KR20220012324A - 박테리아의 변형을 위해 최적화된 유전자 도구 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 퍼미큐테스 문에 속하는 박테리아의 형질전환 및 유전자 변형에 관한 것이다. 따라서, 특히 박테리아의 형질전환을 용이하게 하는데 사용되는 핵산 서열을 포함하여, 이러한 유전자 변형을 허용하는 방법, 도구, 및 키트에 관한 것이고, 상기 서열은 i) 서열 SEQ ID NO: 126의 전부 또는 일부, 및 ii) 박테리아의 유전 물질의 변형 및/또는 박테리아 내에서, 박테리아의 야생형 형태 내에 존재하는 유전 물질에 부분적으로 또는 전체로 부재하는 DNA 서열의 발현을 허용하는 서열을 포함한다. 본 설명은 또한 특히 바람직하게 산업적 규모로, 용매를 생성하기 위한, 수득된 유전자 변형된 박테리아 및 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 박테리아, 특히 퍼미큐테스 (Firmicutes) 문에 속하는 박테리아로서, 전형적으로 용매형성성 박테리아, 예를 들어, 클로스트리듐 (Clostridium) 속, 바람직하게 야생 상태에서 박테리아 염색체 및 염색체 DNA와 상이한 적어도 하나의 DNA 분자 (또는 천연 플라스미드) 둘 모두를 보유하는 박테리아의 유전자 변형 및 형질전환에 관한 것이다. 따라서, 특히 박테리아의 형질전환을 용이하게 하는데 사용되는 핵산 서열을 포함하여, 이러한 유전자 변형을 허용하는 방법, 도구, 및 키트에 관한 것이로, 상기 서열은 i) 서열 SEQ ID NO: 126의 전부 또는 일부, 및 ii) 박테리아의 유전 물질의 변형 및/또는 상기 박테리아의 야생형 형태 내에 서 존재하는 유전 물질에 부분적으로 또는 전체적으로 부재하는 DNA 서열의 상기 박테리아 내에서의 발현을 허용하는 서열을 포함한다. 본 설명은 또한 바람직하게 산업적 규모로, 특히 용매를 생성시키기 위한, 수득된 유전자 변형 박테리아 및 이의 용도에 관한 것이다.
클로스트리듐 속은 퍼미큐테스 문에 속하는, 그람-양성, 엄격 혐기성, 및 포자-형성 박테리아를 함유한다. 클로스트리디아는 몇가지 이유로 과학 공동체에게 중요한 그룹이다. 첫째로 소정 수의 중증 질환 (예를 들어, 파상풍, 보툴리눔 식중독)은 이러한 과의 병원성 구성원에 의한 감염에 기인한다 (John & Wood, 1986; Gonzales et al., 2014). 두번째는 생명공학에서 산형성성 또는 용매형성성 균주의 사용 가능성이다 (Moon et al., 2016). 이들 비-병원성 클로스트리디아는 광범위하게 다양한 당을 전환시켜서 관심 화학종, 보다 특히 ABE 발효라고 불리는 과정에서 아세톤, 부탄올, 및 에탄올 (John & Wood, 1986)을 생성시키는 능력을 천연적으로 보유한다. 유사하게, IBE 발효는 이들 균주의 게놈 내에, 2차 알콜 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 존재 덕분에 (s-ADH; Ismael et al., 1993, Hiu et al., 1987), 아세톤이 다양한 비율로 이소프로판올로 환원되는 동안 (Chen et al., 1986, George et al., 1983), 소정의 특정 종에서 가능하다.
클로스트리디아의 용매형성성 종은 현대 시퀀싱 기술의 출현 전에 그들을 분류하는 것을 어렵게 만든, 중요한 표현형적 유사성을 갖는다 (Rogers et al., 2006). 이들 박테리아의 전체 게놈의 시퀀싱 가능성으로, 이제 다음의 4가지 주요한 종으로 이 박테리아 속을 분류하는 것이 가능하다: 씨. 아세토부틸리쿰 (C. acetobutylicum), 씨. 사카로퍼부틸아세토니쿰 (C. saccharoperbutylacetonicum), 씨. 사카로부틸리쿰 (C. saccharobutylicum) 및 씨. 베이제링키이 (C. beijerinckii). 최근의 공개물은 30개 균주의 전체 게놈의 비교 분석 이후에, 이들 용매형성성 클로스트리디아를 4개의 주요 분기군으로 분류한다고 제안한다 (도 1).
특히, 이들 군은 씨. 아세토부틸리쿰 및 씨. 베이제링키이 종을 개별 기준 씨. 아세토부틸리쿰 ATCC 824 (DSM 792 또는 LMG 5710으로서 지정) 및 씨. 베이제링키이 NCIMB 8052로서 분리한다. 후자는 ABE 발효를 조사하기 위한 모델 균주이다.
천연적으로 IBE 발효를 실시할 수 있는 클로스트리듐 균주는 그 수가 적고 주로 클로스트리듐 베이제링키이 종에 속한다 (참조: Zhang et al., 2018, 표 1). 이들 균주는 전형적으로 씨. 부틸리쿰 (C. butylicum) LMD 27.6, 씨. 아우란티부틸리쿰 (C. aurantibutylicum) NCIB 10659, 씨. 베이제링키이 (C. beijerinckii) LMD 27.6, 씨. 베이제링키이 (C. beijerinckii) VPI2968, 씨. 베이제링키이 (C. beijerinckii) NRRL B-593, 씨. 베이제링키이 (C. beijerinckii) ATCC 6014, 씨. 베이제링키이 (C. beijerinckii) McClung 3081, 씨. 이소프로필리쿰 (C. isopropylicum) IAM 19239, 씨. 베이제링키이 (C. beijerinckii) DSM 6423, C. sp. A1424, 씨. 베이제링키이 옵티노이이 (C. beijerinckii optinoii), 및 씨. 베이제링키이 (C. beijerinckii) BGS1 균주로부터 선택된다.
그들이 1세기 넘게 산업에서 사용되어 왔지만, 특히, 클로스트리듐 속에 속하는, 박테리아에 관한 지식은 오랜 시간 동안 그들을 유전자 변형시키는데서 마주하는 어려움으로 인해 제한적이었다. 다양한 유전자 도구들니 이러한 속의 균주를 최적화시키기 위해 최근 수년 동안 개발되어왔는데, 최신 세대는 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated 단백질) 기술의 사용을 기반으로 한다. 이 방법은 RNA의 분자에 의해 가이드되고, DNA 분자 (관심 표적 서열) 내에서 이중-가닥 파단을 수행하게 되는, 뉴클레아제 (전형적으로, CRISPR/Cas 유전자 도구의 경우에 Cas 유형의 뉴클레아제, 예컨대 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)의 단백질 Cas9)라고 불리는 효소의 사용을 기반으로 한다. 가이드 RNA (gRNA)의 서열은 뉴클레아제의 절단 부위를 결정하게 되어서, 매우 높은 특이성을 부여하게 된다 (도 1).
필수 DNA 분자 내에서 이중-가닥 파단은 유기체에 치명적이므로, 후자의 생존은 이것을 복구하는 이의 능력에 의존적일 것이다 (참조: 예를 들어, Cui & Bikard, 2016). 클로스트리듐 속의 박테리아에서, 이중-가닥 파단의 복구는 절단된 서열의 온전한 카피를 요구하는 상동성 재조합 기전에 의존적이다. 본래 서열을 변형시키면서 이러한 복구를 실시하도록 허용하는 DNA 단편을 박테리아에 공급하여서, 미생물이 이의 게놈에 바람직한 변화를 통합시키게 만드는 것이 가능하다. 수행된 변화는 표적 서열 또는 PAM 부위의 변형을 통해서, Cas9-gRNA 리보뉴클레오단백질에 의한 게놈 DNA의 표적화를 더 이상 허용하지 않게 한다 (도 2).
다양한 접근법이 클로스트리듐 속의 박테리아에서 이러한 유전자 도구를 기능성으로 만들고자 시도하기 위해 기술되었다. 실제로 이들 미생물은 그들의 낮은 형질전환 및 상동성 재조합 빈도때문에 유전자 변형이 어려운 것으로 알려져 있다. 일부 접근법은 씨. 베이제링키이 (C. beijerinckii) 및 씨. 융달리이 (C. ljungdahlii)에서 항상적으로 발현 (Wang et al., 2015; Huang et al., 2016)되거나, 또는 씨. 베이제링키이 (C. beijerinckii), 씨. 사카로퍼부틸아세토니쿰 (C. saccharoperbutylacetonicum) 및 씨. 아우토에타노게눔 (C. authoethanogenum)에서 유도성 프로모터의 제어 하 에 있는, Cas9의 사용을 기반으로 한다 (Wang et al., 2016; Nagaraju et al., 2016; Wang et al., 2017). 다른 저자들은 게놈 내에서, 이중-가닥 파단대신에, 단일-가닥 파단을 수행하는, 뉴클레아제의 변형된 형태, Cas9n의 사용을 기술하였다 (Xu et al., 2015; Li et al., 2016). 이러한 선택은 Cas9의 독성이 너무 높아서 이것을 시험된 실험 조건 하에서 클로스트리듐 속의 박테리아에서 사용할 수 없다는 관찰에 기인한다. 상기 기술된 대부분의 도구는 단일 플라스미드의 사용을 기반으로 한다. 마지막으로, 그들이 예를 들어, 씨. 파스퇴리아눔 (C. pasteurianum)에서 처럼, 미생물의 게놈에서 확인되었을 때 내생성 CRISPR/Cas 시스템을 사용하는 것이 가능하다 (Pyne et al., 2016).
(상기 기술된 마지막 경우에서 처럼) 그들이 변형시키고자 하는 균주의 내생성 기전을 이용하지 않으면, CRISPR 기술을 기반으로 하는 도구는 박테리아 게놈에 삽입시킬 수 있는 관심 핵산의 크기 (및 그러므로 코딩 서열 또는 유전자의 수)([Xu et al., 2015]에 따라서 최선으로 약 1.8 kb))를 상당히 제한하는 주요 단점을 갖는다.
본 발명자는 2종의 상이한 핵산, 전형적으로 2종의 플라스미드의 사용을 기반으로, 클로스트리듐 속의 박테리아에 적합한, 박테리아를 변형하기 위한 보다 강력한 유전자 도구를 개발하였고 기술하였으며 (WO2017064439, Wasels et al., 2017 및 도 3), 이는 특히 이 문제를 해결한다. 특정 구현예에서, 이 도구의 제1 핵산은 cas9 및 변형에 특이적인 제2 핵산의 발현이 실시되게 허용하고, 하나 이상의 gRNA 발현 카세트뿐만 아니라 관심 서열로 Cas9에 의해 표적화되는 박테리아 DNA의 일부분의 치환을 허용하는 복구 매트릭스를 함유한다.
시스템의 독성은 유도성 프로모터의 제어 하에 cas9 및/또는 gRNA 발현 카세트(들)가 위치되게 하여 제한된다. 본 발명자는 최근에 이러한 도구를 개선하여서, 형질전환 효율을 매우 유의하게 증가시켰고, 그리하여 유용한 수 및 분량으로 (특히, 산업적 규모로 생산을 위한 강건한 균주의 선택 관점에서), 관심 유전자 변형 박테리아를 수득하였다 (참조: FR 18/548356). 이러한 개선된 도구에서 적어도 하나의 핵산은 유도성 프로모터의 제어 하에 위치된 항-CRISPR 단백질을 코딩하는 서열 ("acr")을 포함한다. 이러한 항-CRISPR 단백질은 DNA 엔도뉴클레아제/가이드 RNA 복합체의 활성을 억제하는 것을 가능하게 만든다. 단백질의 발현은 박테리아의 형질전환 단계 동안에만 이의 발현을 허용하도록 조절된다.
본 발명자는 또한 아주 최근에, 야생 상태에서, 하나 이상의 항생제에 대한 내성을 박테리아에게 부여하는 유전자를 포함하는 박테리아를, 상기 항생제(들)에 대해 그들을 감수성이게 만들어서, 적어도 2종 핵산의 사용을 기반으로 그들 유전자 도구를 사용하는 것을 더 쉽게 만들기 위해서, 유전자 변형시키는데 성공하였다. 따라서, 그들은 천연적으로 이소프로판올을 생산하는, 균주 씨. 베이제링키이 DSM 6423을 유전자 변형시키는데 성공하였다. 특히, 그들은 "pNF2"로서 본 설명에서 확인된, 균주에 필수적이지 않은 천연 플라스미드를 제거하는데 성공하였다 (참조: FR18/73492).
다음으로 본 발명자들은 본 발명의 상황에서 최초로, 이 플라스미드 pNF2의 제거가 유전 물질의 도입 (즉, 형질전환)의 효율이 약 101 내지 5 x 103 의 배율만큼 증가된 박테리아 씨. 베이제링키이 DSM 6423을 수득하는 것을 가능하게 만든다는 것을 발견하고 개시한다. 이하에 설명된 바와 같이, 발명자는 또한 박테리아의 유전 물질을 변형시키고/시키거나, 박테리아에서, 상기 박테리아의 야생형 형태에 존재하는 유전 물질에 부재하는, DNA 서열을 발현시키는 것을 가능하게 만드는 서열을 보유하는 특정 핵산을 디자인하기 위해서, 플라스미드 pNF2의 일부분을 사용하여, 역시 매우 유의하게, 적어도 2종 핵산의 사용을 기반으로 유전자 도구를 개선시키는데 성공하였다. 이들 핵산 및 새로운 도구는 극적으로 박테리아의 형질전환 효율, 특히 그들이 야생 상태에서 함유하는 천연 플라스미드 또는 플라스미드들이 이전에 고갈된 박테리아의 형질전환 효율을 개선시킨다.
따라서 본 발명은 매우 유리하게 형질전환 효율 및 그러므로 특히 산업적 규모로, 박테리아의 이용을 용이하게 한다.
본 발명은 본 발명의 상황에서 최초로, 박테리아 (상기 박테리아 내에서, 도입된 유전 물질의 전부의 유지를 개선시켜서)의 형질전환을 용이하게 하는 핵산 (또한 본 문맥에서 핵산 "OPT"라고 확인됨)을 기술한다. 핵산 OPT는 i) SEQ ID NO: 126 서열의 전부 또는 일부, 및 ii) 박테리아의 유전 물질의 변형 및/또는 상기 박테리아에서, 상기 박테리아의 야생형 형태에 존재하는 유전 물질에 부분적으로 또는 전체로 부재하는 DNA 서열의 발현을 허용하는 서열을 포함한다. 서열 SEQ ID NO: 126 서열은 또한 본 명세서에서 핵산 "OREP"로서 확인된다.
본 발명자는 박테리아 씨. 베이제링키이 DSM 6423 내에서 형질전환의 빈도를 개선시키는데 성공하였는데, 특히 상기 박테리아 내에서 서열 OREP를 억제시키고 유리하게 박테리아의 유전 물질의 변형, 및/또는 상기 박테리아 내에서, 상기 박테리아의 야생형 형태에서 존재하는 유전 물질에 부분적으로 또는 전체로 부재하는 DNA 서열의 발현을 허용하는 유전자 도구 및/또는 핵산을 구축하기 위해 이러한 서열 OREP의 전부 또는 일부를 사용하는 것에 의한다.
서열 OREP는 관심 핵산 OPT의 복제에 관여하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 127)을 포함한다. 복제에 관여하는 이러한 단백질은 또한 본 명세서에서 단백질 "REP"로서 확인된다 (SEQ ID NO: 128 -
단백질 REP는 서열 SEQ ID NO: 129의 "COG 5655" (플라스미드 롤링 써클 복제 개시자 단백질 REP)로 불리는, 퍼미큐테스의 보존된 도메인을 갖는다.
유전자 도구는 또한 박테리아의 유전 물질의 최적 형질전환 및 이어서 상동성 재조합에 의한 변형, 및/또는 상기 박테리아에서, 퍼미큐테스 문에 속하는 박테리아, 예를 들어, 클로스트리듐 속, 바실러스 속, 또는 락토바실러스 속의 박테리아의 물질에 부분적으로 또는 전체적으로 부재하는 DNA 서열의 발현을 허용한다고 기술된다 (Hidalgo-Cantabrana, C. et al.; Yadav, R. et al.).
특정 구현예에서, 상동성 재조합에 의한 변형을 위한 도구는 전형적으로 하기 i), ii), 및 iii)을 특징으로 한다:
i) - 적어도 하나의 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 효소 Cas9를 코딩하는 제1" 핵산으로서, DNA 엔도뉴클레아제를 코딩하는 서열은 프로모터의 제어 하에 위치되는 것인 제1 핵산, 및
- 상동성 재조합의 기전을 통해서, 관심 서열로 엔도뉴클레아제에 의해 표적화되는 박테리아 DNA의 일부의 치환을 허용하는 복구 매트릭스를 함유하는, 적어도 하나의 "제2" 핵산을 포함하고,
ii) 상기 핵산 중 적어도 하나는 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA)를 더 코딩하거나 또는 유전자 도구는 하나 이상의 가이드 RNA를 더 포함하고, 각각의 가이드 RNA는 DNA 엔도뉴클레아제에 고정을 위한 RNA 구조 및 박테리아 DNA의 일부분의 상보성 서열을 포함하고, 바람직하게 iii) 상기 핵산의 적어도 하나는 유도성 프로모터의 제어 하에 위치된 항-CRISPR 단백질을 코딩하는 서열을 더 포함하거나, 또는 유전자 도구는 유도성 프로모터의 제어 하에 위치된 항-CRISPR 단백질을 코딩하는 제3 핵산을 더 포함한다.
특히, 기술되는 이러한 종류의 유전자 도구는 적어도
- 적어도 하나의 DNA 엔도뉴클레아제를 코딩하는 "제1" 핵산으로서, DNA 엔도뉴클레아제를 코딩하는 서열은 프로모터의 제어 하에 위치되는 것인 "제1" 핵산, 및
- "핵산 OREP"의 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어지는, 즉, i) 서열 SEQ ID NO: 126 서열의 전부 또는 일부, 및 ii) 박테리아의 유전 물질의 변형 및/또는 상기 박테리아에서, 상기 박테리아의 야생형 형태에 존재하는 유전 물질에 부분적으로 또는 전체로 부재하는 DNA 서열의 발현을 허용하는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지는 "다른" 핵산을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 기술된 바와 같은 "복구 매트릭스를 함유하는 제2 핵산"은 이러한 "다른 핵산"을 포함한다.
본 발명자는 또한 퍼미큐테스 문에 속하는 박테리아, 예를 들어, 클로스트리듐 속의 박테리아, 바실러스 속의 박테리아 또는 락토바실러스 속의 박테리아, 전형적으로 용매형성성 박테리아를 형질전환, 바람직하게, 예를 들어 상동성 재조합에 의해 유전자 변형시키기 위한 방법을 비롯하여, 상기 방법을 사용해 수득 (형질전환 및 전형적으로 유전자 변형)된 박테리아들 또는 박테리아를 기술한다. 이 방법은 유리하게 상기 박테리아로, 본 명세서에 기술된 바와 같은 유전자 도구의 전부 또는 일부, 특히 i) SEQ ID NO: 126 서열의 전부 또는 일부, 및 ii) 박테리아의 유전 물질의 변형 및/또는 상기 박테리아에서, 상기 박테리아의 야생형 형태에 존재하는 유전 물질에 부분적으로 또는 전체적으로 부재하는 DNA 서열의 발현을 허용하는 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어지는 핵산 ("핵산 OREP")의 도입에 의한 박테리아의 형질전환 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 이 방법은 유리하게 하기 단계들을 포함한다:
a) 박테리아로, 바람직하게, 항-CRISPR 단백질의 발현을 유도하기 위한 작용제의 존재 하에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 유전자 도구를 도입시키는 단계, 및
b) 단계 a)의 종료 시에 수득된 형질전환된 박테리아를, 항-CRISPR 단백질의 발현을 유도하고, 전형적으로 DNA 엔도뉴클레아제/gRNA 리보뉴클레오단백질 복합체, 예를 들어 Cas9/gRNA의 발현을 허용하는 작용제를 함유하지 않는 배지에서 배양시키는 단계.
본 발명자는 또한 퍼미큐테스 문에 속하는 박테리아, 예를 들어, 클로스트리듐 속의 박테리아, 바실러스 속의 박테리아, 또는 락토바실러스 속의 박테리아를 형질전환, 바람직하게 유전자 변형시키거나, 또는 이러한 박테리아를 사용하여, 적어도 하나의 용매, 예를 들어 용매의 혼합물을 생성시키기 위한, 키트를 기술한다. 이러한 키트는 바람직하게 본 명세서에 기술된 바와 같은 핵산 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 유전자 도구에서 사용되는 선택된 항-CRISPR 단백질의 발현의 유도성 프로모터에 적합한 유도인자를 포함한다. 특정 구현예에서, 키트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 유전자 도구의 엘리먼트의 전부 또는 일부를 포함한다.
또한 퍼미큐테스 문에 속하는 박테리아, 예를 들어, 클로스트리듐 속의 박테리아, 바실러스 속의 박테리아, 또는 락토바실러스 속의 박테리아, 바람직하게 야생 상태에서, 박테리아 염색체 및 염색체 DNA와 상이한 적어도 하나의 DNA 분자 (전형적으로 천연 플라스미드) 둘 모두를 보유하는 박테리아를 형질전환, 및 임의로 유전자 변형시키기 위한, 본 명세서에서 최초로 개시한, 핵산 또는 유전자 도구의 용도를 기술한다.
또한, 본 명세서에서 최초로, 바람직하게 산업적 규모로, 용매 또는 용매의 혼합물, 바람직하게 아세톤, 부탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 이의 혼합물, 전형적으로 이소프로판올/부탄올, 부탄올/에탄올 또는 이소프로판올/에탄올 혼합물의 생산을 허용하기 위한, 핵산, 유전자 도구, 이러한 박테리아를 형질전환, 바람직하게 유전자 변형시키기 위한 방법, 이러한 종류의 방법으로 수득된 박테리아 및/또는 키트의 용도를 기술한다.
1세기가 넘는 동안 산업에서 이용되었지만, 특히 클로스트리듐 속에 속하는 용매형성성 박테리아에 대한 지식은 그들을 유전자 변형시킬 때 대면하게 되는 어려움으로 인해 제한적이다. 예를 들어, 전형적으로 아세톤의 이소프로판올로의 환원을 허용하는, 1차/2차 알콜 데히드로게나제를 코딩하는 adh 유전자를 그들 게놈에 보유하는, 천연적으로 이소프로판올을 생산하는 클로스트리듐 속의 박테리아는 자연 상태에서 ABE 발효를 할 수 있는 박테리아와 유전적으로 기능적으로 상이하다.
본 발명자는 본 발명의 상황에서, 유리하게, 이소프로판올을 천연적으로 생산하는 클로스트리듐 속의 박테리아, 박테리아 씨. 베이제링키이 DSM 6423을 비롯하여 기준 균주 씨. 아세토부틸리쿰 DSM 792을 형질전환 및 유전자 병형시키는데 성공하였다.
실험 부문에 기술된 작업의 일부는 그의 게놈 및 전사체 분석이 최근에 본 발명자에 의해 기술된, IBE 발효할 수 있는 균주, 즉 균주 씨. 베이제링키이 DSM 6423에서 수행되었다 (Mate de Gerando et al., 2018).
이 균주의 게놈의 조립 동안, 본 발명자는 특히, 염색체이외에도, 이동성 유전자 엘리먼트의 존재를 발견하였다 (등록 번호 PRJEB11626 - https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB11626): 2종 천연 플라스미드 (pNF1 및 pNF2) 및 선형 박테리오파지 (Φ6423).
균주 씨. 베이제링키이 DSM 6423은 천연적으로 에리쓰로마이신에 감수성이지만 티암페니콜에는 내성이다. 특허 출원 제FR18/73492호는 티암페니콜에 감수성이게 만들어진, 특정 균주, 균주 씨. 베이제링키이 DSM 6423 ΔcatB (본 명세서에서 또한 씨. 베이제링키이 IFP962 ΔcatB 라고도 확인됨)를 기술한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명자는 균주 씨. 베이제링키이 DSM 6423으로부터, 이의 천연 플라스미드 pNF2를 제거하고, 균주 씨. 베이제링키이 DSM6423 ΔcatB ΔpNF2 (본 명세서에서 또한 씨. 베이제링키이 IFP963 ΔcatB ΔpNF2라고도 확인됨)를 수득하는데 성공하였다. 이러한 균주는 본 출원의 상황에서 최초로 특징규명된다. 이것은 수탁 번호 LMG P-31277 하에 BCCM-LMG 컬렉션에 2019년 2월 20일에 등록되었다. 이 균주는 서열 SEQ ID NO: 18의 유전자 catB 및 플라스미드 pNF2 (야생형)가 결여된다. 본 설명은 또한 전형적으로 서열 SEQ ID NO: 18의 유전자 catB 및 플라스미드 pNF2 (야생형)가 또한 결여된, 임의의 유도된 박테리아, 클론, 돌연변이체, 또는 후자의 유전자 변형 형태에 관한 것이다. 이것은 또한 보다 일반적으로, 야생 상태에서, 박테리아 염색체 및 DNA와 상이한 적어도 하나의 DNA 분자 (본 명세서에서 "비-염색체 (박테리아) DNA" 또는 "천연 (박테리아) 플라스미드"로서 확인됨) 둘 모두를 보유하고, 본 발명의 상황에서 기술된 핵산 및/또는 유전자 도구를 사용하여 유전자 변형시켜서 더 이상 이의 비-염색체 DNA 분자 중 적어도 하나, 전형적으로 이의 비-염색체 DNA 분자 중 몇 개 (예를 들어, 2종, 3종 또는 4종 비-염색체 DNA 분자), 바람직하게 이의 비-염색체 DNA 분자의 전부를 더 이상 포함하지 않는 임의 박테리아에 관한 것이다.
따라서 본 발명자는 본 출원에서, 유전자 변형되어서, 이러한 유전자 변형 덕분에, 특히 적어도 하나의 천연 플라스미드 (즉, 상기 박테리아의 야생형 형태에 천연적으로 존재하는 플라스미드), 바람직하게 이의 천연 플라스미드의 전부를 비롯하여, 이것을 수득하게 허용하는, 도구, 특히 유전자 도구가 상실된, 퍼미큐테서 문에 속하는 용매형성성 박테리아, 예를 들어, 클로스트리듐 속의 박테리아, 바실러스 속의 박테리아, 또는 락토바실러스 속의 박테리아, 보다 특히 이소프로판올을 천연적으로 생성시킬 수 있는 (즉, 야생 상태에서 할 수 있는), 특히 IBE 발효를 천연적으로 실시할 수 있는, 클로스트리듐 속의 박테리아를 기술한다. 이들 도구는 박테리아의 형질전환 및 유전자 변형을 상당히 용이하게 하는 장점을 제공한다. 본 발명자가 수행하는 실험은 박테리아, 특히 퍼미큐테스 문에 속하는 박테리아, 예를 들어 클로스트리듐 속의 박테리아, 바실러스 속의 박테리아, 또는 락토바실러스 속의 박테리아, 특히 야생 상태에서, 이소프로판올을 생산할 수 있는, 특히 IBE 발효를 실시할 수 있는, 클로스크리듐 속의 박테리아, 특히 항생제에 대한 내성을 담당하는 효소를 코딩하는 유전자, 특히 암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제, 예를 들어, 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제 또는 티암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 보유하는 것을 유전자 변형시키기 위한 도구, 보다 일반적으로 본 명세서에 기술된 기술의 가능한 용도를 입증한다.
특정 구현예에서, 본 발명자는 따라서 암페니콜의 클래스에 속하는 항생제에 감수성인 박테리아를 야기시키는데 성공하였고, 상기 박테리아는 이들 항생제에 대한 내성을 담당하는 효소를 코딩하는 유전자를 천연적으로 보유한다 (야생 상태에서 보유한다).
다른 바람직한 박테리아는 야생 상태에서, 박테리아 염색체 및 염색체 DNA와 상이한 적어도 하나의 DNA 분자 둘 모두를 함유한다.
또한 바람직한 박테리아는 야생 상태에서, 박테리아 염색체 및 염색체 DNA와 상이한 적어도 하나의 DNA 분자 둘 모두를 비롯하여, 항생제에 내성을 부여하는 유전자를 함유한다. 특정 구현예에서, 이러한 유전자는 암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제, 예를 들어, 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제 또는 티암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩한다.
본 발명자가 기술하는 제1 목적은 유리하게 상기 박테리아 내에 도입된 유전 물질의 전부의 유지를 개선시켜서 박테리아의 형질전환을 용이하게 하는데 사용가능한 핵산 (본 명세서에서 핵산 "OPT"로 확인됨)에 관한 것이다. 이러한 핵산 OPT는 i) 서열 SEQ ID NO: 126 (서열 "OREP")의 전부 또는 일부 또는 이의 기능성 변이체, 및 ii) 박테리아의 유전 물질의 변형 및/또는 상기 박테리아에서, 상기 박테리아의 야생형 형태에 존재하는 유전 물질에 부분적으로 또는 전체로 부재하는 DNA 서열의 발현을 허용하는, 서열 (또한 본 명세서에서 "관심 서열"이라고도 확인됨)을 포함한다.
서열 OREP (SEQ ID NO: 126)는 서열 SEQ ID NO: 127의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 서열 SEQ ID NO: 127은 바람직하게 핵산 OPT의 복제에 관여하는 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 복제에 관여하는 것으로 여겨지는 단백질은 또한 본 명세서에서 "REP" (SEQ ID NO: 128)로서 확인된다. 단백질 REP는 서열 SEQ ID NO: 129의 "COG 5655"로 불리는, 퍼미큐테스의 보존된 도메인을 갖는다.
특정 구현예에서, 핵산 OPT는 서열 OREP (SEQ ID NO: 126)의 일부분, 전형적으로 서열 OREP의 하나 이상의 단편, 바람직하게 적어도 단백질을 코딩하는 서열 REP (SEQ ID NO: 128) 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편 (즉, 복제에 관여하는 단편), 전형적으로 핵산 OPT의 복제에 관여하는 단백질 REP 내 단편을 코딩하는 서열 SEQ ID NO: 127 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 핵산 OPT의 복제에 관여하는, 단백질 REP 내에 존재하는, 단편을 코딩하는 서열 OREP의 기능성 단편은 서열 SEQ ID NO: 129의 도메인을 포함한다. 단백질 REP의 기능성 단편을 코딩하는 핵산의 이러한 단편, 및 이의 변이체의 예는 당업자가 쉽게 제조할 수 있다. 변이체의 전형적인 예는 서열 SEQ ID NO: 127과 70% 내지 100%, 바람직하게 85% 내지 99%, 보다 더 바람직하게 95% 내지 99%, 예를 들어, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 서열 상동성을 갖는다.
바람직한 구현예에서, 서열 OREP의 단편 또는 기능성 변이체는 핵산 OPT의 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 서열 OREP의 단편 또는 기능성 변이체는 핵산 OPT (예를 들어, 플라스미드 유형의 유전자 구성체)의 복제에 관여하는 단백질 (예를 들어, 단백질 REP)을 코딩하는 서열 또는 이의 변이체 또는 기능성 단편이외에도, 1 내지 150 염기, 바람직하게 1 내지 15 염기, 예를 들어, 염기 A 및 T가 풍부한 서열을 갖는 부위 (Rajewska et al.), 바람직하게 핵산 OPT의 복제를 허용하는 단백질의 고정을 허용하는, 서열 SEQ ID NO: 118의 플라스미드 pNF2 내에 존재하는 부위를 포함한다.
박테리아의 유전 물질의 변형을 허용하는 관심 서열은 전형적으로 예를 들어, 상동성 재조합의 기전을 통해서, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 방법 중 하나에 따라서, 관심 서열로 박테리아의 유전 물질의 일부의 치환을 허용하는 변형 매트릭스이다. 박테리아의 유전 물질의 변형을 허용하는 관심 서열은 또한 관심 박테리아의 게놈 내에서, i) 표적 서열, ii) 표적 서열의 전사를 제어하는 서열, 또는 iii) 표적 서열에 측접하는 서열 중 적어도 한 가닥을, 인식 (적어도 부분적으로 결합), 바람직하게 표적화, 즉, 인식하고 절단을 허용하는 서열일 수 있다.
상기 박테리아 내에서, 상기 박테리아의 야생형 형태에 존재하는 유전 물질에 부분적으로 또는 전체적으로 부재하는 DNA 서열의 발현을 허용하는 관심 서열은 전형적으로 박테리아가 야생 상태에서, 발현할 수 없거나, 또는 충분한 분량으로 발현할 수 없는 하나 이상의 단백질을 발현하도록 허용한다.
특정 양태에 따라서, "핵산 OPT"는 iii) DNA 엔도뉴클레아제를 코딩하는 서열, 예를 들어, Cas9, 및/또는 iv) 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA)를 더 포함하고, 각각의 gRNA는 DNA 엔도뉴클레아제에 고정을 위한 RNA 구조 및 박테리아의 유전 물질으 표적화된 부분의 상보성 서열을 포함한다.
다른 특정 양태에 따라서, "핵산 OPT"는 메틸트랜스퍼라제의 유형 Dam 및 Dcm에 의해 인식되는 단위의 수준에서 메틸화를 나타내지 않는다.
바람직하게, "핵산 OPT"는 발현 카세트 및 벡터로부터 선택되고, 바람직하게 플라스미드, 예를 들어, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124 및 SEQ ID NO: 125로부터 선택되는 서열을 갖는 플라스미드이다.
본 발명자가 기술되는 다른 목적은 관심 박테리아, 전형적으로 퍼미큐테스 문에 속하는 본 명세서에 기술된 바와 같은 박테리아, 예를 들어, 클로스트리듐 속, 바실러스 속, 또는 락토바실러스 속의 박테리아, 바람직하게 이소프로판올을 천연적으로 생산할 수 있는 (즉, 야생 상태에서 할 수 있는), 특히 천연적으로 IBE 발효를 실시할 수 있는 클로스트리듐 속의 박테리아, 바람직하게 하나 이상의 항생제에 천연적으로 내성인 박테리아, 예컨대 씨. 베이제링키이 박테리아를 형질전환 및/또는 유전자 변형시키는데 사용가능한 유전자 도구에 관한것이다. 바람직한 박테리아는 야생 상태에서, 박테리아 염색체 및 염색체 DNA와 상이한 적어도 하나의 DNA 분자 둘 모두를 갖는다.
"퍼미큐테스 문에 속하는 박테리아"는 본 명세서의 상황에서, 클로스트리디아 (Clostridia), 몰리큐테스 (Mollicutes), 바실러스 (Bacilli) 또는 토고박테리아 ( Togobacteria ) 강에 속하는, 바람직하게 클로스트리디아 또는 바실러스 강에 속하는 박테리아를 의미한다.
퍼미큐테스 문에 속하는 특정 박테리아는 예를 들어, 클로스트리듐 속의 박테리아, 바실러스 속의 박테리아 또는 락토바실러스 속의 박테리아를 포함한다.
"클로스트리듐 속의 박테리아"는 특히 산업적으로 관심있다고 말하는 클로스트리듐의 종, 전형적으로 클로스트리듐 속의 용매형성성 또는 아세트산형성성 박테리아를 의미한다. "클로스트리듐 속의 박테리아"라는 표현은 야생형 박테리아를 비롯하여, CRISPR 시스템에 노출없이, 그들 성능을 개선 (예를 들어, 유전자 ctfA, ctfB 및 adc의 과발현)시키려는 목적으로 유전자 변형된 이로부터 유래된 균주를 포함한다.
"산업적 관심의 클로스트리듐 종"은 발효에 의해서, 용매 및 산 예컨대 부티르산 또는 아세트산을, 당 또는 단당류로부터, 전형적으로 5개 탄소 원자 예컨대 자일로스, 아라비노스 또는 프룩토스를 포함하는 당으로부터 출발하여, 6개 탄소 원자 예컨대 글루코스 또는 만노스를 포함하는 당으로부터, 다당류 예컨대 셀룰로스 또는 헤미셀룰로스로부터, 및/또는 클로스트리듐 속의 박테리아가 동화가능하고 사용가능한 임의의 다른 탄소원 (예를 들어, CO, CO2, 및 메탄올)으로부터, 생산할 수 있는 종을 의미한다. 관심 용매형성성 박테리아의 예는 아세톤, 부탄올, 에탄올 및/또는 이소프로판올을 생산하는 클로스트리듐 속의 박테리아, 예컨대 문헌에서 "ABE 균주" [아세톤, 부탄올 및 에탄올의 생산을 허용하는 발효를 실시하는 균주] 및 "IBE 균주" [이소프로판올 (아세톤의 환원에 의함), 부탄올 및 에탄올의 생산을 허용하는 발효를 실시하는 균주]로서 확인되는 균주이다. 클로스트리듐 속의 용매형성성 박테리아는 예를 들어, 씨. 아세토부틸리쿰 (C. acetobutylicum), 씨. 셀룰롤리티쿰 (C. cellulolyticum), 씨. 파이토퍼멘탄스 (C. phytofermentans), 씨. 베이제링키이 (C. beijerinckii), 씨. 사카로부틸리쿰 (C. saccharobutylicum), 씨. 사카로퍼부틸아세토니쿰 (C. saccharoperbutylacetonicum), 씨 스포로게네스 (C. sporogenes), 씨. 부티리쿰 (C. butyricum), 씨. 아우란티부티리쿰 (C. aurantibutyricum) 및 씨. 티로부티리쿰 (C. tyrobutyricum), 바람직하게 씨. 아세토부틸리쿰, 씨. 베이제링키이, 씨. 부티리쿰, 씨. 티로부티리쿰, 및 씨. 셀룰롤리티쿰, 및 보다 더 바람직하게 씨. 아세토부틸리쿰 및 씨. 베이제링키이로부터 선택될 수 있다.
야생 상태에서, 이소프로판올을 생산할 수 있는, 특히 야생 상태에서 IBE 발효를 실시할 수 있는 박테리아는 예를 들어, 박테리아 씨. 베이제링키이, 박테리아 씨. 디올리스 (C. diolis), 박테리아 씨. 푸니세움 (C. puniceum), 박테리아 씨. 부티리쿰 (C. butyricum), 박테리아 씨. 사카로퍼부틸아세토니쿰 (C. saccharoperbutylacetonicum), 박테리아 씨. 보툴리눔 (C. botulinum), 박테리아 씨. 드라케이 (C. drakei), 박테리아 씨. 스카톨로게네스 (C. scatologenes), 박테리아 씨. 퍼프린겐스 (C. perfringens), 및 박테리아 씨. 투니시엔스 (C. tunisiense)로부터 선택되는 박테리아, 바람직하게 박테리아 씨. 베이제링키이, 박테리아 씨. 디올리스, 박테리아 씨. 푸니세움 및 박테리아 씨. 사카로퍼부틸아세토니쿰으로부터 선택되는 박테리아일 수 있다. 천연적으로 이소프로판올을 생산할 수 있는, 특히 야생 상태에서 IBE 발효를 실시할 수 있는, 특히 바람직한 박테리아는 박테리아 씨. 베이제링키이이다.
관심 아세트산형성성 박테리아는 CO2 및 H2 로부터 출발하여 산 및/또는 용매를 생산하는 박테리아이다. 클로스트리듐 속의 아세트산형성성 박테리아는 예를 들어, 씨. 아세티쿰 (C. aceticum), 씨. 써모아세티쿰 (C. thermoaceticum), 씨. 융달리이 (C. ljungdahlii), 씨. 아우토에타노게눔 (C. autoethanogenum), 씨. 디피실 (C. difficile), 씨. 스카톨로게네스 (C. scatologenes) 및 씨. 카르복시디보란스 (C. carboxydivorans)로부터 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 문제의 클로스트리듐 속의 박테리아는 "ABE 균주", 바람직하게 씨. 아세토부틸리쿰의 균주 DSM 792 (균주 ATCC 824 또는 그외에 LMG 5710라고 지정됨), 또는 씨. 베이제링키이의 균주 NCIMB 8052이다.
다른 특정 구현예에서, 문제의 클로스트리듐 속의 박테리아는 "IBE 균주", 바람직하게 DSM 6423, LMG 7814, LMG 7815, NRRL B-593, NCCB 27006으로부터 선택되는 씨. 베이제링키이의 하위분기군, 또는 박테리아 아우란티부티리쿰 DSZM 793 (Georges et al., 1983), 및 균주 DSM 6423과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 상기 박테리아 씨. 베이제링키이 또는 씨. 아우란티부티리쿰의 하위분기군이다. 특히 바람직한 박테리아 씨. 베이제링키이, 또는 특히 바람직한 박테리아 씨. 베이제링키이의 하위분기군은 플라스미드 pNF2가 결여된다.
한편으로 하위분기군 LMG 7814, LMG 7815, NRRL B-593 및 NCCB 27006, 및 다른 한편으로 DSZM 793의 개별 게놈은 하위분기군 DSM 6423의 게넘과 적어도 97%의 서열 동일성 백분율을 갖는다.
