명의 의약 조성물이나 혐기적질환 치료제는 본 발명의 유전자 수송 담체의 2종 이상을 함유하고 있어도 된다.

그리고 본 발명의 의약 조성물이나 혐기적질환 치료제는 본 발명의 유전자 수송 담체 이외의 혐기적질환 치료 효과를 나타내는 화합물을 함유하는 의약 조성물이나 혐기성질환 치료제와 조합하여 이용할 수 있다.

또 본 발명의 의약 조성물이나 혐기적질환 치료제는 본 발명의 효과를 방해하지 않는 한 본 발명의 유전자 수송 담체 외에 임의의 성분을 함유하고 있어도 된다. 그러한 임의 성분으로는 예를 들어 약리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등을 들 수 있다.

본 발명의 의약 조성물이나 혐기적질환 치료제의 제형은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 본 발명의 유전자 수송 담체를 함유하는 액제 혹은 고형 제제를 들 수 있다. 액제는 본 발명의 유전자 수송 담체의 혐기성균의 배양액을 정제하고 여기에 필요에 따라 적당한 생리식염수 혹은 보액 또는 의약 첨가물을 더하여 앰플 또는 바이알병 등에 충전하여 제조할 수 있다. 또 고형 제제는 액제에 적당한 보호제를 첨가하여 앰플 또는 바이알병 등에 충전한 후 동결건조 또는 L 건조시키거나 액제에 적당한 보호제를 첨가하여 동결건조 또는 L 건조시킨 후 이것을 앰플 또는 바이알병 등에 충전하여 제조할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물이나 혐기적질환 치료제의 투여 방법으로는 경구투여, 비경구투여 모두 가능하지만 비경구투여가 바람직하고, 예를 들어 정맥주사, 피하주사, 국소주입, 뇌실내투여 등을 할 수 있으며 정맥주사가 가장 바람직하다.

본 발명의 의약 조성물이나 혐기적질환 치료제의 유전자 수송 담체의 투여량은 질환 부위에서 생육할 수 있으며 유효 치료량의 활성 단백질을 발현하는데 충분한 양인 한 특별히 제한은 되지 않지만, 경제상의 관점 및 부작용을 가능한 한 피하는 관점에서 필요한 치료 효과를 얻을 수 있는 범위에서 가능한 한 적은 것이 바람직하다.

본 발명의 의약 조성물이나 혐기적질환 치료제에서 유전자 수송 담체의 투여량은 질환의 정도, 환자의 체중, 연령, 성별에 따라 적절히 선택하고 개선 정도에 따라 적절히 증감시킬 수 있다.

예를 들어 본 발명의 혐기적질환 치료제를 고형종양 치료제로 이용할 때에는 이용하는 혐기성균의 균 자체가 나타내는 항종양 활성, 이용하는 혐기성균이 생산하는 항종양 활성을 가지는 단백질 등의 종류, 항종양물질 전구체로부터 변환되는 항종양물질의 유효 치료량 및 이용하는 혐기성균의 그 활성 단백질의 생산량 등에 따라 적절히 설정한다.

구체적으로는 예를 들어 정맥내 투여의 경우에는 특히 균괴에 의한 색전 등의 리스크를 저감시킬 것이 요구되기 때문에 가능한 한 저농도의 주사용 제제를 복수 회로 나누어 분주하거나 또는 적당한 보액으로 희석하여 지속주입하는 것이 바람직하다. 예를 들어 성인의 경우 본 발명의 혐기성균의 균체를 체중 1kg 당 10⁶∼10¹²cfu를 1일 1회∼복수 회로 나누어 1일∼복수 일간, 연속 또는 적절히 간격을 두고 투여한다. 보다 구체적으로는 본 발명의 비피더스균의 균체를 10⁴∼10¹⁰cfu/mL 함유하는 제제를 성인 1인당 1∼1000mL를 직접 또는 적절한 보액으로 희석하여 1일 1∼수 회로 나누어 1∼수 일 연속 투여한다.

또 질환조직에 직접 투여하는 국소투여의 경우는 가능한 한 질환조직 전체에 균이 생착, 증식할 것이 요구되기 때문에 고농도의 주사제를 질환조직의 복수 개소에 투여하는 것이 바람직하다. 예를 들어 성인의 경우 본 발명의 비피더스균의 균체를 체중 1kg 당 10⁶∼10¹²cfu를 1일 1 회∼복수 회, 필요에 따라 1일∼복수 일간, 연속 또는 적절히 간격을 두고 투여한다. 보다 구체적으로는 본 발명의 비피더스균의 균체를 10⁴∼10¹⁰cfu/mL 함유하는 제제를 성인 1인당 1∼1000mL를 직접 1일 수 회, 필요에 따라 1일∼수 일 연속 투여한다.

치료기간 중에 질환조직 중의 균이 소실되어 있는 것이 확인된 경우에는 일단 치료를 중단하고 상기와 동일하게 균을 투여한다.

본 발명에서 "X와 Y를 조합하여 이루어진다"에는 X와 Y를 다른 형태로 한 것, X와 Y를 동일한 형태(예를 들어 X와 Y를 함유하는 형태)로 한 것 어떤 경우도 포함한다. 또 X와 Y를 다른 형태로 한 것의 경우 X, Y 모두 다른 성분을 더 함유하고 있는 경우도 포함된다.

본 발명의 의약 조성물이나 혐기적질환 치료제는 혐기적 환경하에 있는 질환, 바람직하게는 각종 고형암에 적용할 수 있다. 고형암으로는 예를 들어 대장암, 뇌종양, 두경부암, 유방암, 폐암, 식도암, 위암, 간암, 담낭암, 담관암, 췌장암, 섬세포암, 융모암, 결장암, 신장세포암, 부신피질암, 방광암, 정소암, 전립선암, 고환종양, 난소암, 자궁암, 융모암, 갑상선암, 악성 칼시노이드 종양, 피부암, 악성흑색종, 골육종, 연부조직육종, 신경아세포종, 바이러스 종양, 망막아세포종, 멜라노머, 편평상피암 등을 들 수 있다.

또 혐기적 환경하에 있는 다른 질환으로는 허혈성질환, 예를 들어 심근경색 또는 폐색성 동맥경화증이나 버거병 등의 하지허혈질환 등을 들 수 있다.

또한 본 발명은 특히 상기한 플라스미드, 유전자 수송 담체 또는 의약 조성물에 이용하는데 유용한 신규 분비 시그널 펩티드도 포함한다. 본 발명자들은 먼저 비피더스균에서 기능하고 우수한 발현단백질의 분비 작용을 나타내는 분비 시그널 펩티드를 찾아내기 위해 상기 형질전환 비피더스균의 친주인 비피도박테리움 롱검 105A을 게놈 해석하여 분비 시그널을 가지면서 막관통 영역을 가지지 않는 분비단백질로 추측되는 단백질을 25종 골라냈다. 25종의 단백질 중에서 분비 시그널이 프로모터와 인접하고 있는 것이 16종, 분비 시그널이 프로모터와 인접하지 않은 것이 9종이었다.

25종의 단백질의 코딩 영역의 염기서열을 정밀조사하여 25종의 분비단백질 중 불완전한 단백질 코딩 서열(CDS)로 추측되는 3개(No. 17, 18, 20)를 제외한 22개(No. 1∼16, 19, 21∼25)에 대해 분비 시그널 및 프로모터로 추정되는 영역의 클로닝을 이하와 같이 행하였다.

분비 시그널이 프로모터와 인접하고 있는 16종의 단백질에 대해서는 그 프로모터(promoter X) 및 분비 시그널(이하 SPxA)로 추정되는 영역을 클로닝하고, 이들과 UV 최적화 녹색형광단백질 변이체(GFPuv; CLONTECH Laboratories, Inc.)를 코딩하는 유전자 및 상기 특허문헌 7∼9에 기재된 플라스미드 제작에 이용한 비피더스균의 히스톤유사 펩티드(HU)의 터미네이터(HU terminator)를 조합한 플라스미드를 제작하고 그 플라스미드(pSPxA)를 이용하여 형질전환한 비피더스균에 대해 발현단백질(GFP)의 분비 기능을 확인했다.

또, 분비 시그널이 프로모터와 인접하지 않은 나머지 9종의 단백질을 포함한 22종의 단백질 전부에 대해 프로모터 영역을 포함하지 않는 분비 시그널(이하 SPxB) 영역을 클로닝하고, 상기 비피더스균의 히스톤유사 펩티드(HU)의 프로모터(HU promoter), 녹색형광단백질(GFP)을 코딩하는 유전자 및 상기 비피더스균의 히스톤유사 펩티드(HU)의 터미네이터(HU terminator)를 조합한 플라스미드를 제작하고 상기와 같이 그 플라스미드(pSPxB)를 이용하여 형질전환한 비피더스균에 대해 발현단백질(GFP)의 분비 기능을 확인했다.

그 결과, 12종의 플라스미드(pSP7A-GFP, pSP12A-GFP, pSP1B-GFP, pSP2B-GFP, pSP3B-GFP, pSP4B-GFP, pSP7B-GFP, pSP9B-GFP, pSP10B-GFP, pSP12B-GFP, pSP16B-GFP, pSP23B-GFP)에서 분비경향이 확인되었고 4종의 플라스미드(pSP7A-GFP, pSP3B-GFP, pSP7B-GFP, pSP23B-GFP)에서 우수한 발현단백질의 분비 기능을 나타내는 것을 확인했다.

또 그 밖에 그 비피도박테리움 롱검 105A의 게놈 해석에 있어서 비피도박테리움 브레베에서 분비가 보고되어 있는 Sec2의 유전자(Laura E. MacConaill et al., Applied and Environmental Microbiology, 2003 Vol. 69: pp6994-7001)와 아미노산 레벨로 상동성이 높은 염기서열을 나타내는 단백질을 검색하여 그 분비 시그널 펩티드에 대해서도 검토했다. 즉 그 분비 시그널 펩티드를 코딩하는 유전자와 상기 비피더스균의 히스톤유사 펩티드(HU)의 프로모터(HU promoter) 유전자를 조합하여 클로닝하고, 이들과 녹색형광단백질(GFP)을 코딩하는 유전자 및 상기 비피더스균의 히스톤양 펩티드(HU)의 터미네이터(HU terminator)를 조합한 플라스미드를 제작하고 상기와 같이 그 플라스미드(pSec2-GFP)를 이용하여 형질전환한 비피더스균에 대해 발현단백질(GFP)의 분비 기능을 확인했더니 우수한 발현단백질의 분비 기능을 나타내는 것을 확인했다.

다음으로 상기에서 분비경향이 인정된 13종의 플라스미드에 대해 GFP를 코딩하는 유전자 대신 다른 목적단백질의 인간 TNF-α를 코딩하는 유전자를 삽입한 플라스미드를 제작하고, 그 플라스미드들을 이용하여 비피더스균을 형질전환하여 그 발현단백질 분비 기능을 확인했다.

그 결과 9종의 플라스미드(pSP7A-TNFα, pSP1B-TNFα, pSP3B-TNFα, pSP4B-TNFα, pSP7B-TNFα, pSP12B-TNFα, pSP16B-TNFα, pSP23B-TNFα, pSec2B-TNFα)에서 분비 기능을 나타내고 2종의 플라스미드(pSP3B-TNFα, pSP23B-TNFα)에서 특별히 우수한 발현단백질의 분비 기능을 나타내는 것을 확인했다.

그리고 이 플라스미드들로부터 비피더스균 이외의 균에서 기능하는 복제개시점, 예를 들어 pUC Ori를 제거한 플라스미드를 제작했다. 그리고 그 플라스미드를 이용하여 형질전환한 비피더스균에 대해 발현단백질의 분비 기능을 확인했더니 비피더스균 이외의 균에서 기능하는 복제개시점인 pUC Ori를 제거한 플라스미드도 마찬가지로 우수한 발현단백질의 분비 기능을 발휘시킬 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

이렇게 하여 적어도 비피더스균에서 기능하면서 우수한 발현단백질의 분비 작용을 나타내는 신규 분비 시그널 펩티드를 찾아냈다.

상기한 바와 같이 본 발명의 분비 시그널 펩티드는 우수한 분비활성을 가지며 비병원성의 편성혐기성균인 비피더스균에서 기능하기 때문에 상기한 플라스미드, 유전자 수송 담체 또는 의약 조성물에 이용할 때 특히 적합하다. 따라서 분비 시그널 펩티드로서 본 발명의 신규 분비 시그널 펩티드를 포함한 모든 양태의 상기 플라스미드, 유전자 수송 담체 또는 의약 조성물도 또한 본 발명에 포함된다.

실시예

이하 제조예 및 실시예를 이용하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는데, 본 발명의 기술적 범위는 이러한 예시에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1: 분비 시그널의 in Silico 스크리닝

Bifidobacterium longum 105A의 전체 게놈 서열에서 추정한 전체 번역 영역의 아미노산 서열 1941개에 대해 PrediSi를 이용한 시그널 펩티드 예측을 하여 188개의 시그널 펩티드를 추정했다. 예측시에는 Gram Positive Bacteria의 파라미터 세트를 이용했다.

추측한 188개의 시그널 펩티드 가운데 막관통 영역을 가지지 않는 25개를 분비단백질 후보로 선정했다. 이 추정 분비단백질 코딩 영역을 표 1에 나타냈다.

[표 1]

제조예 1: 분비형 GFP 발현 플라스미드( pSPxA - GFP )의 구축

시그널 펩티드 후보의 프로모터로 분비형 GFP를 발현시키는 플라스미드를 구축했다. 개요를 도 1에 나타낸다. 자세한 것은 이하와 같다.

인서트 조제

상기 25개의 분비단백질 후보 가운데 그 유전자가 오페론의 선두에 위치하는 16 종류(표 1 No. 1∼16)에 관해 이하와 같이 프로모터 영역을 포함하는 추정 시그널 펩티드 부분 및 그 하류 부분의 60∼90염기를 PCR법으로 증폭했다.

번역개시점의 300bp 상류에 forward primer를 설계하고 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA의 60∼90bp 하류에 reverse primer를 설계했다. Bifidobacterium longum 105A의 게놈 DNA 30ng을 주형으로 하고 2×Phusion Flash PCR Master mix (FINNZYMES)를 이용하여 PCR을 했다.

PCR의 프로그램은 98℃에서 10초 후, 98℃에서 1초, 55℃에서 5초, 72℃에서 9초를 30 사이클, 72℃에서 1분으로 했다. 각 시그널 펩티드의 PCR 프라이머를 표 2.1에 나타냈다. 각 프라이머의 5'측의 15염기는 이하에 나타내는 벡터와 상동인 서열을 가진다.

[표 2]

PCR 산물의 일부를 2% 아갈로스겔(1×TBE buffer, 에티디움브로마이드 포함)을 이용하여 해석하고 추정되는 사이즈의 싱글 밴드인 것을 확인했다.

싱글 밴드가 아닌 경우에는 어닐링 온도를 55℃에서 60℃로 변경하여 다시 PCR를 했다.

