KR20160103007A - 재조합 편성 혐기성 그램 양성균 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항TRAIL-R1 항체 및 항TRAIL-R2 항체에 의해 효과적인 암세포사를 유도함과 동시에 정상세포에의 독성을 경감하는 것을 목적으로 한다. 3개 이상의 항TRAIL-R1 단일쇄 항체 및/또는 3개 이상의 항TRAIL-R2 단일쇄 항체를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 발현 가능한 상태로 포함하는 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.

Description

재조합 편성 혐기성 그램 양성균{Recombinant anaerobic gram-positive bacteria}

본 발명은 재조합 편성 혐기성 그램 양성균을 유효 성분으로 하는 항종양제 및 종양 검출용 마커에 관한 것이다.

TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)은 TNF 슈퍼 패밀리에 속하고, 다양한 암세포에 세포사(아포토시스, apoptosis)를 유도하는 단백질이다. TRAIL은 생체 내에서는 3량체를 형성하고, 세포 내에 데스 도메인(Death Domain)을 가지는 TRAIL 수용체(TRAIL-R1, TRAIL-R2)에 결합된다. TRAIL이 결합되면 TRAIL 수용체는 응집하여 3량체를 형성하고, 이에 따라 세포사 시그널을 세포 내에 전달하는 것이 알려져 있다. TRAIL의 수용체로는 상기 TRAIL-R1, TRAIL-R2 이외에도 TRAIL-R3, TRAIL-R4 및 가용형 수용체인 오스테오프로테게린이 알려져 있다(도 1). TRAIL-R3, TRAIL-R4 및 오스테오프로테게린은 데스 도메인이 완전히 혹은 부분적으로 결실되어 있고, 이들의 수용체는 TRAIL이 결합되어도 세포사를 유도하지 않기 때문에 디코이(decoy) 수용체라고 불린다.

TRAIL은 정상세포에는 세포사를 일으키기 어렵기 때문에 항종양약으로서 개발이 진행되고 있다. 그러나, TRAIL을 이용하여 암세포에 세포사를 효율적으로 유도하게 하기 위해서는 상기 디코이 수용체에 결합되지 않고 TRAIL-R1 및 TRAIL-R2에 효율적으로 결합되어 세포 내에 세포사 시그널을 전달하는 시스템을 개발할 필요가 있다. TRAIL-R1 및 TRAIL-R2에 대한 작동성(아고니스트) 항체는 상기 디코이 수용체에 결합되지 않기 때문에 TRAIL보다 효과적으로 세포사를 유도할 수 있고, 또한 혈중의 반감기가 길기 때문에 투여 간격을 길게 할 수 있다. 따라서, 이들 항체는 현재 임상 단계에 있다(비특허문헌 1). 그러나, HGS-ETR1(항hTRAIL(인간 TRAIL)-R1 작동성 항체) 및 HGS-ETR2(항hTRAIL-R2 작동성 항체)는 2가이기 때문에 Fc수용체를 가진 NK 세포나 대식 세포(macrophage)에 의한 항체의 크로스 링크 없이 TRAIL 수용체의 3량체 형성을 유도할 수 없다(도 2a). 그 때문에 이들 항체는 임상 시험에서는 현저한 치료 효과가 보이지 않는다는 문제가 있었다(비특허문헌 2).

NK 세포나 대식 세포의 관여 없이 직접 암세포막 상의 hTRAIL-R2 분자를 응집시켜 세포사 시그널을 전할 수 있는 강력한 아고니스트 항체로서 HGS-TR2J(KMTR2)가 알려져 있다(비특허문헌 3)(도 2b). 또한, hTRAIL-R2에 대한 라마 1개쇄 VHH 항체의 3~5량체가 NK 세포나 대식 세포의 관여 없이 hTRAIL-R2 발현 암세포에 대해 매우 강력한 세포사를 유도하는 것도 알려져 있다(특허문헌 1)(도 3). 한편, hTRAIL-R1 및 hTRAIL-R2는 암세포뿐만 아니라 다양한 인간 정상 조직에 발현되어 있고, 특히 인간 정상 간세포는 hTRAIL, 항hTRAIL-R 작동성 항체에 감수성이기 때문에(비특허문헌 4 및 비특허문헌 5), hTRAIL-R 작동성 항체는 부작용으로서 간장해를 일으킨다고 생각된다.

특허문헌 1: PCT WO/2011/098520

비특허문헌 1: Ghobrial 등, 2005, CA Cancer J Clin., 55(3), pp. 178-194 비특허문헌 2: Micheau 등, 2013, Br J Pharmacol., 169(8), pp. 1723-1744 비특허문헌 3: Motoki 등, 2005, Clin Cancer Res., 11(8), pp. 3126-3135 비특허문헌 4: Jo 등, 2000, Nat Med., 6(5), pp. 564-567 비특허문헌 5: Mori 등, 2004, Cell Death Differ., 11(2), pp. 203-207

본 발명은 항TRAIL-R1 항체 및 항TRAIL-R2 항체에 의해 효과적인 암세포사를 유도함과 동시에 정상세포에의 독성을 경감하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위해 면밀히 검토한 결과, 본 발명자는 강력한 아고니스트 활성을 가지는 항hTRAIL-R2 VHH 항체를 발현하고 분비하는 비피더스균을 제작하여 이 재조합 비피더스균의 정맥 내 투여에 의해 종양 국소에서의 암세포사를 유도할 수 있음을 처음으로 밝혔다. 또한, 본 발명자는 암세포막 상의 hTRAIL-R1 분자를 인식할 수 있는 신규의 항hTRAIL-R1 VHH 항체를 취득하였다. 본 발명에 의해 강력한 아고니스트 활성을 가지는 항hTRAIL-R1 및 항hTRAIL-R2 항체의 종양 부위 국소 투여에 의해 정상세포에의 독성을 경감하면서 효과적으로 암세포사를 유도하는 것이 가능해진다.

본 발명은 상기 연구 결과에 기초한 것으로, 구체적으로 이하의 발명을 제공한다.

(1) 시그널 펩티드와 3개 이상의 항TRAIL-R1 단일쇄 항체 및/또는 3개 이상의 항TRAIL-R2 단일쇄 항체를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 발현 가능한 상태로 포함하는 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.

(2) 편성 혐기성 그램 양성균이 비피도박테리움속(Bifidobacterium)인, (1)에 기재된 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.

(3) 항TRAIL-R1 단일쇄 항체가

CDR1이 서열 번호 22로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고,

CDR2가 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고,

CDR3이 서열 번호 24로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는, (1) 또는 (2)에 기재된 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.

(4) 항TRAIL-R2 단일쇄 항체가

CDR1이 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고,

CDR2가 서열 번호 16으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고,

CDR3이 서열 번호 17로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.

(5) 상기 융합 단백질이 기능성 펩티드를 더 포함하는, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.

(6) 기능성 펩티드가 표지 단백질인, (5)에 기재된 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.

(7) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 재조합 편성 혐기성 그램 양성균을 유효 성분으로 하는 항종양제.

(8) CDR1이 서열 번호 22로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고,

CDR2가 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고,

CDR3이 서열 번호 24로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 항TRAIL-R1 항체.

본 명세서는 본원의 우선권 기초인 일본특허출원 2014-003441호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

본 발명에 의해 강력한 아고니스트 활성을 가지는 항hTRAIL-R1 및 항hTRAIL-R2 항체의 종양 부위 국소 투여에 의해 정상세포에의 독성을 경감하면서 효과적인 암세포사를 유도하는 것이 가능해진다.