본 발명자는 발효 시험을 수행하여, 하위분기군 DSM 6423, LMG 7815 및 NCCB 27006의 박테리아 씨. 베이제링키이가 야생 상태에서 이소프로판올을 생산할 수 있다는 것을 확인하였다 (참조: 표 1).
[표 1]
발효의 균형은 이소프로판올을 천연적으로 생산하는 균주 씨. 베이제링키이 DSM 6423, LMG 7815 및 NCCB 27006를 사용하여 글루코스로 시험한다. 본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 박테리아 씨. 베이제링키이는 하위분기군 DSM 6423의 박테리아이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 박테리아 씨. 베이제링키이는 균주 씨. 베이제링키이 IFP963 ΔcatB ΔpNF2 (수탁 번호 LMG P-31277 하에 컬렉션 BCCM-LMG에 2019년 2월 20일에 등록되고, 또한 본 명세서에서 씨. 베이제링키이 DSM 6423 ΔcatB ΔpNF2로서 확인됨), 또는 이의 유전자 변형된 형태이다. 박테리아 씨. 베이제링키이 IFP963 ΔcatB ΔpNF2, 또는 이의 상기 유전자 변형된 형태는 서열 SEQ ID NO: 18의 유전자 catB 및 플라스미드 pNF2가 결여된다.
"바실러스 속의 박테리아"는 특히 비. 아밀로리케파시엔스 (B. amyloliquefaciens), 비. 투리지엔시스 (B. thurigiensis), 비. 코아굴란스 (B. coagulans), 비. 세레우스 (B. cereus), 비. 안트라시스 (B. anthracis) 또는 그외에 비. 서브틸리스 (B. subtilis)를 의미한다.
최근의 실험 동안, 본 발명자는 천연 플라스미드 pNF2의 제거가 천연 또는 합성인, 추가의 유전자 엘리먼트 (예를 들어, 발현 카세트(들) 또는 플라스미드 발현 벡터(들))의 도입 및 유지를 위한 상당한 장점을 갖는 것을 관찰하였다. 따라서, 균주 IFP963 ΔcatB ΔpNF2는 이의 야생형 상동체 또는 균주 DSM 6423 ΔcatB (본 명세서에서 IFP962 ΔcatB로서도 확인됨)에 비해서 10 내지 5 x 103 배 더 높은 효율로 형질전환될 수 있다.
형질전환, 바람직하게 유전자 변형시키고자 하는 박테리아는 바람직하게 야생 상태에서, 상기 박테리아에 천연적으로 존재하는 염색체외 DNA의 적어도 하나의 분자 (전형적으로, 적어도 하나의 플라스미드)를 제거하는 것을 가능하게 만드는 본 발명에 따른 핵산 또는 유전자 도구를 사용하는 형질전환의 제1 단계 및 유전자 변형의 제1 단계에 노출된 박테리아이다
본 발명자가 기술하는 특정 유전자 도구는
i) - 적어도 하나의 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들어 효소 Cas9를 코딩하는 적어도 하나의 제1" 핵산으로서, DNA 엔도뉴클레아제를 코딩하는 서열은 프로모터의 제어 하에 위치되는 것인, "제1" 핵산, 및
- 상동성 재조합의 기전을 통해서, 관심 서열로 엔도뉴클레아제에 의해 표적화되는 박테리아 DNA의 일부분의 치환을 허용하는 복구 매트릭스를 함유하는 적어도 하나의 "제2" 핵산을 포함하고,
ii) 상기 핵산 중 적어도 하나는 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA)를 더 코딩하거나 또는 유전자 도구는 하나 이상의 가이드 RNA를 더 포함하며, 각각의 가이드 RNA는 DNA 엔도뉴클레아제에 고정을 위한 RNA 구조 및 박테리아 DNA의 표적화 부분의 상보성 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명자가 기술한 유전자 도구의 예는 바로 CRISPR/Cas 시스템처럼, 2종의 별개 필수 엘리먼트, 즉, i) 엔도뉴클레아제, 본 경우에서, CRISPR 시스템과 연관된 뉴클레아제 (Cas 또는 "CRISPR 연관 단백질"), Cas, 및 ii) 가이드 RNA를 함유한다. 가이드 RNA는 박테리아 CRISPR RNA (crRNA) 및 tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA)의 조합으로 이루어진 키메라 RNA의 형태이다 (Jinek et al., Science 2012). gRNA는 Cas 단백질에 대한 가이드로서 제공되는 "스페이서 서열"에 상응하는 crRNA의 표적화 특이성, 및 단일 전사물 중 tracrRNA의 입체배열 성질을 조합한다. gRNA 및 Cas 단백질이 세포에서 동시에 발현될 때, 표적 게놈 서열은 전형적으로 유리하게 공급되는 복구 매트릭스 덕분에 영구적으로 변형된다.
본 발명에 따른 유전자 도구는 바람직하게 iii) 상기 ("제1" 및 "제2") 핵산 중 적어도 하나는 유도성 프로모터의 제어 하에 위치된 항-CRISPR 단백질을 코딩하는 서열을 더 포함하거나, 또는 유전자 도구는 유도성 프로모터의 제어 하에 위치된 항-CRISPR 단백질을 코딩하는 제3 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
특히, 유전자 도구는 적어도,
- 적어도 하나의 DNA 엔도뉴클레아제를 코딩하는 제1 핵산으로서, DNA 엔도뉴클레아제를 코딩하는 서열은 프로모터의 제어 하에 위치하는 것인 제1 핵산, 및
- 핵산 서열 "OPT", 즉 i) 서열 SEQ ID NO: 126 ("OREP")의 전부 또는 일부, 및 ii) 박테리아의 유전 물질의 변형 및/또는 발현, 상기 박테리아에서, 상기 박테리아의 야생형 형태에 존재하는 유전 물질에 부분적으로 또는 전체적으로 부재하는 DNA 서열의 발현을 허용하는 서열을 포함하는 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어지는 다른 핵산 (또는 "제n 핵산")을 포함하는 것으로 기술되며, 이러한 특정 유전자 도구의 상기 핵산 중 적어도 하나는 바람직하게 유도성 프로모터의 제어 하에 위치된 항-CRISPR 단백질을 코딩하는 서열을 더 포함하거나, 또는 상기 특정 유전자 도구는 바람직하게 유도성 프로모터의 제어 하에 위치된 항-CRISPR 단백질을 코딩하는 제3 핵산을 더 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 기술된 바와 같은 "복구 매트릭스를 함유하는 "제2" 또는 "제n 핵산"은 이러한 "다른 핵산"을 포함하거나, 또는 그로 이루어진다.
다른 특정 구현예에서, "제1 핵산"은 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA)를 더 코딩한다.
"핵산"은 본 발명의 의미에서, 코딩 서열로부터 합성된 전사물의 코돈이 나중에 이의 사용 관점에서 클로스트리듐 속의 박테리아에서 가장 흔하게 발견되는 코돈이 되게 임의로 화학적으로 변형 (즉, 비-천연 염기 포함, 예를 들어, 변형된 연결, 변형된 염기 및/또는 변형된 당을 포함하는 변형된 뉴클레오티드), 또는 최적화된, 임의의 천연, 합성, 반합성, 또는 재조합 DNA 또는 RNA 분자를 의미한다. 클로스트리듐 속의 경우에서, 최적화된 코돈은 전형적으로 아데닌 염기 ("A") 및 티민 염기 ("T")가 풍부한 코돈이다.
본 문헌에 기술된 펩티드 서열에서, 아미노산은 하기 명명법에 따라 그들의 1글자 코돈으로 표시된다: C: 시스테인; D: 아스파르트산; E: 글루탐산; F: 페닐알라닌; G: 글리신; H: 히스티딘; I: 이소류신; K: 리신; L: 류신; M: 메티오닌; N: 아스파라긴; P: 프롤린; Q: 글루타민; R: 아르기닌; S: 세린; T: 트레오닌; V: 발린; W: 트립토판; 및 Y: 티로신.
본 발명의 상황에 기술된 유전자 도구는 적어도 하나의 DNA 엔도뉴클레아제 (본 명세서에서 또한 "뉴클레아제"로도 확인됨), 전형적으로 Cas 유형의 뉴클레아제, 예를 들어 Cas9 또는 MAD7을 코딩하는 제1 핵산을 포함한다.
"Cas9"는 즉, 가이드 RNA 또는 가이드 RNA들과 상호작용할 수 있고 표적 게놈의 DNA의 이중-가닥 파단을 수행하도록 허용하는 효소적 (뉴클레아제) 활성을 발휘할 수 있는, Cas9 단백질 (CRISPR-연관 단백질 9, Csn1 또는 Csx12라고도 함) 또는 이의 기능성 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드 단편을 의미한다. 따라서, "Cas9"는 단백질의 사전정의된 기능에 필수적이지 않은 단백질의 도메인, 특히 gRNA 또는 gRNA들과의 상호작용에 필요하지 않은 도메인을 제거하기 위해서, 변형, 예를 들어, 절두된 단백질을 의미할 수 있다.
"Cas12" 또는 "Cpf1"로도 확인되는, 뉴클레아제 MAD7 (이의 아미노산 서열은 서열 SEQ ID NO: 72에 상응)은 달리, 이러한 종류의 뉴클레아제에 결합할 수 있다고 당업자에게 공지된 하나 이상의 gRNA들과 조합하여서 본 발명의 상황에서 유리하게 사용될 수 있다 (참조: Garcia-Doval et al., 2017 및 Stella S. et al., 2017).
특정 양태에 따라서, 뉴클레아제 MAD7을 코딩하는 서열은 클로스트리듐의 균주에서 쉽게 발현을 위해 최적화된 서열, 바람직하게 서열 SEQ ID NO: 71이다.
다른 특정 양태에 따라서, 뉴클레아제 MAD7을 코딩하는 서열은 바실러스 균주에서 쉽게 발현을 위해 최적화된 서열, 바람직하게 서열 SEQ ID NO: 132이다.
본 발명의 가능한 구현예에서 사용가능한 바와 같은, Cas9 (전체 단백질 또는 이의 단편)를 코딩하는 서열은 임의의 기지 Cas9 단백질로부터 출발하여 수득될 수 있다 (Makarova et al., 2011). 본 발명에서 사용가능한 Cas9 단백질의 예는 에스. 피오게네스 (S. pyogenes) (참조: 국제 출원 공개 번호 WO2017/064439의 SEQ ID NO: 1 및 NCBI 등록 번호: WP_010922251.1), 스트렙토코쿠스 써모필루스 (Streptococcus thermophilus), 스트렙토코쿠스 뮤탄스 (Streptococcus mutans), 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 파스퇴렐라 물코시다 (Pasteurella multocida), 프란시셀라 노피시다 (Francisella novicida), 네이세리아 메닌지티디스 (Neisseria meningitidis), 네이세리아 락타미카 (Neisseria lactamica) 및 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila) 의 Cas9 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다 (참조: Fonfara et al., 2013; Makarova et al., 2015).
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 유전자 도구의 핵산 중 하나에 의해 코딩되는, Cas9 단백질, 또는 이의 기능성 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드 단백질은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 75, 또는 이와 적어도 50%, 바람직하게 적어도 60%의 동일성을 갖고 최소로서 아미노산 서열 SEQ ID NO: 75의 2개 아스파르트산 ("D") 점유 위치 10 ("D10") 및 840 ("D840")을 함유하는 임의의 다른 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진다.
바람직한 구현예에서, Cas9는 에스. 피오게네스 M1 GAS의 균주의 cas9 유전자 (NCBI 등록 번호: NC_002737.2 SPy_1046, SEQ ID NO: 76)에 의해 코딩되는, Cas9 단백질 (NCBI 등록 번호: WP_010922251.1, SEQ ID NO: 75), 또는 이 박테리아 속에서 Cas9 단백질의 용이한 발현을 허용하는, 클로스트리듐 속의 박테리아가 우선적으로 사용하는 코돈, 전형적으로 아데닌 ("A") 및 티민 ("T") 염기 풍부 코돈을 함유하는 전사물의 기원에서 최적화 ("최적화된 형태")를 겪은 후자의 형태를 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 이들 최적화된 코돈은 각각의 박테리아 균주에 특이적인, 당업자에게 충분히 공지된, 코돈의 사용 방식을 준수한다.
특정 구현예에 따라서, Cas9 도메인은 전체 Cas9 단백질, 바람직하게 에스. 피오게네스의 Cas9 단백질 또는 이의 최적화된 형태로 이루어진다.
본 명세서에 기술된 유전자 도구의 각각의 핵산, 전형적으로 상기 유전자 도구의 "제1" 핵산 및 "제2" 또는 "제n" 핵산은 별개 독립체로 이루어지고, 전형적으로 발현 카세트 (또는 "구성체"), 예컨대 예를 들어 하나 이상의 관심 (코딩) 서열, 예를 들어 그의 발현 생성물이 박테리아 내에서 관심 기능의 수행에 기여하는 몇몇 관심 코딩 서열을 포함하는 오페론에 (당업자가 이해하는 의미로) 작동적으로 연결된 적어도 하나의 전사 프로모터를 포함하는 핵산, 또는 전사 활성화 및/또는 종결 서열을 더 포함하는 핵산의 형태이거나; 또는 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는, 원형 또는 선형, 단일 또는 이중 가닥 벡터, 예를 들어 플라스미드, 파지, 코스미드, 인공 또는 합성 염색체의 형태이다. 바람직하게, 벡터는 플라스미드이다.
관심 핵산, 전형적으로 카세트 또는 발현 벡터는 당업자에게 익숙한 통상의 기술을 통해서 구축될 수 있고, 하나 이상의 프로모터, 박테리아 복제 기원 (ORI 서열), 종결자 서열, 선별인자 유전자, 예를 들어 항생제 내성 유전자, 및 카세트 또는 벡터의 표적화 삽입을 허용하는 서열 ("측접된 영역")을 포함할 수 있다. 게다가, 이들 발현 카세트 및 벡터는 당업자에게 익숙한 기술을 통해서 박테리아 게놈 내에서 통합될 수 있다.
관심 ORI 서열은 pIP404, pAMβ1, repH (씨. 아세토부틸리쿰의 복제 기원), ColE1 또는 rep (이. 콜라이의 복제 기원), 또는 벡터, 전형적으로 플라스미드가 박테리아 세포, 예를 들어 클로스트리듐 또는 바실러스 세포 내에서 유지되게 허용하는 임의의 다른 복제 기원으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 상황에서, 바람직한 ORI 서열은 플라스미드 pNF2 (SEQ ID NO: 118)의 서열 OREP (SEQ ID NO: 126) 내에 존재하는 것이다.
관심 종결자 서열은 유전자 adc, thl 의 것, 오페론 bcs 의 것, 또는 박테리아 세포, 예를 들어, 클로스트리듐 또는 바실러스 세포 내에서 전사가 종결되도록 허용하는, 당업자에게 익숙한 임의의 다른 종결자로부터 선택될 수 있다.
관심 선택인자 유전자 (내성 유전자)는 ermB, catP, bla, tetA, tetM, 및/또는 암피실린, 에리쓰로마이신, 클로람페니콜, 티암페니콜, 스펙티노마이신, 테트라사이클린, 또는 당업자에게 익숙한, 박테리아, 예를 들어 클로스트리듐 또는 바실러스 속의 박테리아를 선택하는데 사용가능한 임의의 다른 항생제에 대한 내성을 위한 임의의 다른 유전자로부터 선택될 수 있다.
임의로 본 발명에 따른 유전자 도구의 핵산 중 하나 내에 존재하는, DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들어 Cas9를 코딩하는 서열은 프로모터의 제어 하에 위치될 수 있다. 이러한 프로모터는 항상성 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 뉴클레아제의 발현을 제어하는 프로모터는 유도성 프로모터이다.
본 발명의 상황에서 사용가능한 항상성 프로모터의 예는 유전자 thl 의 프로모터, 유전자 ptb 의 프로모터, 유전자 adc 의 프로모터, 유전자 BCS의 프로모터, 또는 이의 유도체, 바람직하게 기능성이지만 더 짧은 (절두된) 유도체, 예컨대 씨. 아세토부틸리쿰의 유전자 thl 의 프로모터의 "miniPthl" 유도체 (Dong et al., 2012), 또는 관심 박테리아, 예를 들어 클로스트리듐 속의 박테리아 내에서 단백질의 발현을 허용하는, 당업자에게 익숙한, 임의의 다른 프로모터로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 상황에서 사용가능한 유도성 프로모터의 예는 예를 들어 그의 발현이 전사 리프레서 TetR에 의해 제어되는 프로모터, 예를 들어 유전자 tetA (이. 콜라이의 트랜스포존 Tn10에 본래 존재하는 테트라사이클린 내성 유전자)의 프로모터; 그의 발현이 L-아라비노스에 의해 제어되는 프로모터, 예를 들어 바람직하게 시스템 ARAi (Zhang et al., 2015)를 구축하기 위해 씨. 아세토부틸리쿰에서 발현을 조절하는 araR 카세트와 조합되는, ptk 의 프로모터 (Zhang et al., 2015); 그의 발현이 라민아리비오스 (글루코스 β-1,3의 이량체)에 의해 제어되는 프로모터, 예를 들어 바람직하게 리프레서 유전자 glyR3 및 관심 유전자가 바로 후속하는, 유전자 celC 의 프로모터 (Mearls et al. 2015) 또는 유전자 celC 의 프로모터 (Newcomb et al., 2011); 그의 발현이 락토스에 의해 제어되는 프로모터, 예를 들어 유전자 bgaL 의 프로모터 (Banerjee et al., 2014); 그의 발현이 자일로스에 의해 제어되는 프로모터, 예를 들어 유전자 xylB 의 프로모터 (Nariya et al., 2011); 및 그의 발현이 UV 노출에 의해 제어되는 프로모터, 예를 들어, 유전자 bcn 의 프로모터 (Dupuy et al., 2005)로부터 선택될 수 있다.
상기 기술된 프로모터 중 하나로부터 유래된 프로모터, 바람직하게 더 짧은 (절두형) 기능성 유도체가 또한 본 발명의 상황에서 사용될 수 있다.
본 발명의 상황에서 사용가능한 다른 유도성 프로모터는 또한 예를 들어 [Ransom et al. (2015)], [Currie et al. (2013)] 및 [Hartman et al. (2011)]의 논문에 기술되어 있다.
바람직한 유도성 프로모터는 Pcm-2tetO1 및 Pcm-2tetO2/1로부터 선택되는, 언히드로테트라사이클린 (aTc; 테트라사이클린에 비해 덜 독성이고 저농도에서 전사 리프레서 TetR의 억제를 제거할 수 있음)으로 유도가능한, tetA로부터 유래된 프로모터이다 (Dong et al., 2012).
다른 바람직한 유도성 프로모터는 락토스에 의해 유도가능한 프로모터, 예를 들어 유전자 bgaL 의 프로모터이다 (Banerjee et al., 2014).
특정 관심의 핵산, 전형적으로 발현 카세트 또는 벡터는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하고, 각각의 카세트는 gRNA를 코딩한다.
용어 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 본 발명의 의미에서, 박테리아 염색체의 표적 영역으로 가이드하기 위해서, DNA 엔도뉴클레아제와 상호작용할 수 있는 RNA 분자를 의미한다. 절단 특이성은 gRNA에 의해 결정된다. 상기에 설명된 바와 같이, 각각의 gRNA는 하기 2개 영역을 포함한다:
- 표적 염색체 영역에 상보성이고, 내생성 CRISPR 시스템의 crRNA를 모방하는, gRNA의 5' 말단에 있는, 제1 영역 (통상 "SDS" 영역이라고 함), 및
- tracrRNA ("trans-activating crRNA") 및 내생성 CRISPR 시스템의 crRNA 간 염기 쌍형성 상호작용을 모방하고 본질적으로 단일 가닥 서열과 3'에서 이중 가닥 스템-루프 구조 말단부를 갖는, gRNa의 3' 말단에 있는, 제2 영역 (통상 "핸들" 영역이라고 함). 이러한 제2 영역은 DNA 엔도뉴클레아제에 대한 gRNA의 결합에 필수적이다.
gRNA의 제1 영역 ("SDS" 영역)은 표적화되는 염색체 서열에 따라서 가변적이다.
표적 염색체 영역에 상보성인 gRNA의 "SDS" 영역은 적어도 1 뉴클레오티드, 바람직하게 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40 뉴클레오티드, 전형적으로 1 내지 40 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게, 이 영역은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
gRNA의 제2 영역 ("핸들" 영역)은 스템-루프 구조 (또는 헤어핀 구조)를 갖는다. 다양한 gRNA의 "핸들" 영역은 선택된 염색체 표적에 의존적이지 않다.
특정 구현예에 따라서, "핸들" 영역은 적어도 1 뉴클레오티드, 바람직하게 적어도 1, 50, 100, 200, 500 및 1000 뉴클레오티드, 전형적으로 1 내지 1000 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 바람직하게, 이 영역은 40 내지 120 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
gRNA의 총 길이는 일반적으로 50 내지 1000 뉴클레오티드, 바람직하게 80 내지 200 뉴클레오티드, 보다 특히 바람직하게 90 내지 120 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에 따라서, 본 발명에서 사용되는 gRNA는 95 내지 110 뉴클레오티드의 길이, 예를 들어 약 100 또는 약 110 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
당업자는 충분히 공지된 기술을 사용해 표적화하려는 염색체 영역에 의존하여 gRNA의 구조 및 서열을 쉽게 정의할 수 있다 (예를 들어, [DiCarlo et al., 2013]의 논문 참조).
예를 들어, 박테리아 염색체의 박테리아 게놈 내에서 표적화된 DNA 영역/부분/서열은 DNA의 비-코딩 부분 또는 DNA의 코딩 부분에 상응될 수 있다.
소정 서열을 변형시키는 단계로 이루어지는 특정 구현예에서, 박테리아 DNA의 표적화된 부분은 박테리아의 생존에 필수적이다. 이것은 예를 들어, 박테리아 염색체의 임의 영역, 또는 비-염색체 DNA, 예를 들어 특정 성장 조건에서 미생물의 생존에 필수적인 이동성 유전자 엘리먼트, 예를 들어 고려되는 성장 조건이 항생제의 존재 하에서 박테리아의 배양을 요구할 때 상기 항생제에 대한 내성 마커를 함유하는 플라스미드에 위치하는 임의 영역에 상응된다.
미생물의 배양과 연관된 특정 성장 조건에서 필수적이지 않은 유전자 엘리먼트를 제거하려는 목적을 갖는 다른 특정 구현예에서, 박테리아 DNA의 표적화된 부분은 상기 비-염색체 박테리아 DNA의 임의 영역에 상응될 수 있다.
클로스트리듐 속의 박테리아 내에서 표적화된 DNA 부분의 특정 예는 실험 부분의 실시예 1에서 사용되는 서열이다. 그들은 예를 들어 유전자 bdhA (SEQ ID NO: 77) 및 bdhB (SEQ ID NO: 78)를 코딩하는 서열이다. 표적화된 DNA 영역/부분/서열은 DNA 엔도뉴클레아제와의 결합에 관여되는 서열 "PAM" ("프로토스페이서 인접한 모티프")이 후속된다.
소정 gRNA의 "SDS" 영역은 박테리아 게놈, 예를 들어 박테리아 염색체 내에서 표적화된 DNA 영역/부분/서열과 (100%) 동일하거나, 또는 적어도 80%, 바람직하게 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 동일하고, 상기 영역/부분/서열의 상보성 서열의 전부 또는 일부, 전형적으로 적어도 1 뉴클레오티드, 바람직하게 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40 뉴클레오티드, 전형적으로 1 내지 40 뉴클레오티드를 포함하는 서열, 바람직하게 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 뉴클레오티드를 포함하는 서열과 혼성화할 수 있다.
본 발명의 상황에서, 관심 핵산은 서열 ("표적 서열", "표적화된 서열" 또는 "인식 서열")을 표적화하는 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA)를 포함할 수 있다. 이들 다양한 gRNA는 임의로 동일하거나 또는 상이한 미생물 내에 존재하는, 비-염색체 박테리아 DNA (예를 들어, 이동성 유전자 엘리먼트)에 속하는 영역, 또는 염색체 영역을 표적화할 수 있다.
gRNA는 박테리아 세포에, gRNA의 분자 (성숙 또는 전구체) 형태로, 전구체 형태로, 또는 상기 gRNA를 코딩하는 하나 이상의 핵산의 형태로 도입될 수 있다. gRNA는 바람직하게 박테리아 세포에, 상기 gRNA를 코딩하는 하나 이상의 핵산 형태로 도입된다.
gRNA 또는 gRNA들이 RNA 분자의 형태로 직접적으로 세포에 도입될 때, 이들 gRNA들 (성숙 또는 전구체)은 예를 들어 뉴클레아제에 대한 그들 내성을 증가시켜서 세포 내에서 그들 수명을 증가시키도록 허용하는 화학 변형 또는 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 그들은 특히 적어도 하나의 변형되거나 또는 비-천연인 뉴클레오티드 예컨대, 예를 들어, 변형된 염기, 예컨대 이노신, 메틸-5-데옥시시티딘, 디메틸아미노-5-데옥시우리딘, 데옥시우리딘, 디아미노-2,6-푸린, 브로모-5-데옥시우리딘 또는 혼성화를 허용하는 임의의 다른 변형된 염기를 포함하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라서 사용되는 gRNA는 또한 뉴클레오티드간 연결 수준에서, 예를 들어, 예컨대 포스포로티오에이트, H-포스포네이트 또는 알킬-포스포네이트로, 또는 골격 수준에서 예를 들어 예컨대 알파-올리고뉴클레오티드, 2'-O-알킬 리보스 또는 PNA (펩티드 핵산)로 변형될 수 있다 (Egholm et al., 1992).
gRNA는 천연 RNA, 합성 RNA 또는 재조합 기술로 생성된 RNA일 수 있다. 이들 gRNA는 당분야에 공지된 모든 방법, 예컨대, 예를 들어, 화학 합성, 생체내 전사 또는 증폭 기술을 통해 제조될 수 있다.
gRNA가 박테리아 세포에 하나 이상의 핵산 형태로 도입될 때, gRNA 또는 gRNA들을 코딩하는 서열 또는 서열들은 발현 프로모터의 제어 하에 위치된다. 이 프로모터는 항상성일 수 있거나 또는 유도성일 수 있다.
몇개 gRNA가 사용될 때, 각각의 gRNA의 발현은 상이한 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 바람직하게, 사용되는 프로모터는 모든 gRNA에 대해 동일하다. 특정 구현예에서, 하나 및 동일한 프로모터는 발현시키고자 의도하는 gRNA의 몇개, 예를 들어 단지 일부, 또는 달리 말해서 일부 또는 전부의 발현을 허용하기 위해 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, gRNA/gRNA들의 발현을 제어하는 프로모터 또는 프로모터들은 유도성 프로모터이다.
본 발명의 상황에서 사용가능한 항상성 프로모터의 예는 유전자 thl 의 프로모터, 유전자 ptb 의 프로모터 또는 오페론 BCS의 프로모터, 또는 이의 유도체, 바람직하게 miniPthl, 또는 관심 박테리아 내에서 (코딩 또는 비-코딩) RNA의 합성을 허용하는, 당업자에게 친숙한, 임의의 다른 프로모터로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 상황에서 사용가능한 유도성 프로모터의 예는 유전자 tetA 의 프로모터, 유전자 xylA 의 프로모터, 유전자 lacI 의 프로모터, 또는 유전자 bgaL 의 프로모터, 또는 이의 유도체, 바람직하게 2tetO1 또는 tetO2/1로부터 선택될 수 있다. 바람직한 유도성 프로모터는 2tetO1이다.
DNA 엔도뉴클레아제 및 gRNA/gRNA들의 발현을 제어하는 프로모터는 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있고 항상성일 수 있거나 또는 유도성일 수 있다. 특정 바람직한 구현예에서, 각각 DNA 엔도뉴클레아제의 발현 또는 gRNA 또는 gRNA들의 발현을 제어하는 프로모터는 상이한 프로모터이지만 동일한 유도인자에 의해 유도가능하다.
상기 기술된 바와 같은 유도성 프로모터는 유리하게 DNA 엔도뉴클레아제/gRNA 리보뉴클레오단백질 복합체, 예를 들어 Cas9/gRNA의 작용을 제어하고, 바람직한 유전자 변형을 겪은 형질전환체의 선택을 용이하게 하는 것을 가능하게 만든다.
본 발명에 따라 유전자 도구는 유리하게 적어도 하나의 항-CRISPR 단백질, 즉 Cas의 작용을 억제 또는 방지/중화시킬 수 있는 단백질, 및/또는 CRISPR/Cas 시스템, 예를 들어 뉴클레아제가 Cas9 유형의 뉴클레아제일 때 II형의 CRISPR/Cas 시스템의 작용을 억제 또는 방지/중화시킬 수 있는 단백질을 코딩하는 서열을 더 포함할 수 있다. 이러한 서열은 전형적으로 DNA 엔도뉴클레아제 및/또는 gRNA 또는 gRNA들의 발현을 제어하는 프로모터와 상이한 유도성 프로모터의 제어 하에 위치되고, 다른 유도인자에 의해 유도가능하다. 게다가, 바람직한 구현예에서, 항-CRISPR 단백질을 코딩하는 서열은 전형적으로 유전자 도구 내에 존재하는 적어도 2종 핵산 중 하나에 위치된다. 특정 구현예에서, 항-CRISPR 단백질을 코딩하는 서열은 처음의 2종과 상이한 핵산 (전형적으로 "제3 핵산")에 위치된다. 또 다른 특정 구현예에서, 항-CRISPR 단백질을 코딩하는 서열 및 상기 항-CRISPR 단백질의 전사 리프레서를 코딩하는 서열 둘 모두는 박테리아 염색체에 통합된다.
바람직한 구현예에서, 항-CRISPR 단백질을 코딩하는 서열은 유전자 도구 내에서, DNA 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 (본 명세서에서는 또한 "제1 핵산"이라고도 확인됨)에 위치된다. 다른 구현예에서, 항-CRISPR 단백질을 코딩하는 서열은 유전자 도구 내에서, DNA 엔도뉴클레아제를 코딩하는 것과 상이한 핵산, 예를 들어 본 명세서에서 "제2 핵산"으로서 확인되는 핵산 또는 그외에 임의로 유전자 도구 내에 포함되는 "제n" (전형적으로 "제3") 핵산에 위치된다.
항-CRISPR 단백질은 전형적으로 "항-Cas9" 단백질 또는 "항-MAD7" 단백질, 즉, Cas9 또는 CAS7의 작용을 억제 또는 방지/중화시킬 수 있는 단백질이다.
항-CRISPR 단백질은 유리하게 "항-Cas9" 단백질로서, 예를 들어 AcrIIA1, AcrIIA2, AcrIIA3, AcrIIA4, AcrIIA5, AcrIIC1, AcrIIC2 및 AcrIIC3으로부터 선택된다 (Pawluk et al., 2018). 바람직하게 "항-Cas9" 단백질은 AcrIIA2 또는 AcrIIA4이다. 보다 더 바람직하게 "항-Cas9" 단백질은 AcrIIA4이다. 상기 단백질은 전형적으로 예를 들어 효소 Cas9에 결합하여, Cas9의 작용을 제한할 수 있고, 매우 유의하게, 이상적으로 방지할 수 있다 (Dong et al., 2017; Rauch et al., 2017).
유리하게 사용가능한 다른 항-CRISPR 단백질은 "항-MAD7" 단백질, 예를 들어 단백질 AcrVA1이다 (Marino et al., 2018).
바람직한 구현예에서, 항-CRISPR 단백질은 바람직하게 관심 박테리아 균주로 유전자 도구의 핵산 서열을 도입시키는 단계 동안에, DNA 엔도뉴클레아제의 작용을 억제, 바람직하게 중화시킬 수 있다.
항-CRISPR 단백질을 코딩하는 서열의 발현을 제어하는 프로모터는 바람직하게 유도성 프로모터이다. 유도성 프로모터는 항상적으로 발현되는, 전형적으로 상기 유도성 프로모터로부터 출발하여 전사 억제를 허용하는 단백질의 발현을 담당하는 유전자와 연관된다. 이러한 프로모터는 예를 들어 유전자 tetA 의 프로모터, 유전자 xylA 의 프로모터, 유전자 lacI 의 프로모터, 또는 유전자 bgaL 의 프로모터, 또는 이의 유도체로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 상황에서 사용가능한 유도성 프로모터의 예는 항상적으로 발현되고 그의 발현 생성물이 Pbgal로부터 시작되는 전사 억제를 허용하는 유전자 bgaR 와 함께, 유전자 도구 내에서, 동일 핵산 상에, 존재하는 프로모터 Pbgal (락토스로 유도가능)이다. 유도인자, 락토스의 존재 하에서, 프로모터 Pbgal의 전사 억제가 제거되어서, 후자의 하류에 위치된 유전자의 전사를 허용한다. 바람직하게, 하류에 위치된 유전자는 본 발명의 상황에서, 항-CRISPR 단백질을 코딩하는 유전자, 예를 들어 acrIIA4 에 상응된다.
항-CRISPR 단백질의 발현을 제어하는 프로모터는 유리하게 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들어 효소 Cas9이 작용을 제어하고, 따라서 박테리아, 예를 들어 클로스트리듐, 바실러스, 또는 락토바실러스 속의 박테리아의 형질전환, 및 바람직한 유전자 변형을 겪은 형질전환체의 생성을 용이하게 하는 것을 가능하게 만든다.
특정 구현예에서, 본 발명은 그의 서열이 "제1" 핵산으로서 SEQ ID NO: 23의 것인 플라스미드 벡터를 포함하는 유전자 도구에 관한 것이다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 그의 서열이 "제2" 또는 "제n" 핵산으로서 서열 SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124 및 SEQ ID NO: 125 중 하나로부터 선택되는 플라스미드 벡터를 포함하는 유전자 도구에 관한 것이다.
역시 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 그의 서열이 "핵산 OPT"로서 서열 SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124 및 SEQ ID NO: 125 중 하나로부터 선택되는 플라스미드 벡터를 포함하는 유전자 도구에 관한 것이다. 다른 특정 구현예에서, 유전자 도구는 SEQ ID NO: 23, 79, 80, 119, 123, 124 및 125 중 몇개 (예를 들어, 적어도 2개 또는 3개) 서열을 포함하고, 상기 서열은 서로 상이하다.
본 발명자는 박테리아 내에서, 상기 박테리아의 야생형 형태에 존재하는 유전 물질에 부분적으로 또는 전체로 부재하는 DNA 서열의 발현을 허용하는, 관심 핵산, 전형적으로 관심 DNA 서열의 예를 기술한다.
특정 구현예에서, 관심 DNA 서열의 발현은 박테리아, 예를 들어 클로스트리듐 속의 박테리아가 몇가지 상이한 당, 예를 들어 적어도 2종의 상이한 당, 전형적으로 5개 탄소 원자를 포함하는 당 (예컨대 글루코스 또는 만노스) 및/또는 6개 탄소 원자를 포함하는 당 (예컨대 자일로스, 아라비노스 또는 프룩토스) 중에서 적어도 2종의 상이한 당, 바람직하게 예를 들어 글루코스, 자일로스 및 만노스; 글루코스, 아라비노스 및 만노스; 및 글루코스, 자일로스 및 아라비노스로부터 선택되는, 적어도 3종의 상이한 당을 (전형적으로, 동시에) 발효시키도록 허용한다.
다른 특정 구현예에서, 관심 DNA 서열은 적어도 하나의 관심 생성물, 바람직하게 박테리아, 예를 들어 클로스트리듐, 바실러스 또는 락토바실러스 속의 박테리아에 의한 용매의 생성을 촉진하는 생성물, 전형적으로 적어도 하나의 관심 단백질, 예를 들어 효소; 막 단백질 예컨대 수송체; 다른 단백질의 성숙화를 위한 단백질 (샤페론 단백질); 전사 인자; 또는 이의 조합을 코딩한다.
바람직한 구현예에서, 관심 DNA 서열은 용매의 생성을 촉진하고, 전형적으로 i) 효소, 예를 들어 알데히드의 알콜로의 전환에 관여하는 효소를 코딩하는 서열, 예를 들어 알콜 데히드로게나제를 코딩하는 서열 (예를 들어, adh, adhE, adhE1, adhE2, bdhA, bdhB 및 bdhC 로부터 선택되는 서열), 트랜스퍼라제를 코딩하는 서열 (예를 들어, ctfA, ctfB, atoA 및 atoB 로부터 선택되는 서열), 데카르복실라제를 코딩하는 서열 (예를 들어, adc), 히드로게나제를 코딩하는 서열 (예를 들어, etfA, etfB 및 hydA 로부터 선택되는 서열), 및 이의 조합으로부터 선택되는 서열, ii) 막 단백질, 예를 들어 포스포트랜스퍼라제를 코딩하는 서열 (예를 들어, glcG, bglC, cbe4532, cbe4533, cbe4982, cbe4983, cbe0751 로부터 선택되는 서열), iii) 전사 인자를 코딩하는 서열 (예를 들어, sigL, sigE, sigF, sigG, sigH, sigK 로부터 선택되는 서열) 및 iv) 이의 조합으로부터 선택된다.
더 나아가서, 본 발명자는 인식 (적어도 부분적으로 결합), 및 바람직하게 표적화, 즉, 관심 박테리아의 게놈에서, i) 표적 서열, ii) 표적 서열의 전사를 제어하는 서열, 또는 iii) 표적 서열에 측접한 서열의 적어도 하나의 가닥을 인식하고 절단을 허용하는, 관심 핵산의 예를 기술한다.
인식되는 서열은 또한 본 명세서에서 "표적 서열" 또는 "표적화 서열"로서 확인된다.
상기 관심 핵산을 포함하거나, 또는 그로 이루어지는 유전자 도구가 또한 기술된다. 이러한 경우에, 관심 핵산은 전형적으로 본 명세서에 기술된 바와 같은 유전자 도구의 "제2" 또는 "제n" 핵산 내에 존재한다.
관심 핵산은 전형적으로 본 설명의 상황에서, 박테리아의 게놈의 인식 서열을 억제하거나 또는 이의 발현을 변형시키거나, 예를 들어, 이의 발현을 조정/조절하거나, 특히 이를 억제하거나, 바람직하게 상기 박테리아가 상기 서열로부터 출발하는, 단백질, 특히 기능성 단백질을 발현할 수 없게 만들도록 이를 변형시키기 위해 사용된다.
표적 서열이 관심 박테리아가 그에 내성을 부여하는 항생제를 함유하는 배양 배지에서 성장하도록 허용하는 효소를 코딩하는 서열, 이러한 서열의 전사를 제어하는 서열 또는 이러한 서열에 측접하는 서열일 때, 항생제는 전형적으로 암페니콜 부류에 속하는 항생제이다. 본 설명의 상황에서 관심 암페니콜의 예는 클로람페니콜, 티암페니콜, 아지담페니콜 및 플로르페니콜 (Schwarz S. et al., 2004), 특히 클로람페니콜 및 티암페니콜이다.
특정 구현예에서, 관심 핵산은 박테리아 게놈 내에서 표적화되는 DNA 영역/부분/서열과 100% 동일하거나 또는 적어도 80% 동일하거나, 바람직하게 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 표적 서열의 적어도 하나의 상보성 영역을 포함하고, 상기 영역/부분/서열의 상보성 서열의 전부 또는 일부, 전형적으로 적어도 1 뉴클레오티드, 바람직하게 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 14, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40 뉴클레오티드, 전형적으로 1, 10 또는 20 내지 1000 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 10 또는 20 내지 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 또는 200 뉴클레오티드, 1, 10 또는 20 내지 100 뉴클레오티드, 1, 10 또는 20 내지 50 뉴클레오티드, 또는 1, 10 또는 20 내지 40 뉴클레오티드, 예를 들어, 10 내지 40 뉴클레오티드, 10 내지 30 뉴클레오티드, 10 내지 20 뉴클레오티드, 20 내지 30 뉴클레오티드, 15 내지 40 뉴클레오티드, 15 내지 30 뉴클레오티드 또는 15 내지 20 뉴클레오티드를 포함하는 서열, 바람직하게 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 혼성화할 수 있다. 관심 핵산 내에 존재하는 표적 서역의 상보성 영역은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 CRISPR 도구에서 사용되는 가이드 RNA (gRNA)의 "SDS" 영역에 상응될 수 있다.
기술된 다른 특정 구현예에서, 관심 핵산은 박테리아 게놈 내에서 표적화된 상기 DNA 영역/부분/서열과 100% 동일하거나 또는 적어도 80% 동일하거나, 바람직하게 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한, 표적 서열에 각각 상보성인 적어도 2개 영역을 포함한다. 이들 영역은 상기 영역/부분/서열의 상보성 서열의 전부 또는 일부, 전형적으로 적어도 1 뉴클레오티드, 바람직하게 적어도 100 뉴클레오티드, 전형적으로 100 내지 1000 뉴클레오티드를 포함하는 상기 기술된 바와 같은 서열에 혼성화할 수 있다. 관신 핵산 내에 존재하는 표적 서열의 상보성 영역은 본 명세서에 기술된 바와 같은 유전자 변형을 위한 도구, 예를 들어 유전자 도구 ClosTron®, 유전자 도구 Targetron® 또는 ACE® 유형의 대립유전자 교환 도구에서 표적화된 서열의 5' 및 3'에 측접한 영역을 인식, 바람직하게 표적화할 수 있다.