PCR 산물을 PCR 산물 정제키트(QIAquick PCR purification kit, QIAGEN)를 이용하여 정제하고 정제 PCR 산물량을 흡광광도계로 정량했다.

이 자신의 프로모터 영역을 포함한 시그널 펩티드 단편을 시그널 펩티드xA(SPxA)(x=1∼16)로 했다.

벡터 조제

SPxA 클로닝용 벡터를 이하와 같이 조제했다. 조제의 개요를 도 1에 나타낸다. 플라스미드 pAmyB-GFPuv 벡터(도 1, 상단의 오른쪽 도; 서열번호 1)를 BamHI 및 Eco147I(모두 Fermentas)로 완전 분해했다. 반응 조건은 효소의 사용설명서에 따랐다. 소화 후의 플라스미드를 0.8% 정제용 아갈로스겔(1×TBE buffer, 에티디움브로마이드 포함) 전기영동으로 분리하고 약 4.2kbp의 Large fragment를 잘라내고 겔로부터의 DNA 추출키트(QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN)로 아갈로스겔로부터 DNA를 추출 및 정제했다. 정제 DNA 단편(벡터)을 0.8% 아갈로스겔(1×TBE buffer, 에티디움브로마이드 포함)에 DNA 농도 마커와 함께 전기영동하여 그 농도를 추측했다.

pAmyB-GFPuv 벡터 중의 GFPuv 코딩 서열은 비피더스균용으로 코돈을 최적화(GenScript)한 것이다.

Recombination 반응

위에서 조제한 벡터와 인서트를 1:3∼10의 몰비로 혼합하고 재조합 반응에 의해 연결했다(CloneEZ Kit, GenScript). 반응 조건은 제품설명서에 따랐다.

대장균의 형질전환

상기 Recombination 반응액 2㎕를 이용하여 대장균 TOP10 chemically Competent Cell(라이프테크놀로지스재팬 주식회사)을 형질전환하고 LB(75㎍/mL 스펙티노마이신 함유) 플레이트에 도포한 후 37℃에서 하룻밤 배양했다. 형질전환 조건은 제품 설명서에 따랐다.

형질전환한 대장균 콜로니를 LB(75㎍/mL 스펙티노마이신 함유) 액체배지에서 37℃에서 하룻밤 배양하고 여기에서 플라스미드를 추출했다(QIAprep Spin Miniprep Kit, 키아겐 주식회사). 이 플라스미드의 인서트 서열을 결정하고 플라스미드명을 pSPxA-GFP(x=1∼16)로 했다.

비피더스균의 형질전환

상기 형질전환한 대장균에서 추출한 플라스미드 DNA를 3∼5㎕ 이용하여 비피더스균 Bifidobacterium longum 105A의 형질전환을 일렉트로포레이션 시스템(진 펄서 II, 바이오래드연구소 주식회사)에 의해 행했다. 전기쇼크 후에는 큐벳에 IMR 액체배지 800㎕와 비타민 C 첨가액 50㎕의 혼합액을 즉시 첨가하고 이것을 멸균된 2mL 마이크로 튜브로 회수했다. 각 튜브에 대해 동일한 조작을 하고 이들 2mL 튜브의 덮개를 풀어 데시케이터에 넣었다. 데시케이터 내의 공기를 진공 펌프로 탈기한 후, 탄산가스를 봉입했다. 이 조작을 3회 반복하여 데시케이터 내의 공기를 탄산가스로 치환한 후 데시케이터를 37℃로 설정한 인큐베이터에 넣고 3시간 보온했다.

보온 후의 각 균 현탁액을 잘 혼합한 후, 그 100㎕를 칭량하여 IMR 한천배지(75㎍/mL SPCM 함유) 2장에 각각 도포했다. 이 플레이트들을 탈산소·탄산가스 발생제(아네로팩^(R) 켄키, 미츠비시가스화학 주식회사)와 함께 밀폐용기에 넣고 37℃로 설정한 인큐베이터로 2일간 배양했다.

제조예 2: 분비형 GFP 발현 플라스미드( pSPxB - GFP )의 구축

비피더스균의 히스톤유사 프로모터(Hu 프로모터)로 분비형 GFP를 발현시키는 플라스미드를 구축했다. 개요를 도 2에 나타낸다. 자세한 것은 이하와 같다.

인서트 조제

상기 25개의 분비단백질 후보 가운데 불완전한 단백질 코딩 서열(CDS)로 추측되는 3개(No. 17, 18, 20)를 제외한 22개(No. 1∼16, 19, 21∼25)에 대해 추정 시그널 펩티드 코딩 부분 및 그 하류 60∼90염기를 포함한 DNA 단편을 PCR법으로 증폭했다.

번역개시점에 forward primer를 설계하고 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA의 60∼90bp 하류에 reverse primer를 설계했다. 각 시그널 펩티드의 PCR 프라이머를 표 2.2에 나타냈다. 각 프라이머의 5'측의 15염기는 이하에 나타내는 벡터와 상동인 서열을 가진다.

[표 3-1]

[표 3-2]

상기 제조예 1과 동일하게 PCR을 하고 조제한 PCR 산물을 SPx(x=1∼16, 19, 21∼25)로 했다.

벡터 조제

SPx 클로닝용 벡터를 이하와 같이 조제했다. 조제의 개요를 도 2에 나타낸다. 플라스미드 pScHuGFPuv 벡터(도 2, 상단의 오른쪽 도; 서열번호 2)를 HindIII(Fermentas)로 완전 분해했다. 반응 조건은 효소의 사용설명서에 따랐다. 소화 후의 플라스미드를 0.8% 정제용 아갈로스겔(1×TBE buffer, 에티디움브로마이드 포함) 전기영동으로 분리하고 약 4.6kbp의 직쇄 DNAd 단편을 잘라내고 겔로부터의 DNA 추출키트(QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN)로 아갈로스겔로부터 DNA를 추출 및 정제했다. 정제 DNA 단편(벡터)을 0.8% 아갈로스겔(1×TBE buffer, 에티디움브로마이드 포함)에 DNA 농도 마커와 함께 전기영동하여 그 농도를 추측했다.

pScHuGFPuv 벡터 중의 GFPuv 코딩 서열은 비피더스균용으로 코돈을 최적화(GenScript)한 것이다.

Recombination 반응

위에서 조제한 벡터와 인서트를 1:3∼10의 몰비로 혼합하고 재조합 반응에 의해 연결했다(CloneEZ Kit, GenScript). 반응 조건은 제품 설명서에 따랐다.

대장균의 형질전환

상기 Recombination 반응액 2㎕를 이용하여 대장균 TOP10 chemically Competent Cell(라이프테크놀로지스재팬 주식회사)을 형질전환하고 LB(75㎍/mL 스펙티노마이신 함유) 플레이트에 도포한 후 37℃에서 하룻밤 배양했다. 형질전환 조건은 제품 설명서에 따랐다.

형질전환한 대장균 콜로니를 LB(75㎍/mL 스펙티노마이신 함유) 액체배지에서 37℃에서 하룻밤 배양하고 여기에서 플라스미드를 추출했다(QIAprep Spin Miniprep Kit, 키아겐 주식회사). 이 플라스미드의 인서트 서열을 결정하고 플라스미드명을 pSPxB-GFP(x=1∼16, 19, 21∼25)로 했다.

비피더스균의 형질전환

상기 제조예 1과 동일한 방법으로 비피더스균을 형질전환했다.

제조예 3: 분비형 GFP 발현 플라스미드( pSec2 - GFP )의 구축

Bifidobacterium breve UCC2003 에서 분비 펩티드 Sec2가 보고되어 있다(Laura E. MacConaill et al., Applied and Environmental Microbiology, 2003 Vol. 69: pp 6994-7001). B. longum 105A의 게놈 서열에서 Sec2와 상동성이 높은 서열을 검색하고 이것의 분비 시그널을 GFP의 코딩 서열과 연결했다. 이것을 Hu 프로모터에서 발현시키는 플라스미드를 제조예 2의 플라스미드 pScHuGFPuv 벡터를 이용하여 구축했다. 개요를 도 3에 나타낸다. 자세한 것은 이하와 같다.

인서트 조제

B. longum 105A의 Sec2 유전자의 번역개시점에 Sec2-F1 프라이머, 시그널 펩티드 코딩 서열의 123bp 하류에 Sec2-R2프라이머를 설계했다. 프라이머 서열을 표 2.3에 나타낸다. 각 프라이머의 5'측의 15염기는 이하에 나타내는 벡터와 상동인 서열을 가진다.

[표 4]

표 2.3 시그널 펩티드 증식시의 프라이머 (Sec2)

상기 제조예 1과 동일하게 PCR를 하고 조제한 PCR 산물을 Sec2로 했다.

벡터 조제

플라스미드 pScHuGFPuv 벡터(도 3, 상단의 오른쪽 도; 서열번호 2)를 이용하여 상기 제조예 2와 동일하게 조제했다.

Recombination 반응

위에서 조제한 벡터와 인서트를 1:10의 몰비로 혼합하고 재조합 반응에 의해 연결했다(CloneEZ Kit, GenScript). 반응 조건은 제품 설명서에 따랐다.

대장균의 형질전환

상기 Recombination 반응액 2㎕를 이용하여 대장균 TOP10 chemically Competent Cell(라이프테크놀로지스재팬 주식회사)을 형질전환했다. 형질전환 조건은 제품 설명서에 따랐다.

형질전환한 대장균 콜로니를 LB(75㎍/mL 스펙티노마이신 함유) 액체배지에서 37℃에서 하룻밤 배양하고 여기에서 플라스미드를 추출했다(QIAprep Spin Miniprep Kit, 키아겐 주식회사). 이 플라스미드의 인서트 서열을 결정하고 플라스미드명을 pSec2-GFP(서열번호 3)로 했다.

비피더스균의 형질전환

상기 제조예 1과 동일한 방법으로 비피더스균을 형질전환했다.

실시예 1: 재조합 비피더스균의 GFP 단백질 발현

제조예 1∼3에서 얻은 재조합 비피더스균(Bifidobacterium longum 105A/pSPxA-GFP(x=1∼16), Bifidobacterium longum 105A/pSPxB-GFP(x=1∼16, 19, 21∼25) 및 Bifidobacterium longum 105A/pSec2-GFP)의 글리세린 스톡을 APS-2S-2.5SE(75㎍/mL 스펙티노마이신) 액체배지에 1% 식균하고 37℃에서 24시간 혐기배양했다(활성화 배양액).

다음으로 APS-2S-2.5SE(75㎍/mL 스펙티노마이신) 액체배지 20mL당 1M 인산나트륨 완충액(pH6.8) 4mL를 첨가한 배지에 활성화 배양액 0.5%를 식균했다. 이것을 37℃에서 18시간 혐기배양했다.

이 배양액을 이용하여 배양상청 및 세포내 단백질을 이하와 같이 조제했다.

배양액을 원심분리한 후 배양상청을 회수했다. 이 배양상청 내의 단백질을 트리클로로아세트산(TCA)에 의해 침전시키고 아세톤으로 세정한 후, 전기영동용 버퍼에 용해하여 배양상청 내의 단백질을 농축했다. 별도로 세포내 단백질을 이하와 같이 추출했다. 배양액 1mL를 4mL의 PBS와 혼합하고 12,000rpm, 5분, 4℃에서 원심분리 후 상청을 제거하고, 이 침전에 5mL의 PBS를 더하고 현탁, 원심분리하여 상청을 제거하는 조작을 2회 행했다. 세정 후의 균체에 PBS를 더하고 전량을 1mL로 한 후, 초음파 처리에 의해 균체를 파쇄했다. 이것을 원심분리한 후 상청을 회수하여 이것을 세포내 추출물로 했다.

동일한 조작을 야생주 Bifidobacterium longum 105A에 대해서도 하여 음성 컨트롤로 했다. GFP 단백질의 양성 컨트롤에는 recombinant GFPuv(크로테크)를 이용했다.

상기 배양상청 농축물(배양액 1mL 상당), 세포내 단백 추출물(배양액 7.5㎕ 상당)을 12.5% 트리스-글리신겔(아토 주식회사, e-파젤)로 전기영동했다. 이것을 PVDF막(Invitrogen, iBlot Transfer Stacks)에 iBlot Transfer Device(Invitrogen)를 이용하여 전사했다. 블로팅 종료후의 막을 블로킹한 후, 1차 항체에 토끼 GFP 항체(Clontech, A. v. peptide Antibody Living Colors), 2차 항체에 anti-Rabbit IgG HRP Conjugate(Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 반응시키고 ECL Advance Western Blotting Detection Kit(GE Healthcare)로 발광시켰다. 이것을 이미징 애널라이저(Fluor S Max, 바이오래드)로 해석했다.

그 결과, 13종의 균(B. longum 105A/pSP1B-GFP, B. longum 105A/pSP2B-GFP, B. longum 105A/pSP3B-GFP, B. longum 105A/pSP4B-GFP, B. longum 105A/pSP7B-GFP, B. longum 105A/pSP9B-GFP, B. longum 105A/pSP10B-GFP, B. longum 105A/pSP12B-GFP, B. longum 105A/pSP16B-GFP, B. longum 105A/pSP23B-GFP, B. longum 105A/pSP7A-GFP, B. longum 105A/pSP12A-GFP, B. longum 105A/pSec2-GFP)에서 분비 경향이 확인되었다. 동일한 시험을 2회 실시하고 특히 5종(B. longum 105A/pSP3B-GFP, B. longum 105A/pSP7B-GFP, B. longum 105A/pSP23B-GFP, B. longum 105A/pSP7A-GFP, B. longum 105A/pSec2-GFP)에 대해 현저한 분비 작용이 확인되었다(도 4).

제조예 4: 분비형 TNF alpha 발현 비피더스균의 제작( pSPxA - TNF alpha 및 pSPxB - TNF alpha )

플라스미드 벡터 pTNF1 의 구축

인간 TNFα(Accession No. X01394)의 코딩 서열을 비피더스균용으로 코돈 최적화하고 pUC57 벡터에 삽입한 플라스미드(GenScript사에 합성위탁)를 주형으로 하여 TNF-F1 프라이머 및 TNF-R1 프라이머(표 3)로 TNFα 코딩 영역을 타겟으로 한 PCR를 행했다(PrimeSTAR(R) HS Premix, 다카라바이오 주식회사). PCR 산물을 정제(QIAquick PCR purificaton Kit, 키아겐)로 정제한 후 0.8% 아갈로스겔로 전기영동을 하고 약 0.7kbp의 DNA 단편을 잘라내었다. 이 겔에서 DNA를 추출(QIAquick Gel Extraction Kit, 키아겐)하여 인서트로 했다.

[표 5]

별도로 이하와 같이 벡터를 조제했다. 플라스미드 pCDshuttle(특허문헌 9; WO2009/128272A1) 10㎍에 제한 효소 FastDigest Bsp119 I, FastDigest Pst I, FastDigest Nde I, FastDigest Acl I(Fermentas사)를 각 10㎕ 더하고 37℃에서 4.5시간 가온하여 플라스미드를 완전 분해했다. 이것을 0.8% 아갈로스겔로 전기영동하여 약 3.9kbp의 DNA 단편을 잘라내었다. 이 겔에서 DNA를 추출(QIAquick Gel Extraction Kit, 키아겐)하여 벡터로 했다.