도 1은 TRAIL 및 그 수용체의 구조와 세포사 유도의 시그널 전달의 개략도이다.
도 2는 TRAIL-R에 대한 통상 항체 a와 아고니스트 활성을 가지는 항체 b의 세포사 시그널의 세포 내 전달의 차이를 나타내는 개략도이다(통상 항체의 경우, TRAIL을 통한 아포토시스에 NK 세포나 대식 세포 c에 의한 크로스 링크를 필요로 한다. KMTR2 항체의 경우 TRAIL을 통한 아포토시스에 NK 세포나 대식 세포에 의한 크로스 링크를 필요로 하지 않는다).
도 3은 1개쇄 VHH 항체의 3~5량체(도 3에서는 VHH4)가 NK 세포나 대식 세포에 의한 크로스 링크 없이 hTRAIL-R 발현 암세포에 대해 아포토시스를 유도하는 것을 나타내는 개략도이다.
도 4는 정제 hTRAIL-R1:Fc(a), hTRAIL-R2:Fc(b(1)) 및 mTRAIL(마우스 TRAIL)-R2:Fc(b(2))의 SDS-PAGE(SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동) 상을 나타낸다.
도 5는 정제한 4E6 모노머의 SDS-PAGE 상을 나타낸다. 화살표가 4E6 모노머를 나타낸다.
도 6은 4E6 모노머의 hTRAIL-R2:Fc 항원에의 결합 활성의 ELISA에 의한 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 4E6 모노머와 hTRAIL-R2:Fc 항원의 해리 상수의 Biacore X-100에 의한 측정 결과를 나타낸다.
도 8은 정제한 4P6 모노머의 SDS-PAGE 상을 나타낸다.
도 9는 4P6 모노머 및 4E6 모노머의 결합 특이성의 ELISA에 의한 해석 결과를 나타낸다.
도 10은 4P6 모노머와 hTRAIL-R1:Fc 항원의 해리 상수의 Biacore X-100에 의한 측정 결과를 나타낸다.
도 11은 4P6 모노머 및 4E6 모노머의 안타고니스트 활성을 나타낸다.
도 12는 대장균으로 발현시킨 4E6 다이머 Toxin(a), 4E6 다이머 EGFP(b) 및 4E6 테트라머(c)의 유전자 구조의 모식도이다.
도 13은 정제한 대장균 발현 재조합 단백질(a: 4E6 다이머 Toxin, b: 4E6 다이머 EGFP 및 c: 4E6 테트라머)의 SDS-PAGE 상을 나타낸다.
도 14는 인간 대장암 세포 Colo205 세포에 대한 재조합 단백질(a: 4E6 다이머 Toxin 및 4E6 다이머 EGFP와 b: 4E6 모노머 및 4E6 테트라머)의 세포사 유도 활성을 나타낸다.
도 15는 4E6 다이머 EGFP에 의한 암세포(a: Colo205 세포 및 b: BxPC-3 세포)의 형광 염색을 나타낸다. 세로축은 세포수, 가로축은 4E6 다이머 EGFP의 형광 강도를 나타낸다.
도 16은 대장균에서 발현한 항hTRAIL-R2 VHH 항체 테트라머(4E6 테트라머)의 인간 대장암 세포 Colo205 세포(a) 및 췌장암 세포 BxPC-3 세포(b)에 대한 세포사 유도 작용을 나타낸다.
도 17은 비피더스균 배양 상청 1mL로부터 정제한 4E6 테트라머 및 4E6 다이머 EGFP의 SDS-PAGE 상을 나타낸다. 4E6 테트라머는 3클론, 4E6 다이머 EGFP는 2클론의 결과를 나타낸다.
도 18은 비피더스균 배양 상청으로부터 정제한 4E6 테트라머(4E6 테트라머)의 Colo205 세포에 대한 암세포사 유도 활성을 나타낸다.
도 19는 Colo205 세포를 이식한 누드 마우스에서의 4E6 테트라머 분비 비피더스균의 항종양 효과를 나타낸다. 종양 부피는 ㎣로, 평균값+표준오차(n=6)로 나타낸다.
도 20은 Colo205 세포를 이식한 누드 마우스에서 4E6 테트라머 분비 비피더스균을 투여하였을 때의 체중 변화를 나타낸다. 체중은 평균값+표준편차(n=6)로 나타낸다.
도 21은 BxPC-3 세포를 이식한 누드 마우스에서의 4E6 테트라머 분비 비피더스균의 항종양 효과를 나타낸다. 종양 부피는 ㎣로, 평균값+표준오차(n=6)로 나타낸다.
도 22는 BxPC-3 세포를 이식한 누드 마우스에서 4E6 테트라머 분비 비피더스균을 투여하였을 때의 체중 변화를 나타낸다. 체중은 평균값+표준편차(n=6)로 나타낸다.
도 23은 정제한 대장균 발현 재조합 단백질(4P6 트리머)의 SDS-PAGE 상을 나타낸다.
도 24는 대장균으로 발현한 항hTRAIL-R1 VHH 항체 트리머(4P6 트리머)의 인간 대장암 세포 Colo205 세포에 대한 세포사 유도 작용을 나타낸다.
도 25는 비피더스균 배양 상청으로부터 정제한 4P6 트리머의 SDS-PAGE 상을 나타낸다.
도 26은 비피더스균 배양 상청으로부터 정제한 항hTRAIL-R1 VHH 항체 트리머(4P6 트리머)의 인간 대장암 세포 Colo205 세포(a) 및 췌장암 세포 BxPC-3 세포(b)에 대한 세포사 유도 작용을 나타낸다.
도 27은 BxPC-3-Luc#2 세포를 이식한 누드 마우스에서의 4P6 트리머 분비 비피더스균의 항종양 효과를 나타낸다. 종양 부피는 ㎣로, 평균값+표준오차(n=5)로 나타낸다.
도 28은 BxPC-3-Luc#2 세포를 이식한 누드 마우스에서 4P6 트리머 분비 비피더스균을 투여하였을 때의 체중 변화를 나타낸다. 체중은 평균값+표준오차(n=5)로 나타낸다.

이하, 본 발명에 대해 구체적으로 설명한다.

1. 재조합 편성 혐기성 그램 양성균

1-1. 개요 및 정의

본 발명의 제1 태양은 재조합 편성 혐기성 그램 양성균(이하, 종종 「재조합 세균」이라고 약칭함)이다. 본 발명의 재조합 세균은 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 발현 가능한 상태로 포함하는 약제 송달용 담체이다.

「편성 혐기성 그램 양성균」이란 그램 양성균으로 분류되는 편성 혐기성균을 말한다. 여기서 「편성 혐기성균」이란 절대 혐기성균이라고도 불리며, 고산소 존재 하에서는 증식하지 못하고 사멸하는 성질을 가진 세균을 말한다. 따라서, 포유동물의 체내에서는 저산소에서 혐기 상태의 소화기관 내 주로 장 내에서는 증식 가능하지만, 용존 산소가 존재하는 혈액 등의 체액 중이나 통상의 조직 내에서는 증식할 수 없다. 「그램 양성균」이란 그램 염색에 의해 보라색 또는 감색으로 염색되는 세균의 총칭이다. 그램 양성균에는 간균, 구균, 나선균이 알려져 있지만, 본 명세서에서는 특별히 한정되지는 않는다. 그램 양성균은 내독소(endotoxin)를 포함하지 않기 때문에 사후에도 내독소를 방출하지 않는다. 따라서, 안전성 면에서 본 발명의 약제 송달용 담체로서 바람직하다. 본 발명의 재조합 세균으로서는 예를 들어 비피도박테리움속(Bifidobacterium)(본 명세서에서는 이하 비피도박테리움속을 총칭하여 「비피더스균」이라고 부름), 클로스트리듐속(Clostridium)이 해당할 수 있다. 바람직하게는 비피더스균이다. 이는 비피더스균이 외독소(exotoxin)를 분비하지 않고 유산균으로서 일상적으로 이용되고 있으며 인체 등에 대한 안전성이 확인되었기 때문이다. 비피더스균은 어떤 종이어도 되지만, 바람직하게는 인간의 장관 내에 생식하는 종류, 구체적으로 B.비피듐(B. bifidum), B.롱검(B. longum), B.브레이브(B. brave), B.인판티스(B. infantis) 및 B.아돌레센티스(B. adolescentis)이다.

1-2. 구성

본 발명의 편성 혐기성 그램 양성균은 융합 단백질을 코딩하는 핵산(이하, 종종 「융합 유전자」라고 함)을 발현 가능한 상태로 포함한다. 이하, 본 발명의 재조합 세균을 특징짓는 융합 유전자 및 이를 발현 가능한 상태로 하는 발현 카세트의 구성에 대해 구체적으로 설명한다.

1-2-1. 융합 유전자의 구성

본 명세서에서 「융합 단백질을 코딩하는 핵산(융합 유전자)」이란 유전자 재조합 기술에 의해 복수의 유전자 등을 융합하여 구축된, 융합 단백질을 코딩하는 외래성 핵산을 말한다. 융합 유전자는 후술하는 발현 카세트 내에 삽입된 상태로 본 발명의 재조합 세균 내에 도입되어 있다.

본 명세서에서 「융합 단백질」이란 시그널 펩티드, 3개 이상의 단일쇄 항체 및 임의로 기능성 펩티드를 포함하고, 이들을 연결한 세포외 분비성 단백질이다. 시그널 펩티드, 단일쇄 항체 및 기능성 펩티드는 직접 연결되어 있어도 되고, 링커 펩티드를 사이에 두고 간접적으로 연결되어 있어도 된다. 링커 펩티드의 길이나 아미노산 서열은 단일쇄 항체 및 기능성 펩티드 각각의 기능을 저해하지 않는다면 특별히 한정되지는 않는다. 예를 들어 20아미노산 이하 또는 15아미노산 이하에서 자기 폴딩하지 않는 아미노산 서열 등이 적합하다. 본 발명에 이용되는 링커 펩티드로서 예를 들어 IEGRMD 링커 펩티드(서열 번호 27) 및 (GGSGG)₂ 링커 펩티드(서열 번호 28)를 들 수 있다. 이하, 융합 단백질을 구성하는 시그널 펩티드, 단일쇄 항체 및 기능성 펩티드에 대해 구체적으로 설명한다.

(1) 시그널 펩티드

시그널 펩티드는 세포 내에서 생합성된 단백질의 세포외 이행에 필요한 펩티드이다. 통상 N말단 측에 Lys나 Arg와 같은 양전하를 가진 아미노산을 배치하고, 이에 이어서 Ala, Leu, Val, Ile, Val 및 Phe와 같은 소수성이 높은 아미노산 서열을 배치한다. 또한, 시그널 펩티드의 C말단 측에는 시그널 펩티드의 절단과 분비를 촉진하는 시그널 서열 후 삽입 서열 및/또는 융합 단백질로부터 시그널 펩티드를 절단하는 시그널 펩티다아제 인식 부위를 포함하는 아미노산 서열을 가지고 있어도 된다. 시그널 펩티드는 본 발명의 세균 내에서 발현된 상기 융합 단백질을 막에 존재하는 트랜스 로케이터 등을 통해 세포 외에 분비하는 기능을 담당한다. 시그널 펩티드의 아미노산 서열은 특별히 한정되지는 않는다. 편성 혐기성 그램 양성균 내에서 기능할 수 있는 공지의 여하한 시그널 서열의 아미노산 서열을 이용할 수 있다. 또한, 시그널 펩티드의 아미노산 길이도 특별히 한정되지는 않는다. 통상적으로 3아미노산~60아미노산의 범위 내에 있으면 된다. 단, 융합 단백질의 분자량이 너무 커지지 않도록 하기 위해 아미노산 길이가 짧은 시그널 펩티드가 바람직하다.

시그널 펩티드는 융합 단백질의 N말단 측에 배치한다.