특정 양태에 따라서, 표적 서열은 암페니콜 부류에 속하는 하나 이상의 항생제, 예를 들어 클로람페니콜 및/또는 티암페니콜을 함유하는 배양 배지에서 성장할 수 있는, 관심 박테리아, 예를 들어 클로스트리듐 속의 박테리아의 게놈 내에서, 암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제, 예를 들어 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제 또는 티암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 서열, 이러한 서열의 전사를 제어하는 서열, 또는 이러한 서열에 측접하는 서열이다.
인식되는 서열은 예를 들어 씨. 베이제링키이 DSM 6423의 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제, 또는 상기 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 catB (CIBE_3859)에 상응하는 서열 SEQ ID NO: 18, 또는 서열 SEQ ID NO: 18의 전부 또는 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함하는 서열이다. 달리 말해서, 인식되는 서열은 서열 SEQ ID NO: 18의 적어도 1 뉴클레오티드, 바람직하게 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40 뉴클레오티드, 전형적으로 1 내지 40 뉴클레오티드를 포함하는 서열, 바람직하게 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 뉴클레오티드를 포함하는 서열일 수 있다.
서열 SEQ ID NO: 18에 의해 코딩되는 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열의 예는 하기 참조 하에서 NCBI 데이터베이스에서 확인되는 서열에 상응된다: WP_077843937.1, SEQ ID NO: 44 (WP_063843219.1), SEQ ID NO: 45 (WP_078116092.1), SEQ ID NO: 46 (WP_077840383.1), SEQ ID NO: 47 (WP_077307770.1), SEQ ID NO: 48 (WP_103699368.1), SEQ ID NO: 49 (WP_087701812.1), SEQ ID NO: 50 (WP_017210112.1), SEQ ID NO: 51 (WP_077831818.1), SEQ ID NO: 52 (WP_012059398.1), SEQ ID NO: 53 (WP_077363893.1), SEQ ID NO: 54 (WP_015393553.1), SEQ ID NO: 55 (WP_023973814.1), SEQ ID NO: 56 (WP_026887895.1), SEQ ID NO 57 (AWK51568.1), SEQ ID NO: 58 (WP_003359882.1), SEQ ID NO: 59 (WP_091687918.1), SEQ ID NO: 60 (WP_055668544.1), SEQ ID NO: 61 (KGK90159.1), SEQ ID NO: 62 (WP_032079033.1), SEQ ID NO: 63 (WP_029163167.1), SEQ ID NO: 64 (WP_017414356.1), SEQ ID NO: 65 (WP_073285202.1), SEQ ID NO: 66 (WP_063843220.1), 및 SEQ ID NO: 67 (WP_021281995.1).
서열 SEQ ID NO: 18에 의해 코딩되는 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제와 적어도 75% 동일한 아미노산 서열의 예는 서열 WP_077843937.1, WP_063843219.1, WP_078116092.1, WP_077840383.1, WP_077307770.1, WP_103699368.1, WP_087701812.1, WP_017210112.1, WP_077831818.1, WP_012059398.1, WP_077363893.1, WP_015393553.1, WP_023973814.1, WP_026887895.1 AWK51568.1, WP_003359882.1, WP_091687918.1, WP_055668544.1 및 KGK90159.1에 상응된다.
서열 SEQ ID NO: 18에 의해 코딩되는 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제와 적어도 90%가 동일한 아미노산 서열의 예는 서열 WP_077843937.1, WP_063843219.1, WP_078116092.1, WP_077840383.1, WP_077307770.1, WP_103699368.1, WP_087701812.1, WP_017210112.1, WP_077831818.1, WP_012059398.1, WP_077363893.1, WP_015393553.1, WP_023973814.1, WP_026887895.1 및 AWK51568.1이다.
서열 SEQ ID NO: 18에 의해 코딩되는 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제와 적어도 95%가 동일한 아미노산 서열의 예는 서열 WP_077843937.1, WP_063843219.1, WP_078116092.1, WP_077840383.1, WP_077307770.1, WP_103699368.1, WP_087701812.1, WP_017210112.1, WP_077831818.1, WP_012059398.1, WP_077363893.1, WP_015393553.1, WP_023973814.1, 및 WP_026887895.1에 상응한다.
서열 SEQ ID NO: 18에 의해 코딩되는 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제와 적어도 99%가 동일한, 바람직한 아미노산 서열은 서열 WP_077843937.1, SEQ ID NO: 44 (WP_063843219.1) 및 SEQ ID NO: 45 (WP_078116092.1)이다.
서열 SEQ ID NO: 18과 동일한 특정 서열은 참조 WP_077843937.1 하에 NCBI 데이터베이스에서 확인되는 서열이다.
특정 예에 따라서, 표적 서열은 그의 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 66 (WP_063843220.1)에 상응하는 씨. 퍼프린젠스의 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제, 또는 상기 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%가 동일한 서열을 코딩하는 유전자 catQ에 상응하는 서열 SEQ ID NO: 68, 또는 서열 SEQ ID NO: 68의 전부 또는 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함하는 서열이다.
달리 말해서, 인식되는 서열은 서열 SEQ ID NO: 68의 적어도 1 뉴클레오티드, 바람직하게 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40 뉴클레오티드, 전형적으로 1 내지 40 뉴클레오티드를 포함하는 서열, 바람직하게 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 뉴클레오티드를 포함하는 서열일 수 있다.
또 다른 특정 예에서, 인식되는 서열은 박테리아 내에 천연적으로 존재하거나, 또는 상기 박테리아로 인공적으로 도입된, 당업자에게 공지된, 핵산 서열 catB (SEQ ID NO: 18), catQ (SEQ ID NO 68), catD (SEQ ID NO: 69, Schwarz S. et al., 2004) 또는 catP (SEQ ID NO: 70, Schwarz S. et al., 2004)로부터 선택된다.
상기 명시된 바와 같이, 다른 특정 예에 따라서, 표적 서열은 또한 상기 정의된 바와 같은 코딩 서열 (관심 박테리아가 내성이 부여된 항생제를 함유하는 배양 배지에서 성장되게 허용하는 효소를 코딩)의 전사를 제어하는 서열, 전형적으로 프로모터 서열, 예를 들어 유전자 catB 의 프로모터 서열 (SEQ ID NO: 73) 또는 유전자 catQ 의 프로모터 서열 (SEQ ID NO: 74)일 수 있다.
관심 핵산은 이후에 인식되므로, 전형적으로 상기 기술된 바와 같은 코딩 서열의 전사를 제어하는 서열에 결합할 수 있다.
다른 특정 예에 따라서, 표적 서열은 상기 기술된 바와 같은 코딩 서열에 측접하는 서열, 예를 들어, 서열 SEQ ID NO: 18의 유전자 catB 에 측접하는 서열 또는 후자와 적어도 70% 동일한 서열에 측접하는 서열일 수 있다. 상기 측접 서열은 전형적으로 1, 10 또는 20 내지 1000 뉴클레오티드, 예를 들어 1, 10 또는 20 내지 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 또는 200 뉴클레오티드, 1, 10 또는 20 내지 100 뉴클레오티드, 1, 10 또는 20 내지 50 뉴클레오티드, 또는 1, 10 또는 20 내지 40 뉴클레오티드, 예를 들어 10 내지 40 뉴클레오티드, 10 내지 30 뉴클레오티드, 10 내지 20 뉴클레오티드, 20 내지 30 뉴클레오티드, 15 내지 40 뉴클레오티드, 15 내지 30 뉴클레오티드 또는 15 내지 20 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 양태에 따라서, 표적 서열은 상기 코딩 서열에 측접하는 서열의 쌍에 상응하고, 각각의 측접 서열은 전형적으로 적어도 20 뉴클레오티드, 전형적으로 100 내지 1000 뉴클레오티드, 바람직하게 200 내지 800 뉴클레오티드를 포함한다.
본 설명의 상황에서, 관심 박테리아를 형질전환 및/또는 유전자 변형시키는데 사용되는, 관심 핵산의 특정 예는 박테리아, 예를 들어 상기 기술된 바와 같은 클로스트리듐 속의 박테리아의 게놈 내에서, i) 코딩 서열을 인식하거나, ii) 코딩 서열의 전사를 제어하거나, 또는 iii) 코딩 서열, 관심 효소, 바람직하게 암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제, 예를 들어, 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제 또는 티암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제에 측접하는, DNA 단편이다.
상기 명시된 바와 같이, 본 발명에 따른 관심 핵산의 예는 박테리아의 게놈의 인식 서열 ("표적 서열")을 억제하거나 또는 이의 발현을 변형시키거나, 예를 들어 이를 조정하거나, 특히 특히 이를 억제하거나, 바람직하게 상기 박테리아가 상기 서열로부터 출발하는, 단백질, 예를 들어 암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제, 특히 기능성 단백질을 발현할 수 없게 만들기 위해 이를 변형시킬 수 있다.
효소를 코딩하는 인식 서열이 클로람페니콜 및/또는 티암페니콜에 대한 내성을 박테리아에게 부여하는 서열인 특정 구현예에서, 사용되는 선택 유전자는 클로람페니콜 및/또는 티암페니콜에 대한 내성 유전자가 아니고, 바람직하게 유전자 catB, catQ, catD 또는 catP 중 하나가 아니다
특정 구현예에서, 관심 핵신은 코딩 서열을 표적화하거나, 코딩 서열의 전사를 제어하거나, 또는 코딩 서열, 관심 효소, 특히 암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제에 측접하는 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA), 및/또는 변형 매트릭스 (본 명세서에서 또한 "편집 매트릭스"라고도 함), 예를 들어, 표적 서열의 전부 또는 일부를 제거하거나 또는 변형시키는 것을 가능하게 만드는 매트릭스, 바람직하게 표적 서열의 발현을 억제 또는 저해하려는 목적을 갖는, 전형적으로 상기 기술된 바와 같은 표적 서열의 상류 및 하류에 위치하는 서열에 (상응하는) 상동성 서열, 전형적으로 각각이 10 또는 20 염기쌍 내지 1000, 1500 또는 2000 염기쌍, 예를 들어 100, 200, 300, 400 또는 500 염기쌍 내지 1000, 1200, 1300, 1400 또는 1500 염기쌍, 바람직하게 100 내지 1500 또는 100 내지 1000 염기쌍, 보다 더 바람직하게 500 내지 1000 염기쌍 또는 200 내지 800 염기쌍을 포함하는 (표적 서열의 상류 및 하류에 위치하는 상기 서열에 상동성) 서열을 포함하는 매트릭스를 포함한다.
특정 구현예에서, 관심 박테리아를 형질전환 및/또는 유전자 변형시키는데 사용되는 관심 핵산은 Dam 및 Dcm 유형의 메틸트랜스퍼라제 (dam- dcm- 유전자형을 갖는 에스케리치아 콜라이 박테리아로부터 제조)에 의해 인식되는 모티프의 수준에서 메틸화를 갖지 않는 핵산이다.
형질전환 및/또는 유전자 변형시키려는 관심 박테리아가 하위분기군 DSM 6423, LMG 7814, LMG 7815, NRRL B-593 및 NCCB 27006 중 하나에 속하는, 씨. 베이제링키이 박테리아일 때, 유전자 도구로서 사용되는 관심 핵산, 예를 들어 플라스미드는 Dam 및 Dcm 유형의 메틸트랜스퍼라제에 의해 인식되는 모티프 수준에서 메틸화를 갖지 않는 핵산, 전형적으로 GATC 모티프의 아데노신 ("A") 및/또는 CCWGG 모티프 (W는 아데노신 ("A") 또는 티민 ("T")에 상응할 수 있음)의 제2 시토신 "C"가 탈메틸화된 핵산이다.
Dam 및 Dcm 유형의 메틸트랜스퍼라제에 의해 인식되는 모티프의 수준에서 메틸화를 갖지 않는 핵산은 전형적으로 dam - dcm - 유전자형을 갖는 에스케리치아 콜라이 박테리아 (예를 들어, 에스케리치아 콜라이 INV 110, Invitrogen)로부터 제조될 수 있다. 이와 동일한 핵산은 예를 들어 ecoKI 유형의 메틸트랜스퍼라제에 의해 수행되는 다른 메틸화를 포함할 수 있고, 후자는 모티프 AAC(N6)GTGC 및 GCAC(N6)GTT (N은 임의 염기에 상응할 수 있음)의 아데닌 ("A")을 표적화한다.
특정 구현예에서, 표적화된 서열은 암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제, 예를 들어 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자, 예컨대 유전자 catB, 이 유전자의 전사를 제어하는 서열, 또는 이 유전자에 측접한 서열에 상응한다.
본 발명자가 기술한 특정 관심의 핵산은 예를 들어 벡터, 바람직하게 플라스미드, 예를 들어 본 설명의 실험 부분 (실시예 2 참조)에 기술된, 서열 SEQ ID NO: 21의 플라스미드 pCas9ind-ΔcatB 또는 서열 SEQ ID NO: 38의 플라스미드 pCas9ind-gRNA_catB, 특히 Dam 및 Dcm 유형의 메틸트랜스퍼라제에 의해 인식되는 모티프의 수준에서 메틸화를 갖지 않는 상기 서열의 형태이다.
본 설명은 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 관심 박테리아를 형질전환 및/또는 유전자 변형시키기 위한 관심 핵산의 용도에 관한 것이다.
본 발명자가 기술하는 다른 양태는 본 발명에 따른 유전자 도구를 사용하여, 전형적으로 상기 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 관심 핵산을 사용하여, 퍼미큐테스 문에 속하는 박테리아, 예를 들어, 클로스트리듐 속, 바실러스 속 또는 락토바실러스 속의 박테리아, 전형적으로 용매형성성 박테리아, 특히 클로스트리듐 속의 용매형성성 박테리아를 형질전환, 바람직하게 또한 유전자 변형시키기 위한 방법에 관한 것이다. 이 방법은 유리하게 상기 박테리아로, 본 명세서에 기술된 바와 같은 유전자 도구의 전부 또는 일부, 특히 본 명세서에 기술된 바와 같은 관심 핵산, 바람직하게 i) 서열 SEQ ID NO: 126 (OREP)의 전부 또는 일부 , 및 ii) 박테리아의 유전 물질의 변형 및/또는 상기 박테리아에서, 상기 박테리아의 야생형 형태에 존재하는 유전 물질에 부분적으로 또는 전체적으로 부재하는 DNA 서열의 발현을 허용하는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지는 "핵산 OPT"를 도입시켜서 박테리아를 형질전환시키는 단계를 포함한다. 방법은 형질전환된 박테리아, 즉 필요한 재조합 또는 재조합들/변형 또는 변형들/최적화 또는 최적화들을 갖는 박테리아를 수득, 회수, 선택 또는 단리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 박테리아를 형질전환, 바람직하게 유전자 변형시키기 위한 방법은 유전자 변형을 위한 도구, 예를 들어 CRISPR 도구, II형 인트론의 사용을 기반으로 하는 도구 (예를 들어, Targetron® 도구 또는 ClosTron® 도구) 및 대립유전자 교환 도구 (예를 들어, ACE® 도구)로부터 선택되는 유전자 변형을 위한 도구를 포함하고, 상기 박테리아로, 상기 기 술된 바와 같은 본 발명에 따른 관심 핵산을 도입시켜서 박테리아를 형질전환시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 전형적으로 유리하게 퍼미큐테스 문에 속하는 박테리아, 예를 들어 클로스트리듐 속의 박테리아를 형질전환, 및 바람직하게 유전자 변형시키기 위해 선택된 유전자 변형 도구가 야생 상태에서 하나 이상의 항생제에 대한 내성을 담당하는 효소를 코딩하는 유전자를 보유하고/하거나, 야생 상태에서 적어도 하나의 염색체외 DNA 서열을 보유하는, 박테리아, 예컨대 씨. 베이제링키이에 대해 사용하고자 의도되는 경우에 적용되고, 상기 유전자 도구의 응용은 박테리아가 야생 상태에서 내성인 항생제에 대한 내성 마커의 발현을 허용하는 핵산을 사용하여 상기 박테리아를 형질전환시키는 단계 및/또는 바람직하게 상기 박테리아 중에서, 상기 염색체외 DNA 서열을 상실한 박테리아를 선택하기 위해서, (박테리아가 야생 상태에서 내성인) 상기 항생제를 사용하여 형질전환 및/또는 유전자 변형된 박테리아를 선택하는 단계를 포함한다.
예를 들어 CRISPR 도구, II형 인트론의 사용을 기반으로 하는 도구, 및 대립유전자 교환 도구로부터 선택되는 유전자 변형을 위한 도구를 사용하여, 본 발명 덕분에 유리하게 수행가능한 변형은 비바람직한 서열, 예를 들어 박테리아에 하나 이상의 항생제에 대한 내성을 부여하는 효소를 코딩하는 서열을 억제하는 단계, 또는 이러한 비바람직한 서열을 비-기능성으로 만드는 단계로 이루어진다. 본 발명 덕분에 유리하게 수행가능한 다른 변형은 박테리아를, 이의 성능, 예를 들어 관심 용매 또는 관심 용매의 혼합물의 생성에서 이의 성능을 개선시키기 위해서, 유전자 변형시키는 단계로 이루어지고, 상기 박테리아는 야생 상태에서 내성이었던 항생제에 감수성이게 만들고/만들거나, 상기 박테리아의 야생 형태에 존재하는 염색체외 DNA 서열을 제거하기 위해 본 발명의 수단을 통해서 이전에 이미 변형되었다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기술/유전자 도구, 특히 CRISPR/Cas (CRISPR-연관 단백질) 유전자 도구의 사용을 기반으로 한다 (적용한다).
본 발명은 [Wang et al. (2015)]에 기술된 것과 같은 뉴클레아제, gRNA 및 복구 매트릭스를 포함하는 단일 플라스미드를 사용하는 통상의 CRISPR/Cas 유전자 도구를 사용해 구현될 수 있다.
당업자는 충분히 공지된 기술을 사용하여 표적화하려는 염색체 영역 또는 이동성 유전자 엘리먼트에 따라서 gRNA의 구조 및 서열을 쉽게 정의할 수 있다 (예를 들어, [DiCarlo et al., 2013]의 논문 참조).
본 발명자는 2종 플라스미드의 사용을 기반으로, 본 발명의 상황에서 또한 사용가능한, 클로스트리듐 속의 박테리아에 적합한, 박테리아를 변형시키기 위한 유전자 도구를 개발하고 기술하였다 (참조: WO2017/064439, Wasels et al., 2017, 및 본 명세서에 첨부된 도 15).
특정 구현예에서, 이러한 도구의 "제1" 플라스미드는 뉴클레아제 Cas 의 발현을 허용하고, 실시하려는 변형에 특이적인, "제2" 플라스미드는 하나 이상의 gRNA 발현 카세트 (전형적으로 박테리아 DNA의 상이한 영역을 표적화)를 비롯하여, 상동성 재조합 기전을 통해서, Cas에 의해 표적화되는 박테리아 DNA의 일부분의 관심 서열로의 치환을 허용하는 복구 매트릭스를 함유한다. 유전자 cas 및/또는 gRNA 발현 카세트(들)는 항상성 또는 유도성, 바람직하게 당업자에게 공지된 유도성, 발현 프로모터 (예를 들어, 참조로 본 설명에 편입되는 국제 공개 특허 출원 공개 번호 WO2017/064439에 기술됨)의 제어 하에 위치되고, 바람직하게 상이하지만, 동일한 유도인자에 의해 유도가능하다.
사용가능한 gRNA는 본 명세서에서 상기 기술된 바와 같은 gRNA에 상응한다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 박테리아를 형질전환, 및 전형적으로 상동성 재조합을 통해서 유전자 변형시키기 위해 본 발명의 상황에서 사용가능한, CRISPR 기술을 포함하는 특정 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 박테리아로, 항-CRISPR 단백질의 발현을 유도하기 위한 작용제의 존재 하에서 본 발명자에 의해 기술된 핵산 또는 유전자 도구를 도입시키는 단계, 및
b) 단계 a)의 종료 시에 수득된 형질전환된 박테리아를, 전형적으로 DNA 엔도뉴클레아제/gRNA 리보뉴클레오단백질 복합체, 전형적으로 Cas/gRNA의 발현을 허용하는, 항-CRISPR 단백질의 발현의 유도인자를 (상기 항-CRISPR 단백질의 생성을 중지시키고 엔도뉴클레아제의 작용을 허용하기 위해) 함유하지 않는 배지 (또는 포함하지 않는 조건)에서 배양시키는 단계.
항-CRISPR 단백질의 발현의 유도인자는 상기 발현을 유도시키기에 충분한 분량으로 존재한다. 프로모터 Pbgal의 경우에, 유도인자, 락토스는 단백질 BgaR의 발현에 연결된 항-CRISPR 단백질의 발현의 억제 (전사 억제)를 제거하는 것을 가능하게 만든다.
항-CRISPR 단백질의 발현의 유도인자는 바람직하게 약 1 mM 내지 약 1M, 바람직하게 약 10 mM 내지 약 100 mM, 예를 들어 약 40 mM의 농도로 사용된다.
바람직한 구현예에서, 항-CRISPR 단백질은 바람직하게 유전자 도구의 핵산 서열을 관심 박테리아 균주에 도입시키는 단계 동안, 뉴클레아제의 작용을 억제, 바람직하게 중화시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 방법은 단계 b) 동안 또는 그 이후에, 상기 유전자 도구가 상기 박테리아에 도입되었으면 박테리아의 관심 유전자 변형을 허용하기 위해서, 상기 프로모트(들)가 유전자 도구에 존재할 때, 뉴클레아제 및/또는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA들의 발현을 제어하는 유도성 프로모터 또는 프로모터들의 발현의 유도 단계를 더 포함한다. 유도는 선택된 유도성 프로모터에 연결된 발현의 억제를 제거시키는 것을 가능하게 만드는 물질을 사용해 수행된다.
존재할 때, 따라서 유도 단계는 표적 박테리아로 본 발명에 따른 유전자 도구의 도입 이후에, 당업자에게 공지된 엔도뉴클레아제/gRNA 리보뉴클레오단백질 복합체의 발현을 허용하는 배지에서 임의의 배양 단계를 통해 수행될 수 있다. 이것은 예를 들어 박테리아를 충분한 분량으로 존재하는 적합한 물질과 접촉시키거나, 또는 UV 광에 노출을 통해서 수행된다. 이러한 물질은 선택된 유도성 프로모터에 연결된 발현의 억제를 제거하는 것을 가능하게 만든다. 선택된 프로모터가 Pcm-2tetO1 및 Pcm-tetO2/1로부터 선택되는, 언히드로테트라사이클린 (aTc)으로 유도가능한 프로모터일 때, aTc는 바람직하게 약 1 ng/mL 내지 약 5000 ng/mL, 바람직하게 약 10 ng/mL 내지 1000 ng/mL, 10 ng/mL 내지 800 ng/mL, 10 ng/mL 내지 500 ng/mL, 100 ng/mL 또는 200 ng/mL 내지 약 800 ng/mL 또는 1000 ng/mL, 또는 약 100 ng/mL 또는 200 ng/mL 내지 약 500 ng/mL, 600 ng/mL 또는 700 ng/mL, 예를 들어 약 50 ng/mL, 100 ng/mL, 150 ng/mL, 200 ng/mL, 250 ng/mL, 300 ng/mL, 350 ng/mL, 400 ng/mL, 450 ng/mL, 500 ng/mL, 550 ng/mL, 600 ng/mL, 650 ng/mL, 700 ng/mL, 750 ng/mL 또는 800 ng/mL의 농도로 사용된다.
다른 특정 구현예에서, 방법은 복구 매트릭스를 함유하는 핵산을 제거 (그러면 박테리아 세포는 상기 핵신이 "스트리핑"된 것으로 간주)하고/하거나, 단계 a)의 유전자 도구로 도입된 가이드 RNA 또는 가이드 RNA들을 코딩하는 서열 또는 가이드 RNA 또는 가이드 RNA들을 제거하는 추가 단계 c)를 포함한다.
또 다른 특정 구현예에서, 방법은 단계 b) 또는 단계 c)에 후속하여, 항-CRISPR 단백질의 발현을 유도하기 위한 작용제의 존재 하에서, 이미 도입된 것과 상이한 복구 매트릭스를 함유하는 제n, 예를 들어 제3, 제4, 제5 등의 핵산, 및 박테리아의 게놈의 표적화된 구역에 상기 별개 복구 매트릭스에 함유된 관심 서열의 통합을 허용하는 가이드 RNA의 하나 이상의 발현 카세트를 도입시키는 하나 이상의 추가 단계를 포함하고, 각각의 추가 단계는 항-CRISPR 단백질의 발현을 유도하기 위해서, 전형적으로 Cas/gRNA 리보뉴클레오단백질 복합체의 발현을 허용하기 위해서 작용제를 함유하지 않는 배지에서 이렇게 형질전환시킨 박테리아를 배양하는 단계가 후속된다.
본 발명에 따른 방법의 특정 구현예에서, 박테리아는 관심 표적 서열의 적어도 하나의 가닥의 절단을 담당하는 효소를 사용 (예를 들어, 코딩)하여, 상기 기술된 것과 같은 핵산 또는 유전자 도구를 사용해 형질전환되고, 특정 구현예에서, 효소는 뉴클레아제, 바람직하게 Cas 유형의 뉴클레아제이고, 바람직하게 Cas9 효소 및 MAD7 효소로부터 선택된다. 일 구현예에서, 관심 표적 서열은 서열, 예를 들어 박테리아에 하나 이상의 항생제, 바람직하게 암페니콜 부류에 속하는 하나 이상의 항생제, 전형적으로 암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제 예컨대 클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제에 대한 내성을 부여하는 효소를 코딩하는 유전자 catB, 코딩 서열의 전사를 제어하는 서열, 또는 상기 코딩 서열에 측접한 서열이다.
이것이 사용될 때, 항-CRISPR 단백질은 전형적으로 상기 기술된 바와 같은 "항-Cas" 단백질이다. 항-CRISPR 단백질은 유리하게 "항-Cas9" 단백질 또는 "항-MAD7" 단백질이다.
표적화된 DNA ("인식되는 서열")의 일부분처럼, 편집/복구 매트릭스는 그 자체로 천연 및/또는 합성, 코딩 및/또는 비-코딩 서열에 상응하는 핵산 서열의 일부분 또는 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 매트릭스는 또한 하나 이상의 "외래", 즉 퍼미큐테스 문, 특히 클로스트리듐 속, 바실러스 속 또는 락토바실러스 속에 속하는 박테리아의 게놈, 또는 상기 속의 특정 종의 게놈에 천연적으로 부재하는, 서열을 포함할 수 있다. 매트릭스는 또한 서열의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 상황에서 사용되는 유전자 도구는 복구 매트릭스가, 박테리아 게놈 내에서, 관심 핵산, 전형적으로 적어도 1 염기쌍 (bp), 바람직하게 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 1 000, 10 000, 100 000 또는 1 000 000 bp, 전형적으로 1 bp 내지 20 kb, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13 kb, 또는 1 bp 내지 10 kb, 바람직하게 10 bp 내지 10 kb 또는 1 kb 내지 10 kb, 예를 들어 1 bp 내지 5 kb, 2 kb 내지 5 kb, 또는 그외에 2.5 또는 3 kb 내지 5 kb를 포함하는 서열 또는 DNA 서열의 일부분의 도입을 유도하도록 허용한다.
특정 구현예에서, 관심 DNA 서열의 발현은 퍼미큐테스 문, 특히 클로스트리듐 속, 바실러스 속, 또는 락토바실러스 속에 속하는 박테리아가, 몇가지 상이한 당, 예를 들어 적어도 2종의 상이한 당, 전형적으로 5개 탄소 원자를 포함하는 당 (예컨대, 글루코스 또는 만노스) 및/또는 6개 탄소 원자를 포함하는 당 (예컨대 자일로스, 아라비노스 또는 프룩토스) 중에서 적어도 2종의 상이한 당, 바람직하게 예를 들어, 글루코스, 자일로스 및 만노스; 글루코스, 아라비노스 및 만노스; 및 글루코스, 자일로스 및 아라비노스로부터 선택되는, 적어도 3종의 상이한 당을 (전형적으로 동시에) 발효하도록 허용한다.
다른 특정 구현예에서, 관심 DNA 서열은 적어도 하나의 관심 생성물, 바람직하게 변형된 박테리아에 의한 용매의 생성을 촉진하는 생성물, 전형적으로 적어도 하나의 관심 단백질, 예를 들어 효소; 막 단백질 예컨대 수송체; 다른 단백질의 성숙화를 위한 단백질 (샤페론 단백질); 전사 인자; 또는 이의 조합을 코딩한다.
유전자 도구의 엘리먼트 (핵산 또는 gRNA)는 당업자에게 공지된 임의의 간접 또는 직접 방법을 통해서, 예를 들어 형질전환, 접합, 미세주입, 형질감염, 전기천공 등을 통해서, 바람직하게 전기천공을 통해서 박테리아로 도입된다 (Mermelstein et al., 1993).
다른 구현에에서, 본 발명에 따른 방법은 II형 인트론의 사용을 기반으로 하고, 예를 들어 ClosTron® 기술/유전자 도구 또는 Targetron® 유전자 도구를 적용한다.
Targetron® 기술은 전형적으로 표적화된 유전자를 불활성화시키려는 목적으로, 바람직한 유전자좌로 신속하게 박테리아 게놈을 통합시킬 수 있는, 재프로그램가능한 II군 인트론 (락토코쿠스 락티스의 인트론 Ll.ltrB 기반)의 사용을 기반으로 한다 (Chen et al., 2005, Wang et al., 2013). 역스플라이싱을 통한 게놈 내 삽입뿐만 아니라 편집된 구역의 인식 기전은 한편으로는 인트론과 상기 구역 간 상동성, 및 다른 한편으로 단백질 (ltrA)의 활성을 기반으로 한다.
ClosTron® 기술은 인트론의 서열에 선택 마커의 첨가가 보충된, 유사한 접근법을 기반으로 한다 (Heap et al., 2007). 이러한 마커는 게놈에 인트론의 통합을 선택하는 것을 가능하게 만들고, 그러므로 바람직한 돌연변이체의 생성을 용이하게 한다. 이러한 유전자 시스템은 또한 I형 인트론을 이용한다. 사실, 선택 마커 (RAM (retrotransposition-activated marker)라고 함)는 플라스미드로부터 이의 발현을 방지하는, 이러한 종류의 유전자 엘리먼트에 의해 방해받는다 (시스템의 보다 상세한 설명: Zhong et al.). 이러한 유전자 엘리먼트의 스플라이싱은 게놈에 통합 이전에 일어나서, 내성 유전자의 활성 형태를 갖는 염색체의 생성을 허용한다. 시스템의 최적화된 형태는 이러한 유전자의 상류 및 하류에 FLP/FRT 부위를 포함하여, 내성 유전자를 제거하기 위해 리콤비나제 FRT를 사용하는 것을 가능하게 만든다 (Heap et al., 2010).
다른 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 대립유전자 교환 도구의 사용을 기반으로 하고, 예를 들어 ACE® 기술/유전자 도구를 적용한다.
ACE® 기술은 영양요구성 돌연변이체의 사용을 기반으로 한다 (씨. 아세토부틸리쿰 ATCC 824의 우라실의 경우 유전자 pyrE,의 결실을 통해서, 또한 5-플루오로오로트산 (5-FOA)에 대한 내성이 야기됨; Heap et al., 2012). 시스템은 당업자에게 충분히 공지된, 대립유전다 교환 기전을 사용한다. 가성-자살 벡터 (매우 약한 카피수를 가짐)로 형질전환 이후에, 제1 대립유전자 교환 사건을 통한 박테리아 염색체 내 후자의 통합은 초기에 플라스미드 상에 존재한 내성 유전자 덕분에 검증될 수 있다. 통합 단계는 유전자좌 pyrE 내 또는 다른 유전자좌 내에서, 2종의 상이한 방식으로 수행될 수 있다:
유전자좌 pyrE 에서 통합의 경우에, 유전자 pyrE 는 또한 플라스미드에 위치하지만, 발현은 없다 (기능성 프로모터 없음). 제2 재조합은 기능성 유전자 pyrE 를 복원하고 그 다음으로 영양요구성 (우라실 함유하지 않는, 최소 배지)으로 선택될 수 있다. 비기능성 유전자 pyrE 가 또한 선태가능한 특징 (5-FOA에 대한 감수성)을 가지므로, 이후에 기능성 및 비-기능성 사이에서 pyrE 의 상태를 성공적으로 교대시켜서, 동일 모델에서 다른 통합을 고려가능하다.
다른 유전자좌에서 통합의 경우에, 재조합 이후에 반대-선택 마커의 발현을 허용하는 게놈 구역이 표적화된다 (전형적으로, 다른 유전자, 바람직하게 강력하게 발현되는 유전자 이후 오페론에 대함). 이러한 제2 재조합은 이후에 영양요구성 (우라실을 함유하지 않는 최소 배지)을 통해 선택된다.
II형 인트론의 사용을 기반으로 하고, 예를 들어 ClosTron® 기술/유전자 도구 또는 Targetron® 유전자 도구를 적용하거나, 또는 대립유전자 교환 도구의 사용을 기반으로 하고, 예를 들어 ACE® 기술/유전자 도구를 적용하는, 기술된 구현예에서, 표적화된 서열은 전형적으로 본 명세서에 기술된 서열 중 하나이다.
특히 유리하게, 본 발명에 따른 핵산 및 유전자 도구는 하나의 단계로, 즉,단일 핵산 (전형적으로 본 명세서에 기술된 바와 같은 도구의 "핵산 OPT" 또는 "제2" 또는 "제n" 핵산)을 사용하거나, 또는 몇 개 단계로, 즉, 몇 종의 핵산 (전형적으로, 본 명세서에 기술된 바와 같은 "제2" 또는 "제n" 핵산)을 사용하여, 바람직하게 하나의 단계로, 박테리아에 관심의 소형 및 대형 서열 둘 모두의 도입을 허용한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 핵산 및 유전자 도구는 박테리아 DNA의 표적화된 부분을 억제하거나, 또는 이것을 더 짧은 서열 (예를 들어, 적어도 하나의 염기쌍을 상실한 서열)로 및/또는 비-기능성으로 치환시키는 것을 가능하게 만든다. 본 발명의 바람직한 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 핵산 및 유전자 도구는 유리하게 박테리아로, 예를 들어 박테리아 게놈으로, 적어도 하나의 염기쌍, 및 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 kb를 포함하는 관심 핵산을 도입시키는 것을 가능하게 만든다.
본 발명은 또한 형질전환 및/또는 유전자 변형된 박테리아, 전형적으로 퍼미큐테스 문에 속하고, 예를 들어 클로스트리듐 속, 바실러스 속, 또는 락토바실러스 속에 속하는 박테리아, 전형적으로 용매형성성 박테리아, 바람직하게 본 명세서에서 발명자가 기술하거나 또는 본 명세서에서 발명자가 기술한 바와 같은 방법을 사용해 수득된 하위분기군 중 하나에 상응하는 종에 속하는 박테리아를 비롯하여, 이의 임의의 유래된 박테리아, 클론, 돌연변이체 또는 유전자 변형 형태, 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따라서 이렇게 형질전환 및/또는 유전자 변형된 박테리아의 예는 하나 이상의 항생제에 대한 내성을 부여하는 효소를 더 이상 발현하지 않는 박테리아, 특히 암페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제를 더 이상 발현하지 않는 박테리아, 예를 들어 야생 상태에서 유전자 catB 를 발현하고, 본 발명에 따라 형질전환 및/또는 유전자 변형될 때 상기 유전자 catB 가 결여되거나 또는 상기 유전자 catB 를 발현할 수 없는 박테리아이다. 이렇게 본 발명에 따라서 형질전환 및/또는 유전자 변형된 박테리아는 암페니콜, 예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같은 암페니콜, 특히 클로람페니콜 또는 티암페니콜에 감수성이게 된다.
본 발명에 따라서 바람직한 유전자 변형된 박테리아의 특정 예는 수탁 번호 LMG P-31151 하에 벨기에 공동 미생물 자원 센터 (Belgian Co-ordinated collections of Microorganisms) ("BCCM", K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Ghent - Belgium)에 2018년 12월 6자로 등록된 씨. 베이제링키이 IFP962 ΔcatB 로서 본 설명에서 확인되는 박테리아이다.
본 발명에 따라 바람직한 유전자 변형된 박테리아의 다른 특정 예는 수탁 번호 LMG P-31277 하에 컬렉션 BCCM-LMG에 2019년 2월 20일 자로 등록된 균주 씨. 베이제링키이 IFP963 ΔcatB ΔpNF2로서 본 설명에서 확인되는 씨. 베이제링키이 박테리아이다.
본 설명은 또한 상기 박테리아 중 하나의 임의 유래된 박테리아, 클론, 돌연변이체 또는 유전자 변형된 형태, 예를 들어, 암페니콜 예컨대 티암페니콜 및/또는 클로람페니콜에 감수성인 채로 남아 있는 임의의 유래된 박테리아, 클론, 돌연변이체, 또는 유전자 변형된 형태, 전형적으로 서열 SEQ ID NO: 18의 유전자 catB 및 플라스미드 pNF2가 결여된 박테리아에 관한 것이다.
특정 구현예에 따라서, 본 발명에 따라 형질전환 및/또는 유전자 변형된 박테리아, 예를 들어 박테리아 씨. 베이제링키이 IFP962 ΔcatB 또는 박테리아 씨. 베이제링키이 IFP963 ΔcatB ΔpNF2는 여전히 형질전환될 수 있고, 바람직하게 유전자 변형될 수 있다. 이것은 핵산, 예를 들어, 본 설명, 예를 들어 실험 부분에서 기술되는 바와 같은 플라스미드를 사용해 수행될 수 있다. 사용가능한 핵산의 예는 유리하게 서열 SEQ ID NO: 23의 플라스미드 pCas9acr (본 설명의 실험 부분에 기술) 또는 그외에 pCas9ind (SEQ ID NO: 22), pCas9cond (SEQ ID NO: 133) 및 pMAD7 (SEQ ID NO: 134)로부터 선택되는 플라스미드이다.
본 발명의 특정 양태는 실제로 이의 게놈으로 계획적으로 도입된 관심 핵산 또는 핵산들의 발현 덕분에, 하나 이상의 용매, 바람직하게 적어도 이소프로판올을, 바람직하게 산업적 규모로 생성시키기 위한, 예를 들어 본 명세서에 기술된 핵산, 유전자 도구, 또는 방법 중 하나를 사용하여, 본 명세서에 기술된 유전자 변형된 박테리아, 바람직하게 LMG P-31151 번호로 수탁된 박테리아 씨. 베이제링키이 IFP962 ΔcatB (본 명세서에서 또한 씨. 베이제링키이 DSM 6423 ΔcatB로서 확인됨), 보다 더 바람직하게 LMG P-31277 번호로 수탁된 박테리아 씨. 베이제링키이 IFP963 ΔcatB ΔpNF2, 또는 후자 중 하나의 유전자 변형된 형태의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (i) 본 명세서에 기술된 바와 같은 핵산, 예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같은 퍼미큐테스 문에 속하는 박테리아 내 표적 서열을 인식하는 "핵산 OPT" 또는 DNA 단편, 및 (ii) 상기 박테리아의 개선된 변이체를 생성시키기 위한 관점에서, 이러한 종류의 박테리아를 형질전환, 및 전형적으로 유전자 변형시키는 것을 가능하게 만드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 유전자 변형을 위한 도구의 엘리먼트로부터 선택되는, 적어도 하나의 도구, 바람직하게 몇 개 도구; gRNA로서 핵산; 복구 매트릭스로서 핵산; "핵산 OPT"; 적어도 하나의 프라이머 쌍, 예를 들어 본 발명의 상황에서 기술된 바와 같은 프라이머 쌍; 및 상기 도구에 의해 코딩되는 단백질, 예를 들어 Cas9 또는 MAD7 유형의 뉴클레아제의 발현을 허용하는 유도인자를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 퍼미큐테스 문에 속하는 박테리아를 형질전환, 및 전형적으로 유전자 변형시키기 위한 유전자 변형을 위한 도구는 예를 들어, 상기 설명된 바와 같은, "핵산 OPT", CRISPR 도구, II형 인트론의 사용을 기반으로 하는 도구, 및 대립유전자 교환 도구로부터 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 키트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 유전자 도구의 엘리먼트의 일부 또는 전부를 포함한다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 퍼미큐테스 문에 속하는 박테리아를 형질전환, 및 바람직하게 유전자 변형시키기 위하거나, 또는 이러한 종류의 박테리아를 사용하여 적어도 하나의 용매, 예를 들어 용매의 혼합물을 생성시키기 위한 특정 키트는 i) 서열 SEQ ID NO: 126의 전부 또는 일부, 및 ii) 박테리아의 유전 물질의 변형 및/또는 상기 박테리아에서, 상기 박테리아의 야생형 형태에 존재하는 유전 물질에 부분적으로 또는 전체적으로 부재하는 DNA 서열의 발현을 허용하는 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지는 핵산을 비롯하여; 본 명세서에 기술된 유전자 도구에서 사용되는, 선택된 항-CRISPR 단백질의 발현의 유도성 프로모터에 적합한 적어도 하나의 유도인자를 포함한다.