상기 벡터 20ng 및 인서트 36ng을 CloneEZ Kit(GenScript사)를 이용하여 말단 서열의 재조합을 통해 연결했다. 자세한 것은 CloneEZ Kit의 제품 설명서에 따랐다. 이 DNA 2㎕를 이용하여 대장균 TOP10 chemically Competent Cell(라이프테크놀로지스재팬 주식회사)을 형질전환했다. 형질전환 조건은 제품 설명서에 따랐다.

형질전환한 대장균 콜로니를 LB(75㎍/mL 스펙티노마이신 함유) 액체배지에서 37℃에서 하룻밤 배양하고 여기에서 플라스미드를 추출했다(QIAprep Spin Miniprep Kit, 키아겐 주식회사). 이 플라스미드를 pTNF1(도 5, 상단의 오른쪽 도; 서열번호 4)로 했다.

플라스미드 pSPxA-GFP 및 pSPxB-GFP의 GFP 부분을 TNF alpha로 바꾼 플라스미드 pSPxA-TNF alpha 및 pSPxB-TNF alpha의 구축 개요를 도 5 및 도 6에 각각 나타낸다.

플라스미드 pTNF1를 주형으로 하여 TNFvec F1 프라이머 및 TNFvec R1 프라이머(표 4)로 PCR를 하고(PrimeSTAR(R) HS Premix, 다카라바이오 주식회사) 약 3.8kbp의 PCR 산물을 취득하여 이것을 벡터로 했다.

[표 6]

별도로 실시예 1에서 분비 경향을 나타낸 플라스미드 pSPxA-GFP(x=7, 12) 또는 pSPxB-GFP(x=1∼4, 7, 9, 10, 12, 16, 23)를 주형으로 하여 표 5의 프라이머로 인서트의 PCR 증폭을 행하고(PrimeSTAR(R) HS Premix, 다카라바이오 주식회사), 이것을 인서트로 했다.

[표 7]

상기 벡터 100ng과 인서트 40ng을 In-Fusion^TM Advantage PCR Cloning Kit (다카라바이오 주식회사)로 연결시켰다. 이 DNA 2㎕를 이용하여 대장균 TOP10 chemically Competent Cell(라이프테크놀로지스재팬 주식회사)을 형질전환했다. 형질전환 조건은 제품 설명서에 따랐다.

형질전환한 대장균 콜로니를 LB(75㎍/mL 스펙티노마이신 함유) 액체배지에서 37℃에서 하룻밤 배양하고 여기에서 플라스미드를 추출했다(QIAprep Spin Miniprep Kit, 키아겐 주식회사). 이 플라스미드의 전체 길이 서열을 결정하고 플라스미드명을 pSP7A-TNF alpha, pSP12A-TNF alpha, pSP1B-TNF alpha, pSP2B-TNF alpha, pSP3B-TNF alpha, pSP4B-TNF alpha, pSP7B-TNF alpha, pSP9B-TNF alpha, pSP10B-TNF alpha, pSP12B-TNF alpha, pSP16B-TNF alpha, pSP23B-TNF alpha로 했다.

비피더스균의 pSPxA - TNF alpha 및 pSPxB - TNF alpha 에 의한 형질전환

플라스미드 pSPxA-TNF alpha 및 pSPxB-TNF alpha를 이용하여 B. longum 105A의 형질전환을 제조예 1과 동일한 방법을 이용하여 행했다.

참고예 2: 플라스미드 pTNF3 의 구축

비피더스균 유래의 Hu 프로모터 하류에 성숙 인간 TNFα 코딩 서열을 배치한 셔틀 벡터(비피더스균-대장균)를 구축했다. 개요를 도 12에 나타낸다. 자세한 것은 이하와 같다.

인서트 조제

인간 TNFα(Accession No: X01394, 153번째에서 854번째의 미성숙 TNFα 코딩 서열)의 코돈을 비피더스균용으로 최적화한 인공 DNA, 그 상류 및 하류에 비피더스균 유래의 Hu 프로모터 및 Hu 터미네이터를 배치한 플라스미드: human TNFalpha_in_pUC57를 합성했다(GenScript에 커스텀 합성 의뢰).

플라스미드 human TNFalpha_in_pUC57 1ng을 주형으로 하여 TNFα의 코딩 영역의 성숙 TNFα 부분을 PrimeSTAR(R) HS Premix(다카라바이오 주식회사)로 PCR 증폭했다. 프라이머는 TNF F3 프라이머 및 TNF R1 프라이머를 이용하고 각 프라이머의 5'측의 15염기는 벡터의 말단과 상동인 서열을 배치했다(표 6). PCR의 프로그램은 98℃에서 10초, 60℃에서 5초, 72℃에서 30초를 30 사이클 행한 후, 72℃에서 30초로 했다.

PCR 산물의 일부를 DNA 농도 마커와 함께 2% 아갈로스겔(1×TBE buffer, 에티디움브로마이드 포함)로 전기영동하여 약 0.5kbp의 싱글 밴드인 것을 확인하고 그 농도를 추측했다.

벡터 조제

플라스미드 pCDshuttle 1ng을 주형으로 하여 벡터 골격을 PrimeSTAR(R) HS Premix(다카라바이오 주식회사)로 PCR 증폭했다. 프라이머는 pCDshuttle F1 프라이머 및 pCDshuttle R1 프라이머를 이용하고 각 프라이머의 5'측의 15염기는 인서트의 말단과 상동인 서열로 했다(표 6). PCR의 프로그램은 98℃에서 10초, 55℃에서 5초, 72℃에서 4분을 30 사이클 행한 후, 72℃에서 30초로 했다.

PCR 산물의 일부를 DNA 농도 마커와 함께 0.8% 아갈로스겔(1×TBE buffer, 에티디움브로마이드 포함)로 전기영동하여 약 3.9kbp의 싱글 밴드인 것을 확인하고 그 농도를 추측했다.

[표 8]

클로닝

상기 벡터 100ng 및 인서트 50ng을 In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit(다카라바이오 주식회사)를 이용하여 말단 서열의 재조합을 통해 연결했다. 이 때 Cloning Enhancer(다카라바이오 주식회사)도 반응액에 첨가하고 인서트 및 벡터 중에 포함되는 주형 플라스미드의 분해도 동시에 행했다. 자세한 것은 In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit의 제품 설명서에 따랐다.

상기 인퓨전 반응액 2㎕를 이용하여 대장균 TOP10 chemically Competent Cell(Invitrogen 사)을 형질전환했다. 형질전환 조건은 제품 설명서에 따랐다. 형질전환한 대장균 콜로니를 LB(75㎍/mL 스펙티노마이신 함유) 액체배지에서 37℃에서 하룻밤 배양하고 여기에서 플라스미드를 추출했다(QIAprep Spin Miniprep Kit, 키아겐 주식회사). 이 플라스미드의 전체 길이 서열을 결정하고 pTNF3로 했다(서열번호 51).

비피더스균의 형질전환

플라스미드 pTNF3를 이용하여 B. longum 105A 의 형질전환을 제조예 1과 동일한 방법을 이용하여 행했다.

제조예 5: 분비형 TNF α 발현 비피더스균의 제작( pSec2 - TNF alpha )

플라스미드 pSec2-GFP의 GFP 부분을 TNF alpha로 바꾼 플라스미드 pSec2-TNF alpha의 구축 개요를 도 7에 나타낸다.

벡터 조제

플라스미드 pCDshullte를 BamHI, BcuI 및 PstI(모두 Fermentas)로 완전 분해했다. 반응 조건은 효소의 사용설명서에 따랐다. 소화 후의 플라스미드를 1% 정제용 아갈로스겔(1×TBE buffer, 에티디움브로마이드 포함) 전기영동으로 분리하고 약 3.4kbp의 Large fragment를 잘라내고 DNA 추출키트(QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN)로 아갈로스겔로부터 DNA를 추출 및 정제했다. 정제 DNA 단편(벡터)을 0.8% 아갈로스겔(1×TBE buffer, 에티디움브로마이드 포함)에 DNA 농도 마커와 함께 전기영동하여 그 농도를 추측했다.

인서트 조제

플라스미드 pSec2-GFP를 주형으로 하여 Sec2_out1 primer 및 Sec2a_R1 primer(표 5)로 Hu 프로모터를 포함하는 Sec2 시그널 펩티드 코딩 서열을 PCR 증폭했다(PCR 산물 1). 별도로 플라스미드 pTNF1을 주형으로 하여 Sec2a_F1 primer 및 TNF_out1 primer(표 5)로 Hu 터미네이터를 포함하는 TNF alpha의 코딩 서열을 PCR 증폭했다(PCR 산물 2). PCR 산물 1 및 2를 PCR 산물 정제키트(QIAquick PCR purification kit, 키아겐 주식회사)로 정제한 후, 흡광도 측정에 의해 PCR 산물량을 추측했다. PCR 산물 1 및 PCR 산물 2를 등몰량 혼합했다. 이 PCR 산물 혼합 용액 1ng, 2×PCR Solution PrimeSTAR HS(다카라바이오 주식회사)에 0.1×TE 버퍼를 첨가하여 49㎕로 했다. 이 용액을 서멀 사이클러에 세팅하고 98℃에서 10초, 72℃에서 36초를 1 사이클로 하여 5 사이클 반응시키고 2개의 PCR 단편을 연결했다. 그리고 여기에 Sec2_out1 프라이머 및 TNF_out1 프라이머를 첨가하여 98℃에서 10초, 55℃에서 5초, 72℃에서 70초를 1 사이클로 하여 25 사이클 반응시킨 후, 72℃에서 30초 신장 반응시켜 연결 PCR 산물을 증폭했다.

이것을 1% 정제용 아갈로스겔(1×TBE buffer, 에티디움브로마이드 포함) 전기영동으로 분리하고 약 1.2kbp의 단편을 잘라내고 DNA 추출키트(QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN)로 아갈로스겔로부터 DNA를 추출 및 정제했다. 이 정제 DNA 단편을 BamHI 및 BcuI로 완전 분해했다. 반응 조건은 효소의 사용설명서에 따랐다. 소화 후의 플라스미드를 1% 정제용 아갈로스겔(1×TBE buffer, 에티디움브로마이드 포함) 전기영동으로 분리하고 약 1.2kbp의 DNA 단편을 잘라내고 DNA 추출키트(QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN)로 아갈로스겔로부터 DNA를 추출 및 정제했다. 정제 DNA 단편(인서트)을 0.8% 아갈로스겔(1×TBE buffer, 에티디움브로마이드 포함)에 DNA 농도 마커와 함께 전기영동하여 그 농도를 추측했다.

라이게이션

상기 벡터 및 인서트를 1:3(몰비)으로 혼합하여 라이게이션했다(Rapid DNA Ligation Kit, Fermentas). 자세한 것은 제품 설명서에 따랐다.

대장균의 형질전환

상기 라이게이션 반응액 2㎕를 이용하여 대장균 TOP10 chemically Competent Cell(라이프테크놀로지스재팬 주식회사)을 형질전환했다. 형질전환 조건은 제품 설명서에 따랐다.

형질전환한 대장균 콜로니를 LB(75㎍/mL 스펙티노마이신 함유) 액체배지에서 37℃에서 하룻밤 배양하고 여기에서 플라스미드를 추출했다(QIAprep Spin Miniprep Kit, 키아겐 주식회사). 이 플라스미드의 인서트 부분에 대해 전체 길이 서열을 결정하고 PCR 에러가 없는 것을 확인하고 플라스미드명을 pSec2-TNF alpha로 했다.

비피더스균의 pSec2 - TNF alpha 에 의한 형질전환

플라스미드 pSec2-TNF alpha를 이용하여 B. longum 105A의 형질전환을 제조예 1과 동일한 방법을 이용하여 행했다.

실시예 2: 재조합 비피더스균의 TNF alpha 단백질 발현

제조예 4 및 제조예 5에서 얻은 재조합 비피더스균(Bifidobacterium longum 105A/pSPxA-TNF alpha(x=7, 12), Bifidobacterium longum 105A/pSPxB-TNF alpha(x=1∼4, 7, 9, 10, 12, 16, 23) 및 Bifidobacterium longum 105A/pSec2-TNF alpha의 글리세린 스톡을 APS-2S-2.5SE(75㎍/mL 스펙티노마이신) 액체배지에 1% 식균하고 37℃에서 24시간 혐기배양했다(활성화 배양액).

다음으로 APS-2S-2.5SE(75㎍/mL 스펙티노마이신) 액체배지 20mL당 1M 인산나트륨 완충액(pH6.8) 4mL를 첨가한 배지에 활성화 배양액 0.5%를 식균했다. 이것을 37℃에서 18시간 혐기배양했다.

배양액을 원심분리한 후 배양상청을 회수했다. 이 배양상청 내의 단백질을 트리클로로아세트산(TCA)에 의해 침전시켜 아세톤으로 세정한 후, 전기영동용 버퍼에 용해하여 배양상청 내의 단백질을 농축했다.

별도로 세포내 단백질을 이하와 같이 추출했다. 배양액 1mL를 4mL의 PBS와 혼합하고 12,000rpm, 5분, 4℃에서 원심분리 후 상청을 제거하고, 이 침전에 5mL의 PBS를 더하고 현탁, 원심분리하여 상청을 제거하는 조작을 2회 행했다. 세정 후의 균체에 PBS를 더하고 전량을 1mL로 한 후, 초음파 처리를 하여 균체를 파쇄했다. 이것을 원심분리한 후, 상청을 회수하여 이것을 세포내 추출물로서 웨스턴 블로팅 해석에 제공했다.

동일한 조작을 야생주 Bifidobacterium longum 105A에 대해서도 실시하여 음성 컨트롤로 했다. TNF alpha의 양성 컨트롤에는 인간 재조합 TNF alpha(PEPRO TECH, INC.)를 이용했다.

상기 배양상청(배양액 7.5㎕ 상당), 배양상청 농축물(배양액 1mL 상당), 세포내 단백 추출물(배양액 7.5㎕ 상당)을 16% Tris-Glycine 겔(Invitrogen)로 전기영동 했다. 단, 이하의 샘플에 대해서는 겔에 대한 제공을 다음과 같이 조정했다. SP3B-TNF alpha 상청을 배양액 0.15㎕ 상당, SP16B-TNF alpha의 세포내 추출물을 0.15㎕ 상당, SP23B-TNF alpha의 세포내 추출물을 0.75㎕ 상당, 그 배양상청 농축물을 20㎕ 및 100㎕ 상당으로 전기영동에 제공했다. 이것을 PVDF막(Invitrogen, iBlot Transfer Stacks)에 iBlot Transfer Device(Invitrogen)를 이용하여 전사했다. 블로팅 종료후의 막을 블로킹한 후, 1차 항체에 anti-human TNF-alpha(goat)(R&D Systems), 2차 항체에 anti-Goat IgG HRP Conjugate(Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 반응하고 ECL Advance Western Blotting Detection Kit(GE Healthcare)로 발광시켰다. 이것을 이미징 애널라이저(Fluor S Max, 바이오래드)로 해석했다. 해석 결과를 도 8에 나타냈다.