(2) 단일쇄 항체

상기 융합 단백질에는 3개 이상의 단일쇄 항체가 포함된다. 본 명세서에서 「 단일쇄 항체」란 1개쇄 폴리펩티드로 구성되고, 또한 단일체로 표적 물질을 인식하여 결합할 수 있는 항체를 말한다. 2개쇄 이상으로 구성되는 항체는 분자량적으로 너무 크기 때문에 편성 혐기성 그램 양성균 내에서는 발현되지 않을 가능성이나 항체 기능을 가진 적절한 입체 구조가 구축되지 않을 가능성이 높기 때문이다. 따라서, 본 발명의 단일쇄 항체는 하나당 분자량이 35kDa 이하인 저분자 항체인 것이 바람직하다. 천연 항체 및 인공 항체는 불문한다.

본 발명의 단일쇄 항체는 전형적으로 상보성 결정 영역(CDR) 및 프레임워크 영역(FR)으로 이루어지는 가변 영역으로 구성된다. 상보성 결정 영역은 가변성을 나타내어 항체에 결합 특이성을 부여하는 영역이다. 한편, 프레임워크 영역은 가변 영역의 상대적으로 저장되어 있는 부분이다. 완전한 가변 도메인은 3개의 CDR에 의해 연결된 4개의 FR을 포함한다. 3개의 CDR은 그 N말단으로부터 차례대로 CDR1, CDR2 및 CDR3이라고 불리며, 4개의 FR은 그 N말단으로부터 차례대로 FR1, FR2, FR3 및 FR4라고 불린다. 따라서, 가변 영역에서 상기 CDR과 FR은 아미노산 말단으로부터 카르복시 말단 방향으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서로 배열된다.

본 명세서에서 「천연 항체」란 어느 하나의 척추동물이 생산하는 항체와 동일한 아미노산 서열을 가진 항체를 말한다. 천연 항체의 단일쇄 항체의 구체예로서는 예를 들어 낙타과 동물이 생산하는 1개쇄 항체를 들 수 있다(Hamers-Casterman C., et al., 1993, Nature 363: 446-448)(이하, 본 명세서에서는 「낙타과 1개쇄 항체」라고 함). 낙타과 1개쇄 항체는 L쇄 없이 H쇄만으로 구성되는 항체로서, H쇄의 V_H 영역만으로 항원과 결합할 수 있기 때문에 분자량은 약 14kDa로 통상 항체의 10분의 1 정도밖에 없다. 또한, 일반적으로 항원 친화성이 높고 열, 산 및 염기에 대한 내성이 높다는 성질이 있다(Deffar, K., et al., 2009, African Journal of Biotechnology 8 (12): 2645-2652). 따라서, 본 발명에서의 단일쇄 항체로서 매우 적합하다. 낙타과 동물종은 낙타과 1개쇄 항체를 생산할 수 있다면 그 종류는 불문한다. 예를 들어 라마, 알파카, 낙타 등 어떤 동물종 유래의 항체도 이용할 수 있다.

본 명세서에서 「인공 항체」란 인공적으로 구축된 항체이다. 예를 들어 상기 천연 항체의 아미노산 서열에 적당한 변이를 도입한 단일쇄 항체 외에 천연계에는 원칙적으로 존재하지 않는 구조상의 개변을 행한 단일쇄 항체를 들 수 있다. 이러한 인공 항체의 구체예로서 키메라 항체, 인간화 항체, 1개쇄 Fv(scFv: single chain Fragment of variable region)(Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995, Pierce Chemical Co., Rockford, IL), 다이아보디(diabody), 트리아보디(triabody) 또는 테트라보디(tetrabody) 등을 들 수 있다.

「키메라 항체」란 항체 분자의 가변 영역과 정상 영역이 각각 이종의 동물에 유래하는 항체를 말한다. 키메라 항체의 제작은 공지의 방법을 이용하여 행할 수 있고, 예를 들어 항체 V영역을 코딩하는 핵산과 인간 항체 C영역을 코딩하는 핵산을 연결하고 이를 발현 벡터에 넣어 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 얻을 수 있다.

「인간화 항체」란 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 불리는 개변 항체이다. 인간화 항체는 면역 동물 유래의 항체의 CDR을 인간 항체의 상보성 결정 영역에 이식함으로써 구축된다. 그 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다.

1개쇄 Fv는 면역 글로블린 분자에 있어서 L쇄와 H쇄에 위치하는 가변 영역(즉, 각각 V_L 및 V_H)을 충분한 길이의 유연성 링커에 의해 연결하여 하나의 폴리펩티드쇄에 포함한 구조를 가지는 분자량 약 35kDa 이하의 합성 항체이다. 1개쇄 Fv 내에서 두 가변 영역은 서로 자기 집합하여 하나의 기능적인 항원 결합 부위를 형성할 수 있다.

상기 융합 단백질에 있어서 단일쇄 항체는 TRAIL을 응집시켜 3량체를 형성시키기 위해 3개 이상 포함되어야만 한다. 단, 항체 수가 많아지면 융합 단백질의 분자량이 커지기 때문에 통상은 수 개, 예를 들어 3~6개, 3~5개 또는 3~4개가 바람직하다. 개개의 단일쇄 항체는 적당한 링커 펩티드로 연결되어 있는 것이 바람직하다. 링커 펩티드의 길이나 아미노산 서열은 각각의 단일쇄 항체의 항원 결합 활성을 저해하지 않으면 특별히 한정되지는 않는다.

상기 융합 단백질은 동일한 항원을 인식하는 단일쇄 항체를 3개 이상 포함한다. 예를 들어 hTRAIL-R1을 항원으로 하는 경우 상기 융합 단백질은 모두 동일한 hTRAIL-R1을 인식하는 단일쇄 항체를 3개 이상 포함한다.

본 발명에 있어서 항체의 「가」란 항체 1분자가 가지는 항원 결합 부위의 수를 말한다. 예를 들어 IgG는 1분자에 2개의 항원 결합 부위를 가지는 2가의 항체이다. 상기 단일쇄 항체는 1분자당 하나의 항원 결합 부위를 가지는 1가의 항체이다. 본 발명의 융합 단백질은 3개 이상의 단일쇄 항체를 포함하기 때문에 전체적으로 3가 이상이다.

단일쇄 항체는 융합 단백질에 있어서 시그널 펩티드의 C말단 측이면 후술하는 기능성 펩티드와의 순서는 특별히 제한되지 않지만 기능성 펩티드의 N말단 측에 배치하는 것이 바람직하다.

본 발명에서의 단일쇄 항체의 표적 물질은 TRAIL-R1 또는 TRAIL-R2이다. 전술한 바와 같이 본 발명의 재조합 세균은 혐기성 환경 하에서만 증식 가능하기 때문에 생체 내에서 혐기적 환경 하가 되는 세포가 표적 세포로서 적합하다. 구체적으로는 적합한 표지 세포로서 종양 세포 또는 장관 상피 세포를 들 수 있다. 이하, 항TRAIL-R1 항체 및 항TRAIL-R2 항체에 대해 구체적으로 설명한다.

(i) 항TRAIL-R1 항체

본 발명에 있어서 「항TRAIL-R1 단일쇄 항체」란 TRAIL-R1(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 1, TRAIL 수용체 1)에 대한 단일쇄 항체를 말한다. 본 발명에 이용하는 항TRAIL-R1 단일쇄 항체는 TRAIL-R1에 특이적으로 결합하는 것이면 특별히 한정하지 않는다. 본 발명에 이용되는 항TRAIL-R1 단일쇄 항체로서 예를 들어 본 명세서의 실시예에서 취득하여 사용한 4P6을 들 수 있다. 4P6은 알파카 유래의 1개쇄 VHH 항체로서, CDR1이 서열 번호 22로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고, CDR2가 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고, CDR3이 서열 번호 24로 나타나는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에서 이용하는 항TRAIL-R1 단일쇄 항체의 프레임워크 영역의 서열은 특별히 한정하지 않지만, 예를 들어 Maass D.R., et al., 2007, J Immunol Methods. 324: 13-25에 기재되어 있는 알파카 단일쇄 항체(예를 들어 상기 문헌에 기재된 Clone A02)의 프레임워크 영역의 서열을 이용할 수 있다. 따라서, 항TRAIL-R1 단일쇄 항체는 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어 FR1이 서열 번호 18로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고, FR2가 서열 번호 19로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고, FR3이 서열 번호 20으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고, FR4가 서열 번호 21로 나타나는 아미노산 서열을 포함해도 된다.

본 발명에 이용하는 융합 단백질은 특히 TRAIL-R1에 결합하여 아포토시스를 유도하는 아고니스트 활성을 가지는 것이 바람직하다. TRAIL-R1은 3량체 이상으로 응집함으로써 아포토시스를 유도하기 때문에 TRAIL-R1을 활성화시키기 위해 상기 융합 단백질이 전술한 바와 같이 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상, 예를 들어 3개, 4개, 5개 또는 6개의 항TRAIL-R1 단일쇄 항체를 포함하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 일 태양으로서 CDR1이 서열 번호 22로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고, CDR2가 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고, CDR3이 서열 번호 24로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 항TRAIL-R1 항체를 들 수 있다. 이러한 항체의 프레임워크 영역의 서열은 특별히 한정하지 않지만, 예를 들어 상기 Maass D.R의 문헌에 기재된 서열을 이용해도 되고, 따라서 FR1이 서열 번호 18로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고, FR2가 서열 번호 19로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고, FR3이 서열 번호 20으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고, FR4가 서열 번호 21로 나타나는 아미노산 서열을 포함해도 된다. TRAIL-R1을 활성화시키기 위해 이러한 항체는 3가 이상인 것이 바람직하다. 또한, 이러한 항체는 상기와 같은 인공 항체, 예를 들어 키메라 항체 또는 인간화 항체이어도 된다.