키트는 임의로 사용되는 뉴클레아제 및/또는 하나 이상의 가이드 RNA의 발현을 제어하기 위한 유전자 도구에서 사용되는, 선택된 유도성 프로모터(들)에 적합한 하나 이상의 유도인자를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 특정 키트는 표지 (또는 "태그")를 포함하는 뉴클레아제의 발현을 허용한다.
본 발명에 따른 키트는 하나 이상의 소모품 예컨대 배양 배지, 본 명세서에 기술된 바와 같은 퍼미큐테스 문에 속하는 적어도 하나의 컴피턴트 박테리아, 예를 들어 클로스트리듐, 바실러스 또는 락토바실러스 속의 박테리아 (즉, 형질전환 관점에서 조건화), 적어도 하나의 gRNA, 뉴클레아제, 하나 이상의 선택 분자, 또는 설명 리플렛을 더 포함한다.
본 설명은 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 퍼미큐테스 문에 속하는 박테리아, 예를 들어 클로스트리듐, 바실러스 또는 락토바실러스 속의 박테리아 (예를 들어 번호 LMG P-31151 하에 수탁된 박테리아 씨. 베이제링키이 IFP962 ΔcatB), 바람직하게 야생 상태에서, 박테리아 염색체 및 염색체 DNA와 상이한 적어도 하나의 DNA 분자 (전형적으로, 천연 플라스미드) 둘 모두를 보유하는 박테리아, 가장 바람직하게 번호 LMG P-31277 하에 수탁된 박테리아 씨. 베이제링키이 IFP963 ΔcatB ΔpNF2의 형질전환, 및 이상적으로 유전자 변형을 위해 본 명세서에 기술된 방법을 수행하고/하거나, 상기 박테리아를 사용하여, 용매(들) 또는 생물연료(들), 또는 이의 혼합물을, 바람직하게 산업적 규모로 생성시키기 위한, 본 발명에 따른 키트, 또는 이러한 키트의 하나 이상의 엘리먼트의 용도에 관한 것이다.
생성시킬 수 있는 용매는 전형적으로 아세톤, 부탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 이의 혼합물, 전형적으로 에탄올/이소프로판올, 부탄올/이소프로판올, 또는 에탄올/부탄올 혼합물, 바람직하게 이소프로판올/부탄올 혼합물이다.
본 발명에 따라 형질전환된 박테리아의 용도는 전형적으로 산업적 규모로 적어도 100톤의 아세톤, 적어도 100톤의 에탄올, 적어도 1000톤의 이소프로판올, 적어도 1800톤의 부탄올, 또는 적어도 40 000톤의 이의 혼합물의 연간 생성을 허용한다.
하기 제공되는 실시예 및 도면은 이의 범위를 제한하지 않고, 보다 완전히 본 발명을 예시하려는 목적을 위한 것이다.
도면
[도 1] 도 1은 뉴클레아제 Cas9를 사용하여, gRNA에 의해 가이드되는 게놈 DNA 내 하나 이상의 이중 가닥 파단을 생성시키는 것을 가능하게 만드는 유전자 도구로서 게놈을 편집하기 위해 사용되는 CRISPR/Cas9 시스템을 도시한다.
gRNA, 가이드 RNA; PAM, 프로토스페이서 인접한 모티프. [Jinek et al., 2012]로부터 조정된 도면.
[도 2] 도 2는 Cas9에 의해 유도되는 이중-가닥 파단의 상동성 재조합을 통한 복구를 도시한다. PAM, 프로토스페이서 인접한 모티프.
[도 3] 도 3은 클로스트리듐에서 CRISPR/Cas9의 사용을 도시한다.
ermB, 에리쓰로마이신 내성 유전자; catP (SEQ ID NO: 70), 티암페니콜/클로람페니콜 내성 유전자; tetR, 그의 발현 생성물이 Pcm-tetO2/1로부터 출발되는 전사를 억제하는 유전자; Pcm-2tetO1 및 Pcm-tetO2/1, 언히드로테트라사이클린 유도성 프로모터, "aTc" (Dong et al., 2012); miniPthl, 항상성 프로모터 (Dong et al., 2012).
[도 4] 도 4는 pCas9acr 플라스미드 맵 (SEQ ID NO: 23)을 도시한다.
ermB, 에리쓰로마이신 내성 유전자; rep, 이. 콜라이의 복제 기원; repH, 씨. 아세토부틸리쿰의 복제 기원; Tthl, 티올라제 종결자; miniPthl, 항상성 프로모터 (Dong et al., 2012); Pcm-tetO2/1, tetR 의 생성물에 의해 억제되고 언히드로테트라사이클린, "aTc"에 의해 유도가능한 프로모터 (Dong et al., 2012); Pbgal, lacR 의 생성물에 의해 억제되고 락토스에 의해 유도가능한 프로모터 (Hartman et al., 2011); acrIIA4, 항-CRISPR 단백질 AcrII14를 코딩하는 유전자; bgaR, 그의 발현 생성물의 Pbgal로부터 출발하는 전사를 억제하는 유전자.
[도 5] 도 5는 pCas9ind (SEQ ID NO: 22) 또는 pCas9acr (SEQ ID NO: 23)를 함유하는 씨. 아세토부틸리쿰 DSM 792의 상대적 형질전환 속도를 도시한다. 빈도는 pEC750C (SEQ ID NO: 106)의 형질전환 빈도에 대해서, 형질전환에서 사용되는 DNA의 ㎍ 당 수득되는 형질전환체의 수로서 표시되고, 적어도 2회의 독립 실험의 평균값을 나타낸다.
[도 6] 도 6은 복구 매트릭스 존재 (SEQ ID NO: 79 및 SEQ ID NO: 80) 또는 부재 (SEQ ID NO: 105)에서, bdhB 를 표적화하는 gRNA의 발현 플라스미드 및 pCas9acr 을 함유하는 균주 DSM 792의 형질전환체에서 CRISPR/Cas9 시스템의 유도를 도시한다. Em, 에리쓰로마이신; Tm, 티암페니콜; aTc, 언히드로테트라사이클린; ND, 미희석.
[도 7A] 도 7은 CRISPR/Cas9 시스템을 통한 씨. 아세토부틸리쿰 DSM792의 유전자좌 bdh 의 변형을 도시한다. 도 7A는 유전자좌 bdh 의 유전자 구성을 도시한다. 복구 매트릭스 및 게놈 DNA 간 상동성은 연회색 평행 사변형으로 강조되어 있다. 프라이머 V1 및 V2의 혼성화 부위가 또한 도시된다.
[도 7B] 도 7은 CRISPR/Cas9 시스템을 통한 씨. 아세토부틸리쿰 DSM792의 유전자좌 bdh 의 변형을 도시한다. 도 7B는 프라이머 V1 및 V2를 사용한 유전자 bdh 의 증폭을 도시한다. M, 크기 2-log의 마커 (NEB); P, 플라스미드 pGRNA-ΔbdhAΔbdhB; WT, 야생형 균주.
[도 8] 도 8은 [Poehlein et al., 2017]에 따른, 클로스트리듐의 30종 용매형성성 균주의 분류를 도시한다. 하위분기군 씨. 베이제링키이 NRRL B-593은 또한 문헌에서 씨. 베이제링키이 DSM 6423로서 확인된다는 것을 유의한다.
[도 9] 도 9는 pCas9ind-ΔcatB 플라스미드 맵을 도시한다.
[도 10] 도 10은 pCas9acr 플라스미드 맵을 도시한다.
[도 11] 도 11은 pEC750S-uppHR 플라스미드 맵을 도시한다.
[도 12] 도 12는 pEX-A2-gRNA-upp 플라스미드 맵을 도시한다.
[도 13] 도 13은 pEC750S-Δupp 플라스미드 맵을 도시한다.
[도 14] 도 14는 pEC750C-Δupp 플라스미드 맵을 도시한다.
[도 15] 도 15는 pGRNA-pNF2 맵을 도시한다.
[도 16] 도 16은 균주 씨. 베이제링키이 DSM 6423의 박테리아 형질전환으로 생성된 클론에서 유전자 catB의 PCR 증폭을 도시한다.
균주가 여전히 유전자 catB를 보유하면 약 1.5 kb가 증폭되고 이 유전자가 결실되었으면 약 900 bp가 증폭된다.
[도 17] 도 17은 2YTG 배지 및 2YTG 티암페니콜 선택 배지 상에서 균주 C. beijerinckii DSM 6423 WT 및 ΔcatB 의 성장을 도시한다.
[도 18] 도 18은 복구 매트릭스 존재 또는 부재에서, upp를 표적화하는 gRNA의 발현 플라스미드 및 pCas9acr 을 함유하는 균주 씨. 베이제링키이 DSM 6423의 형질전환체에서 CRISPR/Cas9acr 시스템의 유도를 도시한다. 범례: Em, 에리쓰로마이신; Tm, 티암페니콜; aTc, 언히드로테트라사이클린; ND, 미희석.
[도 19A] 도 19는 CRISPR/Cas9 시스템을 통한 씨. 베이제링키이 DSM 6423의 유전자좌 upp 의 변형을 도시한다. 도 19A는 유전자좌 upp 의 유전자 구성을 도시한다: 유전자, gRNA의 표적 부위 및 게놈 DNa 상에서 상응하는 상동성 영역과 연관된, 복구 매트릭스. PCR에 의한 검증을 위한 프라이머의 혼성화 부위 (RH010 및 RH011)가 또한 표시된다.
[도 19B] 도 19는 CRISPR/Cas9 시스템을 통한 씨. 베이제링키이 DSM 6423의 유전자좌 upp 의 변형을 도시한다. 도 19B는 프라이머 RH010 및 RH011를 사용한 유전자좌 upp의 증폭을 도시한다. 1680 bp의 증폭은 변형된 유전자 upp에 대한 1090 bp에 대해서, 야생형 유전자의 경우에 예상된다. M, 100 bp - 3 kb 크기 마커 (Lonza); WT, 야생형 균주.
[도 20] 도 20은 균주 씨. 베이제링키이 6423 ΔcatB 에서 플라스미드 pCas9ind.의 존재를 검증하는 PCR 증폭을 도시한다.
[도 21] 도 21은 CRISPR-Cas9 시스템의 aTc를 함유하는 배지 상에서 유도 이전 (양성 대조군 1 및 2) 및 그 다음에 유도 이후에 천연 플라스미드 pNF2의 존재 또는 부재를 검증하는 PCR 증폭 (900 bp)을 도시한다.
[도 22] 도 22는 2종 플라스미드의 사용을 기반으로, 클로스트리듐 속의 박테리아에 적합한, 박테리아의 변형을 위한 유전자 도구를 도시한다 (참조: WO2017/064439, Wasels et al., 2017).
[도 23] 도 23은 pCas9ind-gRNA_catB 플라스미드 맵을 도시한다.
[도 24] 도 24는 균주 씨. 베이제링키이 DSM6423에서 20 ㎍의 플라스미드 pCas9ind 에 대한 형질전환 효율 (형질전환된 DNA의 ㎍ 당 관찰된 콜로니)을 도시한다. 오차 막대는 생물학적 삼중물에 대한 평균의 표준 오차를 나타낸다.
[도 25] 도 25는 pNF3플라스미드 맵을 도시한다.
[도 26] 도 26은 pEC751S 플라스미드 맵을 도시한다.
[도 27] 도 27은 pNF3S 플라스미드 맵을 도시한다.
[도 28] 도 28은 pNF3E 플라스미드 맵을 도시한다.
[도 29] 도 29는 pNF3C 플라스미드 맵을 도시한다.
[도 30] 도 30은 씨. 베이제링키이 DSM 6423의 3종 균주에서 플라스미드 pCas9ind 의 형질전환 효율 (형질전환된 DNA의 ㎍ 당 관찰된 콜로니)을 도시한다. 오차 막대는 생물학적 이중물에 대한 평균의 표준 편차에 상응한다.
[도 31] 도 31은 씨. 베이제링키이 DSM 6423으로부터 유래된 2종 균주에서 플라스미드 pEC750C의 형질전환 효율 (형질전환된 DNA의 ㎍ 당 관찰된 콜로니)을 도시한다. 오류 막대는 생물학적 이중물에 대한 평균의 표준 편차를 상응한다.
[도 32] 도 32는 균주 씨. 베이제링키이 IFP963 ΔcatBΔpNF2에서 플라스미드 pEC750C, pNF3C, pFW01 및 pNF3E의 형질전환 효율 (형질전환된 DNA의 ㎍ 당 관찰된 콜로니)을 도시한다. 오차 막대는 생물학적 삼중물에 대한 평균의 표준 편차에 상응한다.
[도 33] 도 33은 균주 씨. 베이제링키이 NCIMB 8052에서 플라스미드 pFW01, pNF3E 및 pNF3S의 형질전환 효율 (형질전환된 DNA의 ㎍ 당 관찰된 콜로니)을 도시한다.
실시예
실시예 번호 1
재료 및 방법
배양 조건
씨. 아세토부틸리쿰 DSM 792는 2YTG 배지 (트립톤 16 g.l-1, 효모 추출물 10 g.l-1, 글루코스 5 g.l-1, NaCl 4 g.l-1)에서 배양하였다. 이. 콜라이 NEB10B는 LB 배지 (트립톤 10 g.l-1, 효모 추출물 5 g.l-1, NaCl 5 g.l-1)에서 배양하였다. 고형 배지는 액상 배지에 15 g.l-1 의 한천을 첨가하여 제조하였다. 에리쓰로마이신 (2YTG 또는 LB 배지에서 각각 40 또는 500 mg.l-1 의 농도), 클로람페니콜 (고형 또는 액상 LB에서 각각 25 또는 12.5 mg.l-1) 및 티암페니콜 (2YTG 배지에서 15 mg.l-1)이 필요할 때 사용되었다.
핵산의 취급
모든 효소 및 키트는 공급자 추천에 따라 사용하였다.
플라스미드의 구축
도 4에 도시된, 플라스미드 pCas9acr (SEQ ID NO: 23)는 Eurofins Genomics가 합성한 프로모터 Pbgl의 제어 하에 있는 bgaR 및 acrIIA4 를 함유하는 단편 (SEQ ID NO: 81)을 벡터 pCas9ind 의 SacI 부위 수준에서 클로닝하여 구축하였다 (Wasels et al., 2017).
플라스미드 pGRNAind (SEQ ID NO: 82)는 Eurofins Genomics 가 합성한 프로모터 Pcm-2tetO1 (Dong et al., 2012)의 제어 하에 있는 gRNA의 발현 카세트 (SEQ ID NO: 83)를 벡터 pEC750C (SEQ ID NO: 106)의 SacI 부위에 클로닝하여 구축하였다 (Wasels et al., 2017).
플라스미드 pGRNA-xylB (SEQ ID NO: 102), pGRNA-xylR (SEQ ID NO: 103), pGRNA-glcG (SEQ ID NO: 104) 및 pGRNA-bdhB (SEQ ID NO: 105)는 BsaI로 분해시킨 플라스미드 pGRNAind (SEQ ID NO: 82) 내에서 각각의 프라이머 쌍 5'-TCATGATTTCTCCATATTAGCTAG-3' 및 5'-AAACCTAGCTAATATGGAGAAATC-3', 5'-TCATGTTACACTTGGAACAGGCGT-3' 및 5'-AAACACGCCTGTTCCAAGTGTAAC-3', 5'-TCATTTCCGGCAGTAGGATCCCCA-3' 및 5'-AAACTGGGGATCCTACTGCCGGAA-3', 5'-TCATGCTTATTACGACATAACACA-3' 및 5'-AAACTGTGTTATGTCGTAATAAGC-3'을 클로닝하여 구축하였다.
플라스미드 pGRNA-ΔbdhB (SEQ ID NO: 79)는 한편으로 프라이머 5'-ATGCATGGATCCAAACGAACCCAAAAAGAAAGTTTC-3' 및 5'-GGTTGATTTCAAATCTGTGTAAACCTACCG-3', 다른 한편으로 5'-ACACAGATTTGAAATCAACCACTTTAACCC-3' 및 5'-ATGCATGTCGACTCTTAAGAACATGTATAAAGTATGG-3' 을 사용해 수득된 PCR 생성물의 중복 PCR에 의한 조립을 통해서 수득된 DNA 단편을, BamHI 및 SacI로 분해한 벡터 pGRNA-bdhB에 클로닝하여 구축하였다.
플라스미드 pGRNA-ΔbdhAΔbdhB (SEQ ID NO: 80)는 한편으로 프라이머 5'-ATGCATGGATCCAAACGAACCCAAAAAGAAAGTTTC-3' 및 5'-GCTAAGTTTTAAATCTGTGTAAACCTACCG-3', 다른 한편으로 5'-ACACAGATTTAAAACTTAGCATACTTCTTACC-3' 및 5'-ATGCATGTCGACCTTCTAATCTCCTCTACTATTTTAG-3' 을 사용해 수득된 PCR 생성물의 중복 PCR을 통한 조립에 의해 수득된 DNA 단편을, BamHI 및 SacI로 분해한 벡터 pGRNA-bdhB에 클로닝하여 구축하였다.
형질전환
씨. 아세토부틸리쿰 DSM 792는 [Mermelstein et al., 1993]에 기술된 프로토콜에 따라 형질전환되었다. gRNA의 발현 카세트를 함유하는 플라스미드로 형질전환된 Cas9의 발현 플라스미드 (pCas9ind 또는 pCas9acr)를 이미 함유하는 씨. 아세토부틸리쿰 DSM 792의 형질전환체의 선택은 에리쓰로마이신 (40 mg.l-1), 티암페니콜 (15 mg.l-1) 및 락토스 (40 nM)를 함유하는 2YTG 고형 배지에서 수행되었다.
cas9
의 발현의 유도
cas9 의 발현의 유도는 에리쓰로마이신 (40 mg.l-1), 티암페니콜 (15 mg.l-1) 및 cas9 및 gRNA의 발현의 유도인자, aTc (1 mg.l-1)를 함유하는 2YTG 고형 배지 상에서 수득된 형질전환체를 성장시켜서 수행하였다.
유전자좌
bdh
의 증폭
유전자 bdhA 및 bdhB 의 유전자좌의 수준에서 씨. 아세토부틸리쿰 DSM 792의 게놈의 편집의 제어는 효소 Q5® 고-충실도 DNA 중합효소 (NEB)와 V1 (5'-ACACATTGAAGGGAGCTTTT-3') 및 V2 (5'-GGCAACAACATCAGGCCTTT-3') 프라이머를 사용한 PCR에 의해 실시되었다.
결과
형질전환 효율
cas9 의 발현 플라스미드의 형질전환 빈도에 대한 유전자 acrIIA4 의 삽입의 효과를 평가하기 위해서, 다양한 gRNA 발현 플라스미드는 pCas9ind (SEQ ID NO: 22) 또는 pCas9acr (SEQ ID NO: 23)를 함유하는 DSM 792 균주로 형질전환되었고, 형질전환체는 락토스가 보충된 배지 상에서 선택되었다. 수득된 형질전환 빈도는 도 5에 제시된다.
Δ
bdhB
및 Δ
bdhA
Δ
bdhB
돌연변이체의 생성
bdhB 를 표적화하는 gRNA 발현 카세트를 함유하는 표적화 플라스미드 (pGRNA-bdhB - SEQ ID NO: 105)를 비롯하여, bdhB 유전자 단독의 결실 (pGRNA-ΔbdhB - SEQ ID NO: 79) 또는 bdhA 및 bdhB 유전자의 결실 (pGRNA-ΔbdhAΔbdhB - SEQ ID NO: 80)을 허용하는 복구 매트릭스를 함유하는 유래 플라스미드를 pCas9ind (SEQ ID NO: 22) 또는 pCas9acr (SEQ ID NO: 23)를 함유하는 DSM 792 균주로 형질전환되었다. 수득된 형질전환 빈도는 표 2에 제시된다:
[표 2]
bdhB 를 표적화하는 플라스미드로 pCas9ind 또는 pCas9acr 를 함유하는 DSM 792 균주의 형질전환 빈도. 빈도는 형질전환에 사용된 DNA의 ㎍ 당 수득된 형질전환체의 수로서 표시되고, 적어도 2회 독립 실험의 평균값을 나타낸다.
수득된 형질전환체는 언히드로테트라사이클린, aTc가 보충된 배지 상에서 계대를 통한 CRISPR/Cas9 시스템의 발현의 유도 단계를 겪었다 (도 6).
바람직한 변형은 2종의 aTc-내성 콜로니의 게놈 DNA 상에서 PCR을 통해 확인하였다 (도 7).
결론
[Wasels et al. (2017)]에 기술된 CRISPR/Cas9를 기반으로 하는 유전자 도구는 하기 2종 플라스미드를 사용한다:
- 제1 플라스미드, pCas9ind 는 aTc로 유도가능한 프로모터의 제어 하에 있는, cas9 를 함유하고,
- pEC750C로부터 유래된, 제2 플라스미드는 gRNA의 발현 카세트 (aTc로 유도가능한 제2 프로모터의 제어 하에 위치)를 비롯하여 시스템에 의해 유도되는 이중-가닥 파단의 복구를 허용하는 편집 매트릭스를 함유한다.
그러나, 발명자들은 그들 발현을 비롯한 aTc-유도성 프로모터에 의한 Cas9의 제어에도 불구하고, 소정 gRNA가 여전히 너무 독성인 것으로 보이므로, 결론적으로 유전자 도구에 의한 박테리아의 형질전환 효율 및 그에 따라 염색체의 변형을 제한한다는 것을 관찰하였다.
이러한 유전자 도구를 개선시키기 위해서, cas9 발현 플라스미드는 항-CRISPR 유전자, acrIIA4 를 락토스-유도성 프로모터의 제어 하에 삽입시켜서, 변형되었다. 따라서 상이한 gRNA 발현 플라스미드의 형질전환 효율은 매우 유의하게 개선되어서, 시험된 모든 플라스미드에 대한 형질전환체를 수득하도록 허용할 수 있었다.
pCas9ind 를 함유하는 DSM 792 균주로 도입시킬 수 없는 플라스미드를 사용하여, 씨. 아세토부틸리쿰 DSM 792의 게놈 내 유전자좌 bdhB 의 편집을 수행하는 것이 가능하였다. 관찰된 변형 빈도는 이전에 관찰된 것 (Wasels et al., 2017)과 동일한데, 시험된 콜로니의 100% 가 변형되었다.
결론적으로, cas9 발현 플라스미드의 변형은 Cas9-gRNA 리보뉴클레오단백질 복합체의 더 나은 제어를 허용하여, 유리하게 관심 돌연변이체를 수득하기 위해 Cas9의 작용을 촉발시킬 수 있는 형질전환체의 생성을 용이하게 한다.
실시예 번호 2
재료 및 방법
배양 조건
씨. 베이제링키이 DSM 6423은 2YTG 배지 (트립톤 16 g L-1, 효모 추출물 10 g L-1, 글루코스 5 g L-1, NaCl 4 g L-1)에서 배양하였다. 이. 콜라이 NEB 10-베타 및 INV110은 LB 배지 (트립톤 10 g L-1, 효모 추출물 5 g L-1, NaCl 5 g L-1)에서 배양하였다. 고형 배지는 15 g L-1 의 한천을 액상 배지에 첨가하여 제조하였다. 에리쓰로마이신 (2YTG 또는 LB 배지에 각각 20 또는 500 mg L-1 의 농도), 클로람페니콜 (고형 또는 액상 LB에 각각 25 또는 12.5 mg L-1), 티암페니콜 (2YTG 배지에 15 mg L-1) 또는 스펙티노마이신 (LB 또는 2YTG 배지에 각각 100 또는 650 mg L-1 의 농도)은 필요하면 사용하였다.
핵산 및 플라스미드 벡터
사용된 모든 효소 및 키트는 하기 공급사 추천에 따라 사용하였다.
관찰된 콜로니에 대한 PCR 어세이는 하기 프로토콜을 따른다:
씨. 베이제링키이 DSM 6423의 단리된 콜로니는 100 ㎕의 Tris 10 mM pH 7.5 EDTA 5 mM에 재현탁시킨다. 이 용액은 교반없이 10분 동안 98℃에서 가열된다. 이 박테리아 용해물의 0.5 ㎕는 이후 Phire (Thermo Scientific), Phusion (Thermo Scientific), Q5 (NEB) 또는 KAPA2G Robust (Sigma-Aldrich) 중합효소가 존재하는 10 ㎕의 반응물 중 PCR 매트릭스로서 사용할 수 있다.
모든 구축에 사용된 프라이머의 목록 (명칭/DNA 서열)은 하기에 상술된다:
하기 플라스미드 벡터를 제조하였다:
- 플라스미드 No. 1: pEX-A258-ΔcatB (SEQ ID NO: 17)
이것은 플라스미드 pEX-A258에 클로닝된 합성된 DNA 단편 ΔcatB 를 함유한다. 이러한 단편 ΔcatB 는 i) 언히드로테트라사이클린-유도성 프로모터의 제어 하에 씨. 베이제링키이 DSM6423의 유전자 catB (클로람페니콜-O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 클로람페니콜 내성 유전자 - SEQ ID NO: 18)를 표적화하는 가이드 RNA의 발현 카세트 (발현 카세트: SEQ ID NO: 19), 및 ii) 유전자 catB 의 상류 및 하류에 위치하는 400 bp 상동체를 포함하는 편집 매트릭스 (SEQ ID NO: 20)를 포함한다.
- 플라스미드 No. 2: pCas9ind-ΔcatB (참조: 도 9 및 SEQ ID NO: 21)
이것은 PCR (프라이머 ΔcatB_fwd 및 ΔcatB_rev)에 의해 증폭되고 XhoI 제한 효소로 다양한 DNA의 분해 후에 pCas9ind (국제 특허 출원 공개 번호 WO2017/064439에 기술 - SEQ ID NO: 22)에 클로닝된 단편 ΔcatB를 함유한다.
- 플라스미드 No. 3: pCas9acr (참조: 도 10 및 SEQ ID NO: 23)
- 플라스미드 No. 4: pEC750S-uppHR (참조: 도 11 및 SEQ ID NO: 24)
이것은 유전자 upp 를 결실시키는데 사용되고 유전자 upp 의 상류 및 하류에 2개 상동성 DNA 단편 (개별 크기: 500 (SEQ ID NO: 26) 및 377 (SEQ ID NO: 27) 염기쌍)으로 이루어지는 복구 매트릭스 (SEQ ID NO: 25)를 함유한다. Gibson 클로닝 시스템 (New England Biolabs, Gibson assembly Master Mix 2X)을 사용해 조립체를 수득하였다. 이러한 목적을 위해서, 상류 및 하류 부분들은 균주 DSM 6423 (참조: Mate de Gerando et al., 2018 및 등록 번호 PRJEB11626 (https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB11626))의 게놈 DNA로부터 출발하여, 개별 프라이머 RH001/RH002 및 RH003/RH004를 사용한 PCR을 통해서 증폭되었다. 이들 2개 단편은 이후에 미리 제한 효소 (SalI 및 SacI 제한 효소)를 통해 선형화된 pEC750S로 조립시켰다.
- 플라스미드 No. 5: pEX-A2-gRNA-upp (참조: 도 12 및 SEQ ID NO: 28)
이러한 플라스미드는 pEX-A2로 명명된 복제 플라스미드에 삽입된, 항상적 프로모터 (서열 SEQ ID NO: 30의 비-코딩 RNA)의 제어 하에 유전자 upp 를 표적화하는 가이드 RNA (upp 표적화 프로토스페이서 (SEQ ID NO: 31))의 발현 카세트 (SEQ ID NO: 29)에 상응하는 DNA 단편 gRNA-upp 를 포함한다.
- 플라스미드 No. 6: pEC750S-Δupp (참조: 도 13 및 SEQ ID NO: 32)
이것은 베이스로서 플라스미드 pEC750S-uppHR (SEQ ID NO: 24)을 가지고 또한 항상성 프로모터의 제어 하에 유전자 upp 를 표적화하는 가이드 RNA의 발현 카세트를 포함하는 DNA 단편을 함유한다.
이러한 단편은 pEX-A2-gRNA-upp로 불리는, pEX-A2에 삽입되었다. 이어서 삽입부는 프라이머 pEX-fwd 및 pEX-rev를 사용한 PCR을 통해 증폭되었고, 그 다음에 제한 효소 XhoI 및 NcoI로 분해되었다. 마지막으로, 이러한 단편은 미리 동일한 제한 효소로 분해된 pEC750S-uppHR 에 결찰시켜서 클로닝하여 pEC750S-Δupp 를 수득하였다.
- 플라스미드 No. 7: pEC750C-Δupp (참조: 도 14 및 SEQ ID NO: 33)
가이드 RNA를 비롯하여 복구 매트릭스를 포함하는 카세트는 프라이머 pEC750C-fwd 및 M13-rev를 사용해 증폭시켰다. 앰플리콘은 효소 XhoI 및 SacI의 제한 효소로 분해하였고, 그 다음에 pEC750C에 효소적 결찰을 통해 클로닝하여 pEC750C-Δupp 를 수득하였다.
- 플라스미드 No. 8: pGRNA-pNF2 (참조: 도 15 및 SEQ ID NO: 34)
이 플라스미드는 베이스로서 pEC750C를 가지고 플라스미드 pNF2 (SEQ ID NO: 118)를 표적화하는 가이드 RNA의 발현 카세트를 함유한다.
- 플라스미드 No. 9: pCas9ind-gRNAcatB (참조: 도 23 alc SEQ ID NO: 38).
이것은 PCR (프라이머 ΔcatB_fwd 및 ΔcatBgRNA_rev)에 의해 증폭된 유전자 catB를 표적화하는 가이드 RNA를 코딩하는 서열을 함유하고 제한 효소 XhoI로 다양한 DNA의 분해 및 결찰 후에 pCas9ind (국제 특허 출원 공개 번호 WO2017/064439에 기술)에 클로닝된다.
- 플라스미드 No. 10: pNF3 (참조: 도 25 및 SEQ ID NO: 119)
이것은 특히 복제 기원 및 플라스미드 복제 단백질을 코딩하는 유전자 (CIBE_p20001)를 포함하고, 프라이머 RH021 및 RH022를 사용해 증폭된, pNF2의 일부분을 함유한다. 이러한 PCR 생성물을 이어서 제한효소 부위 SalI 및 BamHI의 수준에서 플라스미드 pUC19 (SEQ ID NO: 117)에 클로닝되었다.
- 플라스미드 No. 11: pEC751S (참조: 도 26 및 SEQ ID NO: 121)
이것은 pEC750C (SEQ ID NO: 106)의 모든 엘리먼트를 함유하지만, 클로람페니콜 내성 유전자 catP (SEQ ID NO: 70)를 제외한다. 후자는 스펙티노마이신 내성을 부여하는, 엔테로코쿠스 파에칼리스 (Enterococcus faecalis)의 유전자 aad9 (SEQ ID NO: 130)로 교체되었다. 이러한 엘리먼트는 플라스미드 pMTL007S-E1 (SEQ ID NO: 120)로부터 출발하여 프라이머 aad9-fwd2 및 aad9-rev를 사용하여 증폭되었고 유전자 catP (SEQ ID NO: 70) 대신에, pEC750C의 부위 AvaII 및 HpaI에 클로닝되었다.
- 플라스미드 No. 12: pNF3S (참조: 도 27 및 SEQ ID NO: 123)
부위 BamHI 및 SacI 사이에 유전자 aad9 의 삽입 (pEC751S로부터 출발하여 프라이머 RH031 및 RH032를 사용해 증폭)과, pNF3의 모든 엘리먼트를 함유한다.
- 플라스미드 No. 13: pNF3E (참조: 도 28 및 SEQ ID NO: 124)
이것은 프로모터 miniPthl의 제어 하에 클로스트리듐 디피실의 유전자 ermB (SEQ ID NO: 131)의 삽입과, pNF3의 모든 엘리먼트를 함유한다. 이 엘리먼트는 pFW01로부터 출발하여 프라이머 RH138 및 RH139를 사용해 증폭되었고 pNF3E의 부위 BamHI 및 SacI 사이에 클로닝되었다.
- 플라스미드 No. 14: pNF3C (참조: 도 29 및 SEQ ID NO: 125)
이것은 클로스트리듐 퍼프린제스의 유전자 catP (SEQ ID NO: 70)의 삽입과, pNF3의 모든 엘리먼트를 함유한다. 이러한 엘리먼트는 pEC750C로부터 출발하여 프라이머 RH140 및 RH141을 사용해 증폭되었고 pNF3E의 부위 BamHI 및 SacI 사이에 클로닝되었다.
결과 번호 1
균주 씨. 베이제링키이 DSM 6423의 형질전환
플라스미드는 이. 콜라이 dam - dcm - 균주 (INV110, Invitrogen)에 도입되어서 복제되었다. 이것은 하기 변형과 함께, [Mermelstein et al. (1993)]에 기술된 프로토콜에 따라 DSM 6423 균주에서 형질전환을 통해 도입시키기 전에 플라스미드 pCas9ind-ΔcatB 상에 Dam 및 Dcm 유형의 메틸화를 제거하는 것을 가능하게 만든다: 균주는 대량의 플라스미드 (20 ㎍)로, 0.8의 OD600 에서, 하기 전기영동 매개변수에 따라 형질전환된다: 100 Ω, 25 μF, 1400 V. 에리쓰로마이신 (20 ㎍/mL)을 함유하는 페트리 디쉬 상에 확산은 따라서 플라스미드 pCas9ind-ΔcatB 를 함유하는 씨. 베이제링키이 DSM 6423의 형질전환체를 수득하는 것을 가능하게 만들었다.
cas9 의 발현의 유도 및 균주 씨. 베이제링키이 DSM 6423 Δ catB (씨. 베이제링키이 IFP962 Δ catB )의 생성
몇개의 에리쓰로마이신-내성 콜로니를 100 ㎕의 배양 배지 (2YTG)에 넣고, 배양 배지 중에서 104 의 희석 배수까지 연속으로 희석시켰다. 각 콜로니의 경우에, 각 희석물의 8 ㎕를 에리쓰로마이신 및 언히드로테트라사이클린 (200 ng/mL)을 함유하는 페트리 디쉬 상에 침전시켜서, 뉴클레아제 Cas9를 코딩하는 유전자의 발현을 유도시키는 것을 가능하게 만들었다.
게놈 DNA의 추출 후에, 이 디쉬 상에서 성장된 콜로니 내 유전자 catB 의 결실은 프라이머 RH076 및 RH077를 사용한, PCR을 통해 검증하였다 (참조: 도 16).
티암페니콜에 대한 균주 씨. 베이제링키이 DSM 6423 Δ catB 의 감수성의 검증
유전자 catB 의 결실이 실제로 새로운 티암페니콜 감수성을 부여한다는 것을 보장하기 위해서, 한천 배지 상에서 비교 분석을 수행하였다. 씨. 베이제링키이 DSM 6423 및 씨. 베이제링키이 DSM 6423 ΔcatB 의 사전 배양은 2YTG 배지에서 수행하였고 이들 사전 배양물의 100 ㎕는 15 mg/L의 농도로 티암페니콜이 보충되거나 또는 보충되지 않은 2YTG 한천 배지 상에 확산시켰다. 오직 초기 균주 씨. 베이제링키이 DSM 6423만이 티암페니콜이 보충된 배지 상에서 성장할 수 있다는 것은 도 17에서 확인할 수 있다.
균주 씨. 베이제링키이 DSM 6423 Δ
catB
에서 CRISPR-Cas9 도구에 의한 유전자 upp의 결실
균주 씨. 베이제링키이 DSM 6423 ΔcatB 의 클론은 dam 및 dcm 유형의 메틸트랜스퍼라제에 의해 인식되는 모티프의 수준에서 메틸화를 갖지 않는 벡터 pCas9acr 로 미리 형질전환되었다 (dam - dcm - 유전자형을 갖는 박테리아 에스케리치아 콜라이로부터 제조). 균주 씨. 베이제링키이 DSM 6423에서 유지되는 플라스미드 pCas9acr 의 존재는 프라이머 RH025 및 RH134를 사용하여 콜로니 상에서 PCR을 통해 검증하였다.
에리쓰로마이신-내성 클론은 사전에 탈메틸화된 pEC750C-Δupp 로 형질전환되었다. 이렇게 수득된 콜로니는 에리쓰로마이신 (20 ㎍/mL), 티암페니콜 (15 ㎍/mL) 및 락토스 (40 mM)를 함유하는 배지에서 선택되었다.
이들 클론 중 몇 개를 이어서 100 ㎕의 배양 배지 (2YTG)에 재현탁시켰고 그 다음에 배양 배지에서 연속으로 희석하였다 (104의 희석 배율까지). 각 희석물의 5 ㎕를 에리쓰로마이신, 티암페니콜 및 언히드로테트라사이클린 (200 ng/mL)을 함유하는 페트리 디쉬 상에 침전시켰다 (참조: 도 18).
각 콜로니 경우에, aTc에 내성인 2개 콜로니는 유전자 upp 를 증폭시키기 위해 의도된 프라이머를 사용한 콜로니 PCR을 통해 시험하였다 (참조: 도 19).
균주 씨. 베이제링키이 DSM 6423 Δ
catB
에서 CRISPR-Cas9 도구에 의한 천연 플라스미드 pNF2의 결실
균주 씨. 베이제링키이 DSM 6423 ΔcatB 의 클론은 Dam 및 Dcm 유형의 메틸트랜스퍼라제에 의해 인식되는 모티프의 수준에서 메틸화를 갖지 않는 벡터 pCas9ind 로 이전에 형질전환되었다 (dam - dcm 유전자형을 갖는 박테리아 에스케리치아 콜라이로부터 제조). 균주 씨. 베이제링키이 DSM6423 내에 플라스미드 pCas9ind 의 존재는 프라이머 pCas9ind_fwd (SEQ ID NO: 42) 및 pCas9ind-_rev (SEQ ID NO: 43)를 사용한 PCR을 통해 검증되었다 (참조: 도 20).
에리쓰로마이신-내성 클론은 이후에 dam - dcm - 유전자형을 갖는 박테리아 에스케리치아 콜라이로부터 제조된, pGRNA-pNF2를 형질전환시키는데 사용되었다.
에리쓰로마이신 (20 ㎍/mL) 및 티암페니콜 (15 ㎍/mL)을 함유하는 배지 상에서 수득된 몇 개 콜로니를 배양 배지에 재현탁하였고, 104 의 희석 배율까지 연속으로 희석하였다. 각 희석물의 8 ㎕는 CRISPR/Cas9 시스템의 발현을 유도하기 위해서 에리쓰로마이신, 티암페니콜 및 언히드로테트라사이클린 (200 ng/mL)을 함유하는 페트리 디쉬 상에 침전시켰다.
천연 플라스미드 pNF2의 부재는 프라이머 pNF2_fwd (SEQ ID NO: 39) 및 pNF2_rev (SEQ ID NO: 40)를 사용한 PCR을 통해 검증되었다 (참조: 도 21).
결론
이러한 작업 과정에서, 본 발명자는 균주 클로스트리듐 베이제링키이 DSM 6423 내에서 다양한 플라스미드를 도입 및 유지시키는데 성공하였다. 그들은 단일 플라스미드의 사용을 기반으로 CRISPR-Cas9 도구를 사용하여 유전자 catB 를 억제하는데 성공하였다. 수득된 재조합 균주의 티암페니콜 감수성은 한천 배지에서 어세이를 통해 확인하였다.
이러한 결실은 CRISPR-Cas9 도구를 보다 효율적으로 사용할 수 있게 하고, 특허 출원 FR1854835에 기술된 2종 플라스미드를 필요로 한다. 이 출원의 장점을 입증하는 2개 실시예를 수행하였다: 균주 클로스트리듐 베이제링키이 DSM 6423에 필수적이지 않은 천연 플라스미드의 제거 및 유전자 upp의 결실.
결과 번호 2
씨. 베이제링키이 균주의 형질전환
이. 콜라이 NEB 10-베타의 균주에서 제조된 플라스미드는 또한 균주 씨. 베이제링키이 NCIMB 8052를 형질전환시키는데 사용된다. 그러나, 씨. 베이제링키이 DSM 6423 경우에, 플라스미드는 이. 콜라이 dam - dcm - 의 균주에 미리 도입되고 복제된다 (INV110, Invitrogen). 이것은 균주 DSM 6423에 형질전환을 통해 그들을 도입시키기 전에 관심 플라스미드 상에서 Dam 및 Dcm 유형의 메틸화를 제거하는 것을 가능하게 만든다.