그 결과, 9종(B. longum 105A/pSP1B-TNF alpha, B. longum 105A/pSP3B-TNF alpha, B. longum 105A/pSP4B-TNF alpha, B. longum 105A/pSP7B-TNF alpha, B. longum 105A/pSP12B-TNF alpha, B. longum 105A/pSP16B-TNF alpha, B. longum 105A/pSP23B-TNF alpha, B. longum 105A/pSP7A-TNF alpha, B. longum 105A/pSec2-TNF alpha)에 대해 분비가 확인되었고 2종(B. longum 105A/SP3B-TNF alpha 및 B. longum 105A/SP23B-TNF alpha)의 배양상청에 대한 발현이 특히 강했다.

참고예 3: TNF α 비분비형 균인 B. longum 105A/ pTNF 3의 분비 확인

참고예 2에서 얻은 B. longum 105A/pTNF3와 야생주인 B. longum 105A 글리세린 스톡을 APS-2S-2.5SE(75㎍/mL 스펙티노마이신) 액체배지에 1% 식균하고 37℃에서 24시간 혐기배양했다(활성화 배양액). APS-2S-2.5SE 액체배지 20mL에 1M 인산나트륨 완충액(pH6.8) 4mL를 첨가한 배지(75㎍/mL 스펙티노마이신)에 활성화 배양액 0.5%를 식균했다. 이것을 37℃에서 18시간 혐기배양했다. 단 야생주는 스펙티노마이신을 첨가하지 않는 배지에서 배양했다. 이 배양액을 원심분리하여 배양상청을 회수했다. 또 세포내 추출물을 이하와 같이 조제했다. 배양액 1mL를 PBS 버퍼로 세정한 후 균체를 PBS 버퍼로 현탁하여 1mL로 하고 초음파 파쇄했다. 이것을 원심분리 후 그 상청을 회수하고 이것을 세포내 추출물로 했다.

야생주에서 얻은 시료를 음성 컨트롤로 했다. 양성 컨트롤에는 인간 유래 재조합 TNF alpha(PEPRO TECH, INC.)를 이용했다. 상기 배양상청(배양액 7.5㎕ 상당), 세포내 추출물(배양액 0.075㎕ 상당)을 15% 폴리아크릴아미겔(아토 주식회사)로 전기영동했다. 이것을 PVDF막(Invitrogen, iBlot Transfer Stacks)에 iBlot Transfer Device(Invitrogen)를 이용하여 전사했다. 블로팅 종료후의 막을 블로킹한 후, 1차 항체로 anti-human TNF-alpha(goat)(R&D Systems), 2차 항체로 anti-Goat IgG HRP Conjugate(Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 반응하고 ECL Advance Western Blotting Detection Kit(GE Healthcare)로 발광시켰다. 이것을 이미징 애널라이저(Fluor S Max, 바이오래드)로 해석했다. 해석 결과를 도 9에 나타냈다.

그 결과, B. longum 105A/pTNF3과 야생주인 B. longum 105A의 세포내 추출물을 비교하면 B. longum 105A/pTNF3에서는 TNFα의 발현을 나타내는 밴드가 확인되었지만, 야생주인 B. longum 105A에서는 확인할 수 없었다. 따라서 플라스미드 pTNF3로 형질전환된 균주는 TNFα를 정상적으로 발현한다는 것을 알 수 있었다. 그러나 양자의 배양상청을 비교해 보면 어느 배양상청 내에서도 TNFα는 확인되지 않아 B. longum 105A/pTNF3로부터는 TNFα가 세포외로 분비되지 않는다는 것을 알았다.

제조예 6: pBifi - SP3B - TNF 의 구축

제조예 4에서 얻은 플라스미드 pSP3B-TNF alpha(대장균-비피더스균 셔틀 벡터)로부터 대장균 중에서의 복제기점을 제거한 플라스미드 pBifi-SP3B-TNF를 구축했다. 구축의 개요를 도 10에 나타낸다.

pUCori 제거 단편의 조제

재조합 대장균 TOP10/pSP3B-TNF alpha(셔틀 벡터)로부터 추출한 플라스미드 2.4㎍에 BamHI 및 BglII를 더하고 37℃에서 소화했다. 이것을, 0.8% 정제용 아갈로스겔을 이용한 전기영동에 의해 분리하고 약 3.8kbp의 DNA 단편을 잘라내었다. 잘라낸 겔로부터 DNA를 추출·정제하고(QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN) 흡광도 측정에 의해 DNA 농도를 측정했다.

pUCori 제거 단편의 셀프 라이게이션

상기 pUCori 제거 단편의 셀프 라이게이션을 튜브 6개로 행했다. 한 튜브당pUCori 제거 단편 50ng을 이용하여 50㎕의 반응계로 22℃에서 5분간 셀프 라이게이션을 행한(RAPID DNA LIGATION KIT, Fermentas) 후, 65℃에서 5분간 가열하여 Ligase를 실활시켰다. 라이게이션 반응액 6개를 하나로 모아 Proteinase K에 의한 단백질의 분해, 이어서 페놀·클로로포름 추출에 의한 단백질 제거 후 에탄올 침전을 행했다. DNA의 용해는 10㎕의 0.1×TE로 행했다.

비피더스균의 형질전환

Bifidobacterium longum 105A 컴피텐트 셀의 형질전환(일렉트로포레이션, 진 펄서 II, 바이오래드연구소 주식회사)을 상기 라이게이션 반응 후의 정제물 150ng(5㎕)을 이용하여 행했다. 전기 쇼크 후, 큐벳에 IMR 액체배지 800㎕와 비타민 C 첨가액 50㎕의 혼합액을 즉시 첨가하고 이것을 멸균된 2mL 마이크로 튜브로 회수했다. 이 튜브의 덮개를 느슨하게 한 상태로 데시케이터에 넣고 진공 펌프로 탈기한 후, 탄산가스를 봉입했다. 이 조작을 3회 반복하여 데시케이터 내의 공기를 탄산가스로 치환한 후 데시케이터를 37℃로 설정한 인큐베이터에 넣고 3시간 보온했다.

보온 후의 균 현탁액을 잘 혼합한 후, IMR 한천배지(75㎍/mL SPCM 함유)에 도포했다. 이 플레이트를 탈산소·탄산가스 발생제(아네로팩^(R) 켄키, 미츠비시가스화학 주식회사)와 함께 밀폐용기에 넣고 37℃로 설정한 인큐베이터로 2일간 배양했다.

형질전환체의 확인 및 재조합 비피더스균의 글리세린 스톡 제작

상기 IMR 한천배지(75㎍/mL SPCM 함유) 위에 형성한 재조합체 후보 콜로니를 BL-bS 한천배지(스펙티노마이신을 포함하는 BL 한천배지, 단 말의 탈섬유소 혈액은 포함하지 않음)에 화선배양하고 탈산소·탄산가스 발생제(아네로팩^(R) 켄키, 미츠비시가스화학 주식회사)와 함께 밀폐용기에 넣어 37℃에서 1일간 배양했다. 화선배양한 비피더스균을 APS-2S-2.5SE(75㎍/mL 스펙티노마이신) 액체배지에서 37℃에서 1일간 혐기배양하고 여기에서 플라스미드 DNA(QIAprep Spin Miniprep Kit, 키아겐 주식회사)를 추출했다. 추출 DNA를 주형으로 하여 Check primer F1(AAD9 카세트 상) 및 Check primer R2(Hu 프로모터 상)에서 PCR 증폭하고 PCR 산물의 크기를 아갈로스겔 전기영동으로 확인했다. 프라이머 서열을 표 7에 나타낸다. PCR 프라이머의 위치를 도 10에 나타낸다. PCR 산물 사이즈는 약 0.5kbp이며, pUC ori 단편이 제거되어 있는 것을 확인했다. 이로부터 이 재조합 비피더스균은 플라스미드 pSP3B-TNF alpha로부터 pUC ori가 제거된 플라스미드, pBifi-SP3B-TNF alpha 를 가지는 것을 확인했다.

[표 9]

BL-bS 한천배지 상의 화선 배양물을 APS-2S-2.5SE(75㎍/mL 스펙티노마이신) 액체배지에 식균하고 37℃에서 24시간 혐기배양했다. 이 배양액에 최종 농도 20%가 되도록 글리세린 용액을 혼합하여 글리세린 스톡으로 했다.

플라스미드 pBifi - SP3B - TNF 의 염기서열 결정

Bifidobacterium longum 105A/pBifi-SP3B-TNF 글리세린 스톡을 APS-2S-2.5SE(75㎍/mL 스펙티노마이신) 액체배지에서 혐기적으로 배양했다. 배양액으로부터 원심분리에 의해 균체를 회수하고 30mM GTA buffer로 현탁 후, N-아세틸무라미다아제 처리를 행했다. 그리고 Proteinase K(키아겐 주식회사) 처리를 한 후 플라스미드 DNA 정제 키트로 정제했다(QIAprep Spin Miniprep Kit, QIAGEN). 이 플라스미드 DNA를 이용하여 모든 염기서열을 결정하고 pUCori를 포함하지 않은 것을 확인했다(서열번호 5).

실시예 3: 재조합 비피더스균의 TNF alpha 단백질 분비 확인

제조예 6에서 얻은 Bifidobacterium longum 105A/pBifi-SP3B-TNF alpha 글리세린 스톡을 APS-2S-2.5SE(75㎍/mL 스펙티노마이신) 액체배지에 1% 식균하고 37℃에서 24시간 혐기배양했다(활성화 배양액). APS-2S-2.5SE(75㎍/mL 스펙티노마이신) 액체배지 20mL에 1M 인산나트륨 완충액(pH6.8) 4mL를 첨가한 배지에 활성화 배양액 0.5%를 식균했다. 이것을 37℃에서 18시간 혐기배양했다. 이 배양액을 원심분리하여 배양상청을 회수했다. 또 세포내 추출물을 이하와 같이 조제했다. 배양액 1mL를 PBS로 세정 후, PBS로 현탁하여 1mL로 하고 초음파 파쇄했다. 이것을 원심분리 후 그 상청을 회수하고 이것을 세포내 추출물로 했다. 같은 조작을 셔틀 벡터인 Bifidobacterium longum 105A/pSP3B-TNF alpha 및 야생주 Bifidobacterium longum 105A(야생주)에 대해서도 실시했다. 단 야생주는 스펙티노마이신을 첨가하지 않는 배지에서 배양했다. 야생주에서 얻은 시료를 음성 컨트롤로 했다. 양성 컨트롤에는 인간 유래 재조합 TNF alpha(PEPRO TECH, INC.)를 이용했다.

상기 배양상청(배양액 0.75㎕ 상당), 세포내 단백 추출물(배양액 1.5㎕ 상당)을 15% 폴리아크릴아미겔(아토 주식회사)로 전기영동했다. 이것을 PVDF막(Invitrogen, iBlot Transfer Stacks)에 iBlot Transfer Device(Invitrogen)를 이용하여 전사했다. 블로팅 종료후의 막을 블로킹한 후, 1차 항체로 anti-human TNF-alpha(goat)(R&D Systems), 2차 항체로 anti-Goat IgG HRP Conjugate(Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 반응하고 ECL Advance Western Blotting Detection Kit(GE Healthcare)로 발광시켰다. 이것을 이미징 애널라이저(Fluor S Max, 바이오래드)로 해석했다. 해석 결과를 도 11에 나타냈다.

실시예 4: pBifi - SP3B - TNF alpha 및 pSP3B - TNF 에서의 대장균 형질전환

제조예 6에서 얻은 플라스미드(pBifi-SP3B-TNF alpha 및 pSP3B-TNF alpha)를 이용하여 대장균 TOP10주를 형질전환했다.

대장균 TOP10 컴피텐트 셀(라이프테크놀로지스재팬 주식회사)의 제품 설명서에 따라 형질전환하여 LB(75㎍/mL 스펙티노마이신 함유) 한천배지에 100㎕씩 2장 도포하고 37℃에서 하룻밤 배양했다. 콜로니는 셔틀 벡터 pSP3B-TNF alpha를 도입한 경우에서만 형성되고(266cfu 및 226cfu), pBifi-SP3B-TNF alpha를 도입한 대장균은 선택 배지 상에서 콜로니를 형성하지 않았다.

참고예 4: 플라스미드 pBEshuttle 의 구축

인서트를 포함하지 않는 단백질 발현 유닛을 가지는 모크 벡터로서 pBEshuttle을 이하와 같이 구축했다. 개요를 도 13에 나타냈다.

PCR 단편의 조제

플라스미드 pCDshuttle 5ng을 주형으로 하여 2개의 PCR 단편 A 및 B를 PrimeSTAR(R) HS Premix(다카라바이오 주식회사)를 이용하여 증폭했다. PCR 단편 A의 증폭에는 MCS F1 primer 및 TNFvec R1 primer를, PCR 단편 B의 증폭에는 pUC ori F2 primer 및 MCS R1 primer를 이용했다(표 8).

PCR 단편 A 증폭용 프라이머의 5'측의 15염기는 PCR 단편 B의 말단과 상동인 서열을, PCR 단편 B 증폭용 프라이머의 5'측의 15염기는 PCR 단편 A의 말단과 상동인 서열을 가지도록 설계했다.

PCR의 프로그램은 98℃에서 10초, 55℃에서 5초, 72℃에서 X초(PCR 단편 A 증폭: X=3분 20초, PCR 단편 B 증폭: X=35초)를 30 사이클 행한 후 72℃에서 30초로 했다.

PCR 산물의 일부를 아갈로스겔(1×TBE buffer, 에티디움브로마이드 포함. PCR 산물 A용: 0.8% 아갈로스겔, PCR 산물 B용: 2% 아갈로스겔)에 DNA 농도 마커와 함께 전기영동하고 싱글 밴드(PCR 산물 A: 약 3.3kbp, PCR 산물 B: 약 0.6kbp)인 것을 확인하고 그 농도를 추측했다.

[표 10]

클로닝

상기 PCR 산물 A 100ng 및 PCR 산물 B 35ng을 In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit(다카라바이오 주식회사)를 이용하여 말단 서열의 재조합을 통해 연결했다. 이 때 Cloning Enhancer(다카라바이오 주식회사)도 반응액에 첨가하고 인서트 및 벡터 중에 포함되는 주형 플라스미드의 분해도 동시에 행했다. 자세한 것은 In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit의 제품 설명서에 따랐다.

상기 인퓨전 반응액 2㎕를 이용하여 대장균 TOP10 chemically Competent Cell(Invitorogen사)을 형질전환했다. 형질전환 조건은 제품 설명서에 따랐다. 형질전환한 대장균 콜로니를 LB(75㎍/mL 스펙티노마이신 함유) 액체배지에서 37℃에서 하룻밤 배양하고 여기에서 플라스미드를 추출했다(QIAprep Spin Miniprep Kit, 키아겐 주식회사). 이 플라스미드의 전체 길이 서열을 결정하고 pBEshuttle로 했다(서열번호 50).