TRAIL-R1에 대한 작동성 항체는 TRAIL-R1을 통해 아포토시스를 유도하기 때문에 본 발명의 항체는 아포토시스 유도제로서 사용할 수 있다.

(ii) 항TRAIL-R2 항체

본 발명에 있어서 「항TRAIL-R2 단일쇄 항체」란 TRAIL-R2(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 2, TRAIL 수용체 2)에 대한 단일쇄 항체를 말한다. 본 발명에 이용하는 항TRAIL-R2 단일쇄 항체는 TRAIL-R2에 특이적으로 결합하는 것이면 특별히 한정하지 않는다. 본 발명에 이용되는 항TRAIL-R2 단일쇄 항체로서 예를 들어 상기 문헌 WO2011/098520에 기재되어 있는 4E6을 들 수 있다. 4E6은 라마 1개쇄 VHH 항체로서 CDR1이 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고, CDR2가 서열 번호 16으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고, CDR3이 서열 번호 17로 나타나는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명에 이용하는 융합 단백질은 특히 TRAIL-R2에 결합하여 아포토시스를 유도하는 아고니스트 활성을 가지는 것이 바람직하다. TRAIL-R2는 3량체 이상으로 응집함으로써 아포토시스를 유도하기 때문에 TRAIL-R2를 활성화시키기 위해 상기 융합 단백질이 전술한 바와 같이 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상, 예를 들어 3개, 4개, 5개 또는 6개의 항TRAIL-R2 단일쇄 항체를 포함하는 것이 특히 바람직하다.

TRAIL-R2에 대한 작동성 항체는 TRAIL-R2를 통해 아포토시스를 유도하기 때문에 본 발명의 항체는 아포토시스 유도제로서 사용할 수 있다.

(3) 기능성 펩티드

상기 융합 단백질에는 임의로 기능성 펩티드가 포함된다. 본 명세서에서 「기능성 펩티드」란 생체 내 또는 세포 내에서 특정의 생물 활성, 예를 들어 효소 활성, 촉매 활성, 기질로서의 기능 또는 생물학적 저해 혹은 항진 기능(예를 들어 세포 상해 활성)을 가지는 펩티드를 말한다. 구체적으로 예를 들어 형광 단백질 혹은 발광 단백질, 효소 또는 외독소를 들 수 있다.

기능성 펩티드 유래의 생물종은 불문한다. 또한, 기능성 펩티드는 천연형 또는 비천연형 중 어느 것이어도 된다. 천연형 기능성 폴리펩티드란 천연계에 존재하는 펩티드를 말한다. 한편, 비천연형 기능성 폴리펩티드란 천연형 기능성 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여 그 기능성 펩티드가 가진 특유의 기능을 잃지 않는 범위에서 아미노산 서열에 적당한 변이(아미노산의 부가, 결실, 치환을 행한 것)를 도입한 개변 펩티드를 말한다.

상기 융합 단백질에서 기능성 펩티드는 2개 이상 포함되어 있어도 된다. 단, 복수의 기능성 펩티드를 포함하는 경우 융합 단백질 전체의 분자량이 너무 커지기 때문에 기능성 펩티드의 총 분자량은 80kDa 이하, 바람직하게는 40kDa 이하로 하는 것이 좋다. 2개 이상의 기능성 펩티드를 포함하는 경우 각각의 기능성 펩티드의 종류는 동일해도 되고 달라도 된다. 예를 들어 외독소와 효소, 또는 외독소와 형광 단백질 또는 발광 단백질을 조합한 기능성 펩티드를 들 수 있다. 2개 이상의 기능성 펩티드를 포함하는 경우 개개의 기능성 펩티드는 직접 연결되어 있어도 되지만, 각각의 기능성 펩티드가 독자적인 기능을 효율적으로 발휘할 수 있도록 적당한 링커 펩티드로 연결되어 있는 것이 바람직하다. 링커 펩티드의 길이나 아미노산 서열은 기능성 펩티드의 기능을 저해하지 않으면 특별히 한정되지는 않는다. 2개 이상의 다른 기능성 펩티드를 하나의 융합 단백질에 포함시킴으로써 단일쇄 항체가 인식하는 표적 물질에 대해 다른 기능을 부여하는 것이 가능해진다.

기능성 펩티드는 융합 단백질에서 시그널 펩티드의 C말단 측이면 특별히 제한되지는 않지만 상기 단일쇄 항체의 C말단 측에 배치하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명의 재조합 세균에서 기능성 펩티드로서 작용할 수 있는 상술한 형광 단백질 혹은 발광 단백질, 효소 또는 외독소에 대해 구체적으로 설명한다.

(i) 형광 단백질 또는 발광 단백질(표지 단백질)

기능성 펩티드로서의 형광 단백질의 종류는 염기 서열을 미리 알고 있다면 특별히 불문한다. 상기 천연형 및 비천연형 중 어느 것이어도 된다. 단, 상기 이유로부터 아미노산 길이가 짧은 것이 바람직하다. 또한, 여기 파장, 형광 파장도 특별히 한정되지는 않는다. 이들 파장은 상황 및 필요에 따라 적절히 선택하면 된다. 구체적인 형광 단백질로서는 예를 들어 CFP, RFP, DsRed, YFP, PE, PerCP, APC, GFP 등을 들 수 있다.

또한, 발광 단백질에 대해서도 염기 서열을 미리 알고 있다면 그 종류는 특별히 불문한다. 상기 형광 단백질과 같이 천연형 및 비천연형 중 어느 것이어도 되지만, 아미노산 길이가 짧은 것이 바람직하다. 구체적인 발광 단백질로서는 예를 들어 에쿼린 등을 들 수 있다.

(ii) 효소

기능성 펩티드로서의 효소의 종류는 염기 서열을 미리 알고 있다면 특별히 불문한다. 표적 물질에 대해 직접 작용하는 효소이어도 되고, 표적 물질에 대해 직접 작용은 하지 않고 그 주변에서 기능하는 효소이어도 된다. 후자의 구체적인 예로서는 발광에 기여하는 루시페라아제, 퍼옥시다아제(예를 들어 서양 와사비 퍼옥시다아제) 등을 들 수 있다. 상기 단일쇄 항체에 효소가 연결된 융합 단백질은 이뮤노엔자임(면역 효소)으로서 기능할 수 있다.

(iii) 외독소

「외독소」(exotoxin)란 세균이 균체 밖으로 분비하는 독성 단백질이다. 외독소는 세포 상해 활성을 가지며 그 염기 서열을 미리 알고 있다면 종류는 불문한다. 예를 들어 녹농균 독소(Pseudomonas toxin; PT) 및 그 파생물, 예를 들어 PT로부터 세포 접착 도메인을 제거한 외독소 A, 디프테리아 독소(Diphtheria toxin: DT) 및 그 파생물, 리신(Ricin) 및 그 파생물을 들 수 있다(Brinkmann U. & Pastan I., 1994, Biochimica et Biophysica Acta, 1198(1): 27-45). 녹농균 외독소 A는 암세포 내에 수용된 후 EF-2를 ADP 리보실화하여 불활성화함으로써 단백질 합성을 저해하여 강한 살세포 효과를 발휘한다는 것이 알려져 있다. 상기 단일쇄 항체에 외독소가 연결된 융합 단백질은 이뮤노톡신(면역 독소)으로서 기능할 수 있다.

1-2-2. 발현 카세트의 구성

본 명세서에서 「발현 카세트」란 상기 융합 유전자를 포함하고 이를 융합 단백질로서 발현 가능한 상태로 할 수 있는 발현 시스템을 말한다. 본 명세서에서 「발현 가능한 상태」란 상기 발현 카세트에 포함되는 융합 유전자가 재조합 세균 내에서 발현 가능하도록 유전자 발현에 필요한 엘리먼트의 제어하에 배치되어 있는 상태를 말한다. 유전자 발현에 필요한 엘리먼트에는 프로모터 및 터미네이터를 들 수 있다.

프로모터는 재조합 세균 내에서 작동 가능한 프로모터라면 특별히 제한하지는 않지만, 사용하는 편성 혐기성 그램 양성균 유래의 프로모터가 바람직하다. 예를 들어 편성 혐기성 그램 양성균에 비피더스균의 B.롱검을 사용하는 경우에는 B.롱검의 hup 유전자 프로모터(서열 번호 25)를 들 수 있다. 또한, 프로모터로는 그 발현 제어의 성질에 따라 과잉 발현형 프로모터, 구성적 프로모터, 부위 특이적 프로모터, 단계 특이적 프로모터 또는 유도성 프로모터 등이 알려져 있다. 본 발명에서의 발현 카세트에 사용하는 프로모터가 어떤 프로모터일지는 특별히 한정되지는 않는다. 필요에 따라 적절히 선택하면 된다. 바람직하게는 과잉 발현형 프로모터 또는 구성적 프로모터이다. 상기 발현 카세트에서 프로모터는 상기 융합 유전자의 개시 코돈보다 상류의 5'측에 배치된다.

터미네이터는 재조합 세균 내에서 상기 프로모터에 의해 전사된 유전자의 전사를 종결할 수 있는 서열이면 특별히 한정되지는 않는다. 예를 들어 히스톤형 단백질 터미네이터(HUT)(서열 번호 26)를 들 수 있다. 바람직하게는 프로모터와 동일 생물종 유래의 터미네이터이며, 보다 바람직하게는 프로모터가 유래하는 생물종의 게놈 상에서 그 프로모터와 세트를 이루고 있는 터미네이터이다. 상기 발현 카세트에서 터미네이터는 상기 융합 유전자의 종지 코돈보다 하류의 3'측에 배치된다.