형질전환은 달리 각 균주에 대해 유사하게, 즉 하기 변형과 함께, [Mermelstein et al. 1992]에 기술된 프로토콜에 따라서, 수행된다: 균주는 대량의 플라스미드 (5-20 ㎍)로, 0.6-0.8의 OD600 에서 형질전환되고, 전기영동 매개변수는 100 Ω, 25 μF, 1400 V이다. 2YTG에서 3시간의 재생이후에, 박테리아는 바람직한 항생제 (에리쓰로마이신: 20-40 ㎍/mL; 티암페니콜: 15 ㎍/mL; 스펙티노마이신: 650 ㎍/mL)를 함유하는 페트리 디쉬 (2YTG 한천) 상에 확산시킨다.
씨. 베이제링키이 DSM 6423의 균주에서 형질전환 효율의 비교
형질전환은 하기 씨. 베이제링키이 균주에서 생물학적 이중물로 수행하였다: DSM 6423 야생형, DSM 6423 ΔcatB 및 DSM 6423 ΔcatB ΔpNF2 (도 30). 이를 위해, 양호한 형질전환 효율을 제공하지 않으므로 박테리아를 변형시키는데 사용하는데 특히 어려운, 벡터 pCas9ind 가 사용되었다. 이것은 3종 균주가 감수성인 항생제로서, 에리쓰로마이신에 대한 내성을 균주에게 부여하는 유전자를 더 포함한다.
결과는 천연 플라스미드 pNF2의 상실에 기인하여, 약 15-20의 배율까지 형질전환 효율의 증가를 의미한다.
형질전환 효율은 또한 야생형 균주가 이 항생제에 내성이므로, 오직 균주 DSM 6423 ΔcatB (IFP962 ΔcatB) 및 DSM 6423 ΔcatB ΔpNF2 (IFP963 ΔcatB ΔpNF2)에서만, 티암페니콜 내성을 부여하는, 플라스미드 pEC750C에 대해 시험되었다 (도 31). 이러한 플라스미드 경우에, 형질전환 효율의 획득은 훨씬 더 현저하다 (약 2000의 배율까지 개선).
다른 플라스미드와 플라스미드 pNF3의 형질전환 효율의 비교
천연 플라스미드 pNF2의 복제 기원을 함유하는 플라스미드의 형질전환 효율을 결정하기 위해서, 플라스미드 pNF3E 및 pNF3C는 균주 씨. 베이제링키이 DSM 6423 ΔcatB ΔpNF2로 도입되었다. 에리쓰로마이신 또는 클로람페니콜 내성 유전자를 함유하는 벡터의 사용은 내성 유전자의 성질에 의존하여 벡터의 형질전환 효율을 비교하는 것을 가능하게 만든다. 플라스미드 pFW01 및 pEC750C를 또한 형질전환시켰다. 이들 2종 플라스미드는 상이한 항생제 (각각 에리쓰로마이신 및 티암페니콜)에 대한 내성 유전자를 함유하고 씨. 베이제링키이 및 씨. 아세토부틸리쿰을 형질전환시키는데 통상적으로 사용된다.
도 32에 도시된 바와 같이, pNF3을 기반으로 하는 벡터는 탁월한 형질전환 효율을 갖고, 특히 씨. 베이제링키이 DSM 6423 ΔcatB ΔpNF2에서 사용가능하다. 특히, pNF3E (에리쓰로마이신 내성 유전자 함유)는 동일한 내성 유전자를 포함하는, pFW01에 비해 훨씬 더 큰 형질전환 효율을 보인다. 이러한 동일한 플라스미드는 야생형 균주 씨. 베이제링키이 DSM 6423에 도입될 수 없어서 (생물학적 이중물에서 형질전환된 5 ㎍의 플라스미드로 0 콜로니 수득), 천연 플라스미드 pNF2의 존재의 효과를 입증한다.
다른 균주/종에서 플라스미드 pNF3의 형질전환성의 검증
클로스트리듐의 다른 용매형성성 균주에서 이러한 새로운 플라스미드를 사용하는 가능성을 예시하기 위해서, 본 발명자는 ABE 균주 씨. 베이제링키이 NCIMB 8052에서 플라스미드 pFW01, pNF3E 및 pNF3S의 형질전환 효율의 비교 분석을 수행하였다 (도 33). 균주 NCIMB 8052는 티암페니콜에 천연적으로 내성이고, 스펙티노마이신 내성을 부여하는, pNF3S가 pNF3C 대신 사용되었다.
결과는 균주 NCIMB 8052가 pNF3 기반 플라스미드로 형질전환가능하다는 것을 입증하고, 이들 벡터가 광범위한 의미로 종 씨. 베이제링키이에 적용가능하다는 것을 입증한다.
pNF3을 기반으로 하는 합성 벡터군의 적용가능성은 또한 씨. 아세토부틸리쿰의 기준 균주 DSM 792에서 시험하였다. 따라서 형질전환 시험은 플라스미드 pNF3C를 통해 이러한 균주를 형질전환하는 것이 가능하다는 것을 보여주었다 (플라스미드 pEC750C 경우 120 콜로니/㎍에 비해 형질전환된 DNA의 ㎍ 당 관찰된 3개 콜로니의 형질전환 효율).
출원 FR18/73492에 기술된 유전자 도구와 플라스미드 pNF3의 상용성의 검증
특허 출원 FR18/73492는 균주 ΔcatB 를 비롯하여 에리쓰로마이신 내성 유전자 및 티암페니콜 내성 유전자의 사용을 요구하는 2개 플라스미드와 CRISPR/Cas9 시스템의 사용을 기술한다. 플라스미드 pNF3의 새로운 군의 장점을 입증하기 위해서, 벡터 pNF3C는 플라스미드 pCas9acr 를 이미 함유하는 균주 ΔcatB 에 형질전환시켰다. 이중으로 수행된, 형질전환은 0.625 ± 0.125 콜로니/DNA의 ㎍ (평균 ± 표준 오차)의 형질전환 효율을 보여주었고, 이것은 pNF3C를 기반으로 하는 벡터가 균주 ΔcatB 에서 pCas9acr 와 조합하여 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
이들 결과와 병행하여, 이의 복제 기원을 포함하는 플라스미드 pNF2의 일부 (SEQ ID NO: 118)는 원하는 대로 변형가능한, 특히 이. 콜라이 균주에서 그들 복제를 비롯하여 씨. 베이제링키이 DSM 6423에서 그들 재도입을 허용하는, 새로운 군의 셔틀 벡터 (SEQ ID NO: 119, 123, 124 및 125)를 생성시키는데 성공적으로 재사용될 수 있었다. 이들 새로운 벡터는 특히 2종의 상이한 핵산을 포함하는 CRISPR/Cas9 도구를 사용하여, 예를 들어 씨. 베이제링키이 DSM 6423 및 이의 유도체에서 유전자 편집을 수행하기 위해 유리한 형질전환 효율을 갖는다.
이들 새로운 벡터는 씨. 베이제링키이 (NCIMB 8052), 및 클로스트리듐 종 (특히, 씨. 아세토부틸리쿰)의 다른 균주에서 성공적으로 시험될 수 있었고, 퍼미큐테스 문의 다른 유기체에서 그들 적용성을 입증한다. 시험은 바실러스에서도 수행되었다.
결론
이들 결과는 천연 플라스미드 pNF2의 억제가 이를 함유하는 박테리아의 형질전환 빈도를 유의하게 증가시킨다는 것을 입증한다 (pFW01의 경우 약 15의 배율까지, pEC750C의 경우 약 2000의 배율까지). 이러한 결과는 형질전환하는 것이 어렵다고 알려진, 클로스트리듐 속의 박테리아 경우에, 특히 천연적으로 낮은 형질전환 효율 (5 콜로니 미만/플라스미드의 ㎍)을 갖는 균주 씨. 베이제링키이 DSM 6423의 경우에 특히 흥미롭다.
[참조 문헌]
SEQUENCE LISTING
<110> IFP Energies nouvelles
<120> Optimized genetic tool for modifying bacteria
<130> B3003PC00
<160> 134
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer deltacatB-fwd
<400> 1
tgttatggat tataagcggc tcgaggacgt caaaccatgt taatcattgc 50
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer deltacatB-rev
<400> 2
aatctatcac tgatagggac tcgagcaatt tcaccaaaga attcgctagc 50
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer RH076
<400> 3
catataataa aaggaaacct cttgatcg 28
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer RH077
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attgccagcc taacacttgg 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer RH001
<400> 5
atctccatgg acgcgtgacg tcgacataag gtaccaggaa ttagagcagc 50
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer RH002
<400> 6
tctatctcca gctctagacc attattattc ctccaagttt gct 43
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer RH003
<400> 7
ataatggtct agagctggag atagattatt tggtactaag 40
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer RH004
<400> 8
tatgaccatg attacgaatt cgagctcgaa gcgcttatta ttgcattagc 50
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer pEX-fwd
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cagattgtac tgagagtgca cc 22
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer pEX-rev
<400> 10
gtgagcggat aacaatttca cac 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer pEC750C-fwd
<400> 11
caatattcca caatattata ttataagcta gc 32
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer M13-rev
<400> 12
caggaaacag ctatgac 17
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer RH010
<400> 13
cggatattgc attaccagta gc 22
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer RH011
<400> 14
ttatcaatct cttacacatg gagc 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer RH025
<400> 15
tagtatgccg ccattattac gaca 24
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer RH134
<400> 16
gtcgacgtgg aattgtgagc 20
<210> 17
<211> 3658
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pEX-A258-deltacatB
<400> 17
ctcgagctgc agcaaaaaaa gcaccgactc ggtgccactt tttcaagttg ataacggact 60
agccttattt taacttgcta tttctagctc taaaactgtg gtctctcttt tcgttgatgg 120
tggaatgata agggtttgca ccttaatttc tcctattgag aaaatcgtct cttctcagac 180
gtcaaaccat gttaatcatt gcttttatca aaaataggat ccactctatc attgatagag 240
tttgaaactc tatcattgat agagtataat atctttgttc atgtacatca tgctatctgt 300
gagttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa 360
gtggcaccga gtcggtgctt tttttgaagc ttgtctttac acttttgccc attaattttt 420
gagttcctta tttttaggga gcttttatta tttttatcat gaaaatttca taaaatactc 480
ataaactaag gatgtcttca taatcagatt agtactccat tttcaatcca tttaatctgg 540
gaatatgata ttttaattac gtattattta agatatatta acgtgtaata taataccccg 600
caaatattaa ttatcacata catatccccc ctttattggg gcattttttg tacccattat 660
tttagtattg tgcagtactt aaataaaaaa atgccgcaaa ttcattttta ttgaataatg 720
cggtatttct tctattcttt atttttatta ctctataaat aatgtaatca agacatgact 780
atctaaatat atgatatctt aattcataat tcgggcctcc taaaaatttt cgtaattcta 840
ttttagaagg cttttttccg tgacctagcc atttcaatct cctttttaca atgatattta 900
cgctttagtt tattatagca cattctgtaa taccgaacta ttcaattttc agagaccatt 960
ttttattgat tcataactta agaatactac gaattactct aatattttac tttttcttat 1020
ctcttgttat tttaacatcg gaattactac taatattaat ttttattttt ccatccgcat 1080
ttgctccaac atttttttaa ctatactttc cttttgttaa taaattatgt tattgttgaa 1140
caatataaga aaagtgcgta acatttttta ttaaaaataa ttaggtattt ctatctgtgg 1200
ggtaccctcg aggtggcagc tctagagcta gcgaattctt tggtgaaatt gttatccgct 1260
cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg 1320
agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct 1380
gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg 1440
gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 1500
ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 1560
aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 1620
ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 1680
gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 1740
cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 1800
gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 1860
tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 1920
cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 1980
cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 2040
gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 2100
agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 2160
cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 2220
tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 2280
tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag 2340
ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat 2400
cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc 2460
cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat 2520
accgcgcgaa ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag 2580
ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg 2640
ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc 2700
tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca 2760
acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg 2820
tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc 2880
actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta 2940
ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc 3000
aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg 3060
ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc 3120
cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc 3180
aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat 3240
actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag 3300
cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc 3360
ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa 3420
taggcgtatc acgaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg 3480
acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca 3540
agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc 3600
atcagagcag attgtactga gagtttggca attggtcgac ctcgagggcg cgcccgta 3658
<210> 18
<211> 660
<212> DNA
<213> Clostridium beijerinckii
<400> 18
atgaatttta atttgataga tattaatcat tggagtagaa agccatactt tgaacattat 60
ttaaacaatg tgaaatgtac ttatagtatg actgccaata tagaaataac tgatttattg 120
tatgaaatta aacttaaaaa tattaaattt tatcctaccc ttatttatat gattgcaact 180
gtggttaata agcataaaga attccgtatt tgttttgatc atgaaggtag tttaggatat 240
tgggatagca tgaatccaag ctatactatt tttcataaag aaaacgaaac attttcaagt 300
atttggacgg aatataacaa aagtttttta cgtttttata gtgattatct tgacgatata 360
aaaaactatg gaaatatcat gaagtttact ccgaaatcaa atgaacctga caatacattt 420
tctgtatcaa gcattccttg ggtgagtttt acaggattta acttgaatgt gtataatgaa 480
ggaacatatt taattcctat ttttactgca ggaaagtatt tcaaacaaga aaataaaata 540
tttattccta tatcaataca agtacatcat gctatctgtg acggttatca tgctagtaga 600
tttattaatg aaatgcaaga attagcattt agttttcaag aatggttaga aaataaataa 660
<210> 19
<211> 160
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gRNA expression cassette
<400> 19
actctatcat tgatagagtt tgaaactcta tcattgatag agtataatat ctttgttcat 60
gtacatcatg ctatctgtga gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 120
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 160
<210> 20
<211> 808
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Editing template
<400> 20
gtctttacac ttttgcccat taatttttga gttccttatt tttagggagc ttttattatt 60
tttatcatga aaatttcata aaatactcat aaactaagga tgtcttcata atcagattag 120
tactccattt tcaatccatt taatctggga atatgatatt ttaattacgt attatttaag 180
atatattaac gtgtaatata ataccccgca aatattaatt atcacataca tatcccccct 240
ttattggggc attttttgta cccattattt tagtattgtg cagtacttaa ataaaaaaat 300
gccgcaaatt catttttatt gaataatgcg gtatttcttc tattctttat ttttattact 360
ctataaataa tgtaatcaag acatgactat ctaaatatat gatatcttaa ttcataattc 420
gggcctccta aaaattttcg taattctatt ttagaaggct tttttccgtg acctagccat 480
ttcaatctcc tttttacaat gatatttacg ctttagttta ttatagcaca ttctgtaata 540
ccgaactatt caattttcag agaccatttt ttattgattc ataacttaag aatactacga 600
attactctaa tattttactt tttcttatct cttgttattt taacatcgga attactacta 660
atattaattt ttatttttcc atccgcattt gctccaacat ttttttaact atactttcct 720
tttgttaata aattatgtta ttgttgaaca atataagaaa agtgcgtaac attttttatt 780
aaaaataatt aggtatttct atctgtgg 808
<210> 21
<211> 9954
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pCas9ind-deltacatB
<400> 21
catggataaa aagtacagta ttggtctaga cataggaact aactctgttg ggtgggctgt 60
tataacagat gaatataaag ttccatcaaa aaaatttaaa gtattaggaa acactgatag 120
acattcaata aaaaaaaact tgataggtgc tttattattc gattcaggag agactgctga 180
agctacacgt ttaaaaagaa cagctagacg tagatataca agaagaaaaa ataggatatg 240
ttatcttcaa gaaattttta gtaatgaaat ggcaaaagtt gatgattcat tctttcacag 300
actagaagaa agtttcttag ttgaagaaga taagaagcat gaaagacacc ctatttttgg 360
taatatcgta gatgaagtag catatcatga gaagtatcca actatctatc atttaagaaa 420
gaaattagtt gattctacag ataaagctga tctgagatta atatatttag ctttagctca 480
tatgattaaa tttagaggac attttttaat agaaggtgat ttaaacccag acaacagcga 540
tgtagataaa ttatttatcc aattagttca aacttataat caattattcg aagagaatcc 600
aattaatgca agtggtgtag acgctaaggc tatattatca gctagattat caaaatctag 660
aagattagaa aatctaatag ctcaacttcc tggagaaaag aaaaatggac tttttgggaa 720
cctaatagct ctctcactcg gactaacacc aaattttaaa agcaattttg atcttgctga 780
agacgcaaag ttacaactat caaaggatac atacgatgat gatttagata atttgttagc 840
tcaaataggt gatcaatatg ctgatttgtt tcttgcagca aaaaacttaa gtgatgcaat 900
tttactatca gatatactta gagtaaatac agaaataaca aaggctcctt tatcagcaag 960
tatgattaaa cgatatgatg agcatcatca agatttaaca ttattaaagg cacttgtaag 1020
acaacaatta ccagaaaaat ataaagaaat tttctttgat caatctaaaa atggatatgc 1080
tggatatata gacggtggag caagtcaaga agagttttat aaatttataa agcctatttt 1140
agaaaaaatg gatggaactg aagaattact tgttaaactt aacagagaag atttacttag 1200
aaaacaaaga acttttgata atggttcaat tcctcaccaa attcatttag gagaattaca 1260
tgctatacta agaagacaag aagattttta tccatttctt aaagataata gagaaaaaat 1320
tgaaaaaatt ttaactttta gaataccata ttatgtagga ccacttgcaa ggggaaattc 1380
aagatttgca tggatgacta gaaaatcaga agaaactata accccgtgga attttgaaga 1440
agtagtagat aaaggagcta gtgctcaatc atttatagaa agaatgacaa attttgataa 1500
gaatcttcct aacgaaaagg ttttgccaaa gcatagcctt ctttatgagt attttacagt 1560
ttataatgag cttactaaag taaaatacgt tacagaagga atgagaaaac cagcattttt 1620
gtctggtgaa caaaagaaag caatagtaga cctattattt aaaacaaata ggaaggttac 1680
cgtaaagcaa cttaaagaag attacttcaa aaaaattgaa tgctttgata gtgttgaaat 1740
atcaggagtt gaagatagat ttaatgcttc acttggtaca tatcacgatc tcttaaaaat 1800
tataaaagat aaggattttt tagataatga agaaaatgaa gatattcttg aagatatagt 1860
attaacattg acactttttg aagatagaga aatgatagaa gaaagattaa aaacatatgc 1920
acatcttttt gatgataagg ttatgaagca acttaaaaga agaagatata caggttgggg 1980
acgtttgtca agaaagctaa ttaatggtat tagagataaa caatcaggaa agactattct 2040
cgattttctt aaatcagatg gatttgctaa tagaaacttt atgcaattaa ttcatgatga 2100
ttctcttact ttcaaagagg atattcaaaa ggctcaagtt tctggacaag gcgatagctt 2160
acacgaacac attgctaacc ttgcagggag ccccgctatc aaaaaaggaa ttttacaaac 2220
agttaaagtt gtagatgaac ttgttaaagt tatgggaaga cacaaacctg agaatatagt 2280
tatagaaatg gccagagaaa atcaaacaac acaaaaagga caaaaaaatt ctagagagag 2340
aatgaagaga attgaagaag gaataaaaga gctaggatca caaatattaa aagaacatcc 2400
agttgaaaat actcaattgc aaaatgaaaa gttatatttg tattacttac aaaatggaag 2460
agatatgtat gttgatcaag aactcgatat taatagatta agtgactatg atgttgatca 2520
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gaactattgg agacaacttt taaatgcaaa gctaattaca caaagaaaat ttgacaattt 2700
aacaaaagca gaaagaggag gattaagcga attagacaaa gctggattta taaaaagaca 2760
acttgttgag acaagacaaa taactaagca tgttgctcaa atacttgatt caagaatgaa 2820
tacaaaatat gatgaaaatg ataaattaat cagagaagta aaagtaataa cattaaagtc 2880
aaaattagta tcagatttca gaaaggattt tcaattttac aaagttcgtg aaataaataa 2940
ctatcatcat gctcatgatg catacttaaa tgctgttgta ggaactgctc ttattaagaa 3000
atatcctaaa ctagaaagcg aatttgttta tggagattat aaagtttatg atgtgcgcaa 3060
aatgatcgcg aaatccgaac aagaaatcgg taaggctaca gcaaaatatt tcttttatag 3120
taatataatg aattttttta agacagaaat aactttggct aatggtgaaa tcagaaaaag 3180
accacttatc gaaacaaatg gagagacagg agaaatagta tgggataaag gaagagattt 3240
tgctactgtt agaaaagtac taagtatgcc acaagtaaat atcgtaaaga aaactgaagt 3300
tcaaactgga ggtttctcta aggaatcaat tttacctaag agaaattcag ataagttaat 3360
tgcaaggaaa aaagattggg acccaaaaaa atacggtggt tttgatagtc caacagttgc 3420
ctatagtgtt cttgtagtag cgaaagttga gaaaggtaag tcaaaaaagt tgaaaagcgt 3480
aaaagaactt cttggtatca caattatgga aagatcttca tttgaaaaaa atccaattga 3540
ctttttagaa gctaagggtt ataaagaagt taaaaaggat ttaatcataa aactaccaaa 3600
gtatagtcta tttgaactcg aaaacggaag aaaacgaatg ctcgctagcg caggagaact 3660
tcaaaaagga aatgaacttg cgctgccatc aaagtatgta aatttcttat atttagcttc 3720
tcattatgag aaattaaaag gatcaccaga ggataatgaa caaaagcaac tatttgtaga 3780
acaacacaaa cattatttag atgaaataat agaacaaata tctgaatttt ctaaaagagt 3840
tatacttgcc gacgcaaatc tagataaggt gctttcagcg tataataaac acagagataa 3900
accaataaga gaacaagcag aaaacattat ccatcttttt acattaacta atcttggtgc 3960
accagctgca tttaagtact ttgatacaac aatagataga aaaagataca catctactaa 4020
agaagtatta gacgcaactt taatacatca atctattaca gggctttatg aaacaagaat 4080
tgatttaagt caactaggcg gagattaagt cgacaaagta ttgttaaaaa taactctgta 4140
gaattataaa ttagttctac agagttattt tttgacccgg gtatattgat aaaaataata 4200
atagtgggta taattaagtt gttaggaggt tagttagaat gatgtcaaga ttagataaaa 4260
gtaaagtgat taacagcgca ttagagctgc ttaatgaggt cggaatcgaa ggtttaacaa 4320
cccgtaaact cgcccagaag ctaggtgtag agcagcctac attgtattgg catgtaaaaa 4380
ataagcgggc tttgctcgac gccttagcca ttgagatgtt agataggcac catactcact 4440
tttgcccttt agaaggggaa agctggcaag attttttacg taataacgct aaaagtttta 4500
gatgtgcttt actaagtcat cgcgatggag caaaagtaca tttaggtaca cggcctacag 4560
aaaaacagta tgaaactctc gaaaatcaat tagccttttt atgccaacaa ggtttttcac 4620
tagagaatgc attatatgca ctcagcgctg tggggcattt tactttaggt tgcgtattgg 4680
aagatcaaga gcatcaagtc gctaaagaag aaagggaaac acctactact gatagtatgc 4740
cgccattatt acgacaagct atcgaattat ttgatcacca aggtgcagag ccagccttct 4800
tattcggcct tgaattgatc atatgcggat tagaaaaaca acttaaatgt gaaagtgggt 4860
cttaaaagca gcataacctt tttccgtgat ggtaacttca cggtaaccaa gatgtcgagt 4920
tgagctcgaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 4980
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tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 5100
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tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat 1140
caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaggtccac tgccgggcct 1200
cttgcgggat caaaagaaaa acgaaatgat acaccaatca gtgcaaaaaa agatataatg 1260
ggagataaga cggttcgtgt tcgtgctgac ttgcaccata tcataaaaat cgaaacagca 1320
aagaatggcg gaaacgtaaa agaagttatg gaaataagac ttagaagcaa acttaagagt 1380
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taaaaatttg taattaagaa ggagtgatta catgaacaaa aatataaaat attctcaaaa 1500
ctttttaacg agtgaaaaag tactcaacca aataataaaa caattgaatt taaaagaaac 1560
cgataccgtt tacgaaattg gaacaggtaa agggcattta acgacgaaac tggctaaaat 1620
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<210> 24
<211> 5754
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pEC750S-uppHR
<400> 24
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aaacagtgta tttaactctt ttatattttc taatcgccta cacggcttat aaaaggtatt 4680
tagagttata tagatatttt catcactcat atctaaatct tttaattcag cgtatttata 4740
gtgccattgg ctatatcctt ttttatctat aacgctcctg gttatccacc ctttacttct 4800
actatgaata ttatctatat agttcttttt attcagcttt aatgcgtttc tcacttattc 4860
acctcccctt ctgtaaaact aagaaaatta tatcatattt tcaataatta ttaactattc 4920
ttaaactctt aataaaaaat agagtaagtc cccaattgaa acttaatcta ttttttatgt 4980
tttaatttat tatttttatt aaaatatttt aaactaaatt aaatgattct ttttaatttt 5040
ttactatttc attccataat atattactat aattatttac aaataatatt tcttcatttg 5100
taatatttag atgatttact aattttagtt tttatatatt aaataattaa tgtataattt 5160
atataaaaaa tcaaaggagc ttataaatta tgattatttc caaagatact aaagatttaa 5220
tttttttcaa ttttaacaat actttttgta atattatgtt taaatttaat tgtatttttt 5280
tcatataata aagccgttga agtaaaccaa tccattttcc ttatgatgtt attattaaat 5340
ttaagtttta taataatatc tttattatat ttattgtttt taaaaaaact agtgaaattt 5400
ctagtgaaat ttccggcttt attaaactta tttttaggaa ttttattttc attttcatct 5460
ttacaggatt tgattatatc tttaaatatg ttttatcaaa tattatcttt ttctaaattt 5520
atatatattt ttattatatt tattattata tatattttat ttttaagttt ctttctaaca 5580
gctattaaaa agaaacttaa aaataaaaac acgtactcta aaccaataaa taaaactatt 5640
tttattattg ctgccttgat tggaatagtt tttagtaaaa ttaatttcaa tattccacaa 5700
tattatatta taagctagca ggcctcgaga tctccatgga cgcgtgacgt cgac 5754
<210> 25
<211> 884
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Repair template
<400> 25
ataaggtacc aggaattaga gcagcgctat gttcagatac atttagtgct catgcaacaa 60
gagaacataa taatgctaat atattaacta tgggtcaaag ggttgttgga gcaggtcttg 120
ctttagatat agtaaaaaca tttatatcag ctaaatttga aggagatagg caccaaaaaa 180
gaatagataa gatttcagat attgaaaaaa agtatacaca ttagaaaaaa gcagctatgc 240
tgcaaataag atcaatttat attagaaaaa agcagctatg ctgcaaataa gatcaattta 300
tattagaaaa aagcagctat gctgcaaata agatcaattt atattagaaa aaagcagcta 360
tgctacaaat aagatcaatt tatattagaa aaaagtagct atgctgcaac aatattaatt 420
tatattacta gaaagctaaa tggggtatat aaatataaag ggctataaat actaaaagca 480
aacttggagg aataataatg gtctagagct ggagatagat tatttggtac taagtaatta 540
gtaatctatt agaattaaaa gctatctaca taagtttctg aatgacccaa gataatttta 600
ctggggggaa tatagaaaat ggagagacga gataagaaaa attattactt ggatattgct 660
gaaacagttt tagagagagg aacctgtcta aggagaaact atggttctat aattgttaaa 720
aatgatgaaa taatttctac tggatacaca ggagcaccta gaggtagaaa aaattgcatg 780
gatttgaata gttgcataag agaaaagttg aaagttccaa gaggtactca ttatgagttg 840
tgtaggagtg tacatagtga agctaatgca ataataagcg cttc 884
<210> 26
<211> 500
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> upp gene upstream fragment
<400> 26
ataaggtacc aggaattaga gcagcgctat gttcagatac atttagtgct catgcaacaa 60
gagaacataa taatgctaat atattaacta tgggtcaaag ggttgttgga gcaggtcttg 120
ctttagatat agtaaaaaca tttatatcag ctaaatttga aggagatagg caccaaaaaa 180
gaatagataa gatttcagat attgaaaaaa agtatacaca ttagaaaaaa gcagctatgc 240
tgcaaataag atcaatttat attagaaaaa agcagctatg ctgcaaataa gatcaattta 300
tattagaaaa aagcagctat gctgcaaata agatcaattt atattagaaa aaagcagcta 360
tgctacaaat aagatcaatt tatattagaa aaaagtagct atgctgcaac aatattaatt 420
tatattacta gaaagctaaa tggggtatat aaatataaag ggctataaat actaaaagca 480
aacttggagg aataataatg 500
<210> 27
<211> 377
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> upp gene downstream fragment
<400> 27
gctggagata gattatttgg tactaagtaa ttagtaatct attagaatta aaagctatct 60
acataagttt ctgaatgacc caagataatt ttactggggg gaatatagaa aatggagaga 120
cgagataaga aaaattatta cttggatatt gctgaaacag ttttagagag aggaacctgt 180
ctaaggagaa actatggttc tataattgtt aaaaatgatg aaataatttc tactggatac 240
acaggagcac ctagaggtag aaaaaattgc atggatttga atagttgcat aagagaaaag 300
ttgaaagttc caagaggtac tcattatgag ttgtgtagga gtgtacatag tgaagctaat 360
gcaataataa gcgcttc 377
<210> 28
<211> 2666
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pEX-A2-gRNA-upp
<400> 28
ctcgagtatt tttgataaaa gcaatgatta acatggtttg acgtctgaga agagacgatt 60
ttctcaatag gagaaattaa ggtgcaaacc cttatcattc caccatgatc cacctgtagc 120
aagcatgttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga 180
aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttg ccatggacct gcttttgctc gcttggatcc 240
gaattcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca 300
taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct 360
cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac 420
gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 480
tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 540
tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 600
ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 660
agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 720
accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 780
ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 840
gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 900
ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 960
gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 1020
taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag 1080
tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 1140
gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 1200
cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 1260
agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 1320
cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 1380
cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 1440
ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 1500
taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgactccc acgctcaccg gctccagatt 1560
tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 1620
ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 1680
atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 1740
gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 1800
tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 1860
cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 1920
taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 1980
ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 2040
ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 2100
cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 2160
ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 2220
gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 2280
gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 2340
aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca 2400
ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc 2460
gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt 2520
gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg 2580
ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccaat 2640
tgggtaccga gctcgcggcc gcaagc 2666
<210> 29
<211> 203
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gRNA expression cassette
<400> 29
tatttttgat aaaagcaatg attaacatgg tttgacgtct gagaagagac gattttctca 60
ataggagaaa ttaaggtgca aacccttatc attccaccat gatccacctg tagcaagcat 120
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 180
ggcaccgagt cggtgctttt ttt 203
<210> 30
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Constitutive promoter
<400> 30
tatttttgat aaaagcaatg attaacatgg tttgacgtct gagaagagac gattttctca 60
ataggagaaa ttaaggtgca aacccttatc attccaccat 100
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protospacer targeting upp
<400> 31
gatccacctg tagcaagcat 20
<210> 32
<211> 5954
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pEC750S-deltaupp
<400> 32
ataaggtacc aggaattaga gcagcgctat gttcagatac atttagtgct catgcaacaa 60
gagaacataa taatgctaat atattaacta tgggtcaaag ggttgttgga gcaggtcttg 120
ctttagatat agtaaaaaca tttatatcag ctaaatttga aggagatagg caccaaaaaa 180
gaatagataa gatttcagat attgaaaaaa agtatacaca ttagaaaaaa gcagctatgc 240
tgcaaataag atcaatttat attagaaaaa agcagctatg ctgcaaataa gatcaattta 300
tattagaaaa aagcagctat gctgcaaata agatcaattt atattagaaa aaagcagcta 360
tgctacaaat aagatcaatt tatattagaa aaaagtagct atgctgcaac aatattaatt 420
tatattacta gaaagctaaa tggggtatat aaatataaag ggctataaat actaaaagca 480
aacttggagg aataataatg gtctagagct ggagatagat tatttggtac taagtaatta 540
gtaatctatt agaattaaaa gctatctaca taagtttctg aatgacccaa gataatttta 600
ctggggggaa tatagaaaat ggagagacga gataagaaaa attattactt ggatattgct 660
gaaacagttt tagagagagg aacctgtcta aggagaaact atggttctat aattgttaaa 720
aatgatgaaa taatttctac tggatacaca ggagcaccta gaggtagaaa aaattgcatg 780
gatttgaata gttgcataag agaaaagttg aaagttccaa gaggtactca ttatgagttg 840
tgtaggagtg tacatagtga agctaatgca ataataagcg cttcgagctc gaattcgtaa 900
tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata 960
cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta 1020
attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa 1080
tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg 1140
ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag 1200
gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa 1260
ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc 1320
cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca 1380
ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 1440
accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 1500
catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 1560
gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 1620
tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc 1680
agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac 1740
actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga 1800
gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc 1860
aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg 1920
gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca 1980
aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt 2040
atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caaagctagc ttaatactag tatatactta 2100
atgtgataag tgtctgacag ctgaccggtc taaagaggtc cgccaatgaa atctataaat 2160
aaactaaatt aagtttattt aattaacaac tatggatata aaataggtac taatcaaaat 2220
agtgaggagg atatatttga atacatacga acaaattaat aaagtgaaaa aaatacttcg 2280
gaaacattta aaaaataacc ttattggtac ttacatgttt ggatcaggag ttgagagtgg 2340
actaaaacca aatagtgatc ttgacttttt agtcgtcgta tctgaaccat tgacagatca 2400
aagtaaagaa atacttatac aaaaaattag acctatttca aagaaaatag gagataaaag 2460
caacttacga tatattgaat taacaattat tattcagcaa gaaatggtac cgtggaatca 2520
tcctcccaaa caagaattta tttatggaga atggttacaa gagctttatg aacaaggata 2580
cattcctcag aaggaattaa attcagattt aaccataatg ctttaccaag caaaacgaaa 2640
aaataaaaga atatacggaa attatgactt agaggaatta ctacctgata ttccattttc 2700
tgatgtgaga agagccatta tggattcgtc agaggaatta atagataatt atcaggatga 2760
tgaaaccaac tctatattaa ctttatgccg tatgatttta actatggaca cgggtaaaat 2820
cataccaaaa gatattgcgg gaaatgcagt ggctgaatct tctccattag aacataggga 2880
gagaattttg ttagcagttc gtagttatct tggagagaat attgaatgga ctaatgaaaa 2940
tgtaaattta actataaact atttaaataa cagattaaaa aaattataaa aaaattgaaa 3000
aaatggtgga aacacttttt tcaatttttt tgttttatta tttaatattt gggaaatatt 3060
cattctaatt ggtaatcaga ttttagaagt tgttaacttc aggtttgtct gtaactaaaa 3120
actagtattt aacctaggat caaaaaaatt tccaataatc ccactctaag ccacaaacac 3180
gccctataaa atcccgcttt aatcccactt tgagacacat gtaatattac tttacgccct 3240
agtatagtga taatttttta cattcaatgc cacgcaaaaa aataaagggg cactataata 3300
aaagttcctt cggaactaac taaagtaaaa aattatcttt acaacctccc caaaaaaaag 3360
aacaggtaca aagtacccta taatacaagc gtaaaaaaaa tgagggtaaa aataaaaaaa 3420
taaaaaaata aaaaaataaa aaaataaaaa aataaaaaaa taaaaaaata taaaaataaa 3480
aaaatataaa aataaaaaaa tataaaaata aaaaaataaa aaaatataaa aataaaaaaa 3540
taaaaaaata taaaaatatt ttttatttaa agtttgaaaa aaattttttt atattatata 3600
atctttgaag aaaagaatat aaaaaatgag cctttataaa agcccatttt ttttcatata 3660
cgtaatatga cgttctaatg tttttattgg tacttctaac attagagtaa tttctttatt 3720
tttaaagcct ttttctttaa gggcttttat tttttttctt aatacattta attcctcttt 3780
ttttgttgct tttcctttag cttttaattg ctcttgataa ttttttttac ctctaatatt 3840
ttctcttctc ttatattcct ttttagaaat tattattgtc atatattttt gttcttcttc 3900
tgtaatttct aataactcta taagagtttc attcttatac ttatattgct tatttttatc 3960
taaataacat ctttcagcac ttctagttgc tcttataact tctctttcac ttaaatgttg 4020
tctaaacata ctattaagtt ctaaaacatc atttaatgcc ttctcaatgt cttctgtaaa 4080
gctacaaaga taatatctat ataaaaataa tataagctct ctgtgtcctt ttaaatcata 4140
ttctcttagt tcacaaagtt ttattatgtc ttgtattctt ccataatata aacttctttc 4200
tctataaata taatttattt tgcttggtct accctttttc ctttcatatg gttttaattc 4260
aggtaaaaat ccattttgta tttctcttaa gtcataaata tattcgtact catctaatat 4320
attgactact gtttttgatt tagagtttat acttcctgga actcttaata ttctcgttgc 4380
atctaaggct tgtctatctg ctccaaagta ttttaattga ttatataaat attcttgaac 4440
cgctttccat aatggtaatg ctttactagg tactgcattt attatccata ttaaatacat 4500
tcctcttcca ctatctatta catagtttgg tataggaata ctttgattaa aataattctt 4560
ttctaagtcc attaatacct ggtctttagt tttgccagtt ttataataat ccaagtctat 4620
aaacagtgta tttaactctt ttatattttc taatcgccta cacggcttat aaaaggtatt 4680
tagagttata tagatatttt catcactcat atctaaatct tttaattcag cgtatttata 4740
gtgccattgg ctatatcctt ttttatctat aacgctcctg gttatccacc ctttacttct 4800
actatgaata ttatctatat agttcttttt attcagcttt aatgcgtttc tcacttattc 4860
acctcccctt ctgtaaaact aagaaaatta tatcatattt tcaataatta ttaactattc 4920
ttaaactctt aataaaaaat agagtaagtc cccaattgaa acttaatcta ttttttatgt 4980
tttaatttat tatttttatt aaaatatttt aaactaaatt aaatgattct ttttaatttt 5040