비피더스균의 형질전환

플라스미드 pBEshuttle을 이용하여 B. longum 105A의 형질전환을 제조예 1과 동일한 방법을 이용하여 실시했다.

제조예 7: 재조합 비피더스균 B. breve / pSP3B - TNF alpha 의 제작

제조예 1의 비피더스균의 형질전환과 동일한 방법으로 플라스미드 pSP3B-TNF alpha에 의한 Bifidobacterium breve JCM1192를 형질전환했다.

실시예 5: 재조합 비피더스균의 TNF α 단백질의 발현량 확인

참고예 4에서 얻은 B. longum 105A/pBEshuttle, 제조예 4에서 얻은 B. longum 105A/pSP3B-TNF alpha, 제조예 6에서 얻은 B. longum 105A/pBifiSP3B-TNF alpha 및 제조예 7에서 얻은 B. breve/pSP3B-TNF alpha 글리세린 스톡을 APS-2S-2.5SE(75㎍/mL 스펙티노마이신) 액체배지에 1% 식균하고 37℃에서 24시간 혐기배양했다(활성화 배양). APS-2S-2.5SE 액체배지 20mL에 1M 인산나트륨 완충액(pH6.8) 4mL를 첨가한 배지(75㎍/mL 스펙티노마이신)에 활성화 배양액 0.5% 를 식균했다. 이것을 37℃에서 18시간 혐기배양했다. 이 배양액을 원심분리하여 배양상청을 회수했다. 배양상청에 대하여 ELISA법(Quantikine Human TNF alpha/TNFSF1A Immunoassay, R&D Systems, Inc.)에 의해 배양상청 내의 TNFα량을 측정했다. 측정 결과를 표 9에 나타냈다.

[표 11]

B. longum 105A/pSP3B-TNF alpha, B. longum 105A/pBifiSP3B-TNF alpha 및 B. breve/pSP3B-TNF alpha 모두 배양상청 내로 TNFα가 분비되고 있었지만, B. longum 105A/pBEshuttle에서는 관찰되지 않았다.

실시예 6: 재조합 비피더스균에서 분비한 TNF α 단백질의 생리 활성과 항 hTNF α 항체에 의한 생리 활성의 중화

피험균의 배양 및 배양상청의 조제

참고예 4에서 얻은 B. longum 105A/pBEshuttle, 제조예 4에서 얻은 B. longum 105A/pSP3B-TNF alpha 및 제조예 6에서 얻은 B. longum 105A/pBifiSP3B-TNF alpha 글리세린 스톡을 APS-2S-2.5SE(75㎍/mL 스펙티노마이신) 액체배지에 1% 식균하고 37℃에서 24시간 혐기배양했다(활성화 배양). APS-2S-2.5SE 액체배지 20mL에 1M 인산나트륨 완충액(pH6.8) 4mL를 첨가한 배지(75㎍/mL 스펙티노마이신)에 활성화 배양액 0.5%를 식균했다. 이것을 37℃에서 18시간 혐기배양했다. 이 배양액을 원심분리하여 배양상청을 회수했다.

TNF α의 세포독성 시험

rhTNFα의 생리 활성과 중화는 TNFα의 생리 활성인 TNFα 수용체를 통한 세포독성을 조사하여 판정했다. 피험세포로서 인간 유방암 세포주인 KPL-1 세포를 이용했다. KPL-1 세포는 DMEM 배지(10%(v/v) FBS 및 0.1%(v/v) 페니실린(50000U/mL)·스트렙토마이신(50mg/mL)액을 첨가한 DMEM 배지)에서 37℃, 5%CO₂의 조건하에서 배양했다. 이 세포 1×10⁴개/웰을 96웰 플레이트에 파종하고 37℃, 5%CO₂에서 24시간 배양하여 콘플루언트의 세포를 얻었다. 이 세포에서 오래된 배지를 흡인 제거하고 새로 최종농도 5㎍/mL 악티노마이신 D가 되도록 악티노마이신 D를 첨가한 10%(v/v) FBS 및 0.1% 페니실린(50000U/mL)·스트렙토마이신(50mg/mL)액 첨가 DMEM 배지를 80㎕/웰씩 첨가했다. 다음으로 측정시료로서 비피더스균용 배지(APS-2S-2.5SE 배지), rhTNFα 표준품으로서 100ng/mL로 조제한 rhTNF alpha, B. longum 105A/pBEshuttle 배양상청 5배 희석액, B. longum 105A/pSP3B-TNF alpha 배양상청 5배 희석액 및 B. longum 105A/pBifiSP3B-TNF alpha 배양상청 5배 희석액을 10㎕/웰씩 첨가했다. 여기에 rhTNFα 생리 활성의 중화능을 측정하기 위해 항hTNFα 항체(anti-human TNF alpha, R&D Systems, 0.0125∼0.1mg/mL), 정상 염소 IgG(normal Goat IgG, R&D Sytems, 0.0125∼0.1mg/mL) 및 10%(v/v) FBS 및 0.1%(v/v) 페니실린(50000U/mL)·스트렙토마이신(50mg/mL)액을 첨가한 DMEM 배지의 각 10㎕/웰을 첨가했다. 이 플레이트를 37℃, 5%CO₂에서 48시간 배양했다.

세포독성의 측정은 Cell Counting Kit-8(DOJINDO)을 사용하고 이 액 10㎕/웰씩을 각 웰에 첨가한 후, 다시 4시간 37℃, 5%CO₂에서 인큐베이트하여 파장 450nm와 630nm로 흡광도를 측정했다(630nm를 참조 파장으로 했음). 해석 결과를 도 14에 나타냈다. 이것에 의해 재조합균 B. longum 105A/pSP3B-TNF alpha 및 B. longum 105A/pBifiSP3B-TNF alpha의 배양상청은 KPL-1 세포에 대해 세포독성을 나타내고 항TNFα 항체에 의해 중화된 점에서 배양상청 내에 분비된 재조합 hTNFα가 생리 활성을 가지는 것임을 확인했다.

실시예 7: B. longum 105A/ pSP3B - TNF alpha 및 B. breve / pSP3B - TNF alpha 의 항종양 효과 측정

제조예 4에서 제작한 B. longum 105A/pSP3B-TNF alpha 및 제조예 7에서 제작한 B. breve/pSP3B-TNF alpha의 항종양 효과를 측정했다.

(1) 이식 종양세포의 배양

인간 유방암 세포주인 KPL-1 세포는 10%(v/v) FBS 및 0.1%(v/v) 페니실린(50000U/mL)·스트렙토마이신(50mg/mL)액을 첨가한 DMEM 배지에서 37℃, 5%CO₂의 조건하에서 배양했다.

콘플루언트가 된 시점에서 1×PBS(-)로 세정 후 1×트립신 EDTA를 더해 세포를 벗기고 원심조작(1000회전/5분간)으로 회수한 세포를 DMEM 배지에서 적절히 희석하여 계대배양했다.

이식 실험에는 5회 계대 후의 세포를 이용했다. 트리판 블루로 염색되지 않는 생세포수를 Thoma 혈구계산반(Thoma deep 0.1mm ERMA, 도쿄)으로 계수하고 행크스액에 현탁하여 세포수를 2.5×10⁶개/mL로 조제했다.

(2) 담암 누드 마우스 제작과 종양체적의 측정

조제한 KPL-1 세포 현탁액 0.2mL를 누드 마우스의 오른쪽 앞다리 뒤쪽 피하에 이식했다(5×10⁵개/마우스).

이식 후의 종양체적은 종양지름(긴 지름, 짧은 지름, 두께)을 버니어 캘리퍼스로 측정하여 아래 식에 의해 구했다.

종양체적(㎣)=긴 지름(mm)×짧은 지름(mm)×두께(mm)/2

(3) 군 나누기 및 군 구성

KPL-1 담암 누드 마우스의 종양체적이 대략 80∼135㎣ 정도인 마우스 24 마리를 선별하여 평균 종양체적이 동일한 정도가 되도록 3군(1군 8마리)으로 나누었다. 이 날을 Day 0으로 설정했다.

시험군 구성은 표 10에 나타내는 바와 같다. 즉, 제1군: 무처리군, 제2군: B. longum 105A/pSP3B-TNF alpha 투여군, 제3군: B. breve/pSP3B-TNF alpha 투여군으로 하였다.

[표 12]

(4) 균의 배양 및 투여용 균액의 조제

균의 배양

제조예 4에서 제작한 비피더스균 B. longum 105A/pSP3B-TNF alpha 및 제조예 7에서 얻은 B. breve/pSP3B-TNF alpha의 글리세린 스톡을 APS-2S-2.5SE(75㎍/mL 스펙티노마이신) 액체배지에 1% 식균하고 37℃에서 23.5시간 혐기배양했다(활성화 배양액). 다음으로 APS-2S-2.5SE(75㎍/mL 스펙티노마이신) 액체배지 20mL에 활성화 배양액의 1%를 식균하고 37℃에서 18시간 혐기배양했다(본배양액).

투여용 배양생균의 조제(B. longum 105A/ pSP3B - TNF alpha )

상기에서 얻어진 본배양액 10mL를 메스피펫으로 칭량하고 40mL의 아주 차갑게 한 PBS 버퍼가 들어간 코니컬 튜브에 더하여 전도혼화로 부드럽게 혼합한 후, 4℃로 냉각한 원심기로 8000rpm로 10분간 원심했다. 원심 후 상청을 제거하고 새로운 PBS 버퍼를 40mL 더하여 볼텍스로 부드럽게 혼합했다. 이 조작을 4회 반복하고 균체를 세정했다. 세정한 균체를 5mL의 PBS 버퍼에 현탁하여 이것을 투여용 배양생균으로 했다.

투여용 배양생균의 조제(B. breve / pSP3B - TNF alpha )

상기에서 얻어진 본배양액 10mL를 메스피펫으로 칭량하고 40mL의 아주 차갑게 한 PBS 버퍼가 들어간 코니컬 튜브에 더하여 전도혼화로 부드럽게 혼합한 후, 4℃로 냉각한 원심기로 8000rpm로 10분간 원심했다. 원심 후 상청을 제거하고 새로운 PBS 버퍼를 40mL 더하여 볼텍스로 부드럽게 혼합했다. 이 조작을 4회 반복하고 균체를 세정했다. 세정한 균체를 10mL의 PBS 버퍼에 현탁하여 이것을 투여용 배양생균으로 했다.

(5) 균 및 말토오스의 투여

균의 투여

제2군 및 제3군에 마우스당 0.2mL의 각 배양생균(제2군: B.lonum 105A/pSP3B-TNF alpha, 제3군: B. breve/pSP3B-TNF alpha)을 1일 2회(AM/PM), 주에 2회(Day 1, 4, 8, 11)의 페이스로 2주간에 걸쳐 정맥내 투여했다. 배양생균은 총투여용량으로 1.6mL, 총투여균수로 B.lonum 105A/pSP3B-TNF alpha에서는 3.1×10⁹cfu/마우스, B. breve/pSP3B-TNF alpha에서는 4.8×10⁹cfu/마우스를 투여했다. 투여생균수는 아래와 같이 하여 측정했다.

생균수 측정

배양생균을 혐기성 희석액으로 10⁶배로 희석하고 그 100㎕를 BLFS 플레이트 각 3장에 도포하여 밀폐용기(아네로팩 각형 용기, 미츠비시가스화학) 내에 탈산소·탄산가스 발생제와 함께 37℃의 항온기에 3일간 혐기배양했다. 콜로니수가 30∼300 정도 검출되는 플레이트로부터 아래 식에 의해 투여균수를 산출했다.

투여균수(cfu)=콜로니수(a)×플레이트 도포시의 희석률(b)×배양생균 1mL당 환산계수(c)×투여량(mL)

(a): (P1＋P2＋P3)/3 [3 플레이트(P1, P2, P3)의 평균 콜로니수]

(b): ×10⁶ [10⁶배 희석]

(c): ×10 [1 플레이트당 100㎕를 도포]

말토오스의 투여

제2, 3군에 균의 당원으로서 10% 말토오스 용액 1mL를 마우스에 1일 2회(200mg/body/day) 복강내 투여했다. 투여기간은 배양생균 투여일로부터 21일간(Day 1∼21)으로 했다.

(6) 종양증식 억제 효과의 확인

모든 마우스에 대해 치료 개시전(군 나누기할 때) 및 치료 개시후 22일간, 3∼4일에 1회의 빈도로 종양지름을 측정하여 종양증식에 대한 효과를 확인했다.

각 군 마우스의 종양체적의 평균치±SD를 산출하고 대조군(제1군)에 대한 상대 종양체적 비율[T/C(%)]을 지표로 하여 항종양 효과를 판정했다. 또 제1군과 제2군, 제1군과 제3군 사이에서의 통계학적 해석(2군간 비교: t-test)을 실시했다.

각 군의 종양체적(평균치±SD)을 이하의 표 11에 나타낸다.

또 이 때의 경일적인 종양체적의 변동을 도 15에 나타낸다.

[표 13]

B.lonum 105A/pSP3B-TNF alpha 및 B. breve/pSP3B-TNF alpha 어느 쪽을 투여한 군에서도 무처리군과 비교하여 의미 있는 종양체적의 감소가 관찰되었다.

실시예 8: B. longum 105A/ pSP3B - TNF alpha 의 항종양 효과 측정

제조예 4에서 제작한 B. longum 105A/pSP3B-TNF alpha의 아드리아마이신 병용에 있어서의 항종양 효과를 측정했다.

(1) 이식 종양세포의 배양

인간 유방암 세포주인 KPL-1 세포는 10%(v/v) FBS 및 0.1%(v/v) 페니실린(50000U/mL)·스트렙토마이신(50mg/mL)액을 첨가한 DMEM 배지에서 37℃, 5%CO₂의 조건하에서 배양했다.

콘플루언트가 된 시점에서 1×PBS(-)로 세정 후 1×트립신 EDTA를 더해 세포를 벗기고 원심조작(1000회전/5분간)으로 회수한 세포를 DMEM 배지에서 적절히 희석하여 계대배양했다.

이식 실험에는 5회 계대 후의 세포를 이용했다. 트리판 블루로 염색되지 않는 생세포수를 Thoma 혈구계산반(Thoma deep 0.1 mm ERMA, 도쿄)으로 계수하고 행크스액에 현탁하여 세포수를 2.5×10⁶개/mL로 조제했다.

(2) 담암 누드 마우스 제작과 종양체적의 측정

조제한 KPL-1 세포 현탁액 0.2mL를 누드 마우스의 오른쪽 앞다리 뒤쪽 피하에 이식했다(5×10⁵개/마우스). 이식 후의 종양체적은 종양지름(긴 지름, 짧은 지름, 두께)을 버니어 캘리퍼스로 측정하여 아래 식에 의해 구했다.