상기 융합 단백질을 재조합 세균 내에서 안정적으로 발현시키기 위해 발현 카세트를 포함하는 벡터를 발현 벡터로 하여 동일 균체 내에 도입할 수 있다. 또는 상동성 재조합을 통해 동일 균의 게놈 내에 삽입해도 된다. 발현 벡터를 사용하는 경우, 벡터로는 플라스미드 등을 사용할 수 있다. 벡터는 본 발명의 재조합 세균 내에서 복제 가능하며 균체 내에서 안정적으로 유지되는 적당한 선발 마커 유전자를 포함하는 것을 이용한다. 벡터는 대장균 등의 다른 세균 내에서도 복제 가능한 셔틀 벡터이어도 된다. 예를 들어 pKKT427, pBESAF2, pPSAB1 등을 들 수 있다. 재조합 세균의 게놈 내에 삽입하는 경우, 융합 유전자만을 재조합 세균의 게놈 중에 발현 가능한 상태가 되도록 삽입해도 된다. 즉, 재조합 세균의 내재성 프로모터나 터미네이터의 제어 하에 융합 유전자를 삽입해도 된다.

발현 카세트는 하나의 발현 카세트 내에 하나의 융합 유전자를 포함하는 모노시스트로닉이어도 되고, 2개 이상의 융합 유전자를 포함하는 폴리시스트로닉이어도 된다.

1-3. 재조합 편성 혐기성 그램 양성균의 제조 방법

본 발명의 재조합 세균은 해당 분야에서 공지의 분자 유전학적 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어 상기 융합 유전자이면 시그널 펩티드 및 단일쇄 항체를 각각 코딩하는 핵산을 예를 들어 Green and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed(2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press나 Ausubelet al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Ed., A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995), John Wiley & Sons에 기재된 수법을 이용하여 구축하면 된다.

상기 단일쇄 항체를 취득하는 데에 TRAIL-R1 또는 TRAIL-R2에 결합하는 항체를 코딩하는 유전자의 염기 서열 정보를 사용할 수 있다. 이 항체의 염기 서열 정보는 예를 들어 전술한 CDR 및 FR의 염기 서열에 기초해도 된다.

TRAIL-R1 또는 TRAIL-R2에 대한 항체를 새로 제작하는 경우 이들에 대한 모노클로날 항체의 제작은 해당 분야에서 공지의 방법에 따라 행하면 된다. 이하에 그 제작예를 나타낸다.

표적으로 하는 TRAIL-R1 또는 TRAIL-R2의 세포외 도메인을 면역원으로 하여 낙타과 동물에 투여하여 면역한다. 필요하다면 면역을 효과적으로 행하기 위해 아쥬반트를 첨가해도 된다. 아쥬반트의 예로서는 시판의 완전 프로인트 아쥬반트(FCA), 불완전 프로인트 아쥬반트(FIA) 등을 들 수 있고, 이들을 단독으로 또는 혼합하여 이용할 수 있다. 면역원 용액의 1회 투여량은 상기 동물 1마리당 약 50~200μg의 면역원을 포함하고 있으면 된다. 면역 간격은 특별히 한정되지 않고, 첫회 면역 후 수일에서 수주간 간격으로, 바람직하게는 1~4주간 간격으로 2~10회, 바람직하게는 5~7회 추가 면역을 행한다. 첫회 면역 후 면역 동물의 혈청 중의 항체값 측정을 ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)법 등에 의해 반복하여 행한다. 계속해서 면역된 동물로부터 항체 생산 세포를 채취한다. 항체 생산 세포로는 비장 세포, 림프절 세포, 말초혈 세포 등을 들 수 있지만, 말초혈 세포가 바람직하다. 다음으로 말초혈 세포로부터 RNA를 추출하고 올리고 dT 프라이머 및 랜덤 6mer 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성한다. 이 cDNA로부터 낙타과 1개쇄 항체의 가변 영역(V_HH 영역)의 유전자를 PCR에 의해 증폭하고, pCANTAB6(McCafferty J., et al., 1994, Appl. Biochem. Biotech., 47, 157-173) 등의 파지미드 벡터에 상기 유전자를 편입시켜 일렉트로포레이션법으로 대장균 TG1에 도입한다. 상기 대장균 TG1에 M13K07 헬퍼 파지를 감염시키고 파지를 회수함으로써 낙타과 1개쇄 항체 가변 영역(V_HH 영역) 발현 파지 라이브러리를 취득한다. 표준적으로는 1×10⁷pfu종 이상의 라이브러리가 된다.

표적 항원에 대한 항체를 발현하는 파지를 선별하려면 바이오 패닝을 행한다. 이는 고정화된 표적 항원에 항체 파지 라이브러리를 반응시켜 결합하지 않은 파지를 세정에 의해 제거한 후에, 결합한 파지를 용출하여 대장균에 감염시켜 증식시키는 조작을 3회에서 5회 행함으로써 표적 항원에 특이적인 파지를 농축하는 방법이다. 패닝한 파지를 대장균 TG1에 재감염시킨 후, V_HH 삽입 pCANTAB 파지미드 벡터를 포함하는 TG1 클론을 단리하고, 개개의 TG1 클론에 KO7 헬퍼 파지를 감염시켜 V_HH 항체를 제시한 클론화 파지를 얻는다. 이들 중에서 항원에 반응하는 클론을 선택한다. 취득한 파지로부터 항체의 염기 서열을 얻을 수 있다.

융합 유전자는 발현 가능하도록 상기 발현 카세트 내에 분자 유전학적 방법을 이용하여 삽입된다. 발현 카세트는 필요에 따라 예를 들어 플라스미드 등의 벡터에 편입시킨다. 벡터에 발현 카세트를 편입시키려면 발현 카세트의 5'말단 및 3'말단을 적당한 제한 효소로 절단하여 벡터 내의 멀티 클로닝 사이트 등의 대응하는 제한 부위에 삽입하는 방법 등을 채용할 수 있다. 또한, 벡터가 본 발명의 재조합 세균 내에서 발현 가능한 발현용 벡터인 경우, 상기 융합 유전자를 그 발현용 벡터의 발현 제어 영역 내(벡터 내의 프로모터 및 터미네이터 간의 멀티 클로닝 부위 등)에 삽입함으로써 발현 카세트를 구축함과 동시에 목적의 발현 벡터를 구축하는 것도 가능하다. 이들 구체적인 방법에 대해서는 예를 들어 상기 Green and Sambrook(2012)에 기재된 방법을 참조하기 바란다.

목적의 재조합 세균은 상기 발현 벡터, 발현 카세트 또는 융합 유전자를 약제 송달용 담체인 편성 혐기성 그램 양성균에 도입함으로써 제조할 수 있다. 발현 벡터 등을 목적의 편성 혐기성 그램 양성균 내에 도입하는 방법은 해당 분야에서 공지의 분자 생물학적 방법을 이용하면 된다. 예를 들어 전기 천공법(일렉트로포레이션법)이나 인산 칼슘법의 공지의 방법을 이용할 수 있다. 이들 구체적인 방법에 대해서는 예를 들어 상기 Green and Sambrook(2012)에 기재된 방법을 참조하기 바란다.

2. 항종양제

2-1. 개요

본 발명의 제2 태양은 항종양제이다. 본 발명에서 「항종양제」란 종양 세포에 대해 세포 상해 활성을 가지며 그 세포를 아포토시스에 이르게 하여 그 결과 종양 세포의 증식을 억제할 수 있는 약제를 말한다. 단, 그 약효는 종양 세포의 증식을 억제할 수 있으면 되고 종양 세포를 근절시키지 않아도 된다.

본 발명의 항종양제는 제1 태양의 재조합 세균을 유효 성분으로 하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 항종양제에 따르면 유효 성분인 재조합 세균이 종양 내에서만 증식하고, 종양 내에서 3개 이상의 항TRAIL-R1 단일쇄 항체 및/또는 3개 이상의 항TRAIL-R2 단일쇄 항체를 분비함으로써 효율적으로 종양에서의 아포토시스를 유도하여 종양을 퇴축시킬 수 있다.

2-2. 구성

본 발명의 항종양제는 전술한 바와 같이 제1 태양의 재조합 세균을 유효 성분으로 한다. 이 경우의 재조합 세균은 융합 유전자가 표적 세포인 종양 세포의 표면 항원의 일종인 TRAIL-R1을 인식하여 결합하는 단일쇄 항체 및/또는 TRAIL-R2를 인식하여 결합하는 단일쇄 항체를 코딩하고 있다. 따라서, 본 발명의 항종양제의 유효 성분인 재조합 세균은 세포외 분비성 항종양 세포 융합 단백질을 분비하게 된다.

본 발명의 항종양제의 표적이 되는 종양은 TRAIL-R1 및/또는 TRAIL-R2를 발현하는 것이면 양성, 악성을 불문하고 어떤 종양이어도 된다. 예를 들어 뇌종양, 갑상선암, 구강암, 식도암, 위암, 대장암, 인두암, 폐암, 간암, 신장암, 부신암, 췌장암, 담관암, 자궁경암, 자궁체암, 난소암, 유방암, 전립선암, 방광암, 선유육종, 비만세포종 또는 멜라노마를 표적 종양으로서 들 수 있다.

본 발명의 재조합 세균이 융합 유전자를 발현한 경우 그 산물인 세포외 분비성 항종양 세포 융합 단백질은 세포 외에 분비된다. 분비된 융합 단백질은 단일쇄 항체 부분에서 표적 물질인 종양 세포에 결합하여 TRAIL-R1 및/또는 TRAIL-R2를 다량체화함으로써 아포토시스를 유도한다.