ttactatttc attccataat atattactat aattatttac aaataatatt tcttcatttg 5100
taatatttag atgatttact aattttagtt tttatatatt aaataattaa tgtataattt 5160
atataaaaaa tcaaaggagc ttataaatta tgattatttc caaagatact aaagatttaa 5220
tttttttcaa ttttaacaat actttttgta atattatgtt taaatttaat tgtatttttt 5280
tcatataata aagccgttga agtaaaccaa tccattttcc ttatgatgtt attattaaat 5340
ttaagtttta taataatatc tttattatat ttattgtttt taaaaaaact agtgaaattt 5400
ctagtgaaat ttccggcttt attaaactta tttttaggaa ttttattttc attttcatct 5460
ttacaggatt tgattatatc tttaaatatg ttttatcaaa tattatcttt ttctaaattt 5520
atatatattt ttattatatt tattattata tatattttat ttttaagttt ctttctaaca 5580
gctattaaaa agaaacttaa aaataaaaac acgtactcta aaccaataaa taaaactatt 5640
tttattattg ctgccttgat tggaatagtt tttagtaaaa ttaatttcaa tattccacaa 5700
tattatatta taagctagca cgcctcgagt atttttgata aaagcaatga ttaacatggt 5760
ttgacgtctg agaagagacg attttctcaa taggagaaat taaggtgcaa acccttatca 5820
ttccaccatg atccacctgt agcaagcatg ttttagagct agaaatagca agttaaaata 5880
aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt ttgccatgga 5940
cgcgtgacgt cgac 5954
<210> 33
<211> 5853
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pEC750C-deltaupp
<400> 33
atcaaaaaaa tttccaataa tcccactcta agccacaaac acgccctata aaatcccgct 60
ttaatcccac tttgagacac atgtaatatt actttacgcc ctagtatagt gataattttt 120
tacattcaat gccacgcaaa aaaataaagg ggcactataa taaaagttcc ttcggaacta 180
actaaagtaa aaaattatct ttacaacctc cccaaaaaaa agaacaggta caaagtaccc 240
tataatacaa gcgtaaaaaa aatgagggta aaaataaaaa aataaaaaaa taaaaaaata 300
aaaaaataaa aaaataaaaa aataaaaaaa tataaaaata aaaaaatata aaaataaaaa 360
aatataaaaa taaaaaaata aaaaaatata aaaataaaaa aataaaaaaa tataaaaata 420
ttttttattt aaagtttgaa aaaaattttt ttatattata taatctttga agaaaagaat 480
ataaaaaatg agcctttata aaagcccatt ttttttcata tacgtaatat gacgttctaa 540
tgtttttatt ggtacttcta acattagagt aatttcttta tttttaaagc ctttttcttt 600
aagggctttt attttttttc ttaatacatt taattcctct ttttttgttg cttttccttt 660
agcttttaat tgctcttgat aatttttttt acctctaata ttttctcttc tcttatattc 720
ctttttagaa attattattg tcatatattt ttgttcttct tctgtaattt ctaataactc 780
tataagagtt tcattcttat acttatattg cttattttta tctaaataac atctttcagc 840
acttctagtt gctcttataa cttctctttc acttaaatgt tgtctaaaca tactattaag 900
ttctaaaaca tcatttaatg ccttctcaat gtcttctgta aagctacaaa gataatatct 960
atataaaaat aatataagct ctctgtgtcc ttttaaatca tattctctta gttcacaaag 1020
ttttattatg tcttgtattc ttccataata taaacttctt tctctataaa tataatttat 1080
tttgcttggt ctaccctttt tcctttcata tggttttaat tcaggtaaaa atccattttg 1140
tatttctctt aagtcataaa tatattcgta ctcatctaat atattgacta ctgtttttga 1200
tttagagttt atacttcctg gaactcttaa tattctcgtt gcatctaagg cttgtctatc 1260
tgctccaaag tattttaatt gattatataa atattcttga accgctttcc ataatggtaa 1320
tgctttacta ggtactgcat ttattatcca tattaaatac attcctcttc cactatctat 1380
tacatagttt ggtataggaa tactttgatt aaaataattc ttttctaagt ccattaatac 1440
ctggtcttta gttttgccag ttttataata atccaagtct ataaacagtg tatttaactc 1500
ttttatattt tctaatcgcc tacacggctt ataaaaggta tttagagtta tatagatatt 1560
ttcatcactc atatctaaat cttttaattc agcgtattta tagtgccatt ggctatatcc 1620
ttttttatct ataacgctcc tggttatcca ccctttactt ctactatgaa tattatctat 1680
atagttcttt ttattcagct ttaatgcgtt tctcacttat tcacctcccc ttctgtaaaa 1740
ctaagaaaat tatatcatat tttcaataat tattaactat tcttaaactc ttaataaaaa 1800
atagagtaag tccccaattg aaacttaatc tattttttat gttttaattt attattttta 1860
ttaaaatatt ttaaactaaa ttaaatgatt ctttttaatt ttttactatt tcattccata 1920
atatattact ataattattt acaaataata tttcttcatt tgtaatattt agatgattta 1980
ctaattttag tttttatata ttaaataatt aatgtataat ttatataaaa aatcaaagga 2040
gcttataaat tatgattatt tccaaagata ctaaagattt aatttttttc aattttaaca 2100
atactttttg taatattatg tttaaattta attgtatttt tttcatataa taaagccgtt 2160
gaagtaaacc aatccatttt ccttatgatg ttattattaa atttaagttt tataataata 2220
tctttattat atttattgtt tttaaaaaaa ctagtgaaat ttctagtgaa atttccggct 2280
ttattaaact tatttttagg aattttattt tcattttcat ctttacagga tttgattata 2340
tctttaaata tgttttatca aatattatct ttttctaaat ttatatatat ttttattata 2400
tttattatta tatatatttt atttttaagt ttctttctaa cagctattaa aaagaaactt 2460
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attggaatag tttttagtaa aattaatttc aatattccac aatattatat tataagctag 2580
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acataataat gctaatatat taactatggg tcaaagggtt gttggagcag gtcttgcttt 2940
agatatagta aaaacattta tatcagctaa atttgaagga gataggcacc aaaaaagaat 3000
agataagatt tcagatattg aaaaaaagta tacacattag aaaaaagcag ctatgctgca 3060
aataagatca atttatatta gaaaaaagca gctatgctgc aaataagatc aatttatatt 3120
agaaaaaagc agctatgctg caaataagat caatttatat tagaaaaaag cagctatgct 3180
acaaataaga tcaatttata ttagaaaaaa gtagctatgc tgcaacaata ttaatttata 3240
ttactagaaa gctaaatggg gtatataaat ataaagggct ataaatacta aaagcaaact 3300
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ggggaatata gaaaatggag agacgagata agaaaaatta ttacttggat attgctgaaa 3480
cagttttaga gagaggaacc tgtctaagga gaaactatgg ttctataatt gttaaaaatg 3540
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tgaatagttg cataagagaa aagttgaaag ttccaagagg tactcattat gagttgtgta 3660
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tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 4320
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ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 4800
ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat 4860
atgagtaaac ttggtctgac agttaccaaa gctagcttaa tactagtata tacttaatgt 4920
gataagtgtc tgacagctga ccggtctaaa gaggtcccta gcgcctacgg ggaatttgta 4980
tcgataaggg gtacaaattc ccactaagcg ctcggccggg gatcgatccc cgggtacgta 5040
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taaacttgaa tttgagaggg aacttagatg gtatttgaaa aaattgataa aaatagttgg 5220
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gttaaagtgg atatcacaca aataaaggaa aagggaatga aactatatcc tgcaatgctt 5340
tattatattg caatgattgt aaaccgccat tcagagttta ggacggcaat caatcaagat 5400
ggtgaattgg ggatatatga tgagatgata ccaagctata caatatttca caatgatact 5460
gaaacatttt ccagcctttg gactgagtgt aagtctgact ttaaatcatt tttagcagat 5520
tatgaaagtg atacgcaacg gtatggaaac aatcatagaa tggaaggaaa gccaaatgct 5580
ccggaaaaca tttttaatgt atctatgata ccgtggtcaa ccttcgatgg ctttaatctg 5640
aatttgcaga aaggatatga ttatttgatt cctattttta ctatggggaa atattataaa 5700
gaagataaca aaattatact tcctttggca attcaagttc atcacgcagt atgtgacgga 5760
tttcacattt gccgttttgt aaacgaattg caggaattga taaatagtta acttcaggtt 5820
tgtctgtaac taaaaactag tatttaacct agg 5853
<210> 34
<211> 4966
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pGRNA-pNF2
<400> 34
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tgctagctta taatataata ttgtggaata ttgaaattaa ttttactaaa aactattcca 120
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ttaagtttct ttttaatagc tgttagaaag aaacttaaaa ataaaatata tataataata 240
aatataataa aaatatatat aaatttagaa aaagataata tttgataaaa catatttaaa 300
gatataatca aatcctgtaa agatgaaaat gaaaataaaa ttcctaaaaa taagtttaat 360
aaagccggaa atttcactag aaatttcact agttttttta aaaacaataa atataataaa 420
gatattatta taaaacttaa atttaataat aacatcataa ggaaaatgga ttggtttact 480
tcaacggctt tattatatga aaaaaataca attaaattta aacataatat tacaaaaagt 540
attgttaaaa ttgaaaaaaa ttaaatcttt agtatctttg gaaataatca taatttataa 600
gctcctttga ttttttatat aaattataca ttaattattt aatatataaa aactaaaatt 660
agtaaatcat ctaaatatta caaatgaaga aatattattt gtaaataatt atagtaatat 720
attatggaat gaaatagtaa aaaattaaaa agaatcattt aatttagttt aaaatatttt 780
aataaaaata ataaattaaa acataaaaaa tagattaagt ttcaattggg gacttactct 840
attttttatt aagagtttaa gaatagttaa taattattga aaatatgata taattttctt 900
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aggtattaat ggacttagaa aagaattatt ttaatcaaag tattcctata ccaaactatg 1260
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cattaccatt atggaaagcg gttcaagaat atttatataa tcaattaaaa tactttggag 1380
cagatagaca agccttagat gcaacgagaa tattaagagt tccaggaagt ataaactcta 1440
aatcaaaaac agtagtcaat atattagatg agtacgaata tatttatgac ttaagagaaa 1500
tacaaaatgg atttttacct gaattaaaac catatgaaag gaaaaagggt agaccaagca 1560
aaataaatta tatttataga gaaagaagtt tatattatgg aagaatacaa gacataataa 1620
aactttgtga actaagagaa tatgatttaa aaggacacag agagcttata ttatttttat 1680
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tagagttatt agaaattaca gaagaagaac aaaaatatat gacaataata atttctaaaa 1920
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ctaaaggaaa agcaacaaaa aaagaggaat taaatgtatt aagaaaaaaa ataaaagccc 2040
ttaaagaaaa aggctttaaa aataaagaaa ttactctaat gttagaagta ccaataaaaa 2100
cattagaacg tcatattacg tatatgaaaa aaaatgggct tttataaagg ctcatttttt 2160
atattctttt cttcaaagat tatataatat aaaaaaattt ttttcaaact ttaaataaaa 2220
aatattttta tattttttta tttttttatt tttatatttt tttatttttt tatttttata 2280
tttttttatt tttatatttt tttattttta tattttttta tttttttatt tttttatttt 2340
tttatttttt tattttttta tttttttatt tttaccctca ttttttttac gcttgtatta 2400
tagggtactt tgtacctgtt cttttttttg gggaggttgt aaagataatt ttttacttta 2460
gttagttccg aaggaacttt tattatagtg cccctttatt tttttgcgtg gcattgaatg 2520
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cccttttcct ttatttgtgt gatatccact ttaacggtca tgctgtaggt acaaggtaca 3240
cttgcaaagt agtggtcaaa atactctttt ctgttccaac tatttttatc aattttttca 3300
aataccatct aagttccctc tcaaattcaa gtttatcgct ctaatgaaca aagatattat 3360
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ctagctttgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 3660
tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 3720
cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 3780
ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 3840
accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 3900
cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca 3960
cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 4020
tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 4080
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cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgaattcg agctcactct 4800
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ccatctacta aacaagtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta 4920
tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg ctttttttga agcttg 4966
<210> 35
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> catB gene upstream fragment
<400> 35
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atatattaac gtgtaatata ataccccgca aatattaatt atcacataca tatcccccct 240
ttattggggc attttttgta cccattattt tagtattgtg cagtacttaa ataaaaaaat 300
gccgcaaatt catttttatt gaataatgcg gtatttcttc tattctttat ttttattact 360
ctataaataa tgtaatcaag acatgactat ctaaatatat 400
<210> 36
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> catB gene downstream fragment
<400> 36
aattcataat tcgggcctcc taaaaatttt cgtaattcta ttttagaagg cttttttccg 60
tgacctagcc atttcaatct cctttttaca atgatattta cgctttagtt tattatagca 120
cattctgtaa taccgaacta ttcaattttc agagaccatt ttttattgat tcataactta 180
agaatactac gaattactct aatattttac tttttcttat ctcttgttat tttaacatcg 240
gaattactac taatattaat ttttattttt ccatccgcat ttgctccaac atttttttaa 300
ctatactttc cttttgttaa taaattatgt tattgttgaa caatataaga aaagtgcgta 360
acatttttta ttaaaaataa ttaggtattt ctatctgtgg 400
<210> 37
<211> 218
<212> PRT
<213> Clostridium beijerinckii
<400> 37
Met Asn Phe Asn Leu Ile Asp Ile Asn His Trp Ser Arg Lys Pro Tyr
1 5 10 15
Phe Glu His Tyr Leu Asn Asn Val Lys Cys Thr Tyr Ser Met Thr Ala
20 25 30
Asn Ile Glu Ile Thr Asp Leu Leu Tyr Glu Ile Lys Leu Lys Asn Ile
35 40 45
Lys Phe Tyr Pro Thr Leu Ile Tyr Met Ile Ala Thr Val Val Asn Lys
50 55 60
His Lys Glu Phe Arg Ile Cys Asp His Glu Gly Ser Leu Gly Tyr Trp
65 70 75 80
Asp Ser Met Asn Pro Ser Tyr Thr Ile Phe His Lys Glu Asn Glu Thr
85 90 95
Phe Ser Ser Ile Trp Thr Glu Tyr Asn Lys Ser Phe Leu Arg Phe Tyr
100 105 110
Ser Asp Tyr Leu Asp Asp Ile Lys Asn Tyr Gly Asn Ile Met Lys Phe
115 120 125
Thr Pro Lys Ser Asn Glu Pro Asp Asn Thr Phe Ser Val Ser Ser Ile
130 135 140
Pro Trp Val Ser Phe Thr Gly Phe Asn Leu Asn Val Tyr Asn Glu Gly
145 150 155 160
Thr Tyr Leu Ile Pro Ile Phe Thr Ala Gly Lys Tyr Phe Lys Gln Glu
165 170 175
Asn Lys Ile Phe Ile Pro Ile Ser Ile Gln Val His His Ala Ile Cys
180 185 190
Asp Gly Tyr His Ala Ser Arg Phe Ile Asn Glu Met Gln Glu Leu Ala
195 200 205
Phe Ser Phe Gln Glu Trp Leu Glu Asn Lys
210 215
<210> 38
<211> 9113
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pCas9ind-gRNA_catB
<400> 38
catggataaa aagtacagta ttggtctaga cataggaact aactctgttg ggtgggctgt 60
tataacagat gaatataaag ttccatcaaa aaaatttaaa gtattaggaa acactgatag 120
acattcaata aaaaaaaact tgataggtgc tttattattc gattcaggag agactgctga 180
agctacacgt ttaaaaagaa cagctagacg tagatataca agaagaaaaa ataggatatg 240
ttatcttcaa gaaattttta gtaatgaaat ggcaaaagtt gatgattcat tctttcacag 300
actagaagaa agtttcttag ttgaagaaga taagaagcat gaaagacacc ctatttttgg 360
taatatcgta gatgaagtag catatcatga gaagtatcca actatctatc atttaagaaa 420
gaaattagtt gattctacag ataaagctga tctgagatta atatatttag ctttagctca 480
tatgattaaa tttagaggac attttttaat agaaggtgat ttaaacccag acaacagcga 540
tgtagataaa ttatttatcc aattagttca aacttataat caattattcg aagagaatcc 600
aattaatgca agtggtgtag acgctaaggc tatattatca gctagattat caaaatctag 660
aagattagaa aatctaatag ctcaacttcc tggagaaaag aaaaatggac tttttgggaa 720
cctaatagct ctctcactcg gactaacacc aaattttaaa agcaattttg atcttgctga 780
agacgcaaag ttacaactat caaaggatac atacgatgat gatttagata atttgttagc 840
tcaaataggt gatcaatatg ctgatttgtt tcttgcagca aaaaacttaa gtgatgcaat 900
tttactatca gatatactta gagtaaatac agaaataaca aaggctcctt tatcagcaag 960
tatgattaaa cgatatgatg agcatcatca agatttaaca ttattaaagg cacttgtaag 1020
acaacaatta ccagaaaaat ataaagaaat tttctttgat caatctaaaa atggatatgc 1080
tggatatata gacggtggag caagtcaaga agagttttat aaatttataa agcctatttt 1140
agaaaaaatg gatggaactg aagaattact tgttaaactt aacagagaag atttacttag 1200
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tgctatacta agaagacaag aagattttta tccatttctt aaagataata gagaaaaaat 1320
tgaaaaaatt ttaactttta gaataccata ttatgtagga ccacttgcaa ggggaaattc 1380
aagatttgca tggatgacta gaaaatcaga agaaactata accccgtgga attttgaaga 1440
agtagtagat aaaggagcta gtgctcaatc atttatagaa agaatgacaa attttgataa 1500
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gtctggtgaa caaaagaaag caatagtaga cctattattt aaaacaaata ggaaggttac 1680
cgtaaagcaa cttaaagaag attacttcaa aaaaattgaa tgctttgata gtgttgaaat 1740
atcaggagtt gaagatagat ttaatgcttc acttggtaca tatcacgatc tcttaaaaat 1800
tataaaagat aaggattttt tagataatga agaaaatgaa gatattcttg aagatatagt 1860
attaacattg acactttttg aagatagaga aatgatagaa gaaagattaa aaacatatgc 1920
acatcttttt gatgataagg ttatgaagca acttaaaaga agaagatata caggttgggg 1980
acgtttgtca agaaagctaa ttaatggtat tagagataaa caatcaggaa agactattct 2040
cgattttctt aaatcagatg gatttgctaa tagaaacttt atgcaattaa ttcatgatga 2100
ttctcttact ttcaaagagg atattcaaaa ggctcaagtt tctggacaag gcgatagctt 2160
acacgaacac attgctaacc ttgcagggag ccccgctatc aaaaaaggaa ttttacaaac 2220
agttaaagtt gtagatgaac ttgttaaagt tatgggaaga cacaaacctg agaatatagt 2280
tatagaaatg gccagagaaa atcaaacaac acaaaaagga caaaaaaatt ctagagagag 2340
aatgaagaga attgaagaag gaataaaaga gctaggatca caaatattaa aagaacatcc 2400
agttgaaaat actcaattgc aaaatgaaaa gttatatttg tattacttac aaaatggaag 2460
agatatgtat gttgatcaag aactcgatat taatagatta agtgactatg atgttgatca 2520
tattgttcct caatcatttt taaaagatga ttcaatcgat aacaaagtat taactagatc 2580
agataaaaat agaggaaagt cagataatgt accatctgaa gaagttgtta aaaaaatgaa 2640
gaactattgg agacaacttt taaatgcaaa gctaattaca caaagaaaat ttgacaattt 2700
aacaaaagca gaaagaggag gattaagcga attagacaaa gctggattta taaaaagaca 2760
acttgttgag acaagacaaa taactaagca tgttgctcaa atacttgatt caagaatgaa 2820
tacaaaatat gatgaaaatg ataaattaat cagagaagta aaagtaataa cattaaagtc 2880
aaaattagta tcagatttca gaaaggattt tcaattttac aaagttcgtg aaataaataa 2940
ctatcatcat gctcatgatg catacttaaa tgctgttgta ggaactgctc ttattaagaa 3000
atatcctaaa ctagaaagcg aatttgttta tggagattat aaagtttatg atgtgcgcaa 3060
aatgatcgcg aaatccgaac aagaaatcgg taaggctaca gcaaaatatt tcttttatag 3120
taatataatg aattttttta agacagaaat aactttggct aatggtgaaa tcagaaaaag 3180
accacttatc gaaacaaatg gagagacagg agaaatagta tgggataaag gaagagattt 3240
tgctactgtt agaaaagtac taagtatgcc acaagtaaat atcgtaaaga aaactgaagt 3300
tcaaactgga ggtttctcta aggaatcaat tttacctaag agaaattcag ataagttaat 3360
tgcaaggaaa aaagattggg acccaaaaaa atacggtggt tttgatagtc caacagttgc 3420
ctatagtgtt cttgtagtag cgaaagttga gaaaggtaag tcaaaaaagt tgaaaagcgt 3480
aaaagaactt cttggtatca caattatgga aagatcttca tttgaaaaaa atccaattga 3540
ctttttagaa gctaagggtt ataaagaagt taaaaaggat ttaatcataa aactaccaaa 3600
gtatagtcta tttgaactcg aaaacggaag aaaacgaatg ctcgctagcg caggagaact 3660
tcaaaaagga aatgaacttg cgctgccatc aaagtatgta aatttcttat atttagcttc 3720
tcattatgag aaattaaaag gatcaccaga ggataatgaa caaaagcaac tatttgtaga 3780
acaacacaaa cattatttag atgaaataat agaacaaata tctgaatttt ctaaaagagt 3840
tatacttgcc gacgcaaatc tagataaggt gctttcagcg tataataaac acagagataa 3900
accaataaga gaacaagcag aaaacattat ccatcttttt acattaacta atcttggtgc 3960
accagctgca tttaagtact ttgatacaac aatagataga aaaagataca catctactaa 4020
agaagtatta gacgcaactt taatacatca atctattaca gggctttatg aaacaagaat 4080
tgatttaagt caactaggcg gagattaagt cgacaaagta ttgttaaaaa taactctgta 4140
gaattataaa ttagttctac agagttattt tttgacccgg gtatattgat aaaaataata 4200
atagtgggta taattaagtt gttaggaggt tagttagaat gatgtcaaga ttagataaaa 4260
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tttgcccttt agaaggggaa agctggcaag attttttacg taataacgct aaaagtttta 4500
gatgtgcttt actaagtcat cgcgatggag caaaagtaca tttaggtaca cggcctacag 4560
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tattcggcct tgaattgatc atatgcggat tagaaaaaca acttaaatgt gaaagtgggt 4860
cttaaaagca gcataacctt tttccgtgat ggtaacttca cggtaaccaa gatgtcgagt 4920
tgagctcgaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 4980
caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag 5040
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tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 6060
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acagcaaaga atggcggaaa cgtaaaagaa gttatggaaa taagacttag aagcaaactt 6300
aagagtgtgt tgatagtgca gtatcttaaa attttgtata ataggaattg aagttaaatt 6360
agatgctaaa aatttgtaat taagaaggag tgattacatg aacaaaaata taaaatattc 6420
tcaaaacttt ttaacgagtg aaaaagtact caaccaaata ataaaacaat tgaatttaaa 6480
agaaaccgat accgtttacg aaattggaac aggtaaaggg catttaacga cgaaactggc 6540
taaaataagt aaacaggtaa cgtctattga attagacagt catctattca acttatcgtc 6600
agaaaaatta aaactgaata ctcgtgtcac tttaattcac caagatattc tacagtttca 6660
attccctaac aaacagaggt ataaaattgt tgggagtatt ccttaccatt taagcacaca 6720
aattattaaa aaagtggttt ttgaaagcca tgcgtctgac atctatctga ttgttgaaga 6780
aggattctac aagcgtacct tggatattca ccgaacacta gggttgctct tgcacactca 6840
agtctcgatt cagcaattgc ttaagctgcc agcggaatgc tttcatccta aaccaaaagt 6900
aaacagtgtc ttaataaaac ttacccgcca taccacagat gttccagata aatattggaa 6960
gctatatacg tactttgttt caaaatgggt caatcgagaa tatcgtcaac tgtttactaa 7020
aaatcagttt catcaagcaa tgaaacacgc caaagtaaac aatttaagta ccgttactta 7080
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aaaaaaaaat acttgttatg tattcaatta cgggttaaaa tatagacaag ttgaaaaatt 7380
taataaaaaa ataagtcctc agctcttata tattaagcta ccaacttagt atataagcca 7440
aaacttaaat gtgctaccaa cacatcaagc cgttagagaa ctctatctat agcaatattt 7500
caaatgtacc gacatacaag agaaacatta actatatata ttcaatttat gagattatct 7560
taacagatat aaatgtaaat tgcaataagt aagatttaga agtttatagc ctttgtgtat 7620
tggaagcagt acgcaaaggc ttttttattt gataaaaatt agaagtatat ttattttttc 7680
ataattaatt tatgaaaatg aaagggggtg agcaaagtga cagaggaaag cagtatctta 7740
tcaaataaca aggtattagc aatatcatta ttgactttag cagtaaacat tatgactttt 7800
atagtgcttg tagctaagta gtacgaaagg gggagcttta aaaagctcct tggaatacat 7860
agaattcata aattaattta tgaaaagaag ggcgtatatg aaaacttgta aaaattgcaa 7920
agagtttatt aaagatactg aaatatgcaa aatacattcg ttgatgattc atgataaaac 7980
agtagcaacc tattgcagta aatacaatga gtcaagatgt ttacataaag ggaaagtcca 8040
atgtattaat tgttcaaaga tgaaccgata tggatggtgt gccataaaaa tgagatgttt 8100
tacagaggaa gaacagaaaa aagaacgtac atgcattaaa tattatgcaa ggagctttaa 8160
aaaagctcat gtaaagaaga gtaaaaagaa aaaataattt atttattaat ttaatattga 8220
gagtgccgac acagtatgca ctaaaaaata tatctgtggt gtagtgagcc gatacaaaag 8280
gatagtcact cgcattttca taatacatct tatgttatga ttatgtgtcg gtgggacttc 8340
acgacgaaaa cccacaataa aaaaagagtt cggggtaggg ttaagcatag ttgaggcaac 8400
taaacaatca agctaggata tgcagtagca gaccgtaagg tcgttgttta ggtgtgttgt 8460
aatacatacg ctattaagat gtaaaaatac ggataccaat gaagggaaaa gtataatttt 8520
tggatgtagt ttgtttgttc atctatgggc aaactacgtc caaagccgtt tccaaatctg 8580
ctaaaaagta tatcctttct aaaatcaaag tcaagtatga aatcataaat aaagtttaat 8640
tttgaagtta ttatgatatt atgtttttct attaaaataa attaagtata tagaatagtt 8700
taataatagt atatacttaa tgtgataagt gtctgacagt gtcacagaaa ggatgattgt 8760
tatggattat aagcggctcg aggacgtcaa accatgttaa tcattgcttt tatcaaaaat 8820
aggatccact ctatcattga tagagtttga aactctatca ttgatagagt ataatatctt 8880
tgttcatgta catcatgcta tctgtgagtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 8940
gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttt gaagcttgtc 9000
tttacacttt tgcccctcga gtccctatca gtgatagatt gaaactctat cattgataga 9060
gtataatatc tttgttcatt agagcgataa acttgaattt gagagggaac ttc 9113
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer pNF2
<400> 40
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<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 41
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 42
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer pCas9ind _rev
<400> 43
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<211> 219
<212> PRT
<213> Clostridium butyricum
<400> 44
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Phe Glu His Tyr Leu Asn Asn Val Lys Cys Thr Tyr Ser Met Thr Ala
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Asn Ile Glu Ile Thr Asp Leu Leu Tyr Glu Ile Lys Leu Lys Asn Ile
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<211> 219
<212> PRT
<213> Clostridium beijerinckii
<400> 45
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Asn Ile Glu Ile Thr Asp Leu Leu Tyr Glu Ile Lys Leu Lys Asn Ile
35 40 45
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<213> Clostridium beijerinckii
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<211> 219
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<213> Clostridium beijerinckii
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Phe Glu His Tyr Leu Asn Asn Val Lys Cys Thr Tyr Ser Met Thr Ala
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<210> 49
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clostridium diolis
<400> 49
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115 120 125
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195 200 205
Ala Phe Ser Phe Gln Glu Trp Leu Glu Asn Lys
210 215
<210> 50
<211> 219
<212> PRT
<213> Clostridium beijerinckii
<400> 50
Met Asn Phe Asn Leu Ile Asp Ile Asn His Trp Ile Arg Lys Pro Tyr
1 5 10 15
Phe Glu His Tyr Leu Asn Asn Val Lys Cys Thr Tyr Ser Met Thr Ala
20 25 30
Asn Ile Glu Ile Thr Asp Leu Leu Tyr Glu Ile Lys Leu Lys Asn Ile
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<212> PRT
<213> Clostridium beijerinckii
<400> 51
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130 135 140
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165 170 175
Gly Asn Lys Ile Phe Ile Pro Ile Ser Ile Gln Val His His Ala Ile
180 185 190
Cys Asp Gly Tyr His Ala Ser Arg Phe Ile Asn Glu Met Gln Glu Leu
195 200 205
Ala Phe Ser Phe Gln Glu Trp Leu Glu Asn Lys Tyr Ile
210 215 220
<210> 52
<211> 219
<212> PRT
<213> Clostridium beijerinckii
<400> 52
Met Asn Phe Asn Leu Ile Asp Ile Asn Asn Trp Ser Arg Lys Pro Tyr
1 5 10 15
Phe Glu His Tyr Leu Asn Asn Val Lys Cys Thr Tyr Ser Met Thr Ala
20 25 30
Asn Ile Glu Ile Thr Asp Leu Leu Tyr Glu Ile Lys Leu Lys Asn Ile
35 40 45
Lys Phe Tyr Pro Thr Leu Ile Tyr Met Ile Ala Thr Val Val Asn Asn
50 55 60
His Lys Glu Phe Arg Ile Cys Phe Asp His Asn Gly Ser Leu Gly Tyr
65 70 75 80
Trp Asp Ser Met Asn Pro Ser Tyr Thr Ile Phe His Lys Glu Asn Glu
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100 105 110
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115 120 125
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Gly Thr Tyr Leu Ile Pro Ile Phe Thr Ala Gly Lys Tyr Phe Lys Gln
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180 185 190
Cys Asp Gly Tyr His Ala Ser Arg Phe Ile Asn Glu Met Gln Glu Leu
195 200 205
Ala Phe Ser Phe Arg Glu Trp Leu Glu Asn Lys
210 215
<210> 53
<211> 219
<212> PRT
<213> Clostridium saccharoperbutylacetonicum
<400> 53
Met Asn Phe Asn Leu Ile Asp Ile Asn His Trp Ser Arg Lys Pro Tyr
1 5 10 15
Phe Glu His Tyr Leu Asn Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Met Thr Ala
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
Tyr Ser Asp Tyr Ile Asp Asp Ile Lys Asn Tyr Gly Asn Ile Met Lys
115 120 125
Phe Thr Pro Lys Ser Asn Glu Pro Asp Asn Ile Phe Pro Val Ser Ser
130 135 140
Ile Pro Trp Val Ser Phe Thr Gly Phe Asn Leu Asn Val Tyr Asn Glu
145 150 155 160
Gly Thr Tyr Leu Ile Pro Ile Phe Thr Ala Gly Lys Tyr Phe Lys Gln
165 170 175
Glu Asn Lys Ile Phe Ile Pro Ile Ser Ile Gln Val His His Ala Val
180 185 190
Cys Asp Gly Tyr His Ala Ser Arg Phe Ile Asn Glu Met Gln Glu Leu
195 200 205
Ala Phe Ser Phe Gln Glu Trp Leu Glu Asn Lys
210 215
<210> 54
<211> 219
<212> PRT
<213> Clostridium saccharoperbutylacetonicum
<400> 54
Met Asn Phe Asn Leu Ile Asp Ile Asn His Trp Ser Arg Lys Pro Tyr
1 5 10 15
Phe Glu His Tyr Leu Asn Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Met Thr Ala
20 25 30
Asn Ile Glu Ile Thr Asp Leu Leu Tyr Glu Ile Lys Leu Lys Asn Ile
35 40 45
Lys Phe Tyr Pro Thr Leu Ile Tyr Met Ile Ala Thr Val Val Asn Asn
50 55 60
His Lys Glu Phe Arg Ile Cys Phe Asp His Lys Gly Ser Leu Gly Tyr
65 70 75 80
Trp Asp Ser Met Asn Pro Ser Tyr Thr Ile Phe Tyr Lys Glu Asn Glu
85 90 95
Thr Phe Ser Ser Ile Trp Thr Glu Tyr Asn Glu Ser Phe Leu Arg Phe
100 105 110
Tyr Ser Asp Tyr Ile Asp Asp Ile Lys Asn Tyr Gly Asn Ile Met Lys
115 120 125
Phe Thr Pro Lys Ser Asn Glu Pro Asp Asn Ile Phe Pro Val Ser Ser
130 135 140
Ile Pro Trp Val Ser Phe Thr Gly Phe Asn Leu Asn Val Tyr Asn Glu
145 150 155 160
Gly Thr Tyr Leu Ile Pro Ile Phe Thr Ala Gly Lys Tyr Phe Lys Gln
165 170 175
Glu Asn Lys Ile Phe Ile Pro Ile Ser Ile Gln Val His His Ala Val
180 185 190
Cys Asp Gly Tyr His Ala Ser Arg Phe Ile Asn Glu Met Gln Glu Leu
195 200 205
Ala Phe Ser Phe Gln Glu Trp Leu Glu Asn Lys
210 215
<210> 55
<211> 219
<212> PRT
<213> Clostridium beijerinckii
<400> 55
Met Asn Phe Asn Leu Ile Asp Ile Asn Asn Trp Ser Arg Lys Pro Tyr
1 5 10 15
Phe Glu His Tyr Leu Asn Asn Val Lys Cys Thr Tyr Ser Met Thr Ala
20 25 30
Asn Ile Glu Ile Thr Asp Leu Leu Tyr Glu Ile Lys Leu Lys Asn Ile
35 40 45
Lys Phe Tyr Pro Thr Leu Ile Tyr Met Ile Ala Thr Val Val Asn Asn
50 55 60
His Lys Glu Phe Arg Ile Cys Phe Asp His Asn Gly Ser Leu Gly Tyr
65 70 75 80
Trp Asp Ser Met Asn Pro Ser Tyr Thr Ile Phe His Lys Glu Asn Glu
85 90 95
Thr Phe Ser Ser Ile Trp Thr Glu Tyr Asn Glu Ser Phe Leu Arg Phe
100 105 110
Tyr Ser Asp Tyr Leu Asp Asp Ile Lys Asn Tyr Gly Asn Ile Met Lys
115 120 125
Phe Thr Pro Lys Ser Asn Arg Ser Asp Asn Thr Phe Pro Val Ser Ser
130 135 140
Ile Pro Trp Val Ser Phe Thr Gly Phe Asn Leu Asn Val Tyr Asn Glu
145 150 155 160
Gly Thr Tyr Leu Ile Pro Ile Phe Thr Ala Gly Lys Tyr Phe Lys Gln
165 170 175
Gly Asn Lys Ile Phe Ile Pro Ile Ser Ile Gln Val His His Ala Ile
180 185 190
Cys Asp Gly Tyr His Ala Ser Arg Phe Ile Asn Glu Met Gln Glu Leu
195 200 205
Ala Phe Ser Phe Arg Glu Trp Leu Glu Asn Lys
210 215
<210> 56
<211> 221
<212> PRT
<213> Clostridium beijerinckii
<400> 56
Met Asn Phe Asn Leu Ile Asp Ile Asn His Trp Asn Arg Lys Pro Phe
1 5 10 15
Phe Glu His Tyr Leu Asn Asn Val Lys Cys Thr Tyr Ser Met Thr Ala
20 25 30
Asn Ile Glu Ile Thr Asp Leu Leu Tyr Glu Ile Lys Leu Lys Asn Ile
35 40 45
Lys Phe Tyr Pro Thr Leu Ile Tyr Met Ile Ala Thr Val Val Asn Asn
50 55 60
His Lys Glu Phe Arg Ile Cys Phe Asp His Lys Gly Ser Leu Gly Tyr
65 70 75 80
Trp Asp Ser Met Asn Pro Ser Tyr Thr Ile Phe His Glu Glu Asn Glu
85 90 95
Thr Phe Ser Ser Ile Trp Thr Glu Tyr Asn Glu Ser Phe Leu Arg Phe
100 105 110
Tyr Ser Asp Tyr Leu Asp Asp Ile Lys Asn Tyr Gly Asn Ile Met Lys
115 120 125
Phe Thr Pro Lys Ser Asn Glu Pro Asp Asn Thr Phe Pro Val Ser Ser
130 135 140
Ile Pro Trp Val Ser Phe Thr Gly Phe Asn Leu Asn Val Cys Asn Glu
145 150 155 160
Gly Thr Tyr Leu Thr Pro Ile Phe Thr Ala Gly Lys Tyr Phe Lys Gln
165 170 175
Glu Asn Lys Ile Phe Ile Pro Ile Ser Ile Gln Val His His Ser Ile
180 185 190
Cys Asp Gly Tyr His Ala Ser Arg Phe Ile Asn Glu Met Gln Glu Leu
195 200 205
Ala Phe Ser Phe Gln Glu Trp Leu Glu Asn Lys Tyr Ile
210 215 220
<210> 57
<211> 219
<212> PRT
<213> Clostridium beijerinckii
<400> 57
Met Asn Phe Asn Leu Ile Asp Ile Lys His Trp Ser Arg Lys Pro Tyr
1 5 10 15
Phe Glu His Tyr Leu Asn Asn Val Lys Cys Thr Tyr Ser Met Thr Ala
20 25 30
Asn Ile Glu Ile Thr Asp Leu Leu Tyr Glu Ile Arg Leu Lys Asn Ile
35 40 45
Lys Leu Tyr Pro Thr Leu Ile Tyr Met Ile Ala Thr Val Val Asn Asn
50 55 60
His Lys Glu Phe Arg Thr Cys Phe Asp His Ser Gly Ser Leu Gly Tyr
65 70 75 80
Trp Asp Ser Met Ser Pro Ser Tyr Thr Ile Phe His Lys Glu Asn Glu
85 90 95
Thr Phe Ser Ser Ile Trp Thr Glu Tyr Asn Glu Ser Phe Pro Arg Phe
100 105 110
Tyr Ser Asp Tyr Phe Asp Asp Ile Lys Asn Tyr Gly Asn Ile Met Lys
115 120 125
Phe Thr Pro Lys Leu Asn Glu Pro Asp Asn Thr Phe Pro Val Ser Ser
130 135 140
Ile Pro Trp Val Ser Phe Thr Gly Phe Asn Leu Asn Val Tyr Asn Glu
145 150 155 160
Gly Thr Tyr Leu Ile Pro Ile Phe Thr Thr Gly Lys Tyr Phe Lys Gln
165 170 175
Glu Asn Lys Met Phe Ile Pro Ile Ser Ile Gln Val His His Ala Ile
180 185 190
Cys Asp Gly Tyr His Ala Ser Arg Phe Ile Asn Glu Met Gln Glu Leu
195 200 205
Ala Phe Ser Phe Gln Asp Trp Leu Glu Asn Lys
210 215
<210> 58
<211> 219
<212> PRT
<213> Clostridium botulinum
<400> 58
Met Lys Phe Asn Leu Ile Asp Ile Glu His Trp Asn Arg Lys Pro Tyr
1 5 10 15
Phe Glu Tyr Tyr Leu His Ser Val Arg Cys Thr Tyr Ser Met Thr Ala
20 25 30
Asn Ile Glu Ile Thr Asn Leu Leu His Glu Ile Lys Leu Lys Lys Leu
35 40 45
Lys Leu Tyr Pro Thr Leu Ile Tyr Ile Ile Ala Thr Val Val Asn Asn
50 55 60
His Lys Glu Phe Arg Thr Cys Phe Asp Glu Asn Gly Asn Leu Gly Tyr
65 70 75 80
Trp Asp Ser Met Ser Pro Ser Tyr Thr Ile Phe His Lys Asp Asn Glu
85 90 95
Thr Phe Ser Ser Ile Trp Thr Asp Tyr Asp Glu Ser Phe Ser Cys Phe
100 105 110
Tyr Asn Asp Tyr Leu Asp Asp Ile Lys Asn Tyr Gly Ala Ile Met Lys
115 120 125
Phe Thr Pro Lys Leu Asn Glu Pro Ala Asn Thr Phe Pro Val Ser Ser
130 135 140
Ile Pro Trp Val Asn Phe Thr Gly Phe Asn Leu Asn Val Tyr Asn Asn
145 150 155 160
Gly Thr Tyr Leu Val Pro Ile Phe Thr Met Gly Lys Tyr Phe Glu Gln
165 170 175
Asn Asn Lys Ile Phe Ile Pro Met Ser Ile Gln Val His His Ala Val
180 185 190
Cys Asp Gly Tyr His Ile Ser Arg Phe Ile Asn Glu Val Gln Glu Leu
195 200 205
Ala Leu Asn Ser Gln Thr Trp Leu Lys His Lys
210 215
<210> 59
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Anaerocolumna aminovalerica
<400> 59
Met Lys Phe Asn Leu Ile Asp Ile Glu Asn Trp Asn Arg Lys Pro Tyr
1 5 10 15
Phe Glu His Tyr Leu Asn Ser Val Arg Cys Thr Tyr Ser Met Thr Ala
20 25 30
Asn Ile Glu Ile Thr Asn Leu Leu His Glu Ile Lys Leu Lys Asp Leu
35 40 45
Lys Leu Tyr Pro Thr Leu Ile Tyr Ile Leu Ala Thr Val Val Asn Asn
50 55 60
His Lys Glu Phe Arg Thr Cys Phe Asp Glu Asn Gly Asn Leu Gly Tyr
65 70 75 80
Trp Asp Ser Met Ser Pro Ser Tyr Thr Ile Phe His Lys Glu Asn Glu
85 90 95
Thr Phe Ser Ser Ile Trp Thr Glu Tyr Asp Glu Ser Phe Ser Arg Phe
100 105 110
Tyr Thr Ala Tyr Leu Asp Asp Ile Lys Asn His Gly Asn Ile Met Lys
115 120 125
Phe Thr Pro Lys Leu Asn Glu Pro Ala Asn Thr Phe Pro Ile Ser Ser
130 135 140