종양체적(㎣)=긴 지름(mm)×짧은 지름(mm)×두께(mm)/2

(3) 군 나누기 및 군 구성

KPL-1 담암 누드 마우스의 종양체적이 대략 80∼120㎣ 정도인 마우스 18 마리를 선별하여 평균 종양체적이 동일한 정도가 되도록 3군(1군 6마리)으로 나누었다. 이 날을 Day 0으로 설정했다.

시험군 구성은 표 12에 나타내는 바와 같다. 즉, 제1군: 무처리군, 제2군: 아드리아마이신 단독 투여군, 제3군: 균(B. longum 105A/pSP3B-TNF alpha)＋아드리아마이신 병용 투여군으로 했다.

[표 14]

(4) 균(B. longum 105A/pSP3B-TNF alpha)의 배양

제조예 4에서 제작한 비피더스균 B. longum 105A/pSP3B-TNF alpha의 글리세린 스톡을 APS-2S-2.5SE(75㎍/mL 스펙티노마이신) 액체배지에 1% 식균하고 37℃에서 23.5시간 혐기배양했다(활성화 배양액). 다음으로 APS-2S-2.5SE(75㎍/mL 스펙티노마이신) 액체배지 20mL에 활성화 배양액의 1%를 식균하고 37℃에서 18시간 혐기배양했다(본배양액).

투여용 배양생균의 조제

상기 본배양액 5mL를 메스피펫으로 칭량하고 20mL의 아주 차갑게 한 PBS 버퍼가 들어간 코니컬 튜브에 더하여 전도혼화로 부드럽게 혼합한 후, 4℃로 냉각한 원심기로 8000rpm로 10분간 원심했다. 원심 후 상청을 제거하고 새로운 PBS 버퍼를 20mL 더하여 볼텍스로 부드럽게 혼합했다. 이 조작을 4회 반복하여 균체를 세정했다. 세정한 균체를 2.5mL의 PBS 버퍼에 현탁하여 이것을 투여용 배양생균으로 했다.

(5) 균, 말토오스 및 아드리아마이신의 투여

균의 투여

제3군에 마우스당 0.2mL의 배양생균(피험약)을 1일 2회(AM/PM), 주에 2회(Day 1, 5, 8, 12) 정맥내 투여했다. 배양생균은 총투여용량으로 1.6mL, 총투여균수로 3.0×10⁹cfu/마우스를 투여했다. 투여생균수는 이하와 같이 하여 측정했다.

생균수 측정

배양생균을 혐기성 희석액으로 10⁶배로 희석하고 그 100㎕를 BLFS 플레이트 각 3장에 도포하여 밀폐용기(아네로팩 각형 용기, 미츠비시가스화학) 내에 탈산소·탄산가스 발생제와 함께 넣고 37℃의 항온기에 3일간 혐기배양했다. 콜로니수가 30∼300 정도 검출되는 플레이트로부터 아래 식에 의해 투여균수를 산출했다.

투여균수(cfu)=콜로니수(a)×플레이트 도포시의 희석률(b)×배양생균 1mL 당 환산계수(c)×투여량(mL)

(a): (P1＋P2＋P3)/3 [3 플레이트(P1, P2, P3)의 평균 콜로니수]

(b): ×10⁶ [10⁶배 희석]

(c): ×10 [1 플레이트당 100㎕를 도포]

말토오스의 투여

제3군에 균의 당원으로서 10% 말토오스 용액 1mL를 마우스에 1일 2회(200mg/body/day) 복강내 투여했다. 투여 기간은 배양생균 투여일부터 20일간(Day 1∼20)으로 했다.

아드리아마이신의 투여

제2군 및 제3군에 아드리아마이신 용액(1.0mg/mL) 0.1mL를 첫회 균투여 전날(Day 0)에만 마우스에 정맥내 투여했다.

(6) 종양증식 억제 효과의 확인

모든 마우스에 대해 치료 개시전(군 나누기할 때) 및 치료 개시 후 21일간, 3∼4일에 1회의 빈도로 종양지름을 측정하여 종양증식에 대한 효과를 확인했다.

각 군 마우스의 종양체적의 평균치±SD를 산출하고 대조군(제1군)에 대한 상대 종양체적 비율[T/C(%)]을 지표로 하여 항종양 효과를 판정했다. 또 TNFα를 분비하는 본균의 항종양능을 판정하기 위해 제2군과 제3군 사이에 통계학적 해석(2군간 비교: t-test)을 실시했다.

각 군의 종양체적(평균치±SD)을 이하의 표 13에 나타낸다.

또 이 때의 경일적인 종양체적의 변동을 도 16에 나타낸다.

[표 15]

B. longum 105A/pSP3B-TNF alpha와 아드리아마이신을 병용한 군은 무처리 군뿐만 아니라 아드리아마이신만 투여한 군과 비교해도 의미 있게 종양체적이 감소하고 있었다. 이것은 즉 아드리아마이신과 B. longum 105A/pSP3B-TNF alpha를 병용하면 효과를 높일 수 있다는 것을 의미한다.

제조예 8: 비분비형 인간 IL -18 발현 비피더스균의 제작

플라스미드 phIL18mut - His 의 구축

비피더스균 유래의 Hu 프로모터 하류에 인간 IL-18만 배치하여 분비 시그널을 가지지 않은 셔틀 벡터(비피더스균-대장균)를 구축했다. 개요를 도 17에 나타낸다. 자세한 것은 이하와 같다.

인서트 조제

인간 IL-18(Accession No: NM_001562, 성숙 단백질 코딩 영역 329번째에서 799번째 염기서열)의 코돈을 비피더스균용으로 최적화한 인공 DNA, 그 상류 및 하류에 비피더스균 유래의 Hu 프로모터 및 Hu 터미네이터를 배치한 플라스미드: human IL18_opt_in_pUC57(GenScript에 커스텀 합성 의뢰)를 사용했다. 인공 DNA 합성시에는 성숙 인간 IL-18의 7번째 아미노산(E→A) 및 54번째 아미노산(K→A)의 2개소에 아미노산 치환을 도입하고 IL-18 결합 단백에 의한 중화를 감소시키고 C 말단에 히스티딘 태그를 부가했다(성숙 인간 IL-18의 아미노산 서열: 서열번호 47).

플라스미드 human IL18_opt_in_pUC5 72㎍에 BamHI 25unit 및 BcuI1 5unit(효소는 모두 Fermentas)을 첨가하고 37℃에서 3시간 보온하여 완전 분해했다. 소화 후의 플라스미드를 1% 정제용 아갈로스겔(1×TBE buffer, 에티디움브로마이드 포함)으로 전기영동하여 DNA 단편을 분리했다. 약 1kbp의 소단편을 잘라내고 DNA 추출키트(QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN)로 아갈로스겔로부터 DNA를 추출 및 정제했다. 정제 DNA 단편(인서트)을 0.8% 아갈로스겔(1×TBE buffer, 에티디움브로마이드 포함)에 DNA 농도 마커와 함께 전기영동하여 그 농도를 추측했다.

벡터 조제

플라스미드 pCDshuttle을 BamHI, BcuI, PstI, Bsp119I(모두 Fermentas, PstI 및 Bsp119I는 CD상에 인식 부위가 있음)으로 완전 분해했다. 반응 조건은 효소의 사용설명서에 따랐다. 소화 후의 플라스미드를 1% 정제용 아갈로스겔(1×TBE buffer, 에티디움브로마이드 포함) 전기영동으로 분리하고 약 3.4kbp의 큰 단편을 잘라내고 DNA 추출키트(QIAquick Gel Extraction Kit, 키아겐 주식회사)로 아갈로스겔로부터 DNA를 추출 및 정제했다. 정제 DNA 단편(벡터)을 0.8% 아갈로스겔(1×TBE buffer, 에티디움브로마이드 포함)로 DNA 농도 마커와 함께 전기영동하여 그 농도를 추측했다.

클로닝

상기 벡터 및 인서트를 1:3(몰비)로 혼합하고 라이게이션을 행했다(Rapid DNA Ligation Kit, Fermentas). 자세한 것은 제품 설명서에 따랐다.

상기 라이게이션 반응액 2㎕를 이용하여 대장균 TOP10 chemically Competent Cell(Invitorogen사)을 형질전환했다. 형질전환 조건은 제품 설명서에 따랐다. 형질전환한 대장균 콜로니를 LB(75㎍/mL 스펙티노마이신 함유) 액체배지에서 37℃에서 하룻밤 배양하고 여기에서 플라스미드를 추출했다(QIAprep Spin Miniprep Kit, 키아겐 주식회사). 이 플라스미드명을 phIL18mut-His 로 했다(서열번호 48).

pSP3B - hIL18mut 의 구축

비피더스균 유래의 Hu 프로모터 하류에 시그널 펩티드와 융합한 human IL18mut를 배치한 셔틀 벡터(비피더스균-대장균)를 구축했다. 개요를 도 18에 나타낸다. 자세한 것은 이하와 같다.

인서트 조제

플라스미드 phIL18mut-His 5ng을 주형으로 하여 hIL18mut 코딩 영역을 PrimeSTAR(R) HS Premix(다카라바이오 주식회사)로 PCR 증폭했다. 프라이머는 IL18 F2 프라이머 및 IL18 R2 프라이머를 이용하고 각 프라이머의 5'측의 15염기는 벡터의 말단과 상동인 서열로 했다(표 14). PCR 산물에 IL-18의 C 말단의 히스티PCR 산물의 일부를 DNA 농도 마커와 함께 2% 아갈로스겔(1×TBE buffer, 에티디움브로마이드 포함)로 전기영동하여 약 0.5kbp의 싱글 밴드인 것을 확인하고 또 그 농도를 추측했다.

벡터 조제

플라스미드 pSP3B-TNF alpha 5ng을 주형으로 하여 시그널 펩티드 SP3 및 벡터 골격을 PrimeSTAR(R) HS Premix(다카라바이오 주식회사)로 PCR 증폭했다. 프라이머는 vector F3 프라이머 및 vector R2 프라이머(표 14)를 이용하고 각 프라이머의 5'측의 15염기는 인서트의 말단과 상동인 서열로 했다. PCR의 프로그램은 98℃에서 10초, 55℃에서 5초, 72℃에서 4분을 30 사이클 행한 후, 72℃에서 30초로 했다.

PCR 산물의 일부를 DNA 농도 마커와 함께 0.8% 아갈로스겔(1×TBE buffer, 에티디움브로마이드 포함)로 전기영동하여 약 4kbp의 싱글 밴드인 것을 확인하고 또 그 농도를 추측했다.

[표 16]

클로닝

상기 벡터 100ng 및 인서트 40ng을 In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit(다카라바이오 주식회사)를 이용하여 말단 서열의 재조합을 통해 연결했다. 이 때 Cloning Enhancer(다카라바이오 주식회사)도 반응액에 첨가하고 인서트 및 벡터 중에 포함되는 주형 플라스미드의 분해도 동시에 행했다. 자세한 것은 In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit의 제품 설명서에 따랐다.

상기 인퓨전 반응액 2㎕를 이용하여 대장균 TOP10 chemically Competent Cell(Invitorogen 사)을 형질전환했다. 형질전환 조건은 제품 설명서에 따랐다. 형질전환한 대장균 콜로니를 LB(75㎍/mL 스펙티노마이신 함유) 액체배지에서 37℃에서 하룻밤 배양하고 여기에서 플라스미드를 추출했다(QIAprep Spin Miniprep Kit, 키아겐 주식회사). 이 플라스미드의 전체 길이 서열을 결정하고 pSP3B-hIL18mut 로 했다(서열번호 49).

비피더스균의 형질전환

플라스미드 pSP3B-hIL18mut를 이용하여 B. longum 105A 및 B. breve JCM1192의 형질전환을 제조예 1과 동일한 방법을 이용하여 행했다.

실시예 9: 재조합 비피더스균의 인간 IL -18 단백질 발현

시료 조제

제조예 8에서 얻은 재조합 비피더스균: Bifidobacterium longum 105A/pSP3B-hIL18mut 및 참고예 4에서 얻은 Bifidobacterium longum 105A/pBEshuttle의 글리세린 스톡을 APS-2S-2.5SE(75㎍/mL 스펙티노마이신) 액체배지에 1% 식균하고 37℃에서 24시간 혐기배양했다(활성화 배양액). 다음으로 APS-2S-2.5SE(75㎍/mL 스펙티노마이신) 액체배지 20mL당 1M 인산나트륨 완충액(pH6.8) 4mL를 첨가한 배지에 활성화 배양액 0.5%를 식균했다. 이것을 37℃에서 18시간 혐기배양했다(본배양액).

상기와 동일한 방법으로 Bifidobacterium breve JCM1192/pSP3B-hIL18mut을 배양했다. 단, 본배양은 14시간 배양으로 했다.

본배양액을 1.5mL용 튜브에 1.3mL 덜어 원심분리(14,000rpm, 5분, 4℃)한 후 그 상청을 회수하여 이것을 IL-18 측정용 시료로 했다.

IL -18 측정

Human IL-18 ELISA 키트(MBL)를 이용하여 각 상청의 인간 IL-18 단백량을 측정했다. 그 결과, Bifidobacterium longum 105A/pSP3B-hIL18에서 986pg/mL, Bifidobacterium breve JCM1192/pSP3B-hIL18mut에서 1632pg/mL의 IL-18이 검출되었지만, 모크에서는 검출되지 않았다.

본 발명의 분비 시그널 펩티드를 발현 유닛에 도입하는 것에 의해 생리 활성을 잃는 일 없이 발현단백질을 효율적으로 형질전환균체 외로 분비시키는 것이 가능해진다. 따라서 본 발명의 벡터 및 그 벡터로 형질전환된 혐기성 미생물은 종래의 것과 비교하여 혐기성질환조직에 있어서 치료제를 효율적으로 질환 부위에 공급할 수 있기 때문에 높은 치료 효과를 얻을 수 있다.