본 발명의 유효 성분인 재조합 세균은 항종양제에서 생균 상태로 포함된다. 본 발명의 제1 태양에 기재된 재조합 세균은 고농도의 산소 존재 하에서는 증식하지 못하고 곧 사멸한다. 따라서, 생체 내에서는 산소 분압이 낮은 부위에서만 증식, 생존이 가능하다. 이러한 부위의 대표적인 예로서 진행암으로 보여지는 종양(고형암)의 중심 부위 또는 장관 내를 들 수 있다. 그러므로, 본 발명의 항종양제는 주사 등에 의해 체내 투여한 경우 종양 선택적 송달성이 높은 항종양제가 될 수 있다.

또한, 본 발명의 항종양제는 유효 성분인 재조합 세균의 생존, 증식, 융합 단백질의 발현 및 분비를 저해 또는 억제하지 않는 범위에서 다른 항종양제와 병용할 수 있다.

본 발명의 항종양제는 재조합 세균을 생균 상태로 유지 또는 보존하는 것을 전제로 하여 원칙적으로 해당 분야에서 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences(Merck Publishing Co., Easton, Pa.)에 기재된 방법을 이용하면 된다. 구체적인 제제화 방법은 투여 방법에 따라 다르다. 투여 방법은 크게 경구 투여와 비경구 투여로 나누어지는데 본 발명의 항종양제의 경우 비경구 투여가 보다 바람직하다.

본 발명의 항종양제를 비경구 투여하는 경우 그 구체예로서는 주사에 의한 투여를 들 수 있다. 본 발명의 항종양제를 주사로 투여하는 경우 재조합 세균을 제약상 허용 가능한 용매와 혼합하고 필요에 따라 제약상 허용 가능한 담체를 더한 현탁액제로서 조제할 수 있다.

「제약상 허용 가능한 용매」는 물 혹은 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 수용액 또는 유성액 중 어느 것이어도 된다. 수용액으로서는 예를 들어 생리식염수, 포도당이나 기타 보조제를 포함하는 등장액을 들 수 있다. 보조제로서는 예를 들어 D-솔비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨, 그 밖에도 저농도의 비이온성 계면활성제(예를 들어 폴리소르베이트 80(TM), HCO-60), 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르류 등을 들 수 있다. 유성액으로서는 참기름, 콩기름을 들 수 있고, 용해 보조제로서 안식향산 벤질 또는 벤질알코올과 병용할 수도 있다. 또한, 완충제, 예를 들어 인산염 완충액, 아세트산 나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들어 염산 프로카인, 안정제, 예를 들어 벤질알코올, 페놀, 산화방지제와 배합해도 된다.

주사제는 제약상 허용되는 부형제, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, pH조절제 등과 적절히 조합하여 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화함으로써 제제화하면 된다.

주사는 예를 들어 혈관 내 주사, 임파관 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하 주사 등을 들 수 있는데 본 발명의 항종양제의 유효 성분인 재조합 세균이 종양 내에서 증식하여 그 종양 세포의 증식을 억제한다는 메커니즘으로 인해 종양소(巢)의 위치가 명확하지 않은 경우에는 전신 투여인 혈관 내 주사 또는 임파관 내 주사 등의 순환기 내 투여가 바람직하다. 혈관 내 주사에는 정맥 내 주사 및 동맥 내 주사 등이 있는데 본 발명의 항종양제를 투여하는 경우 어느 것이어도 된다. 한편, 종양소의 위치가 확정되어 있는 경우에는 상기 전신 투여 외에 종양에 직접적으로 투여하는 국소 투여이어도 된다.

본 발명의 항종양제를 경구 투여하는 경우에 대해서는 유효 성분인 재조합 세균에 더하여 제약상 허용 가능한 담체를 첨가해도 된다.

「제약상 허용 가능한 담체」란 약제의 제제화나 생체에의 적용을 용이하게 하고 유효 성분인 재조합 세균의 생존을 유지하기 위해 그 균체의 작용을 저해 또는 억제하지 않는 범위에서 첨가되는 물질을 말한다. 예를 들어 부형제, 결합제, 붕괴제, 충전제, 유화제, 유동 첨가 조절제 또는 윤활택제를 들 수 있다.

「부형제」로서는 예를 들어 단당, 이당류, 시클로덱스트린 및 다당류와 같은 당(구체적으로 한정되지는 않지만, 글루코오스, 수크로오스, 락토오스, 라피노스, 만니톨, 솔비톨, 이노시톨, 덱스트린, 말토덱스트린, 전분 및 셀룰로오스를 포함함), 금속염(예를 들어 인산 나트륨 혹은 인산 칼슘, 황산 칼슘, 황산 마그네슘), 구연산, 주석산, 글리신, 저, 중, 고분자량의 폴리에틸렌글리콜(PEG), 플루로닉 혹은 이들의 조합을 들 수 있다.

「결합제」로서는 예를 들어 옥수수, 밀, 쌀 혹은 감자의 전분을 이용한 전분풀, 젤라틴, 트래거캔스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨 및/또는 폴리비닐피롤리돈 등을 들 수 있다.

「붕괴제」로서는 예를 들어 상기 전분이나 카르복시메틸 전분, 가교 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 혹은 알긴산 나트륨 또는 이들의 염을 들 수 있다.

「충전제」로서는 예를 들어 상기 당 및/또는 인산 칼슘(예를 들어 인산 삼칼슘 혹은 인산 수소 칼슘)을 들 수 있다.

「유화제」로서는 예를 들어 솔비탄 지방산 에스테르, 글리세린 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르, 프로필렌글리콜 지방산 에스테르를 들 수 있다.

「유동 첨가 조절제」 및 「활택제」로서는 예를 들어 규산염, 탈크, 스테아린산염 또는 폴리에틸렌글리콜을 들 수 있다.

그 밖에 필요에 따라 교미교취제, 현탁제, 희석제, 계면활성제, 증량제, 부습제, 보습제(예를 들어 글리세린, 전분 등), 흡착제(예를 들어 전분, 유당, 카올린, 벤토나이트, 콜로이드형 규산 등), 붕괴 억제제(예를 들어 백설탕, 스테아린, 카카오 버터, 수소 첨가유 등), 코팅제, 착색제, 보존제, 항산화제, 향료, 풍미제, 감미제, 완충제 등을 포함할 수도 있다. 상기와 같은 담체를 하나 또는 2개 이상, 필요에 따라 적절히 사용하면 된다.

경구 백신제의 제형으로서는 예를 들어 고형제(정제, 환제, 설하제(舌下劑), 캡슐제, 드롭제를 포함함), 과립제, 분제, 산제, 액제 등을 들 수 있다. 나아가 고형제는 필요에 따라 해당 분야에서 공지의 제피(劑皮)를 입힌 제형, 예를 들어 당의정, 젤라틴 피포정, 장용정(腸溶錠), 필름 코팅정, 이중정, 다층정으로 할 수 있다. 제형의 구체적인 형상, 크기에 대해서는 모두 각각의 제형에서 해당 분야에서 공지의 제형 범위 내에 있으면 되고 특별히 한정되지는 않는다.

본 발명의 항종양제에서의 재조합 세균의 함유량은 원칙 1회의 투여로 그 균체가 표적의 종양에 생존하면서 증식 가능한 상태에 도달할 수 있는 양이며, 또한 이를 적용하는 피검체에 대해 유해한 부작용을 거의 또는 전혀 부여하지 않는 양이면 된다. 이러한 함유량은 항종양제의 표적 세포의 종류, 암의 진행도, 종양의 크기, 전신의 종양소수, 항종양제의 제형 및 투여 방법에 따라 다르기 때문에 각각의 조건을 감안하여 적절히 정할 수 있다.

본 명세서의 항종양제의 투여 대상은 종양을 가지거나 그 개연성이 높은 피검체이다. 본 명세서에서 「피검체」란 본 발명의 항종양제를 적용하는 동물을 말한다. 예를 들어 포유동물, 바람직하게는 인간, 개, 고양이, 말, 마우스, 래트, 토끼, 소, 원숭이 등, 보다 바람직하게는 인간이다.

2-3. 효과

본 발명의 항종양제에 따르면 유효 성분인 재조합 세균이 산소 분압이 낮은 종양 내에서만 생존 및 증식하여 항종양 세포 융합 단백질을 분비한다. 따라서, 이러한 융합 단백질을 종양 세포에까지 효율적으로 전달하고 또한 계속적으로 작용시킬 수 있다. 또한, 융합 단백질의 작용에 의해 종양 세포의 증식이 억제되어 종양이 퇴축함으로써 조직 중의 산소 분압이 높아지면 편성 혐기성 그램 양성균인 재조합 세균은 생존 불가능해지므로 생체 내로부터 자동으로 배제할 수 있다. 이에 의해, 종래의 세균 요법과 비교하여 고형암에 대해 비병원성인 편성 혐기성 균으로 다른 항종양 약을 투여하지 않고 단독의 정맥 내 투여에 의해 항종양 효과를 발휘할 수 있는 안전하면서 간편한 치료법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 항종양제는 정맥 내 주사가 가능하기 때문에 피검체에 부여하는 침습성도 낮다는 이점을 가진다.

3. 종양 검출용 마커

3-1. 개요

본 발명의 제3 태양은 종양 검출용 마커이다. 본 발명에서 「종양 검출용 마커」란 생체 내에서 종양을 검출할 수 있는 마커이다.

본 발명의 종양 검출용 마커는 제1 태양의 재조합 세균을 유효 성분으로 하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 종양 검출용 마커에 의하면 유효 성분인 재조합 세균이 종양 내에서만 증식하고 종양 내에서 효소, 형광 단백질 또는 발광 단백질을 분비함으로써 생체 내에서의 종양의 위치나 크기를 모니터링할 수 있다.