Ile Pro Trp Val Ser Phe Thr Gly Phe Asn Leu Asn Val Tyr Asn Asp
145 150 155 160
Gly Lys Tyr Leu Leu Pro Ile Phe Thr Thr Gly Lys Tyr Phe Glu Gln
165 170 175
Asn Ser Lys Ile Phe Ile Pro Met Ser Val Gln Val His His Ala Val
180 185 190
Cys Asp Gly Tyr His Ile Ser Arg Phe Ile Asn Glu Val Gln Glu Val
195 200 205
Ile Leu Asn Tyr Gln Thr Trp Leu Gly Asp Lys
210 215
<210> 60
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Desnuesiella massiliensis
<400> 60
Met Lys Phe Asn Leu Ile Asp Ile Glu His Trp Asn Arg Lys Pro Tyr
1 5 10 15
Phe Glu His Tyr Leu Asn Ser Val Arg Cys Thr Tyr Ser Met Thr Ala
20 25 30
Asn Ile Glu Ile Thr Asn Leu Leu His Asp Ile Lys Leu Lys Lys Leu
35 40 45
Lys Leu Tyr Pro Thr Leu Ile Tyr Ile Ile Ala Thr Val Val Asn Asn
50 55 60
His Glu Glu Phe Arg Thr Cys Phe Tyr Glu Asn Gly Asn Leu Gly Tyr
65 70 75 80
Trp Asp Ser Met Ser Pro Ser Tyr Thr Ile Phe His Lys Asp Asn Glu
85 90 95
Thr Phe Ser Glu Ile Trp Ser Glu Tyr Asp Glu Ser Phe Ser Cys Phe
100 105 110
Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Asp Ile Lys Asn Tyr Gly Asp Ile Met Arg
115 120 125
Phe Thr Pro Lys Leu Asn Glu Pro Ala Asn Thr Phe Pro Ile Ser Cys
130 135 140
Ile Pro Trp Val Ser Phe Thr Gly Phe Asn Leu Asn Val Tyr Asn Asp
145 150 155 160
Gly Arg Tyr Leu Val Pro Ile Phe Thr Ile Gly Lys Tyr Phe Glu Gln
165 170 175
Asn Asn Lys Ile Phe Ile Pro Met Ser Ile Gln Val His His Ala Val
180 185 190
Cys Asp Gly Tyr His Thr Ser Arg Phe Ile Asn Glu Val Gln Glu Leu
195 200 205
Ala Leu Asn Ser Gln Thr Trp Leu Arg His Lys
210 215
<210> 61
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clostridium sp. HMP27
<400> 61
Met Lys Phe Asn Leu Ile Asp Thr Glu His Trp Asn Arg Lys Pro Tyr
1 5 10 15
Phe Glu His Tyr Leu Asn Ser Val Arg Cys Thr Tyr Ser Ile Thr Ala
20 25 30
Asn Ile Glu Ile Thr Asn Leu Leu His Asp Ile Lys Gln Lys Lys Leu
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Trp Asp Ser Met Ser Pro Ser Tyr Thr Ile Phe His Lys Asp Asn Glu
85 90 95
Thr Phe Ser Ser Ile Trp Thr Glu Tyr Asp Lys Ser Phe Ser Cys Phe
100 105 110
Tyr Ser Lys Tyr Leu His Asp Ile Lys Asn Tyr Gly Asp Ile Met Ser
115 120 125
Phe Thr Pro Lys Leu Asn Glu Pro Ala Asn Thr Phe Pro Ile Ser Cys
130 135 140
Ile Pro Trp Val Ser Phe Thr Gly Phe Asn Leu Asn Ile Tyr Asn Asp
145 150 155 160
Gly Thr Tyr Leu Val Pro Ile Phe Thr Ile Gly Lys Tyr Phe Lys Gln
165 170 175
Ala Asp Lys Ile Leu Ile Pro Ile Ser Ile Gln Val His His Ala Val
180 185 190
Cys Asp Gly Tyr His Thr Ser Arg Phe Ile Asn Glu Val Gln Glu Leu
195 200 205
Ile Leu Asn Tyr Gln Thr Trp Leu Lys His Lys
210 215
<210> 62
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clostridium drakei
<400> 62
Met Lys Phe Asn Leu Ile Asp Ile Glu Asn Trp Asn Arg Lys Pro Tyr
1 5 10 15
Phe Glu His Tyr Leu Asn Ala Val Arg Cys Thr Tyr Ser Met Thr Ala
20 25 30
Asn Ile Glu Ile Thr Gly Leu Leu Arg Glu Ile Lys Leu Lys Gly Leu
35 40 45
Lys Leu Tyr Pro Thr Leu Ile Tyr Ile Ile Thr Ala Val Ile Asn Arg
50 55 60
His Lys Glu Phe Arg Thr Cys Phe Asp Glu Asn Arg Lys Leu Gly Tyr
65 70 75 80
Trp Asp Ser Met Ser Pro Ser Tyr Thr Val Phe His Lys Glu Asp Glu
85 90 95
Thr Phe Ser Ser Ile Trp Thr Glu Tyr Asp Glu Ser Phe Pro Arg Phe
100 105 110
Tyr Asp Asn Tyr Leu Asp Asp Ile Lys Ser Tyr Gly Asp Val Leu Lys
115 120 125
Phe Met Pro Lys Pro Asp Glu Pro Gly Asn Thr Phe Asn Val Ser Ser
130 135 140
Ile Pro Trp Val Asn Phe Thr Gly Phe Asn Leu Asn Ile Tyr Asn Asp
145 150 155 160
Ala Thr Tyr Leu Ile Pro Ile Phe Thr Met Gly Lys Phe Phe His Gln
165 170 175
Asp Asn Lys Ile Phe Ile Pro Met Ser Ile Gln Val His His Ala Val
180 185 190
Cys Asp Gly Tyr His Thr Ser Arg Phe Phe Asn Glu Val Gln Glu Leu
195 200 205
Ser Ser Asn Phe Glu Thr Trp Leu Asp Glu Lys
210 215
<210> 63
<211> 219
<212> PRT
<213> Clostridium scatologenes
<400> 63
Met Lys Phe Asn Leu Ile Asp Ile Glu Asp Trp Asn Arg Lys Pro Tyr
1 5 10 15
Phe Glu His Tyr Leu Asn Ala Val Arg Cys Thr Tyr Ser Met Thr Ala
20 25 30
Asn Ile Glu Ile Thr Gly Leu Leu Arg Glu Ile Lys Leu Lys Gly Leu
35 40 45
Lys Leu Tyr Pro Thr Leu Ile Tyr Ile Ile Thr Ala Val Ile Asn Arg
50 55 60
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65 70 75 80
Trp Asp Ser Met Ser Pro Ser Tyr Thr Val Phe His Lys Glu Asp Glu
85 90 95
Thr Phe Ser Ser Ile Trp Thr Glu Tyr Asp Glu Ser Phe Pro Arg Phe
100 105 110
Tyr Asp Asn Tyr Leu Asp Asp Ile Lys Ser Tyr Gly Asp Val Leu Lys
115 120 125
Phe Met Pro Lys Pro Asp Glu Pro Gly Asn Thr Phe Asn Val Ser Ser
130 135 140
Ile Pro Trp Val Asn Phe Thr Gly Phe Asn Leu Asn Ile Tyr Asn Asp
145 150 155 160
Ala Thr Tyr Leu Ile Pro Ile Phe Thr Met Gly Lys Phe Phe His Gln
165 170 175
Asp Asn Lys Ile Phe Ile Pro Met Ser Ile Gln Val His His Ala Val
180 185 190
Cys Asp Gly Tyr His Thr Ser Arg Phe Phe Asn Glu Val Gln Glu Leu
195 200 205
Ser Ser Asn Phe Glu Thr Trp Leu Gly Glu Lys
210 215
<210> 64
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clostridium tunisiense
<400> 64
Met Lys Phe Asn Leu Ile Asp Thr Glu His Trp Asp Arg Lys Pro Tyr
1 5 10 15
Phe Glu His Tyr Phe Asn Ser Val Lys Cys Thr Tyr Ser Met Thr Ala
20 25 30
Asn Ile Glu Ile Thr Asn Leu Leu Asn His Ile Arg Leu Lys Lys Leu
35 40 45
Lys Leu Tyr Pro Thr Leu Ile Tyr Ile Ile Ala Thr Val Val Asn Asn
50 55 60
His Glu Glu Phe Arg Ile Cys Phe Asp Glu Asn Asn Asn Leu Gly Tyr
65 70 75 80
Trp Asp Ser Met Ser Pro Asn Tyr Thr Ile Phe His Glu Asp Asn Lys
85 90 95
Thr Phe Ser Ser Ile Trp Thr Glu Tyr Glu Glu Ser Phe Ser Gly Phe
100 105 110
Tyr Asn Lys Tyr Leu Glu Asp Ile Lys Thr Tyr Gly His Ile Met Ser
115 120 125
Phe Glu Pro Lys Leu Asn Glu Ser Thr Asn Thr Phe Pro Ile Ser Cys
130 135 140
Ile Pro Trp Val Ser Phe Thr Gly Phe Asn Leu Asn Ile Gln Asp Asp
145 150 155 160
Gly Thr Tyr Leu Thr Pro Ile Phe Thr Leu Gly Lys Tyr Phe Glu Gln
165 170 175
Asn Asn Lys Thr Phe Ile Pro Ile Ser Ile Gln Val His His Ala Val
180 185 190
Cys Asp Gly Tyr His Thr Ser Arg Phe Ile Asn Glu Val Gln Glu Leu
195 200 205
Ala Ser Asp Phe Gln Ile Trp Leu Thr Tyr Lys
210 215
<210> 65
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lachnospiraceae
<400> 65
Met Lys Phe Asn Leu Ile Asp Ile Glu Asp Trp Asn Arg Lys Pro Tyr
1 5 10 15
Phe Glu His Tyr Leu Asn Ala Val Arg Cys Thr Tyr Ser Met Thr Ala
20 25 30
Asn Ile Glu Ile Thr Gly Leu Leu Arg Glu Ile Lys Leu Lys Gly Leu
35 40 45
Lys Leu Tyr Pro Thr Leu Ile Tyr Ile Ile Thr Thr Val Val Asn Arg
50 55 60
His Lys Glu Phe Arg Thr Cys Phe Asp Gln Lys Gly Lys Leu Gly Tyr
65 70 75 80
Trp Asp Ser Met Asn Pro Ser Tyr Thr Val Phe His Lys Asp Asn Glu
85 90 95
Thr Phe Ser Ser Ile Trp Thr Glu Tyr Asp Glu Asn Phe Pro Arg Phe
100 105 110
Tyr Tyr Asn Tyr Leu Glu Asp Ile Arg Asn Tyr Ser Asp Val Leu Asn
115 120 125
Phe Met Pro Lys Thr Gly Glu Pro Ala Asn Thr Ile Asn Val Ser Ser
130 135 140
Ile Pro Trp Val Asn Phe Thr Gly Phe Asn Leu Asn Ile Tyr Asn Asp
145 150 155 160
Ala Thr Tyr Leu Ile Pro Ile Phe Thr Leu Gly Lys Tyr Phe Gln Gln
165 170 175
Asp Asn Lys Ile Leu Leu Pro Met Ser Val Gln Val His His Ala Val
180 185 190
Cys Asp Gly Tyr His Thr Ser Arg Phe Phe Asn Glu Ala Gln Glu Leu
195 200 205
Ala Ser Asn Tyr Glu Thr Trp Leu Gly Glu Lys
210 215
<210> 66
<211> 219
<212> PRT
<213> Clostridium perfringens
<400> 66
Met Lys Phe Asn Leu Ile Asp Ile Glu Asp Trp Asn Arg Lys Pro Tyr
1 5 10 15
Phe Glu His Tyr Leu Asn Ala Val Arg Cys Thr Tyr Ser Met Thr Ala
20 25 30
Asn Ile Glu Ile Thr Gly Leu Leu Arg Glu Ile Lys Leu Lys Gly Leu
35 40 45
Lys Leu Tyr Pro Thr Leu Ile Tyr Ile Ile Thr Thr Val Val Asn Arg
50 55 60
His Lys Glu Phe Arg Thr Cys Phe Asp Gln Lys Gly Lys Leu Gly Tyr
65 70 75 80
Trp Asp Ser Met Asn Pro Ser Tyr Thr Val Phe His Lys Asp Asn Glu
85 90 95
Thr Phe Ser Ser Ile Trp Thr Glu Tyr Asp Glu Asn Phe Pro Arg Phe
100 105 110
Tyr Tyr Asn Tyr Leu Glu Asp Ile Arg Asn Tyr Ser Asp Val Leu Asn
115 120 125
Phe Met Pro Lys Thr Gly Glu Pro Ala Asn Thr Ile Asn Val Ser Ser
130 135 140
Ile Pro Trp Val Asn Phe Thr Gly Phe Asn Leu Asn Ile Tyr Asn Asp
145 150 155 160
Ala Thr Tyr Leu Ile Pro Ile Phe Thr Leu Gly Lys Tyr Phe Gln Gln
165 170 175
Asp Asn Lys Ile Leu Leu Pro Met Ser Val Gln Val His His Ala Val
180 185 190
Cys Asp Gly Tyr His Ile Ser Arg Phe Phe Asn Glu Ala Gln Glu Leu
195 200 205
Ala Ser Asn Tyr Glu Thr Trp Leu Gly Glu Lys
210 215
<210> 67
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clostrdium sp. BL8
<400> 67
Met Lys Phe Asn Leu Ile Asp Ile Asp Gln Trp Asp Arg Lys Pro Tyr
1 5 10 15
Phe Glu His Tyr Phe Asn Ser Val Lys Cys Thr Tyr Ser Ile Thr Ala
20 25 30
Asn Ile Glu Ile Thr Asn Leu Leu Lys Asp Ile Lys Ile Thr Lys Leu
35 40 45
Lys Leu Tyr Pro Thr Leu Ile Tyr Ile Ile Ala Thr Val Ile Asn Asn
50 55 60
His Glu Glu Phe Arg Thr Cys Phe Asp Glu Asn Asn Asn Leu Gly Tyr
65 70 75 80
Trp Asp Ser Met Ser Pro Asn Tyr Thr Ile Phe His Glu Glu Thr Lys
85 90 95
Thr Phe Ser Asn Ile Trp Thr Glu Tyr Asp Lys Ser Phe Ser Gly Phe
100 105 110
Tyr Asn Lys Tyr Val Glu Asp Asn Lys Asn Tyr Gly Asn Ile Met Asn
115 120 125
Phe Asp Pro Lys Leu Asn Glu Pro Ala Asn Thr Phe Pro Ile Ser Cys
130 135 140
Ile Pro Trp Val Ser Phe Thr Gly Phe Asn Leu Asn Ile Gln Asp His
145 150 155 160
Gly Thr Tyr Leu Thr Pro Ile Phe Thr Leu Gly Lys Tyr Phe Glu Glu
165 170 175
Asn Asn Lys Val Phe Ile Pro Met Ser Ile Gln Val His His Ala Val
180 185 190
Cys Asp Gly Tyr His Thr Ser Arg Phe Ile Asn Glu Val Gln Glu Leu
195 200 205
Ala Ser Asn Ser Gln Ser Trp Leu Lys His
210 215
<210> 68
<211> 660
<212> DNA
<213> Clostridium perfringens
<400> 68
atgaaattta atttgataga tattgaggat tggaatagaa agccatactt tgagcattat 60
ttaaatgcgg ttaggtgcac ttacagtatg actgcaaata tagagataac tggtttactg 120
cgtgaaatta aacttaaggg cctgaaactg taccctacgc ttatttatat catcacaact 180
gtggttaacc gtcacaagga gttccgcacc tgttttgatc aaaaaggtaa gttaggatac 240
tgggatagta tgaacccaag ttatactgtc tttcataagg ataacgaaac tttttcaagt 300
atttggacag agtatgacga gaacttccca cgtttttact ataattacct tgaggatatt 360
agaaactata gcgacgtttt gaatttcatg cctaagacag gtgaacctgc taatacaatt 420
aatgtgtcca gcattccttg ggtgaatttt accggattca acctgaatat atacaatgat 480
gcaacatatc taatccctat ttttactttg ggtaagtatt ttcagcagga taataaaatt 540
ttattaccta tgtctgtaca ggtgcatcat gcggtttgcg acggttatca tataagcaga 600
ttttttaatg aggcacagga attagcgtca aattatgaga catggttagg agaaaaataa 660
<210> 69
<211> 624
<212> DNA
<213> Clostridium difficile
<400> 69
atggtatttg aaaaaattga taaaaatagt tggaacagaa aagagtattt tgaccactac 60
tttgcaagtg taccttgtac atacagcatg accgttaaag tggatatcac acaaataaag 120
gaaaagggaa tgaaactata tcctgcaatg ctttattata ttgcaatgat tgtaaaccgc 180
cattcagagt ttaggacggc aatcaatcaa gatggtgaat tggggatata tgatgagatg 240
ataccaagct atacaatatt tcacaatgat actgaaacat tttccagcct ttggactgag 300
tgtaagtctg actttaaatc atttttagca gattatgaaa gtgatacgca acggtatgga 360
aacaatcata gaatggaagg aaagccaaat gctccggaaa acatttttaa tgtatctatg 420
ataccgtggt caaccttcga tggctttaat ctgaatttgc agaaaggata tgattatttg 480
attcctattt ttactatggg gaaatattat aaagaagata acaaaattat acttcctttg 540
gcaattcaag ttcatcacgc agtatgtgac ggatttcaca tttgccgttt tgtaaacgaa 600
ttgcaggaat tgataaatag ttaa 624
<210> 70
<211> 624
<212> DNA
<213> Clostridium perfringens
<400> 70
atggtatttg aaaaaattga taaaaatagt tggaacagaa aagagtattt tgaccactac 60
tttgcaagtg taccttgtac atacagcatg accgttaaag tggatatcac acaaataaag 120
gaaaagggaa tgaaactata tcctgcaatg ctttattata ttgcaatgat tgtaaaccgc 180
cattcagagt ttaggacggc aatcaatcaa gatggtgaat tggggatata tgatgagatg 240
ataccaagct atacaatatt tcacaatgat actgaaacat tttccagcct ttggactgag 300
tgtaagtctg actttaaatc atttttagca gattatgaaa gtgatacgca acggtatgga 360
aacaatcata gaatggaagg aaagccaaat gctccggaaa acatttttaa tgtatctatg 420
ataccgtggt caaccttcga tggctttaat ctgaatttgc agaaaggata tgattatttg 480
attcctattt ttactatggg gaaatattat aaagaagata acaaaattat acttcctttg 540
gcaattcaag ttcatcacgc agtatgtgac ggatttcaca tttgccgttt tgtaaacgaa 600
ttgcaggaat tgataaatag ttaa 624
<210> 71
<211> 3897
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Optimized MAD7
<400> 71
ctcgagtccc tatcagtgat agattgaaac tctatcattg atagagtata atatctttgt 60
tcattagagc gataaacttg aatttgagag ggaacttaga tgaacaacgg cacaaataat 120
tttcagaact tcatagggat atcaagtttg cagaaaacgt taagaaatgc tttaataccc 180
acggaaacca cgcaacagtt catagttaag aacggaataa ttaaagaaga tgagttaaga 240
ggcgagaaca gacagatttt aaaagatata atggatgact actacagagg attcatatct 300
gagactttaa gttctattga tgacatagat tggactagct tattcgaaaa aatggaaatt 360
cagttaaaaa atggtgataa taaagatacc ttaattaagg aacagacaga gtatagaaaa 420
gcaatacata aaaaatttgc gaacgacgat agatttaaga acatgtttag cgccaaatta 480
attagtgaca tattacctga atttgttata cacaacaata attattcggc atcagagaaa 540
gaggaaaaaa cccaggtgat aaaattgttt tcgagatttg cgactagctt taaagattac 600
ttcaagaaca gagcaaattg cttttcagcg gacgatattt catcaagcag ctgccataga 660
atagttaacg acaatgcaga gatattcttt tcaaatgcgt tagtttacag aagaatagta 720
aaatcgttaa gcaatgacga tataaacaaa atttcgggcg atatgaaaga ttcattaaaa 780
gaaatgagtt tagaagaaat atattcttac gagaagtatg gggaatttat tacccaggaa 840
ggcattagct tctataatga tatatgtggg aaagtgaatt cttttatgaa cttatattgt 900
cagaaaaata aagaaaacaa aaatttatac aaacttcaga aacttcacaa acagattcta 960
tgcattgcgg acactagcta tgaggttccg tataaatttg aaagtgacga ggaagtgtac 1020
caatcagtta acggcttcct tgataacatt agcagcaaac atatagttga aagattaaga 1080
aaaataggcg ataactataa cggctacaac ttagataaaa tttatatagt gtccaaattt 1140
tacgagagcg ttagccaaaa aacctacaga gactgggaaa caattaatac cgccttagaa 1200
attcattaca ataatatatt gccgggtaac ggtaaaagta aagccgacaa agtaaaaaaa 1260
gcggttaaga atgatttaca gaaatccata accgaaataa atgaactagt gtcaaactat 1320
aagttatgca gtgacgacaa cataaaagcg gagacttata tacatgagat tagccatata 1380
ttgaataact ttgaagcaca ggaattgaaa tacaatccgg aaattcacct agttgaatcc 1440
gagttaaaag cgagtgagct taaaaacgtg ttagacgtga taatgaatgc gtttcattgg 1500
tgttcggttt ttatgactga ggaacttgtt gataaagaca acaattttta tgcggaatta 1560
gaggagattt acgatgaaat ttatccagta attagtttat acaacttagt tagaaactac 1620
gttacccaga aaccgtacag cacgaaaaag attaaattga actttggaat accgacgtta 1680
gcagacggtt ggtcaaagtc caaagagtat tctaataacg ctataatatt aatgagagac 1740
aatttatatt atttaggcat atttaatgcg aagaataaac cggacaagaa gattatagag 1800
ggtaatacgt cagaaaataa gggtgactac aaaaagatga tttataattt gttaccgggt 1860
cccaacaaaa tgataccgaa agttttcttg agcagcaaga cgggggtgga aacgtataaa 1920
ccgagcgcct atatactaga ggggtataaa cagaataaac atataaagtc ttcaaaagac 1980
tttgatataa ctttctgtca tgatttaata gactacttca aaaactgtat tgcaattcat 2040
cccgagtgga aaaacttcgg ttttgatttt agcgacacca gtacttatga agacatttcc 2100
gggttttata gagaggtaga gttacaaggt tacaagattg attggacata cattagcgaa 2160
aaagacattg atttattaca ggaaaaaggt caattatatt tattccagat atataacaaa 2220
gatttttcga aaaaatcaac cgggaatgac aaccttcaca ccatgtactt aaaaaatctt 2280
ttctcagaag aaaatcttaa ggatatagtt ttaaaactta acggcgaagc ggaaatattc 2340
ttcaggaaga gcagcataaa gaacccaata attcataaaa aaggctcgat tttagttaac 2400
agaacctacg aagcagaaga aaaagaccag tttggcaaca ttcaaattgt gagaaaaaat 2460
attccggaaa acatttatca ggagttatac aaatacttca acgataaaag cgacaaagag 2520
ttatctgatg aagcagccaa attaaagaat gtagtgggac accacgaggc agcgacgaat 2580
atagttaagg actatagata cacgtatgat aaatacttcc ttcatatgcc tattacgata 2640
aatttcaaag ccaataaaac gggttttatt aatgatagga tattacagta tatagctaaa 2700
gaaaaagact tacatgtgat aggcattgat agaggcgaga gaaacttaat atacgtgtcc 2760
gtgattgata cttgtggtaa tatagttgaa cagaaaagct ttaacattgt aaacggctac 2820
gactatcaga taaaattaaa acaacaggag ggcgctagac agattgcgag aaaagaatgg 2880
aaagaaattg gtaaaattaa agagataaaa gagggctact taagcttagt aatacacgag 2940
atatctaaaa tggtaataaa atacaatgca attatagcga tggaggattt gtcttatggt 3000
tttaaaaaag ggagatttaa ggttgaaaga caagtttacc agaaatttga aaccatgtta 3060
ataaataaat taaactattt agtatttaaa gatatttcga ttaccgagaa tggcggttta 3120
ttaaaaggtt atcagttaac atacattcct gataaactta aaaacgtggg tcatcagtgc 3180
ggctgcattt tttatgtgcc tgctgcatac acgagcaaaa ttgatccgac caccggcttt 3240
gtgaatatat ttaaatttaa agacttaaca gtggacgcaa aaagagaatt cattaaaaaa 3300
tttgactcaa ttagatatga cagtgaaaaa aatttattct gctttacatt tgactacaat 3360
aactttatta cgcaaaacac ggttatgagc aaatcatcgt ggagtgtgta tacatacggc 3420
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gatcttagac aagacattat agattatgaa attgttcagc acatattcga aattttcaga 3600
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atttcacctg tattaaacga aaataacatt ttttatgaca gcgcgaaagc gggggatgca 3720
cttcctaagg atgccgatgc aaatggtgcg tattgtattg cattaaaagg gttatatgaa 3780
attaaacaaa ttaccgaaaa ttggaaagaa gatggtaaat tttcgagaga taaattaaaa 3840
ataagcaata aagattggtt cgactttata cagaataaga gatatttata agtcgac 3897
<210> 72
<211> 1263
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MAD7
<400> 72
Met Asn Asn Gly Thr Asn Asn Phe Gln Asn Phe Ile Gly Ile Ser Ser
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Leu Gln Lys Thr Leu Arg Asn Ala Leu Ile Pro Thr Glu Thr Thr Gln
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Gln Phe Ile Val Lys Asn Gly Ile Ile Lys Glu Asp Glu Leu Arg Gly
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Glu Asn Arg Gln Ile Leu Lys Asp Ile Met Asp Asp Tyr Tyr Arg Gly
50 55 60
Phe Ile Ser Glu Thr Leu Ser Ser Ile Asp Asp Ile Asp Trp Thr Ser
65 70 75 80
Leu Phe Glu Lys Met Glu Ile Gln Leu Lys Asn Gly Asp Asn Lys Asp
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Thr Leu Ile Lys Glu Gln Thr Glu Tyr Arg Lys Ala Ile His Lys Lys
100 105 110
Phe Ala Asn Asp Asp Arg Phe Lys Asn Met Phe Ser Ala Lys Leu Ile
115 120 125
Ser Asp Ile Leu Pro Glu Phe Val Ile His Asn Asn Asn Tyr Ser Ala
130 135 140
Ser Glu Lys Glu Glu Lys Thr Gln Val Ile Lys Leu Phe Ser Arg Phe
145 150 155 160
Ala Thr Ser Phe Lys Asp Tyr Phe Lys Asn Arg Ala Asn Cys Phe Ser
165 170 175
Ala Asp Asp Ile Ser Ser Ser Ser Cys His Arg Ile Val Asn Asp Asn
180 185 190
Ala Glu Ile Phe Phe Ser Asn Ala Leu Val Tyr Arg Arg Ile Val Lys
195 200 205
Ser Leu Ser Asn Asp Asp Ile Asn Lys Ile Ser Gly Asp Met Lys Asp
210 215 220
Ser Leu Lys Glu Met Ser Leu Glu Glu Ile Tyr Ser Tyr Glu Lys Tyr
225 230 235 240
Gly Glu Phe Ile Thr Gln Glu Gly Ile Ser Phe Tyr Asn Asp Ile Cys
245 250 255
Gly Lys Val Asn Ser Phe Met Asn Leu Tyr Cys Gln Lys Asn Lys Glu
260 265 270
Asn Lys Asn Leu Tyr Lys Leu Gln Lys Leu His Lys Gln Ile Leu Cys
275 280 285
Ile Ala Asp Thr Ser Tyr Glu Val Pro Tyr Lys Phe Glu Ser Asp Glu
290 295 300
Glu Val Tyr Gln Ser Val Asn Gly Phe Leu Asp Asn Ile Ser Ser Lys
305 310 315 320
His Ile Val Glu Arg Leu Arg Lys Ile Gly Asp Asn Tyr Asn Gly Tyr
325 330 335
Asn Leu Asp Lys Ile Tyr Ile Val Ser Lys Phe Tyr Glu Ser Val Ser
340 345 350
Gln Lys Thr Tyr Arg Asp Trp Glu Thr Ile Asn Thr Ala Leu Glu Ile
355 360 365
His Tyr Asn Asn Ile Leu Pro Gly Asn Gly Lys Ser Lys Ala Asp Lys
370 375 380
Val Lys Lys Ala Val Lys Asn Asp Leu Gln Lys Ser Ile Thr Glu Ile
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Asn Glu Leu Val Ser Asn Tyr Lys Leu Cys Ser Asp Asp Asn Ile Lys
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Leu Lys Ala Ser Glu Leu Lys Asn Val Leu Asp Val Ile Met Asn Ala
450 455 460
Phe His Trp Cys Ser Val Phe Met Thr Glu Glu Leu Val Asp Lys Asp
465 470 475 480
Asn Asn Phe Tyr Ala Glu Leu Glu Glu Ile Tyr Asp Glu Ile Tyr Pro
485 490 495
Val Ile Ser Leu Tyr Asn Leu Val Arg Asn Tyr Val Thr Gln Lys Pro
500 505 510
Tyr Ser Thr Lys Lys Ile Lys Leu Asn Phe Gly Ile Pro Thr Leu Ala
515 520 525
Asp Gly Trp Ser Lys Ser Lys Glu Tyr Ser Asn Asn Ala Ile Ile Leu
530 535 540
Met Arg Asp Asn Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Phe Asn Ala Lys Asn Lys
545 550 555 560
Pro Asp Lys Lys Ile Ile Glu Gly Asn Thr Ser Glu Asn Lys Gly Asp
565 570 575
Tyr Lys Lys Met Ile Tyr Asn Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys Met Ile
580 585 590
Pro Lys Val Phe Leu Ser Ser Lys Thr Gly Val Glu Thr Tyr Lys Pro
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Ser Ala Tyr Ile Leu Glu Gly Tyr Lys Gln Asn Lys His Ile Lys Ser
610 615 620
Ser Lys Asp Phe Asp Ile Thr Phe Cys His Asp Leu Ile Asp Tyr Phe
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Lys Asn Cys Ile Ala Ile His Pro Glu Trp Lys Asn Phe Gly Phe Asp
645 650 655
Phe Ser Asp Thr Ser Thr Tyr Glu Asp Ile Ser Gly Phe Tyr Arg Glu
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Val Glu Leu Gln Gly Tyr Lys Ile Asp Trp Thr Tyr Ile Ser Glu Lys
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Asp Ile Asp Leu Leu Gln Glu Lys Gly Gln Leu Tyr Leu Phe Gln Ile
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Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Lys Lys Ser Thr Gly Asn Asp Asn Leu His
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Thr Met Tyr Leu Lys Asn Leu Phe Ser Glu Glu Asn Leu Lys Asp Ile
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Val Leu Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Ile Phe Phe Arg Lys Ser Ser
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Ile Lys Asn Pro Ile Ile His Lys Lys Gly Ser Ile Leu Val Asn Arg
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Thr Tyr Glu Ala Glu Glu Lys Asp Gln Phe Gly Asn Ile Gln Ile Val
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Arg Lys Asn Ile Pro Glu Asn Ile Tyr Gln Glu Leu Tyr Lys Tyr Phe
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Asn Asp Lys Ser Asp Lys Glu Leu Ser Asp Glu Ala Ala Lys Leu Lys
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Asn Val Val Gly His His Glu Ala Ala Thr Asn Ile Val Lys Asp Tyr
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Phe Lys Ala Asn Lys Thr Gly Phe Ile Asn Asp Arg Ile Leu Gln Tyr
850 855 860
Ile Ala Lys Glu Lys Asp Leu His Val Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu
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Arg Asn Leu Ile Tyr Val Ser Val Ile Asp Thr Cys Gly Asn Ile Val
885 890 895
Glu Gln Lys Ser Phe Asn Ile Val Asn Gly Tyr Asp Tyr Gln Ile Lys
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Leu Lys Gln Gln Glu Gly Ala Arg Gln Ile Ala Arg Lys Glu Trp Lys
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Glu Ile Gly Lys Ile Lys Glu Ile Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Leu Val
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Ile His Glu Ile Ser Lys Met Val Ile Lys Tyr Asn Ala Ile Ile Ala
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Met Glu Asp Leu Ser Tyr Gly Phe Lys Lys Gly Arg Phe Lys Val Glu
965 970 975
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Tyr Leu Val Phe Lys Asp Ile Ser Ile Thr Glu Asn Gly Gly Leu Leu
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Lys Gly Tyr Gln Leu Thr Tyr Ile Pro Asp Lys Leu Lys Asn Val
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Gly His Gln Cys Gly Cys Ile Phe Tyr Val Pro Ala Ala Tyr Thr
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Ser Lys Ile Asp Pro Thr Thr Gly Phe Val Asn Ile Phe Lys Phe
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Lys Asp Leu Thr Val Asp Ala Lys Arg Glu Phe Ile Lys Lys Phe
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Asp Ser Ile Arg Tyr Asp Ser Glu Lys Asn Leu Phe Cys Phe Thr
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Phe Asp Tyr Asn Asn Phe Ile Thr Gln Asn Thr Val Met Ser Lys
1085 1090 1095
Ser Ser Trp Ser Val Tyr Thr Tyr Gly Val Arg Ile Lys Arg Arg
1100 1105 1110
Phe Val Asn Gly Arg Phe Ser Asn Glu Ser Asp Thr Ile Asp Ile
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Thr Lys Asp Met Glu Lys Thr Leu Glu Met Thr Asp Ile Asn Trp
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Arg Asp Gly His Asp Leu Arg Gln Asp Ile Ile Asp Tyr Glu Ile
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Asn Ser Leu Ser Glu Leu Glu Asp Arg Asp Tyr Asp Arg Leu Ile
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Ser Pro Val Leu Asn Glu Asn Asn Ile Phe Tyr Asp Ser Ala Lys
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Ala Gly Asp Ala Leu Pro Lys Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr
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Cys Ile Ala Leu Lys Gly Leu Tyr Glu Ile Lys Gln Ile Thr Glu
1220 1225 1230
Asn Trp Lys Glu Asp Gly Lys Phe Ser Arg Asp Lys Leu Lys Ile
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Ser Asn Lys Asp Trp Phe Asp Phe Ile Gln Asn Lys Arg Tyr Leu
1250 1255 1260
<210> 73
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CatB promoter
<400> 73
taaaaaatgt tacgcacttt tcttatattg ttcaacaata acataattta ttaacaaaag 60
gaaagtatag ttaaaaaaat gttggagcaa atgcggatgg aaaaataaaa attaatatta 120
gtagtaattc cgatgttaaa ataacaagag ataagaaaaa gtaaaatatt agagtaattc 180
gtagtattct taagttatga atcaataaaa aatggtctct gaaaattgaa tagttcggta 240
ttacagaatg tgctataata aactaaagcg taaatatcat tgtaaaaagg agattgaaat 300
ggctaggtca cggaaaaaag ccttctaaaa tagaattacg aaaattttta ggaggcccga 360
att 363
<210> 74
<211> 322
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CATQ promoter
<400> 74
ctgcgtacac atccagacat cgctttagag tatggtgaat taaagatgga gcgggcttat 60
cgattctcag aggatattga aggctactgc actggtaagg atgcatttgt aaagcaacta 120
gaaaaggatg ctttgcgatg gtggcaaact gtctgttagg aggttattct caaaggattg 180
caagaagcag ttgaggataa tccgtataac taactattac acattcttaa cattgctggt 240
ttgtatcggt agaataacac gaattaacaa aggatatatt ttgtagtagc aagtgtattt 300
gttttatatt ctatgaacct at 322
<210> 75
<211> 1368
<212> PRT
<213> Streptococcus pyogenes
<400> 75
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
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Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
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Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
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Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
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Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
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Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
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Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
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Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
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Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
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Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
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Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
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Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765
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785 790 795 800
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Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005
Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020
Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035
Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050
Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
1055 1060 1065
Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080
Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095
Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110
Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
1115 1120 1125
Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140
Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
1145 1150 1155
Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
1160 1165 1170
Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys
1175 1180 1185
Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
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Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly
1205 1210 1215
Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1220 1225 1230
Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245
Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1250 1255 1260
His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys
1265 1270 1275
Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala
1280 1285 1290
Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn
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Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
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tattaaaata ttttaaacta aattaaatga ttctttttaa ttttttacta tttcattcca 4260
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<220>
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<223> Primer
<400> 99
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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aaaaaataaa aaaataaaaa aataaaaaaa tataaaaata aaaaaatata aaaataaaaa 360
aatataaaaa taaaaaaata aaaaaatata aaaataaaaa aataaaaaaa tataaaaata 420
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aaaaaataaa aaaataaaaa aataaaaaaa tataaaaata aaaaaatata aaaataaaaa 360
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agcttttaat tgctcttgat aatttttttt acctctaata ttttctcttc tcttatattc 720
ctttttagaa attattattg tcatatattt ttgttcttct tctgtaattt ctaataactc 780
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ccccgggtac gtacccggca gtttttcttt ttcggcaagt gttcaagaag ttattaagtc 4200
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<223> pGRNA-glcG
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aatattttta tattttttta tttttttatt tttatatttt tttatttttt tatttttata 2280
tttttttatt tttatatttt tttattttta tattttttta tttttttatt tttttatttt 2340
tttatttttt tattttttta tttttttatt tttaccctca ttttttttac gcttgtatta 2400
tagggtactt tgtacctgtt cttttttttg gggaggttgt aaagataatt ttttacttta 2460
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tcttttttaa ctcccgaaag ggagttcttt cttttcttga tactatacgt aactatttcg 1560
atttgccctg aacctaatca aagctagata aattcagtat tagggcataa aaaaacttgc 1620
tttttcgggt ggaaatctgt ataatttaaa ttgcttagat aaaaattacc aattccatac 1680
gaaaggagca agttttacat aaggttaaag ccttatgtga attctcattt aattacatga 1740
ataataataa cacagaaagt gaagaattaa aagagcaaag tcaactattg cttgacaaat 1800
gcacaaaaaa gaaaaagaaa aatcctaaat ttagtagtta tatagaacca ttagtaagca 1860
agaaattatc tgaaagaata aaggaatgtg gtgacttttt gcagatgtta tctgatttaa 1920
accttgaaaa ttcgaaactg catagagcaa gtttttgtgg taacagattt tgtcctatgt 1980
gtagctggcg tattgcttgt aaggatagtt tggaaatatc tattctcatg gagcatttac 2040
gcaaagagga aagcaaagaa tttatctttt tgaccttaac aactccaaat gtgaaaggtg 2100
cggaccttga taattccata aaagcataca ataaagcatt taaaaagtta atggaacgca 2160
aagaggtcaa gagcatagta aaaggctaca taagaaagct agaagtaacc tataatttgg 2220
acaagagttc caaatcatat aatacttatc acccacattt ccatgtggta ctagcagtca 2280
atagaagtta ctttaaaaag caaaatctat atataaacca tcatagatgg cttagtttgt 2340
ggcaagagtc aactggtgat tattcgataa ctcaagttga tgtaagaaag gctaaaatta 2400
acgattataa agaggtttat gagcttgcta agtattcggc taaggattcc gactatttaa 2460
tcaatagaga agtgtttacg gtattctaca aatctttaaa gggtaaacag gtacttgtat 2520
ttagtggatt atttaaagac gctcataaaa tgtataagaa tggagagcta gatctgtata 2580
agaagttgga tactatcgaa tatgcttata tggtaagtta taactggctt aaaaagaagt 2640
atgatacttc aaatattaga gaattaactg aggaagaaaa gcagaaattc aataaaaatt 2700
taatcgaaga tgtggatatt gagtaggtgg gattatatct cacctttttt attgtctttt 2760
catgttgaaa ttttgacgct taatgcatga agtattgaca agtttaaaaa ttacggtttt 2820
taatccttag ttgattagca ggattatggc cggaatgctc cgtccagtcc tgttaaggaa 2880
ttaaaattcc ctaaaaccct tggctatgat ttatagcgag aatcgtcaat taaaaattta 2940
ataggtgcta tgaaagtcga ttaataatta attttaaaat gcaatatgaa acataattac 3000
aagaatttga cttttaatac aagaattgat atcatagtta cattaatacg gatcccggca 3060
gtttttcttt ttcggcaagt gttcaagaag ttattaagtc gggagtgcag tcgaagtggg 3120
caagttgaaa aattcacaaa aatgtggtat aatatctttg ttcattagag cgataaactt 3180
gaatttgaga gggaacttag atggtatttg aaaaaattga taaaaatagt tggaacagaa 3240
aagagtattt tgaccactac tttgcaagtg taccttgtac ctacagcatg accgttaaag 3300
tggatatcac acaaataaag gaaaagggaa tgaaactata tcctgcaatg ctttattata 3360
ttgcaatgat tgtaaaccgc cattcagagt ttaggacggc aatcaatcaa gatggtgaat 3420
tggggatata tgatgagatg ataccaagct atacaatatt tcacaatgat actgaaacat 3480
tttccagcct ttggactgag tgtaagtctg actttaaatc atttttagca gattatgaaa 3540