<110> Anaeropharma Science <120> transfection vector <130> PCT417-1AN <160> 51 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 4586 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of plasmid pAmyB-GFPuv <400> 1 ggatccgggc atcgccgaat atactcccac cacacaacaa gttagggtgg tacaaaacac 60 catcaattaa gtaccacctt tgcaaacatt ttcacaaatg aaagagttgt ttcagcaacg 120 attttcattg ttttttccaa ggcttttcgc actttagcac cctagaaaag gtataaaata 180 aacagcatac gttcgcaata gtgcaaacgc tatcaaagaa gatgaacccc cgttaaaggg 240 attgaagaaa aggaataaag gagccatgaa acatcggaaa cccgcaccgg cctggcatag 300 gctggggctg aagattagca agaaagtggt ggtcggcatc accgccgcgg cgaccgcctt 360 cggcggactg gcaatcgcca gcaccgcagc acaggcctcc aagggcgagg agctgttcac 420 cggcgtggtg ccgatcctgg tggagctgga cggcgacgtg aacggccaca agttctccgt 480 gtccggcgag ggcgagggcg acgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac 540 caccggcaag ctgccggtgc cgtggccgac cctggtgacc accttctcct acggcgtgca 600 gtgcttctcc cgctacccgg accacatgaa gcgccacgac ttcttcaagt ccgccatgcc 660 ggagggctac 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Sequence <220> <223> DNA sequence of signal peptide SP14 <400> 19 ttgccgggac ctatatgtcc ccggcaacaa cagccgtata tacgctaccg atcagtgctg 60 ccctcatcat ccttggcacc tgccgtggcg gcctcagtct ccttggcgtt ccacccggcg 120 acggcattcc aaccactcca tccgatgacc actagcaagc acagcgagaa gacaatagtg 180 gcccaa 186 <210> 20 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of signal peptide SP15 <400> 20 atgaaacgta gcgattatat gttggcggca ctcgcctcag ccgtcctgcc gaatctgggg 60 gtggccggcg tacgcgagaa cgtgcaggcc agcgcaaccg acgaggccaa aggcatcgat 120 cagaccgtga ttcaagatgc ctcaggcaag 150 <210> 21 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of signal peptide SP16 <400> 21 atgagcaata gtgcatcatc gtttaccggc gtgtccagcg gttataccgc cgggactccg 60 gttccagccg attcacccat ccgtgacaat atcgccgatg ccgttcgccg cgtacgcgag 120 acgactccgt tggcc 135 <210> 22 <211> 195 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of signal peptide SP19 <400> 22 ttggcaagat gggtcactcg gagcgttccg 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Sequence <220> <223> sequence of SP5 with promoter <400> 33 ctcgcgggct tggcggtcgg cacagcaacc cgtctggcag caggcacagc agcagatgca 60 acttcggaca gaggcatgtt ggaaaacttc tgcatatcat ccctcctcaa tggaattatt 120 tcgtcgttct cttatttcag aaggaattat tacattcaat taggacttta ggcataaaca 180 ttccaccaca caacagaaaa cacaggaaga actactgaaa ttaccaggca aaatcggaaa 240 gccatcgcat tccggcaaca ggtacagtga acacagagca caacgaacgg agaagacacc 300 atgaccgcga ttgacgagac cgaccagcgc atcctcacca tgctggaggc cgacggccgc 360 gccacgctcg cgcaactggc ccaggcgacc ggactgtccg tctccgccgc ccagtcgcgc 420 gtgcagaagc tggagaagcg cggcatcatc aagggataca aggccatcat cgaccaa 477 <210> 34 <211> 441 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of SP6 with promoter <400> 34 gttcgggtcc gggtgcggac gccatcttgc gtccgtgcga gcttttcgtg cctcttctgt 60 ccttggaagc tgacgtgttt tgattttcac gaatgacgcg ataattacgt tttcgggatg 120 ctccttagcc gtattcgctc gtcgttctgc aagacccatc aagaaatgtg cattggttac 180 cggttcgccc gtacaggatg aacgtcggca tgtgcgattt ggaagatgct ggctacgttg 240 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ataccaagat ggcgtgttgc cgaagaatgt 120 gtataataaa agatgttatc gcaaccatag ctacaaagtg gcgaaacaaa gccgttttgt 180 gactactgaa ccatagagtg atggttcacg atagcatgac gacgaggaga gttgccatgc 240 tgttgtggtg acaatcactg cagaccgccg aaaggcgatc caaggaagga gaacagaacg 300 atgaagttca ccgttgctaa gaaggccatt gcacttaccg gtgcggttgc catgctgggt 360 tccgttgccg cctgcggttc cgacaccgcc agtggcaagc cggctcaaga taaggacgtt 420 accgaaatca ccgtgtgggc ttgggagccc acgctg 456 <210> 40 <211> 471 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of SP12 with promoter <400> 40 gcgttacttc catgttcgct tttgtttgat ttgctcgaca cgccggaata atcattgata 60 ttaagccaat tcaagcacgt tattcatagt cgaatcacag tctcgaaccc gtttgatgtg 120 agaaaaaacg cgaaaatgcg aaagcgcttt tgcaaaaact tccatgttcg tttatattga 180 gaaaaggctt tcgcagtgtt acctgctccg ggcaaaggag cgagcagggc gaaaccaagg 240 aggcggaccg tccgccaccg cctctcatag ttgagcggat atatagagaa agaagcgaac 300 atggtgtctt tcaataaact gacccgtact cttgctggca tcgctgccgc cgcgttgatc 360 gttccgctgg ccgcctgtgg tggctccggc aatggtggca 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tagttaccaa tagtcattac 180 cataagtaac tatatgcagg ctctagacaa acccaacggc ctgcgcgccc gtgtcgagtt 240 ccgtttcgac ataaaaaagc cagggaatcc ctggcttgca atgcacatat cgctgcagat 300 ttgccgggac ctatatgtcc ccggcaacaa cagccgtata tacgctaccg atcagtgctg 360 ccctcatcat ccttggcacc tgccgtggcg gcctcagtct ccttggcgtt ccacccggcg 420 acggcattcc aaccactcca tccgatgacc actagcaagc acagcgagaa gacaatagtg 480 gcccaa 486 <210> 43 <211> 400 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of SP15 with promoter <400> 43 accggcacct gcgccggcga taatgcgcac cggcccttgc aacgtagtcg cggcggtacg 60 ctgccgctca tcgagcccct caagaatccc ctgcgcctgt tccatgcgtc cattgtggca 120 cgattcgcgc tcacggcacg actcatgcct atggctgaat cgggctcacg acaaaacatc 180 gccagaatca tgcgttttgc gtgtcattct gcggtgcgaa tcgccacgga tgtattagtg 240 tggaagggtg atgaaacgta gcgattatat gttggcggca ctcgcctcag ccgtcctgcc 300 gaatctgggg gtggccggcg tacgcgagaa cgtgcaggcc agcgcaaccg acgaggccaa 360 aggcatcgat cagaccgtga ttcaagatgc ctcaggcaag 400 <210> 44 <211> 435 <212> DNA <213> 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aaaaaaaata ggagataaaa gcaacttacg atatattgaa 3120 ttaacaatta ttattcagca agaaatggta ccgtggaatc atcctcccaa acaagaattt 3180 atttatggag aatggttaca agagctttat gaacaaggat acattcctca gaaggaatta 3240 aattcagatt taaccataat gctttaccaa gcaaaacgaa aaaataaaag aatatacgga 3300 aattatgact tagaggaatt actacctgat attccatttt ctgatgtgag aagagccatt 3360 atggattcgt cagaggaatt aatagataat tatcaggatg atgaaaccaa ctctatatta 3420 actttatgcc gtatgatttt aactatggac acgggtaaaa tcataccaaa agatattgcg 3480 ggaaatgcag tggctgaatc ttctccatta gaacataggg agagaatttt gttagcagtt 3540 cgtagttatc ttggagagaa tattgaatgg actaatgaaa atgtaaattt aactataaac 3600 tatttaaata acagattaaa aaaattataa aaaaattgaa aaaatggtgg aaacactttt 3660 ttcaattttt ttagatcttg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 3720 gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 3780 tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 3840 agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 3900 ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 3960 taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 4020 gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 4080 gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 4140 ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 4200 ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 4260 gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 4320 caagaagatc ctttgatctt ttctac 4346 <210> 49 <211> 4484 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of pSP3B-hIL18mut <400> 49 ggatccgtct tcctgctggc ctatgcattg ggttccgcag tgcccactcc aggcggtctg 60 ggcggtgtgg aagcggcgct gacattcgcg ttcgtggcgg tcggagtgcc gcagggcgtg 120 gcgctttccg ccactttgct gcaccgcgtg gtgttctact ggctgcgcat tccgctgggc 180 gcggcggcca tgaagtggct tgacaagcat aatcttgtct gattcgtcta ttttcatacc 240 cccttcgggg aaatagatgt gaaaaccctt ataaaacgcg ggttttcgca gaaacatgcg 300 ctagtatcat tgatgacaac atggactaag caaaagtgct tgtcccctga cccaagaagg 360 atgctttatg ttcaataagc gacacatcgt ccgtaccatt gcggccaccg ccagcatcct 420 ggctctgtcg ttcaccgcag cctgcggttc cggccagtcc accgcatcca attccaccga 480 ttcggacgac atcacccagc agacgtacaa gccgggcaag ctgaccatcg cctacttcgg 540 caagctggcc tccaagctgt ccgtgatccg taacctgaac gaccaggtgc tgttcatcga 600 ccagggcaac cgtccgctgt tcgaagatat gaccgactcc gattgccgcg acaacgcccc 660 gcgtaccatc ttcatcatct cgatgtacgc cgattcccag ccgcgtggca tggccgtgac 720 catctccgtc aagtgcgaga agatcagcac cctgagctgc gaaaacaaga tcatctcctt 780 caaggagatg aacccgccgg acaacatcaa ggataccaag agcgacatca tcttcttcca 840 gcgctccgtg ccgggccacg acaacaagat gcagttcgag tccagctcgt acgaaggcta 900 cttcctggcc tgcgagaagg aacgcgacct gttcaagctg atcctgaaga aggaagacga 960 actgggcgac cgtagcatca tgttcaccgt ccagaacgag gattgatgac cttctgctcg 1020 tagcgattac ttcgagcatt actgacgaca aagaccccga ccgagatggt cggggtcttt 1080 ttgttgtggt gctgtgacgt gttgtccaac cgtattattc cggactagtc ctccaggacc 1140 tcgtctacga ggcgctgagc gaggaatggc gcaaaaggga cggcgagatc agcgacccat 1200 gggccaacga cgaggcggac ggataccagc cgccctcata cgagccggtc aaccccgaac 1260 gcaggactcc ccagacgccc tccgatggcc tgatctgacg tccgaaaaaa ggcgctgtgc 1320 gcccttttta aatcttttat aaatcttttt acattctttt agcccctccg cagccttact 1380 ctcccaacgg gtttcagccg aaacctacac caaaagggga gcgaacctac accaaaaggg 1440 gagcgaacct acaccaaaag gggagcgaac ctacaccaaa aggggagcta tatacacctt 1500 ttgttattta aggtgcaagt tgtgctatgc tgaggccatg tccaatgaga tcgtgaagtt 1560 cagcaaccag ttcaacaacg tcgcgctgaa gaagttcgac gccgtgcacc tggacgtgct 1620 catggcgatc gcctcaaggg tgagggagaa gggcacggcc acggtggagt tctcgttcga 1680 ggagctgcgc ggcctcatgc gattgaggaa gaacctgacc aacaagcagc tggccgacaa 1740 gatcgtgcag acgaacgcgc gcctgctggc gctgaactac atgttcgagg attcgggcaa 1800 gatcatccag ttcgcgctgt tcacgaagtt cgtcaccgac ccgcaggagg cgactctcgc 1860 ggttggggtc aacgaggagt tcgcgttcct gctcaacgac ctgaccagcc agttcacgcg 1920 cttcgagctg gccgagttcg ccgacctcaa gagcaagtac gccaaggagt tctaccgcag 1980 ggccaagcag taccgcagct ccggaatctg gaagatcggc cgcgacgagt tctgccgact 2040 gcttggcgtt ccaccgtcgg caataaccca gacacgatat ctgaatcaga aggttcttca 2100 gccaattcag gaggagtgtg ggcctctcct tggcctgaag atcgagcgcc agtacgtgaa 2160 acgcaggctg tcgggcttcg tgttcacatt cgcccgcgag acccctccgg tgatcgacgc 2220 caggcccgtg gaggcgagga agacggacgg cgacggcaag ggccattgga cgagcgttgc 2280 cgggtacggc gaggtgttca cgaccacggc gttgttcgac gtgacggccg cccgggctca 2340 cttcgacggc accgttgaag ccggggagtg ccgtttctgc gcgtttgacg cgcgcaaccg 2400 cgaacatcat gcgcggaacg ccggaaggct gttctagcgg ccgtgtccgc gcctctgggg 2460 cggttgcgcc tgccatgggt cgatctgccg ctgttcggcc tcacgctggt ctgtgcgctg 2520 cctgatctcc ctgagcaggt cggccttggt cctgggggcg cttcgctcct cgaacgggcc 2580 gctctccccc aggtcctcgg gctcgctcag gtccaacggc tcgtcaccgg acggctcggg 2640 ccggttctct ccctgtgccg ggttctccgc ctgtgcgcgt tgttcggcca tgcgcagtgc 2700 gagggccttc acctgttcgg ggcttgtcga ctcgattttc gttcgtgaat acatgttata 2760 ataactataa ctaataacgt aacgtgactg gcaagagata tttttaaaac aatgaatagg 2820 tttacactta ctttagtttt atggaaatga aagatcatat catatataat ctagaataaa 2880 attaactaaa ataattatta tctagataaa aaatttagaa gccaatgaaa tctataaata 2940 aactaaatta agtttattta attaacaact atggatataa aataggtact aatcaaaata 3000 gtgaggagga tatatttgaa tacatacgaa caaattaata aagtgaaaaa aatacttcgg 3060 aaacatttaa aaaataacct tattggtact tacatgtttg gatcaggagt tgagagtgga 3120 ctaaaaccaa atagtgatct tgacttttta gtcgtcgtat ctgaaccatt gacagatcaa 3180 agtaaagaaa tacttataca aaaaattaga cctatttcaa aaaaaatagg agataaaagc 3240 aacttacgat atattgaatt aacaattatt attcagcaag aaatggtacc gtggaatcat 3300 cctcccaaac aagaatttat ttatggagaa tggttacaag agctttatga acaaggatac 3360 attcctcaga aggaattaaa ttcagattta accataatgc tttaccaagc aaaacgaaaa 3420 aataaaagaa tatacggaaa ttatgactta gaggaattac tacctgatat tccattttct 3480 gatgtgagaa gagccattat ggattcgtca gaggaattaa tagataatta tcaggatgat 3540 gaaaccaact ctatattaac tttatgccgt atgattttaa ctatggacac gggtaaaatc 3600 ataccaaaag atattgcggg aaatgcagtg gctgaatctt ctccattaga acatagggag 3660 agaattttgt tagcagttcg tagttatctt ggagagaata ttgaatggac taatgaaaat 3720 gtaaatttaa ctataaacta tttaaataac agattaaaaa aattataaaa aaattgaaaa 3780 aatggtggaa acactttttt caattttttt agatcttgag caaaaggcca gcaaaaggcc 3840 aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 3900 catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 3960 caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 4020 ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 4080 aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 4140 gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 4200 cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 4260 ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta 4320 tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 4380 tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 4440 cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctac 4484 <210> 50 <211> 3863 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of pBEshuttle <400> 50 ggatccgtct tcctgctggc ctatgcattg ggttccgcag tgcccactcc aggcggtctg 60 ggcggtgtgg aagcggcgct gacattcgcg ttcgtggcgg tcggagtgcc gcagggcgtg 120 gcgctttccg ccactttgct gcaccgcgtg gtgttctact ggctgcgcat tccgctgggc 180 gcggcggcca tgaagtggct tgacaagcat aatcttgtct gattcgtcta ttttcatacc 240 cccttcgggg aaatagatgt gaaaaccctt ataaaacgcg ggttttcgca gaaacatgcg 300 ctagtatcat tgatgacaac atggactaag caaaagtgct tgtcccctga cccaagaagg 360 atgctttatg aagcttatcc tgcagtgacc ttctgctcgt agcgattact tcgagcatta 420 ctgacgacaa agaccccgac cgagatggtc ggggtctttt tgttgtggtg ctgtgacgtg 480 ttgtccaacc gtattattcc ggactagtcc tccaggacct cgtctacgag gcgctgagcg 540 aggaatggcg caaaagggac ggcgagatca gcgacccatg ggccaacgac gaggcggacg 600 gataccagcc gccctcatac gagccggtca accccgaacg caggactccc cagacgccct 660 ccgatggcct gatctgacgt ccgaaaaaag gcgctgtgcg ccctttttaa atcttttata 720 aatcttttta cattctttta gcccctccgc agccttactc tcccaacggg tttcagccga 780 aacctacacc aaaaggggag cgaacctaca ccaaaagggg agcgaaccta caccaaaagg 840 ggagcgaacc tacaccaaaa ggggagctat atacaccttt tgttatttaa ggtgcaagtt 900 gtgctatgct gaggccatgt ccaatgagat cgtgaagttc agcaaccagt tcaacaacgt 960 cgcgctgaag aagttcgacg ccgtgcacct ggacgtgctc atggcgatcg cctcaagggt 1020 gagggagaag ggcacggcca cggtggagtt ctcgttcgag gagctgcgcg gcctcatgcg 1080 attgaggaag aacctgacca acaagcagct ggccgacaag atcgtgcaga cgaacgcgcg 1140 cctgctggcg ctgaactaca tgttcgagga ttcgggcaag atcatccagt tcgcgctgtt 1200 cacgaagttc gtcaccgacc cgcaggaggc gactctcgcg gttggggtca acgaggagtt 1260 cgcgttcctg ctcaacgacc tgaccagcca gttcacgcgc ttcgagctgg ccgagttcgc 1320 cgacctcaag agcaagtacg ccaaggagtt ctaccgcagg gccaagcagt accgcagctc 1380 cggaatctgg aagatcggcc gcgacgagtt ctgccgactg cttggcgttc caccgtcggc 1440 aataacccag acacgatatc tgaatcagaa ggttcttcag ccaattcagg aggagtgtgg 1500 gcctctcctt ggcctgaaga tcgagcgcca gtacgtgaaa cgcaggctgt cgggcttcgt 1560 gttcacattc gcccgcgaga cccctccggt gatcgacgcc aggcccgtgg aggcgaggaa 1620 gacggacggc gacggcaagg gccattggac gagcgttgcc gggtacggcg aggtgttcac 1680 gaccacggcg ttgttcgacg tgacggccgc ccgggctcac ttcgacggca ccgttgaagc 1740 cggggagtgc cgtttctgcg cgtttgacgc gcgcaaccgc gaacatcatg cgcggaacgc 1800 cggaaggctg ttctagcggc cgtgtccgcg cctctggggc ggttgcgcct gccatgggtc 1860 gatctgccgc tgttcggcct cacgctggtc tgtgcgctgc ctgatctccc tgagcaggtc 1920 ggccttggtc ctgggggcgc ttcgctcctc gaacgggccg ctctccccca ggtcctcggg 1980 ctcgctcagg tccaacggct cgtcaccgga cggctcgggc cggttctctc cctgtgccgg 2040 gttctccgcc tgtgcgcgtt gttcggccat gcgcagtgcg agggccttca cctgttcggg 2100 gcttgtcgac tcgattttcg ttcgtgaata catgttataa taactataac taataacgta 2160 acgtgactgg caagagatat ttttaaaaca atgaataggt ttacacttac tttagtttta 2220 tggaaatgaa agatcatatc atatataatc tagaataaaa ttaactaaaa taattattat 2280 ctagataaaa aatttagaag ccaatgaaat ctataaataa actaaattaa gtttatttaa 2340 ttaacaacta tggatataaa ataggtacta atcaaaatag tgaggaggat atatttgaat 2400 acatacgaac aaattaataa agtgaaaaaa atacttcgga aacatttaaa aaataacctt 2460 attggtactt acatgtttgg atcaggagtt gagagtggac taaaaccaaa tagtgatctt 2520 gactttttag tcgtcgtatc tgaaccattg acagatcaaa gtaaagaaat acttatacaa 2580 aaaattagac ctatttcaaa aaaaatagga gataaaagca acttacgata tattgaatta 2640 acaattatta ttcagcaaga aatggtaccg tggaatcatc ctcccaaaca agaatttatt 2700 tatggagaat ggttacaaga gctttatgaa caaggataca ttcctcagaa ggaattaaat 2760 tcagatttaa ccataatgct ttaccaagca aaacgaaaaa ataaaagaat atacggaaat 2820 tatgacttag aggaattact acctgatatt ccattttctg atgtgagaag agccattatg 2880 gattcgtcag aggaattaat agataattat caggatgatg aaaccaactc tatattaact 2940 ttatgccgta tgattttaac tatggacacg ggtaaaatca taccaaaaga tattgcggga 3000 aatgcagtgg ctgaatcttc tccattagaa catagggaga gaattttgtt agcagttcgt 3060 agttatcttg gagagaatat tgaatggact aatgaaaatg taaatttaac tataaactat 3120 ttaaataaca gattaaaaaa attataaaaa aattgaaaaa atggtggaaa cacttttttc 3180 aattttttta gatcttgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 3240 ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 3300 agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 3360 tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 3420 ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 3480 gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 3540 ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 3600 gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 3660 aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg 3720 aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 3780 ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 3840 gaagatcctt tgatcttttc tac 3863 <210> 51 <211> 4319 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of pTNF3 <400> 51 ggatccgtct tcctgctggc ctatgcattg ggttccgcag tgcccactcc aggcggtctg 60 ggcggtgtgg aagcggcgct gacattcgcg ttcgtggcgg tcggagtgcc gcagggcgtg 120 gcgctttccg ccactttgct gcaccgcgtg gtgttctact ggctgcgcat tccgctgggc 180 gcggcggcca tgaagtggct tgacaagcat aatcttgtct gattcgtcta ttttcatacc 240 cccttcgggg aaatagatgt gaaaaccctt ataaaacgcg ggttttcgca gaaacatgcg 300 ctagtatcat tgatgacaac atggactaag caaaagtgct tgtcccctga cccaagaagg 360 atgctttatg gtgcgctcct cctcccgtac cccgtccgat aagccggtcg cccatgtggt 420 cgccaacccg caggccgagg gccagctgca gtggctgaac cgtcgcgcca acgccctgct 480 ggccaacggc gtggaactgc gcgacaacca gctggtcgtg ccgtccgagg gcctgtacct 540 gatctactcc caggtgctgt tcaagggcca gggctgcccg tccacccacg tcctgctgac 600 ccataccatc tcccgcatcg ccgtgtccta ccagaccaag gtcaacctgc tgtccgccat 660 caagtccccg tgccagcgtg agaccccgga aggcgccgag gccaagccgt ggtacgaacc 720 gatctacctg ggcggcgtgt tccagctgga aaagggcgat cgtctgtccg ccgagatcaa 780 ccgtccggac tacctggatt tcgccgagtc cggccaggtc tacttcggca tcatcgccct 840 gtgaccttct gctcgtagcg attacttcga gcattactga cgacaaagac cccgaccgag 900 atggtcgggg tctttttgtt gtggtgctgt gacgtgttgt ccaaccgtat tattccggac 960 tagtcctcca ggacctcgtc tacgaggcgc tgagcgagga atggcgcaaa agggacggcg 1020 agatcagcga cccatgggcc aacgacgagg cggacggata ccagccgccc tcatacgagc 1080 cggtcaaccc cgaacgcagg actccccaga cgccctccga tggcctgatc tgacgtccga 1140 aaaaaggcgc tgtgcgccct ttttaaatct tttataaatc tttttacatt cttttagccc 1200 ctccgcagcc ttactctccc aacgggtttc agccgaaacc tacaccaaaa ggggagcgaa 1260 cctacaccaa aaggggagcg aacctacacc aaaaggggag cgaacctaca ccaaaagggg 1320 agctatatac accttttgtt atttaaggtg caagttgtgc tatgctgagg ccatgtccaa 1380 tgagatcgtg aagttcagca accagttcaa caacgtcgcg ctgaagaagt tcgacgccgt 1440 gcacctggac gtgctcatgg cgatcgcctc aagggtgagg gagaagggca cggccacggt 1500 ggagttctcg ttcgaggagc tgcgcggcct catgcgattg aggaagaacc tgaccaacaa 1560 gcagctggcc gacaagatcg tgcagacgaa cgcgcgcctg ctggcgctga actacatgtt 1620 cgaggattcg ggcaagatca tccagttcgc gctgttcacg aagttcgtca ccgacccgca 1680 ggaggcgact ctcgcggttg gggtcaacga ggagttcgcg ttcctgctca acgacctgac 1740 cagccagttc acgcgcttcg agctggccga gttcgccgac ctcaagagca agtacgccaa 1800 ggagttctac cgcagggcca agcagtaccg cagctccgga atctggaaga tcggccgcga 1860 cgagttctgc cgactgcttg gcgttccacc gtcggcaata acccagacac gatatctgaa 1920 tcagaaggtt cttcagccaa ttcaggagga gtgtgggcct ctccttggcc tgaagatcga 1980 gcgccagtac gtgaaacgca ggctgtcggg cttcgtgttc acattcgccc gcgagacccc 2040 tccggtgatc gacgccaggc ccgtggaggc gaggaagacg gacggcgacg gcaagggcca 2100 ttggacgagc gttgccgggt acggcgaggt gttcacgacc acggcgttgt tcgacgtgac 2160 ggccgcccgg gctcacttcg acggcaccgt tgaagccggg gagtgccgtt tctgcgcgtt 2220 tgacgcgcgc aaccgcgaac atcatgcgcg gaacgccgga aggctgttct agcggccgtg 2280 tccgcgcctc tggggcggtt gcgcctgcca tgggtcgatc tgccgctgtt cggcctcacg 2340 ctggtctgtg cgctgcctga tctccctgag caggtcggcc ttggtcctgg gggcgcttcg 2400 ctcctcgaac gggccgctct cccccaggtc ctcgggctcg ctcaggtcca acggctcgtc 2460 accggacggc tcgggccggt tctctccctg tgccgggttc tccgcctgtg cgcgttgttc 2520 ggccatgcgc agtgcgaggg ccttcacctg ttcggggctt gtcgactcga ttttcgttcg 2580 tgaatacatg ttataataac tataactaat aacgtaacgt gactggcaag agatattttt 2640 aaaacaatga ataggtttac acttacttta gttttatgga aatgaaagat catatcatat 2700 ataatctaga ataaaattaa ctaaaataat tattatctag ataaaaaatt tagaagccaa 2760 tgaaatctat aaataaacta aattaagttt atttaattaa caactatgga tataaaatag 2820 gtactaatca aaatagtgag gaggatatat ttgaatacat acgaacaaat taataaagtg 2880 aaaaaaatac ttcggaaaca tttaaaaaat aaccttattg gtacttacat gtttggatca 2940 ggagttgaga gtggactaaa accaaatagt gatcttgact ttttagtcgt cgtatctgaa 3000 ccattgacag atcaaagtaa agaaatactt atacaaaaaa ttagacctat ttcaaaaaaa 3060 ataggagata aaagcaactt acgatatatt gaattaacaa ttattattca gcaagaaatg 3120 gtaccgtgga atcatcctcc caaacaagaa tttatttatg gagaatggtt acaagagctt 3180 tatgaacaag gatacattcc tcagaaggaa ttaaattcag atttaaccat aatgctttac 3240 caagcaaaac gaaaaaataa aagaatatac ggaaattatg acttagagga attactacct 3300 gatattccat tttctgatgt gagaagagcc attatggatt cgtcagagga attaatagat 3360 aattatcagg atgatgaaac caactctata ttaactttat gccgtatgat tttaactatg 3420 gacacgggta aaatcatacc aaaagatatt gcgggaaatg cagtggctga atcttctcca 3480 ttagaacata gggagagaat tttgttagca gttcgtagtt atcttggaga gaatattgaa 3540 tggactaatg aaaatgtaaa tttaactata aactatttaa ataacagatt aaaaaaatta 3600 taaaaaaatt gaaaaaatgg tggaaacact tttttcaatt tttttagatc ttgagcaaaa 3660 ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc 3720 cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca 3780 ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 3840 accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 3900 catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 3960 gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 4020 tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc 4080 agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac 4140 actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga 4200 gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc 4260 aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctac 4319