3-2. 구성

기본적인 구성은 제2 태양의 항종양제에 준한다. 그래서, 여기서는 주로 상기 항종양제와 다른 점에 대해 설명하고, 중복되는 구성에 대해서는 원칙적으로 생략한다.

본 발명의 종양 검출용 마커는 전술한 바와 같이 제1 태양의 재조합 세균을 유효 성분으로 한다. 이 경우의 재조합 세균은 융합 유전자가 표적 세포인 종양 세포의 표면 항원을 인식하여 결합하는 단일쇄 항체를 코딩하고, 기능성 펩티드가 표지 단백질 또는 표지화를 유도하는 단백질을 코딩한다. 표지 단백질로서는 예를 들어 전술한 형광 단백질 또는 발광 단백질을 들 수 있다. 또한, 표지화를 유도하는 단백질로서는 루시페린이나 루미놀과 같은 발광소 또는 형광소를 기질로 하는 효소(루시페라아제나 퍼옥시다아제)를 들 수 있다. 따라서, 본 발명의 종양 검출용 마커의 유효 성분인 재조합 세균은 세포외 분비성 항종양 세포 이뮤노마커(면역 표지자)를 분비하게 된다.

본 발명의 재조합 세균이 융합 유전자를 발현한 경우 그 산물인 세포외 분비성 항종양 세포 이뮤노마커는 세포 외로 분비된다. 분비된 이뮤노마커는 단일쇄 항체 부분에서 표적 물질인 종양 세포의 세포막 상의 TRAIL-R1 또는 TRAIL-R2에 결합하고, 그 세포는 표지화된다. 구체적으로 기능성 펩티드가 발광 단백질 또는 형광 단백질과 같은 표지 단백질인 경우 단일쇄 항체 부분과 연결된 이들의 표지 단백질에 의해 종양 세포가 직접 표지화된다. 한편, 기능성 펩티드가 효소인 경우 단일쇄 항체 부분과 연결된 효소에 의해 종양 세포가 효소 표지된다.

본 발명의 종양 검출용 마커는 제2 태양의 항종양제와 병용할 수 있다. 이 경우 유효 성분인 재조합 세균이 종양 검출용 마커와 항종양제를 각각 독립된 분자로서 분비하는, 즉 동일 표적 물질을 인식하는 단일쇄 항체를 포함하는 다른 융합 단백질을 분비하는 동일하거나 다른 재조합 세균이어도 되고, 기능성 단백질 부분에 외독소와 표지 단백질 또는 효소를 포함하는 하나의 융합 단백질을 분비하는 재조합 세균이어도 된다. 이러한 경우 동일한 종양 세포를 표지화함과 동시에 외독소의 작용에 의해 종양 세포를 상해하는 것이 가능해진다.

또한, 유효 성분인 재조합 세균의 생존, 증식, 이뮤노마커의 발현 및 분비를 저해 또는 억제하지 않는 범위에서 다른 항종양제와 병용할 수도 있다.

3-3. 검출

본 발명의 종양 검출용 마커를 피검체에 투여한 경우 그 개체가 종양을 가지고 있으면 유효 성분인 재조합 세균이 그 종양 내에서 증식하여 항종양 세포 이뮤노마커가 분비된다. 분비된 이뮤노마커는 종양 세포를 표지화한다. 표지화된 종양 세포의 검출은 이뮤노마커가 발광 단백질 또는 형광 단백질과 같은 표지 단백질인 경우에는 그 표지 단백질 자신이 발하는 발광 또는 형광을, 또한 효소 표지인 경우에는 생체 내에 투여된 루시페린 등 기질의 효소 반응에 의한 발광 또는 형광을 검출하면 된다. 이뮤노마커의 검출 방법은 특별히 한정되지는 않는다. 종양의 대부분은 생체 내부에 존재하기 때문에 개복 등의 수술에 의해 종양을 노출시킨 후에 이뮤노마커를 검출해도 되고, 생체 내의 발광 또는 형광을 체외로부터 비침습적으로 검출해도 된다. 바람직하게는 체외로부터 검출하는 방법이다. 이뮤노마커 유래의 발광 또는 형광을 체외로부터 검출하는 방법으로서는 한정하지 않지만, 예를 들어 in vivo 바이오 이미징법을 이용할 수 있다. 예를 들어 Katz, M.H. et al., 2003, Cancer Res. 63: 5521-5525, Schmitt, C.A. et al., 2002, Cancer Cell, 1: 289-298, Katz, M.H. et al., 2003, J. Surg. Res., 113: 151-160 등에 기재된 방법을 이용하여 검출할 수 있다. 시판의 IVIS Imaging System(Caliper)이나 이와 유사한 장치에 의해 검출해도 된다.

3-4. 효과

본 발명의 종양 검출용 마커에 의하면 생체 내 종양의 위치 및 크기를 이뮤노마커에 기초하여 생체 외부로부터 모니터링할 수 있다. 또한, 본 발명의 종양 검출용 마커와 제2 태양의 항종양제를 병용함으로써 이뮤노톡신에 의해 종양 세포의 증식을 억제시킴과 동시에 이뮤노마커에 의해 생체 내 종양을 생체 외부로부터 검출함으로써 종양의 퇴축이나 치유 효과를 경시적으로 모니터링하는 것이 가능해진다.

실시예

<실시예 1: 비피더스균 발현용 항인간 TRAIL-R2 유전자 발현 카세트의 제작>

(1) 비피더스균 발현용 항hTRAIL-R2 VHH 항체 4량체(4E6 테트라머)의 유전자 발현 카세트

B.롱검 hup 유전자 유래의 프로모터 영역(서열 번호 25), B.롱검 유래의 usp 분비 시그널 서열(서열 번호 29), DTY(시그널 서열 후 삽입 서열), WO/2011/098520에 기재된 4E6의 아미노산 서열, 8C7 EGFP 유전자 유래의 (GGSGG)₂ 링커 펩티드(서열 번호 28) 및 히스톤형 단백질 유래의 터미네이터(HUT)(서열 번호 26)를 이용하여 C말단에는 His-Tag 서열을 코딩하는 DNA를 부가한 유전자를 DNA 합성하였다(서열 번호 1).

(2) 비피더스균 발현용 항hTRAIL-R2 VHH 항체 다이머 녹농균 외독소 A서브유닛 융합체(4E6 다이머 Toxin)의 유전자 발현 카세트

B.롱검 hup 유전자 유래의 프로모터 영역(서열 번호 25), B.롱검 유래의 usp 분비 시그널 서열(서열 번호 29), DTY(시그널 서열 후 삽입 서열), WO/2011/098520에 기재된 4E6의 아미노산 서열, 8C7 EGFP 유전자 유래의 (GGSGG)₂ 링커 펩티드(서열 번호 28), 녹농균 외독소 A(pJH8(ATCC로부터 구입)에 코딩되는 ExotoxinA의 DNA 서열) 및 히스톤형 단백질 유래의 터미네이터(HUT)(서열 번호 26)를 이용하여 C말단에는 His-Tag 서열을 코딩하는 DNA를 부가한 유전자를 DNA 합성하였다(서열 번호 2).

(3) 비피더스균 발현용 항hTRAIL-R2 VHH 항체 다이머 녹색 형광 단백질 융합체(4E6 다이머 EGFP)의 유전자 발현 카세트

B.롱검 hup 유전자 유래의 프로모터 영역(서열 번호 25), B.롱검 유래의 usp 분비 시그널 서열(서열 번호 29), DTY(시그널 서열 후 삽입 서열) 및 히스톤형 단백질 유래의 터미네이터(HUT)(서열 번호 26)를 이용하여 4E6 다이머 유전자의 3'말단에 8C7 EGFP 유전자 유래의 (GGSGG)₂ 링커 펩티드(서열 번호 28)+EGFP(Zhang G. et al., 1996, Biochem Biophys Res Commun, 227(3): 707-711) 유전자+His-Tag 서열을 코딩하는 DNA 서열을 부가하였다(서열 번호 3).

<실시예 2: hTRAIL-R1:Fc, hTRAIL-R2:Fc, mTRAIL-R2:Fc 분비 발현 초파리 배양 세포의 제작과 재조합 단백질의 정제>

(1) 유전자 발현 카세트의 제작

(1-1) 초파리 배양 세포 발현용 인간 TRAIL-R1: 알파카 Fc(hTRAIL-R1:Fc)의 유전자 발현 카세트

KpnI 사이트, 번역 개시 컨센서스 서열(Cavener D.R., 1987, Nucleic Acids Res. 15, 1353-1361), Bip 분비 시그널(Life Technologies), hTRAIL-R1 세포외 영역(Accession No.AAC51226, 109~239아미노산), IEGRMD 링커(서열 번호 27), Lama pacos(alpaca) IgG1 Fc(Accession No.AM773729, 102~335아미노산), His-Tag 서열, 종지 코돈, XhoI 사이트로 구성되는 DNA를 합성하였다(서열 번호 4).

(1-2) 초파리 배양 세포 발현용 인간 TRAIL-R2: 알파카 Fc(hTRAIL-R2: Fc)의 유전자 발현 카세트

KpnI 사이트, 번역 개시 컨센서스 서열(Cavener D.R., 1987, Nucleic Acids Res. 15, 1353-1361), Bip 분비 시그널(Life Technologies), hTRAIL-R2 세포외 영역(Accession No.Q6FH58, 54~182아미노산), IEGRMD 링커(서열 번호 27), Lama pacos(alpaca) IgG1 Fc(Accession No.AM773729, 102~335아미노산), His-Tag 서열, 종지 코돈, XhoI 사이트로 구성되는 DNA를 합성하였다(서열 번호 5).