gtgatacgca acggtatgga aacaatcata gaatggaagg aaagccaaat gctccggaaa 3600
acatttttaa tgtatctatg ataccgtggt caaccttcga tggctttaat ctgaatttgc 3660
agaaaggata tgattatttg attcctattt ttactatggg gaaatattat aaagaagata 3720
acaaaattat acttcctttg gcaattcaag ttcatcacgc agtatgtgac ggatttcaca 3780
tttgccgttt tgtaaacgaa ttgcaggaat tgataaatag ttaacttcag gtttgtctgt 3840
aactaaaaac tagtatttaa ccgagctcga attcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg 3900
actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca 3960
gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga 4020
atggcgaatg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc 4080
gcatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac 4140
acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca 4200
gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga 4260
aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa 4320
taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt 4380
gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa 4440
tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta 4500
ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag 4560
taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca 4620
gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta 4680
aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc 4740
gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc 4800
ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca 4860
ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc 4920
acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca 4980
taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac 5040
tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg 5100
cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg 5160
ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg 5220
gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac 5280
gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc 5340
aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct 5400
aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc 5460
actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc 5520
gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg 5580
atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa 5640
atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc 5700
ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt 5760
gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa 5820
cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc 5880
tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc 5940
cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct 6000
ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat 6060
gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc 6120
tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg 6180
ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc 6240
gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag a 6271
<210> 126
<211> 2793
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OREP
<400> 126
cacgataaaa caaggtttta aggataagaa aagtcatgag atttatagta aatcttgtga 60
ctttttttat tgaatagtag agagagttcg gaagtataac acgctatatt cttgatattt 120
ttagaatagc aagcattgga tttgtcctga cactttccca aaaattaagg agttattcct 180
taaaccaaaa agattaatgt gggaacaaat ttagtgtatc catttttgaa gggcgcactt 240
atacaccacc aaaatggtgt gtgcgaaatc tttaaaaaag atttatcaaa aagctttttt 300
aaagctggga catttagaaa atcaataatg ttttttgccc aatacgctag tcttaaaatc 360
tgcaaggttg ataactattt agtcccaggt attagaatgg ggcatatata tacaaagtat 420
atatatgcgt aaatatatgt gggactgtgg gaacaaaatt gcgtgctaaa attgtattga 480
aaaggtaatg aaaaggtcat gctttggtat tgctaacgta tagaaaaggt aatgaaaagc 540
tcatggttct ataaaaaaga tgtacccacg aaaataatag gctttgccta tttccccatg 600
taatatgggg gcagttttct cttatgctct ttcttaacat attgaataaa tacaaaatgc 660
agctttgtgg gaataaaaat atttttgttt ttattcttat agttagacaa aattttaatc 720
ttttttgtgc tataacaaga ttaaaatttg tgggaacatt aagaaatatt gttgtcacaa 780
ataaaaagga gagtgggaac aattgctata aaaaacgcag aaattaagat tagagttaca 840
aaagagcaaa aagaattatt taagaaaatt gcaaaagctg aaaatatgag tatgagtgaa 900
tttattattg tgaccacaga atatttagcc agaaaaaaag atgaaaatat gaaatcaaaa 960
gacatgatcg agagaagagc tgcgaagact gaagaaaaaa ttatgaagct aaaaaagaaa 1020
ctaaataaaa acaggtaata tagattacag ttttaagctt gttttcccta tagactagag 1080
taaatatata aatatacctg tcaagggctt ataagcccct ttagggggtg cgtagcaccc 1140
ttgacaggta tatttatata ttttagggtg ccattaaggg aaacaagctt taaaatgcct 1200
ttaaaggcat tttaaaataa ataaaaaaaa gatggttttt accatctttt ttaactcccg 1260
aaagggagtt ctttcttttc ttgatactat acgtaactat ttcgatttgc cctgaaccta 1320
atcaaagcta gataaattca gtattagggc ataaaaaaac ttgctttttc gggtggaaat 1380
ctgtataatt taaattgctt agataaaaat taccaattcc atacgaaagg agcaagtttt 1440
acataaggtt aaagccttat gtgaattctc atttaattac atgaataata ataacacaga 1500
aagtgaagaa ttaaaagagc aaagtcaact attgcttgac aaatgcacaa aaaagaaaaa 1560
gaaaaatcct aaatttagta gttatataga accattagta agcaagaaat tatctgaaag 1620
aataaaggaa tgtggtgact ttttgcagat gttatctgat ttaaaccttg aaaattcgaa 1680
actgcataga gcaagttttt gtggtaacag attttgtcct atgtgtagct ggcgtattgc 1740
ttgtaaggat agtttggaaa tatctattct catggagcat ttacgcaaag aggaaagcaa 1800
agaatttatc tttttgacct taacaactcc aaatgtgaaa ggtgcggacc ttgataattc 1860
cataaaagca tacaataaag catttaaaaa gttaatggaa cgcaaagagg tcaagagcat 1920
agtaaaaggc tacataagaa agctagaagt aacctataat ttggacaaga gttccaaatc 1980
atataatact tatcacccac atttccatgt ggtactagca gtcaatagaa gttactttaa 2040
aaagcaaaat ctatatataa accatcatag atggcttagt ttgtggcaag agtcaactgg 2100
tgattattcg ataactcaag ttgatgtaag aaaggctaaa attaacgatt ataaagaggt 2160
ttatgagctt gctaagtatt cggctaagga ttccgactat ttaatcaata gagaagtgtt 2220
tacggtattc tacaaatctt taaagggtaa acaggtactt gtatttagtg gattatttaa 2280
agacgctcat aaaatgtata agaatggaga gctagatctg tataagaagt tggatactat 2340
cgaatatgct tatatggtaa gttataactg gcttaaaaag aagtatgata cttcaaatat 2400
tagagaatta actgaggaag aaaagcagaa attcaataaa aatttaatcg aagatgtgga 2460
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cccttggcta tgatttatag cgagaatcgt caattaaaaa tttaataggt gctatgaaag 2700
tcgattaata attaatttta aaatgcaata tgaaacataa ttacaagaat ttgactttta 2760
atacaagaat tgatatcata gttacattaa tac 2793
<210> 127
<211> 2793
<212> DNA
<213> Clostridium beijerinckii
<400> 127
cacgataaaa caaggtttta aggataagaa aagtcatgag atttatagta aatcttgtga 60
ctttttttat tgaatagtag agagagttcg gaagtataac acgctatatt cttgatattt 120
ttagaatagc aagcattgga tttgtcctga cactttccca aaaattaagg agttattcct 180
taaaccaaaa agattaatgt gggaacaaat ttagtgtatc catttttgaa gggcgcactt 240
atacaccacc aaaatggtgt gtgcgaaatc tttaaaaaag atttatcaaa aagctttttt 300
aaagctggga catttagaaa atcaataatg ttttttgccc aatacgctag tcttaaaatc 360
tgcaaggttg ataactattt agtcccaggt attagaatgg ggcatatata tacaaagtat 420
atatatgcgt aaatatatgt gggactgtgg gaacaaaatt gcgtgctaaa attgtattga 480
aaaggtaatg aaaaggtcat gctttggtat tgctaacgta tagaaaaggt aatgaaaagc 540
tcatggttct ataaaaaaga tgtacccacg aaaataatag gctttgccta tttccccatg 600
taatatgggg gcagttttct cttatgctct ttcttaacat attgaataaa tacaaaatgc 660
agctttgtgg gaataaaaat atttttgttt ttattcttat agttagacaa aattttaatc 720
ttttttgtgc tataacaaga ttaaaatttg tgggaacatt aagaaatatt gttgtcacaa 780
ataaaaagga gagtgggaac aattgctata aaaaacgcag aaattaagat tagagttaca 840
aaagagcaaa aagaattatt taagaaaatt gcaaaagctg aaaatatgag tatgagtgaa 900
tttattattg tgaccacaga atatttagcc agaaaaaaag atgaaaatat gaaatcaaaa 960
gacatgatcg agagaagagc tgcgaagact gaagaaaaaa ttatgaagct aaaaaagaaa 1020
ctaaataaaa acaggtaata tagattacag ttttaagctt gttttcccta tagactagag 1080
taaatatata aatatacctg tcaagggctt ataagcccct ttagggggtg cgtagcaccc 1140
ttgacaggta tatttatata ttttagggtg ccattaaggg aaacaagctt taaaatgcct 1200
ttaaaggcat tttaaaataa ataaaaaaaa gatggttttt accatctttt ttaactcccg 1260
aaagggagtt ctttcttttc ttgatactat acgtaactat ttcgatttgc cctgaaccta 1320
atcaaagcta gataaattca gtattagggc ataaaaaaac ttgctttttc gggtggaaat 1380
ctgtataatt taaattgctt agataaaaat taccaattcc atacgaaagg agcaagtttt 1440
acataaggtt aaagccttat gtgaattctc atttaattac atgaataata ataacacaga 1500
aagtgaagaa ttaaaagagc aaagtcaact attgcttgac aaatgcacaa aaaagaaaaa 1560
gaaaaatcct aaatttagta gttatataga accattagta agcaagaaat tatctgaaag 1620
aataaaggaa tgtggtgact ttttgcagat gttatctgat ttaaaccttg aaaattcgaa 1680
actgcataga gcaagttttt gtggtaacag attttgtcct atgtgtagct ggcgtattgc 1740
ttgtaaggat agtttggaaa tatctattct catggagcat ttacgcaaag aggaaagcaa 1800
agaatttatc tttttgacct taacaactcc aaatgtgaaa ggtgcggacc ttgataattc 1860
cataaaagca tacaataaag catttaaaaa gttaatggaa cgcaaagagg tcaagagcat 1920
agtaaaaggc tacataagaa agctagaagt aacctataat ttggacaaga gttccaaatc 1980
atataatact tatcacccac atttccatgt ggtactagca gtcaatagaa gttactttaa 2040
aaagcaaaat ctatatataa accatcatag atggcttagt ttgtggcaag agtcaactgg 2100
tgattattcg ataactcaag ttgatgtaag aaaggctaaa attaacgatt ataaagaggt 2160
ttatgagctt gctaagtatt cggctaagga ttccgactat ttaatcaata gagaagtgtt 2220
tacggtattc tacaaatctt taaagggtaa acaggtactt gtatttagtg gattatttaa 2280
agacgctcat aaaatgtata agaatggaga gctagatctg tataagaagt tggatactat 2340
cgaatatgct tatatggtaa gttataactg gcttaaaaag aagtatgata cttcaaatat 2400
tagagaatta actgaggaag aaaagcagaa attcaataaa aatttaatcg aagatgtgga 2460
tattgagtag gtgggattat atctcacctt ttttattgtc ttttcatgtt gaaattttga 2520
cgcttaatgc atgaagtatt gacaagttta aaaattacgg tttttaatcc ttagttgatt 2580
agcaggatta tggccggaat gctccgtcca gtcctgttaa ggaattaaaa ttccctaaaa 2640
cccttggcta tgatttatag cgagaatcgt caattaaaaa tttaataggt gctatgaaag 2700
tcgattaata attaatttta aaatgcaata tgaaacataa ttacaagaat ttgactttta 2760
atacaagaat tgatatcata gttacattaa tac 2793
<210> 128
<211> 329
<212> PRT
<213> Clostridium beijerinckii
<400> 128
Met Asn Asn Asn Asn Thr Glu Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gln Ser Gln
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Lys Cys Thr Lys Lys Lys Lys Lys Asn Pro Lys Phe
20 25 30
Ser Ser Tyr Ile Glu Pro Leu Val Ser Lys Lys Leu Ser Glu Arg Ile
35 40 45
Lys Glu Cys Gly Asp Phe Leu Gln Met Leu Ser Asp Leu Asn Leu Glu
50 55 60
Asn Ser Lys Leu His Arg Ala Ser Phe Cys Gly Asn Arg Phe Cys Pro
65 70 75 80
Met Cys Ser Trp Arg Ile Ala Cys Lys Asp Ser Leu Glu Ile Ser Ile
85 90 95
Leu Met Glu His Leu Arg Lys Glu Glu Ser Lys Glu Phe Ile Phe Leu
100 105 110
Thr Leu Thr Thr Pro Asn Val Lys Gly Ala Asp Leu Asp Asn Ser Ile
115 120 125
Lys Ala Tyr Asn Lys Ala Phe Lys Lys Leu Met Glu Arg Lys Glu Val
130 135 140
Lys Ser Ile Val Lys Gly Tyr Ile Arg Lys Leu Glu Val Thr Tyr Asn
145 150 155 160
Leu Asp Lys Ser Ser Lys Ser Tyr Asn Thr Tyr His Pro His Phe His
165 170 175
Val Val Leu Ala Val Asn Arg Ser Tyr Phe Lys Lys Gln Asn Leu Tyr
180 185 190
Ile Asn His His Arg Trp Leu Ser Leu Trp Gln Glu Ser Thr Gly Asp
195 200 205
Tyr Ser Ile Thr Gln Val Asp Val Arg Lys Ala Lys Ile Asn Asp Tyr
210 215 220
Lys Glu Val Tyr Glu Leu Ala Lys Tyr Ser Ala Lys Asp Ser Asp Tyr
225 230 235 240
Leu Ile Asn Arg Glu Val Phe Thr Val Phe Tyr Lys Ser Leu Lys Gly
245 250 255
Lys Gln Val Leu Val Phe Ser Gly Leu Phe Lys Asp Ala His Lys Met
260 265 270
Tyr Lys Asn Gly Glu Leu Asp Leu Tyr Lys Lys Leu Asp Thr Ile Glu
275 280 285
Tyr Ala Tyr Met Val Ser Tyr Asn Trp Leu Lys Lys Lys Tyr Asp Thr
290 295 300
Ser Asn Ile Arg Glu Leu Thr Glu Glu Glu Lys Gln Lys Phe Asn Lys
305 310 315 320
Asn Leu Ile Glu Asp Val Asp Ile Glu
325
<210> 129
<211> 256
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Consensus COG5655
<400> 129
Met Cys Gln Lys Arg Ser Asp Tyr Ser Asp Glu Lys Ala Trp Leu Lys
1 5 10 15
Asp Lys Ser Lys Asp Gly Lys Val Glu Pro Trp Arg Glu Lys Lys Glu
20 25 30
Ala Asn Val Lys Tyr Phe Glu Leu Leu Lys Ile Leu Met Phe Lys Lys
35 40 45
Ala Glu Arg Val Tyr Arg Cys Asn Glu Leu Leu Glu Leu Gln Lys Val
50 55 60
Asn Glu Thr Gly Glu Asn Lys Leu Cys Pro Asn Trp Phe Cys Lys Ser
65 70 75 80
Leu Leu Cys Pro Met Cys Asn Trp Arg Lys Pro Met Lys Ser Asp Leu
85 90 95
Gln Asp Gly Leu Tyr Val Lys Arg Val Ile Ser Tyr Gly Pro Leu Leu
100 105 110
Lys Trp Lys His Leu Lys Leu Asn Leu Lys Asn Val Glu Asp Gly Asp
115 120 125
Leu Leu Asn Lys Ser Leu Asp Glu Met Ala Leu Gly Phe Lys Arg Thr
130 135 140
Met Gly Phe Lys Lys Ile Ala Lys Asn Phe Val Gly Phe Met Lys Ser
145 150 155 160
Thr Glu Ile Thr Tyr Asn Glu Lys Asp Asn Ser Tyr Asn Gln His Met
165 170 175
His Val Leu Phe Cys Ser Glu Gln Thr Tyr Phe Lys Asn Phe Ile Asn
180 185 190
Asn Thr Pro Gln Glu Phe Trp Asn Lys Arg Trp Ser Lys Ala Met Lys
195 200 205
Leu Asp Tyr Asp Pro Gln Val Met Lys Leu Trp Thr Met Tyr Lys Lys
210 215 220
Glu Ile Lys Asn Tyr Ile Gln Thr Ala Leu Gln Glu Thr Ala Lys Tyr
225 230 235 240
Asp Val Lys Asp Met Asp Ser Ala Thr Ile Asp Asp Glu Lys Ser Leu
245 250 255
<210> 130
<211> 768
<212> DNA
<213> Enterococcus faecalis
<400> 130
gtgaggagga tatatttgaa tacatacgaa caaattaata aagtgaaaaa aatacttcgg 60
aaacatttaa aaaataacct tattggtact tacatgtttg gatcaggagt tgagagtgga 120
ctaaaaccaa atagtgatct tgacttttta gtcgtcgtat ctgaaccatt gacagatcaa 180
agtaaagaaa tacttataca aaaaattaga cctatttcaa agaaaatagg agataaaagc 240
aacttacgat atattgaatt aacaattatt attcagcaag aaatggtacc gtggaatcat 300
cctcccaaac aagaatttat ttatggagaa tggttacaag agctttatga acaaggatac 360
attcctcaga aggaattaaa ttcagattta accataatgc tttaccaagc aaaacgaaaa 420
aataaaagaa tatacggaaa ttatgactta gaggaattac tacctgatat tccattttct 480
gatgtgagaa gagccattat ggattcgtca gaggaattaa tagataatta tcaggatgat 540
gaaaccaact ctatattaac tttatgccgt atgattttaa ctatggacac gggtaaaatc 600
ataccaaaag atattgcggg aaatgcagtg gctgaatctt ctccattaga acatagggag 660
agaattttgt tagcagttcg tagttatctt ggagagaata ttgaatggac taatgaaaat 720
gtaaatttaa ctataaacta tttaaataac agattaaaaa aattataa 768
<210> 131
<211> 738
<212> DNA
<213> Clostridium difficile
<400> 131
atgaacaaaa atataaaata ttctcaaaac tttttaacga gtgaaaaagt actcaaccaa 60
ataataaaac aattgaattt aaaagaaacc gataccgttt acgaaattgg aacaggtaaa 120
gggcatttaa cgacgaaact ggctaaaata agtaaacagg taacgtctat tgaattagac 180
agtcatctat tcaacttatc gtcagaaaaa ttaaaactga atactcgtgt cactttaatt 240
caccaagata ttctacagtt tcaattccct aacaaacaga ggtataaaat tgttgggagt 300
attccttacc atttaagcac acaaattatt aaaaaagtgg tttttgaaag ccatgcgtct 360
gacatctatc tgattgttga agaaggattc tacaagcgta ccttggatat tcaccgaaca 420
ctagggttgc tcttgcacac tcaagtctcg attcagcaat tgcttaagct gccagcggaa 480
tgctttcatc ctaaaccaaa agtaaacagt gtcttaataa aacttacccg ccataccaca 540
gatgttccag ataaatattg gaagctatat acgtactttg tttcaaaatg ggtcaatcga 600
gaatatcgtc aactgtttac taaaaatcag tttcatcaag caatgaaaca cgccaaagta 660
aacaatttaa gtaccgttac ttatgagcaa gtattgtcta tttttaatag ttatctatta 720
tttaacggga ggaaataa 738
<210> 132
<211> 3792
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Optimized Mad7 CDS for B. subtilis
<400> 132
atgaacaacg gcacaaataa ttttcagaac tttattggca tttcatcatt gcagaaaacg 60
ttaagaaatg ctttaattcc gacggaaaca acgcaacagt ttattgttaa aaacggaatt 120
attaaagaag atgaattaag aggcgaaaac agacagattt taaaagatat tatggatgac 180
tactacagag gatttatttc tgaaacatta tcatctattg atgacattga ttggacaagc 240
ttatttgaaa aaatggaaat tcagttaaaa aatggtgata ataaagatac attaattaaa 300
gaacagacag aatatagaaa agcaattcat aaaaaatttg cgaacgacga tagatttaaa 360
aacatgttta gcgccaaatt aatttcagac attttacctg aatttgttat tcataacaat 420
aattattcag catcagaaaa agaagaaaaa acacaggtga ttaaattgtt ttcaagattt 480
gcgacaagct ttaaagatta ctttaaaaac agagcaaatt gcttttcagc ggacgatatt 540
tcatcaagca gctgccatag aattgttaac gacaatgcag aaattttttt ttcaaatgcg 600
ttagtttaca gaagaattgt aaaatcatta agcaatgacg atattaacaa aatttcaggc 660
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ggcgaattta ttacacagga aggcattagc ttttataatg atatttgtgg caaagtgaat 780
tcttttatga acttatattg tcagaaaaat aaagaaaaca aaaatttata caaacttcag 840
aaacttcata aacagattct gtgcattgcg gacacaagct atgaagttcc gtataaattt 900
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atttatattg tgtccaaatt ttacgaaagc gttagccaaa aaacatacag agactgggaa 1080
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atttataatt tgttaccggg tccgaacaaa atgattccga aagttttttt gagcagcaaa 1800
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catattaaat cttcaaaaga ctttgatatt acattttgtc atgatttaat tgactacttt 1920
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ttatttcaga tttataacaa agatttttca aaaaaatcaa caggcaatga caaccttcat 2160
acaatgtact taaaaaatct tttttcagaa gaaaatctta aagatattgt tttaaaactt 2220
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aaaggctcaa ttttagttaa cagaacatac gaagcagaag aaaaagacca gtttggcaac 2340
attcaaattg tgagaaaaaa tattccggaa aacatttatc aggaattata caaatacttt 2400
aacgataaaa gcgacaaaga attatctgat gaagcagcca aattaaaaaa tgtagtggga 2460
catcatgaag cagcgacgaa tattgttaaa gactatagat acacgtatga taaatacttt 2520
cttcatatgc ctattacgat taattttaaa gccaataaaa cgggttttat taatgataga 2580
attttacagt atattgctaa agaaaaagac ttacatgtga ttggcattga tagaggcgaa 2640
agaaacttaa tttacgtgtc cgtgattgat acatgtggta atattgttga acagaaaagc 2700
tttaacattg taaacggcta cgactatcag attaaattaa aacaacagga aggcgctaga 2760
cagattgcga gaaaagaatg gaaagaaatt ggtaaaatta aagaaattaa agaaggctac 2820
ttaagcttag taattcatga aatttctaaa atggtaatta aatacaatgc aattattgcg 2880
atggaagatt tgtcttatgg ttttaaaaaa ggcagattta aagttgaaag acaagtttac 2940
cagaaatttg aaacaatgtt aattaataaa ttaaactatt tagtatttaa agatatttca 3000
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aaaagagaat ttattaaaaa atttgactca attagatatg actcagaaaa aaatttattt 3240
tgctttacat ttgactacaa taactttatt acgcaaaaca cggttatgag caaatcatca 3300
tggtcagtgt atacatacgg cgtgagaatt aaaagaagat ttgtgaacgg cagattttca 3360
aacgaatcag atacaattga cattacaaaa gatatggaaa aaacgttgga aatgacggac 3420
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catatttttg aaatttttag attaacagtg caaatgagaa actccttgtc tgaattagaa 3540
gacagagatt acgatagatt aatttcacct gtattaaacg aaaataacat tttttatgac 3600
agcgcgaaag cgggcgatgc acttcctaaa gatgccgatg caaatggtgc gtattgtatt 3660
gcattaaaag gcttatatga aattaaacaa attacagaaa attggaaaga agatggtaaa 3720
ttttcaagag ataaattaaa aattagcaat aaagattggt ttgactttat tcagaataaa 3780
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<210> 133
<211> 10469
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pCas9cond
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ttatcttcaa gaaattttta gtaatgaaat ggcaaaagtt gatgattcat tctttcacag 300
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tcgagtccct atcagtgata gattgaaact ctatcattga tagagtataa tatctttgtt 60
cattagagcg ataaacttga atttgagagg gaacttagat gaacaacggc acaaataatt 120
ttcagaactt catagggata tcaagtttgc agaaaacgtt aagaaatgct ttaataccca 180
cggaaaccac gcaacagttc atagttaaga acggaataat taaagaagat gagttaagag 240
gcgagaacag acagatttta aaagatataa tggatgacta ctacagagga ttcatatctg 300
agactttaag ttctattgat gacatagatt ggactagctt attcgaaaaa atggaaattc 360
agttaaaaaa tggtgataat aaagatacct taattaagga acagacagag tatagaaaag 420
caatacataa aaaatttgcg aacgacgata gatttaagaa catgtttagc gccaaattaa 480
ttagtgacat attacctgaa tttgttatac acaacaataa ttattcggca tcagagaaag 540
aggaaaaaac ccaggtgata aaattgtttt cgagatttgc gactagcttt aaagattact 600
tcaagaacag agcaaattgc ttttcagcgg acgatatttc atcaagcagc tgccatagaa 660
tagttaacga caatgcagag atattctttt caaatgcgtt agtttacaga agaatagtaa 720
aatcgttaag caatgacgat ataaacaaaa tttcgggcga tatgaaagat tcattaaaag 780
aaatgagttt agaagaaata tattcttacg agaagtatgg ggaatttatt acccaggaag 840
gcattagctt ctataatgat atatgtggga aagtgaattc ttttatgaac ttatattgtc 900
agaaaaataa agaaaacaaa aatttataca aacttcagaa acttcacaaa cagattctat 960
gcattgcgga cactagctat gaggttccgt ataaatttga aagtgacgag gaagtgtacc 1020
aatcagttaa cggcttcctt gataacatta gcagcaaaca tatagttgaa agattaagaa 1080
aaataggcga taactataac ggctacaact tagataaaat ttatatagtg tccaaatttt 1140
acgagagcgt tagccaaaaa acctacagag actgggaaac aattaatacc gccttagaaa 1200
ttcattacaa taatatattg ccgggtaacg gtaaaagtaa agccgacaaa gtaaaaaaag 1260
cggttaagaa tgatttacag aaatccataa ccgaaataaa tgaactagtg tcaaactata 1320
agttatgcag tgacgacaac ataaaagcgg agacttatat acatgagatt agccatatat 1380
tgaataactt tgaagcacag gaattgaaat acaatccgga aattcaccta gttgaatccg 1440
agttaaaagc gagtgagctt aaaaacgtgt tagacgtgat aatgaatgcg tttcattggt 1500
gttcggtttt tatgactgag gaacttgttg ataaagacaa caatttttat gcggaattag 1560
aggagattta cgatgaaatt tatccagtaa ttagtttata caacttagtt agaaactacg 1620
ttacccagaa accgtacagc acgaaaaaga ttaaattgaa ctttggaata ccgacgttag 1680
cagacggttg gtcaaagtcc aaagagtatt ctaataacgc tataatatta atgagagaca 1740
atttatatta tttaggcata tttaatgcga agaataaacc ggacaagaag attatagagg 1800
gtaatacgtc agaaaataag ggtgactaca aaaagatgat ttataatttg ttaccgggtc 1860
ccaacaaaat gataccgaaa gttttcttga gcagcaagac gggggtggaa acgtataaac 1920
cgagcgccta tatactagag gggtataaac agaataaaca tataaagtct tcaaaagact 1980
ttgatataac tttctgtcat gatttaatag actacttcaa aaactgtatt gcaattcatc 2040
ccgagtggaa aaacttcggt tttgatttta gcgacaccag tacttatgaa gacatttccg 2100
ggttttatag agaggtagag ttacaaggtt acaagattga ttggacatac attagcgaaa 2160
aagacattga tttattacag gaaaaaggtc aattatattt attccagata tataacaaag 2220
atttttcgaa aaaatcaacc gggaatgaca accttcacac catgtactta aaaaatcttt 2280
tctcagaaga aaatcttaag gatatagttt taaaacttaa cggcgaagcg gaaatattct 2340
tcaggaagag cagcataaag aacccaataa ttcataaaaa aggctcgatt ttagttaaca 2400
gaacctacga agcagaagaa aaagaccagt ttggcaacat tcaaattgtg agaaaaaata 2460
ttccggaaaa catttatcag gagttataca aatacttcaa cgataaaagc gacaaagagt 2520
tatctgatga agcagccaaa ttaaagaatg tagtgggaca ccacgaggca gcgacgaata 2580
tagttaagga ctatagatac acgtatgata aatacttcct tcatatgcct attacgataa 2640
atttcaaagc caataaaacg ggttttatta atgataggat attacagtat atagctaaag 2700
aaaaagactt acatgtgata ggcattgata gaggcgagag aaacttaata tacgtgtccg 2760
tgattgatac ttgtggtaat atagttgaac agaaaagctt taacattgta aacggctacg 2820
actatcagat aaaattaaaa caacaggagg gcgctagaca gattgcgaga aaagaatgga 2880
aagaaattgg taaaattaaa gagataaaag agggctactt aagcttagta atacacgaga 2940
tatctaaaat ggtaataaaa tacaatgcaa ttatagcgat ggaggatttg tcttatggtt 3000
ttaaaaaagg gagatttaag gttgaaagac aagtttacca gaaatttgaa accatgttaa 3060
taaataaatt aaactattta gtatttaaag atatttcgat taccgagaat ggcggtttat 3120
taaaaggtta tcagttaaca tacattcctg ataaacttaa aaacgtgggt catcagtgcg 3180
gctgcatttt ttatgtgcct gctgcataca cgagcaaaat tgatccgacc accggctttg 3240
tgaatatatt taaatttaaa gacttaacag tggacgcaaa aagagaattc attaaaaaat 3300
ttgactcaat tagatatgac agtgaaaaaa atttattctg ctttacattt gactacaata 3360
actttattac gcaaaacacg gttatgagca aatcatcgtg gagtgtgtat acatacggcg 3420
tgagaataaa aagaagattt gtgaacggca gattctcaaa cgaaagtgat accattgaca 3480
taaccaaaga tatggagaaa acgttggaaa tgacggacat taactggaga gatggccacg 3540
atcttagaca agacattata gattatgaaa ttgttcagca catattcgaa attttcagat 3600
taacagtgca aatgagaaac tccttgtctg aattagagga cagagattac gatagattaa 3660
tttcacctgt attaaacgaa aataacattt tttatgacag cgcgaaagcg ggggatgcac 3720
ttcctaagga tgccgatgca aatggtgcgt attgtattgc attaaaaggg ttatatgaaa 3780
ttaaacaaat taccgaaaat tggaaagaag atggtaaatt ttcgagagat aaattaaaaa 3840
taagcaataa agattggttc gactttatac agaataagag atatttataa gtcgacaaag 3900
tattgttaaa aataactctg tagaattata aattagttct acagagttat tttttgaccc 3960
gggtatattg ataaaaataa taatagtggg tataattaag ttgttaggag gttagttaga 4020
atgatgtcaa gattagataa aagtaaagtg attaacagcg cattagagct gcttaatgag 4080
gtcggaatcg aaggtttaac aacccgtaaa ctcgcccaga agctaggtgt agagcagcct 4140
acattgtatt ggcatgtaaa aaataagcgg gctttgctcg acgccttagc cattgagatg 4200
ttagataggc accatactca cttttgccct ttagaagggg aaagctggca agatttttta 4260
cgtaataacg ctaaaagttt tagatgtgct ttactaagtc atcgcgatgg agcaaaagta 4320
catttaggta cacggcctac agaaaaacag tatgaaactc tcgaaaatca attagccttt 4380
ttatgccaac aaggtttttc actagagaat gcattatatg cactcagcgc tgtggggcat 4440
tttactttag gttgcgtatt ggaagatcaa gagcatcaag tcgctaaaga agaaagggaa 4500
acacctacta ctgatagtat gccgccatta ttacgacaag ctatcgaatt atttgatcac 4560
caaggtgcag agccagcctt cttattcggc cttgaattga tcatatgcgg attagaaaaa 4620
caacttaaat gtgaaagtgg gtcttaaaag cagcataacc tttttccgtg atggtaactt 4680
cacggtaacc aagatgtcga gttgagctcg aattcgtaat catggtcata gctgtttcct 4740
gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt 4800
aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc 4860
gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 4920
agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 4980
gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 5040
gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 5100
cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 5160
aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 5220
tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 5280
ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 5340
ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 5400
cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 5460
ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 5520
gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt 5580
atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 5640
aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 5700
aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 5760
gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 5820
cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 5880
gacagttacc aggtccactg ccgggcctct tgcgggatca aaagaaaaac gaaatgatac 5940
accaatcagt gcaaaaaaag atataatggg agataagacg gttcgtgttc gtgctgactt 6000
gcaccatatc ataaaaatcg aaacagcaaa gaatggcgga aacgtaaaag aagttatgga 6060
aataagactt agaagcaaac ttaagagtgt gttgatagtg cagtatctta aaattttgta 6120
taataggaat tgaagttaaa ttagatgcta aaaatttgta attaagaagg agtgattaca 6180
tgaacaaaaa tataaaatat tctcaaaact ttttaacgag tgaaaaagta ctcaaccaaa 6240
taataaaaca attgaattta aaagaaaccg ataccgttta cgaaattgga acaggtaaag 6300
ggcatttaac gacgaaactg gctaaaataa gtaaacaggt aacgtctatt gaattagaca 6360
gtcatctatt caacttatcg tcagaaaaat taaaactgaa tactcgtgtc actttaattc 6420
accaagatat tctacagttt caattcccta acaaacagag gtataaaatt gttgggagta 6480
ttccttacca tttaagcaca caaattatta aaaaagtggt ttttgaaagc catgcgtctg 6540
acatctatct gattgttgaa gaaggattct acaagcgtac cttggatatt caccgaacac 6600
tagggttgct cttgcacact caagtctcga ttcagcaatt gcttaagctg ccagcggaat 6660
gctttcatcc taaaccaaaa gtaaacagtg tcttaataaa acttacccgc cataccacag 6720
atgttccaga taaatattgg aagctatata cgtactttgt ttcaaaatgg gtcaatcgag 6780
aatatcgtca actgtttact aaaaatcagt ttcatcaagc aatgaaacac gccaaagtaa 6840
acaatttaag taccgttact tatgagcaag tattgtctat ttttaatagt tatctattat 6900
ttaacgggag gaaataattc tatgagtccc taggcaggcc tccgccatta tttttttgaa 6960
caattgacaa ttcatttctt attttttatt aagtgatagt caaaaggcat aacagtgctg 7020
aatagaaaga aatttacaga aaagaaaatt atagaattta gtatgattaa ttatactcat 7080
ttatgaatgt ttaattgaat acaaaaaaaa atacttgtta tgtattcaat tacgggttaa 7140
aatatagaca agttgaaaaa tttaataaaa aaataagtcc tcagctctta tatattaagc 7200
taccaactta gtatataagc caaaacttaa atgtgctacc aacacatcaa gccgttagag 7260
aactctatct atagcaatat ttcaaatgta ccgacataca agagaaacat taactatata 7320
tattcaattt atgagattat cttaacagat ataaatgtaa attgcaataa gtaagattta 7380
gaagtttata gcctttgtgt attggaagca gtacgcaaag gcttttttat ttgataaaaa 7440
ttagaagtat atttattttt tcataattaa tttatgaaaa tgaaaggggg tgagcaaagt 7500
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agcagtaaac attatgactt ttatagtgct tgtagctaag tagtacgaaa gggggagctt 7620
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tgaaaacttg taaaaattgc aaagagttta ttaaagatac tgaaatatgc aaaatacatt 7740
cgttgatgat tcatgataaa acagtagcaa cctattgcag taaatacaat gagtcaagat 7800
gtttacataa agggaaagtc caatgtatta attgttcaaa gatgaaccga tatggatggt 7860
gtgccataaa aatgagatgt tttacagagg aagaacagaa aaaagaacgt acatgcatta 7920
aatattatgc aaggagcttt aaaaaagctc atgtaaagaa gagtaaaaag aaaaaataat 7980
ttatttatta atttaatatt gagagtgccg acacagtatg cactaaaaaa tatatctgtg 8040
gtgtagtgag ccgatacaaa aggatagtca ctcgcatttt cataatacat cttatgttat 8100
gattatgtgt cggtgggact tcacgacgaa aacccacaat aaaaaaagag ttcggggtag 8160
ggttaagcat agttgaggca actaaacaat caagctagga tatgcagtag cagaccgtaa 8220
ggtcgttgtt taggtgtgtt gtaatacata cgctattaag atgtaaaaat acggatacca 8280
atgaagggaa aagtataatt tttggatgta gtttgtttgt tcatctatgg gcaaactacg 8340
tccaaagccg tttccaaatc tgctaaaaag tatatccttt ctaaaatcaa agtcaagtat 8400
gaaatcataa ataaagttta attttgaagt tattatgata ttatgttttt ctattaaaat 8460
aaattaagta tatagaatag tttaataata gtatatactt aatgtgataa gtgtctgaca 8520
gtgtcacaga aaggatgatt gttatggatt ataagcggc 8559
Claims (15)
- 수탁 번호 LMG P-31277 하에 컬렉션 BCCM-LMG에 2019년 2월 20일자로 등록된 박테리아 씨. 베이제링키이 (C. beijerinckii) 또는 이의 유전자 변형 형태.
- i) 서열 SEQ ID NO: 126의 전부 또는 일부, 및 ii) 박테리아의 유전 물질의 변형 및/또는 상기 박테리아에서, 상기 박테리아의 야생형 형태에 존재하는 유전 물질에 부분적으로 또는 전체로 부재하는 DNA 서열의 발현을 허용하는 서열을 포함하는 핵산.
- 제2항에 있어서, 박테리아의 유전 물질의 변형을 허용하는 서열은 상동성 재조합 기전을 통해서, 박테리아의 유전 물질의 일부분의 대상 서열로의 치환을 허용하는 변형 매트릭스인 것을 특징으로 하는 핵산.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 핵산은 iii) DNA 엔도뉴클레아제를 코딩하는 서열, 및/또는 iv) 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA)로서, 각각의 gRNA는 DNA 엔도뉴클레아제에 고정을 위한 RNA 구조 및 박테리아의 유전 물질의 표적화된 부분의 상보성 서열을 포함하는 것인 가이드 RNA를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
- 제2항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 핵산은 발현 카세트 및 벡터로부터 선택되고, 바람직하게 플라스미드, 예를 들어, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124 및 SEQ ID NO: 125로부터 선택되는 서열을 갖는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 핵산.
- 박테리아를 형질전환 및 유전자 변형시키기 위한 유전자 도구로서, 상기 유전자 도구는 적어도,
- 적어도 하나의 DNA 엔도뉴클레아제를 코딩하는 제1 핵산으로서, DNA 엔도뉴클레아제를 코딩하는 서열은 프로모터의 제어 하에 위치되는 것인, 제1 핵산, 및
- 제2항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 기술된 바와 같은 제2 핵산
을 포함하고,
유전자 도구의 상기 핵산 중 적어도 하나는 바람직하게 유도성 프로모터의 제어 하에 위치된 항-CRISPR 단백질을 코딩하는 서열을 더 포함하거나, 또는 유전자 도구는 유도성 프로모터의 제어 하에 위치된 항-CRISPR 단백질을 코딩하는 제3 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 도구. - 제6항에 있어서, 제1 핵산은 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA)를 더 코딩하거나 또는 유전자 도구는 하나 이상의 gRNA를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 도구.
- 박테리아를 형질전환시키고 임의로 유전자 변형시키기 위한, 제2항 내지 제6항 중 어느 하나에 기술된 바와 같은 핵산, 또는 제6항 또는 제7항에 기술된 바와 같은 유전자 도구의 용도.
- 유전자 변형을 위한 도구를 사용하여 박테리아를 형질전환, 및 바람직하게 유전자 변형시키기 위한 방법으로서, 제2항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 따른 핵산을 상기 박테리아에 도입시켜서 박테리아를 형질전환시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
- 제2항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 박테리아는 퍼미큐테스 (Firmicutes) 문에 속하고, 바람직하게 클로스트리듐 (Clostridium) 속, 바실러스 (Bacillus) 속, 또는 락토바실러스 (Lactobacillus) 속에 속하는 것을 특징으로 하는, 핵산, 유전자 도구, 용도, 또는 방법.
- 제10항에 있어서, 박테리아는 클로스트리듐 속의 박테리아, 바람직하게 씨. 아세토부틸리쿰 (C. acetobutylicum), 씨. 셀룰롤리티쿰 (C. cellulolyticum), 씨. 파이토퍼멘탄스 (C. phytofermentans), 씨. 베이제링키이 (C. beijerinckii), 씨. 사카로부틸리쿰 (C. saccharobutylicum), 씨. 사카로퍼부틸아세토니쿰 (C. saccharoperbutylacetonicum), 씨. 스포로게네스 (C. sporogenes), 씨. 부티리쿰 (C. butyricum), 씨. 아우란티부티리쿰 (C. aurantibutyricum), 씨. 티로부티리쿰 (C. tyrobutyricum)으로부터 선택되는 용매형성성 박테리아, 또는 씨. 아세티쿰 (C. aceticum), 씨. 써모아세티쿰 (C. thermoaceticum), 씨. 융달리이 (C. ljungdahlii), 씨. 아우토에타노게눔 (C. autoethanogenum), 씨. 디피실 (C. difficile), 씨. 스카톨로게네스 (C. scatologenes) 및 씨. 카르복시디보란스 (C. carboxydivorans)로부터 선택되는 아세트산형성성 박테리아인 것을 특징으로 하는, 핵산, 유전자 도구, 용도, 또는 방법.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 박테리아는 플라스미드 pNF2가 결여된 박테리아 씨. 베이제링키이, 바람직하게 DSM 6423, LMG 7814, LMG 7815, NRRL B-593, NCCB 27006 및 균주 DSM 6423과 적어도 95%, 바람직하게 97% 동일성을 갖는 하위분기군으로부터 선택되는 하위분기군인 것을 특징으로 하는, 핵산, 유전자 도구, 용도, 또는 방법.
- 박테리아를 형질전환 및 바람직하게 유전자 변형시키거나 또는 박테리아를 사용하여 적어도 하나의 용매를 생성시키기 위한 키트로서, 상기 키트는 제6항 또는 제7항에 기술된 바와 같은 유전자 도구에서 사용되는, 제2항 내지 제5항 중 어느 하나에 기술된 바와 같은 핵산, 및 선택된 항-CRISPR 단백질의 발현의 유도성 프로모터에 적합한 적어도 하나의 유도인자를 포함하는 것인 키트.
- 산업적 규모로 용매 또는 용매의 혼합물, 바람직하게 아세톤, 부탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 이의 혼합물, 전형적으로 이소프로판올/부탄올 혼합물의 생성을 허용하기 위한, 제2항 내지 제5항 중 어느 하나에 기술된 바와 같은 핵산, 제6항 또는 제7항에 따른 유전자 도구, 제9항에 따른 방법, 또는 제13항에 따른 키트의 용도.
- 제9항 내지 제12항 중 어느 하나에 따른 방법으로 수득가능한 박테리아 씨. 베이제링키이로서, 상기 박테리아는 서열 SEQ ID NO: 18의 유전자 catB 및 플라스미드 pNF2가 결여된 것을 특징으로 하는, 박테리아.
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