Claims (35)

1. 형질전환 혐기성균 제작용의 형질전환용 플라스미드로서, 혐기성균에서 기능하는 분비 시그널, 프로모터, 혐기적질환의 진단 또는 치료에 유용한 단백질을 코딩하는 적어도 1종의 유전자 또는 핵산, 터미네이터를 포함하는 발현카세트를 가지고, 그 분비 시그널이 서열번호 8의 염기서열로 코딩되는 분비 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA인, 형질전환용 플라스미드.
2. 제1항에 있어서,
   발현카세트에 포함되는 프로모터 유전자가 서열번호 45의 염기서열인 형질전환용 플라스미드.
3. 제1항에 있어서,
   발현카세트에 포함되는 터미네이터 유전자가 서열번호 46의 염기서열로 표시되는 DNA인 형질전환용 플라스미드.
4. 제1항에 있어서,
   발현카세트에 포함되는 적어도 1종의 유전자 또는 핵산이 항종양 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자인 형질전환용 플라스미드.
5. 제4항에 있어서,
   항종양 활성을 가지는 단백질이 종양괴사인자(TNF)-α 및 인터류킨(IL)-18로 이루어지는 군에서 선택되는 1종인 형질전환용 플라스미드.
6. 제5항에 있어서,
   항종양 활성을 가지는 단백질이 종양괴사인자(TNF)-α인 형질전환용 플라스미드.
7. 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 형질전환용 플라스미드(pBifi-SP3B-TNF alpha).
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 형질전환용 플라스미드로 형질전환된 혐기성균으로 이루어지는 유전자 수송 담체.
9. 제8항에 있어서,
   혐기성균이 비피도박테리움속 세균인 유전자 수송 담체.
10. 제9항에 있어서,
    비피도박테리움속 세균이 비피도박테리움 롱검인 유전자 수송 담체.
11. 제8항에 있어서,
    혐기적 환경하에 있는 종양조직 내에서 생육할 수 있고, 적어도 1종의 혐기적질환의 치료에 유용한 단백질을 발현하고 분비할 수 있는 유전자 수송 담체.
12. 제11항에 있어서,
    혐기적질환의 치료에 유용한 단백질이 항종양 활성을 가지는 단백질인 유전자 수송 담체.
13. 제12항에 있어서,
    항종양 활성을 가지는 단백질이 종양괴사인자(TNF)-α 또는 IL-18인 유전자 수송 담체.
14. 제8항에 기재된 유전자 수송 담체를 함유하는 의약 조성물.
15. 제14항에 있어서,
    유전자 수송 담체가, 형질전환된 Bifidobacterium longum인 의약 조성물.
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