(1-3) 초파리 배양 세포 발현용 마우스 TRAIL-R2: 알파카 Fc(mTRAIL-R2: Fc)의 유전자 발현 카세트

KpnI 사이트, 번역 개시 컨센서스 서열(Cavener D.R., 1987, Nucleic Acids Res. 15, 1353-1361), Bip 분비 시그널(Life Technologies), mTRAIL-R2 세포외 영역(Accession No.Q9QZM4, 52~177아미노산), IEGRMD 링커(서열 번호 27), Lama pacos(alpaca) IgG1 Fc(Accession No.AM773729, 102~335아미노산), His-Tag 서열, 종지 코돈, XhoI 사이트로 구성되는 DNA를 합성하였다(서열 번호 6).

(2) hTRAIL-R1: Fc, hTRAIL-R2: Fc, mTRAIL-R2: Fc 분비 발현 초파리 배양 세포의 제작과 재조합 단백질의 정제

hTRAIL-R1, hTRAIL-R2, mTRAIL-R2의 세포외 영역과 알파카 IgG1의 Fc를 융합한 단백질을 얻기 위해 이들 재조합 단백질을 초파리 배양 세포인 S2세포로 분비 발현하는 벡터, pAc5.1/hTRAIL-R1 Fc, pAc5.1/hTRAIL-R2 Fc, pAc5.1/mTRAIL-R2 Fc를 작성하였다. pAc5.1/V5-HisA 플라스미드(Life Technologies)의 KpnI, XhoI 사이트에 재조합 단백질의 S2분비 발현 유전자 카세트를 삽입하였다. 인산 칼슘법에 의해 하이그로마이신 내성 유전자를 포함하는 pCoHygro 플라스미드(Life Technologies)와 19:1의 비로 S2세포에 도입하였다. 세포는 300μg/mL 하이그로마이신(Life Technologies), 10% 소 태아 혈청(Tissue Culture Biologicals)을 포함하는 Schneider's Drosophila Medium(Life Technologies)으로 배양하여 약제 내성 세포를 얻었다. 약제 내성 세포(1×10⁷ 세포/mL)는 20mM 글루타민을 포함하는 EXPRESS FIVE SFM(Life Technologies)으로 배양하여 7일째에 배양 상청을 회수하였다. 재조합 단백질은 TALON 레진(다카라 바이오)을 이용하여 정제하였다. 구체적으로는 TALON 레진을 충전한 칼럼에 배양 상청을 첨가 후, 세정 버퍼(25mM HEPES pH 7.4, 0.3M NaCl, 5mM 이미다졸)로 세정하고 용출 버퍼(25mM HEPES pH 7.4, 0.3M NaCl, 150mM 이미다졸)로 재조합 단백질을 용출하였다. 정제 단백질은 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동하고, Coomassie Brilliant Blue(CBB) R-250(Bio-Rad)으로 염색하여 각 단백질의 정제를 확인하였다(도 4).

<실시예 3: E. coli BL21(DE3)에서의 재조합 4E6 모노머 단백질의 발현·정제 및 결합 활성>

(1) 대장균 발현용 항hTRAIL-R2 VHH 항체/Myc-Tag(4E6 모노머) 유전자 발현 카세트의 제작

WO/2011/098520에 기재된 4E6 VHH 모노머의 아미노산 서열 정보를 기초로 대장균 발현용 유전자를 DNA 합성하였다(서열 번호 7).

(2) 4E6 모노머의 대장균에 의한 발현·정제

4E6 모노머를 발현하는 벡터는 pET22b(+)의 NdeI와 NotI 부위에 삽입하였다. E.coli BL21Star™(DE3) One Shot(Life technologies)에 본 발현 벡터 플라스미드 DNA를 도입하였다. 부속 매뉴얼에 따라 재조합 대장균을 100mL의 100μg/mL 암피실린(시그마 알드리치)이 들어간 2YT 배지를 이용하여 37℃에서 배양하고, OD₆₀₀=0.4~0.5에 이르렀을 때에 0.5mM IPTG(이소프로필-β-티오갈락토피라노시드, 다카라 바이오)를 첨가하여 30℃에서 3시간 배양하였다. 배양 종료 후, 대장균을 회수하여 10mL의 추출 버퍼(50mM Na Phosphate pH 7.8, 300mM NaCl, EDTA-Free protease inhibitor cocktail(Roche))에 재현탁하였다. 얼음 중에서 Sonifier 250(Branson)을 이용하여 Output Control 2, Duty cycle 80%의 조건으로 초음파 처리를 1분간 2회 행하여 균체를 파쇄하였다. 처리 후의 현탁액을 15000rpm으로 4℃에서 20분 원심하여 상청을 회수하였다. 융합 단백질의 정제는 His Trap 칼럼(GE Healthcare UK)을 이용하였다. 초음파 처리 현탁액의 원심 상청을 그대로 His Trap 칼럼에 걸고 결합 버퍼(20mM 인산 나트륨, 0.5M NaCl, 20mM Imidazole pH 7.4)로 칼럼을 세정한 후, 500mM Imidazole을 포함하는 용출액으로 융합 단백질을 용출시켰다. 정제 샘플을 15% 아크릴아미드 SDS 전기 영동에 제공하고 CBB로 염색하여 약 15KDa로 정제된 4E6 모노머 단백질을 확인하고, BSA(소 혈청 알부민 단백질)의 염색과 비교하여 4E6 모노머의 농도를 산출하였다. 그 결과, 4E6 모노머의 농도는 ~3μg/μl이었다(도 5).

(3) ELISA에 의한 4E6 모노머의 hTRAIL-R2: Fc 항원에의 결합 활성의 확인

hTRAIL-R2: Fc는 실시예 2와 같이 조제하였다. 96 웰 이뮤노플레이트(Nunc)에 50μL/웰로 0.1M NaHCO₃(Blank), 또는 1μg/mL 혹은 10μg/mL의 BSA를 포함하는 0.1M NaHCO₃(BSA 음성 항원), 또는 1μg/mL 혹은 10μg/mL의 hTRAIL-R2: Fc를 포함하는 0.1M NaHCO₃를 첨가하여 4℃에서 하룻밤 두었다. 여기에 350μL/웰의 SuperBlock-PBS(서모 사이언티픽)를 더하고 실온에서 1시간 방치하였다. 400μL/웰의 PBS-T(0.05% Tween20을 포함하는 인산 완충 생리식염수)로 세정 후, 40μL/웰, 1μg/mL의 4E6 모노머를 포함하는 SuperBlock-PBS를 더하고 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시 400μL/웰의 PBS-T로 3회 세정하고, 40μL/웰의 SuperBlock-PBS로 500배 희석한 항Myc 마우스 단일클론성 항체 9E10(Santa Cruz Biotechnology)을 더하여 1시간 실온에서 반응시켰다. 400μL/웰의 PBS-T로 3회 세정하고, 40μL/웰로 항마우스 IgG 염소 항체 HRP를 더하고 1시간 실온에 두었다. 그 후, 400μL/웰의 PBS-T로 3회 세정하고, 50μL/웰로 TMB 시약(와코 순약)을 더하여 10분간 정도 반응시킨 후 0.5M 황산으로 반응을 스톱시켰다. 그 후, 450nm의 흡광도를 측정하고, 트리플리케이트로 행한 측정의 평균값과 표준편차를 산출하였다. 정제한 4E6 모노머 단백질은 hTRAIL-R2: Fc에 특이적으로 결합하였다(도 6).

(4) 4E6 모노머와 hTRAIL-R2 ECD(extracellular domain)의 해리 상수(K_D)의 측정

4E6 모노머와 hTRAIL-R2: Fc(실시예 2 참조)의 결합 친화성을 Biacore X-100(GE 헬스케어)을 이용한 표면 플라즈몬 공명법으로 해석하였다. 측정은 Biacore X-100 부속의 설명서에 따라 멀티사이클 카이네틱스법으로 행하여 4E6 모노머를 0.919nM, 1.838nM, 3.675nM, 7.35nM, 14.7nM, 29.4nM, 58.8nM 및 117.6nM으로 측정하였다.

각 농도에서의 센서 그램 및 피팅 커브를 도 7에 나타낸다. 4E6 모노머와 재조합 인간 TRAIL-R2: Fc 항원의 K_D값은 7.5×10^-11M이었다.

<실시예 4: 신규 항hTRAIL-R1 VHH 항체(4P6 모노머)의 취득>

(1) 신규 항hTRAIL-R1 VHH 항체(4P6 모노머) 유전자의 단리

항TRAIL-R1 VHH 항체는 지금까지 알려지지 않았기 때문에 이하의 방법에 의해 작성하였다. 즉, Maass 등에 의한 문헌(J Immunol Methods., 2007, 324, 13-25)을 참고하여 hTRAIL-R1: 인간 Fc(R&D Systems)에 결합하는 VHH 항체 유전자를 파지 디스플레이법에 의해 단리하였다. 100μg의 hTRAIL-R1: 알파카 Fc를 1~2주 간격으로 알파카에 6회 면역하고 8주 후 백혈구를 회수하고 RNeasy(Qiagen, Venlo, Netherland)을 이용하여 RNA를 추출하였다. 이 RNA로부터 PrimeScriptII 1st strand cDNA synthesis kit(다카라 바이오)에 의해 올리고 dT 프라이머, 랜덤 6 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하였다. VHH 항체 유전자는 PrimeSTAR GXL DNA polymerase(다카라 바이오)에 의해 95℃ 1분을 1사이클, 98℃ 10초, 55℃ 15초, 68℃ 1분을 25사이클로 PCR을 행하여 증폭하였다. 이 증폭 산물에 대해 95℃ 1분을 1사이클, 98℃ 10초, 60℃ 15초, 68℃ 1분을 20사이클로 마찬가지로 PCR을 행하여 항체 유전자를 증폭하였다. PCR에는 프라이머 DNA 서열 1(서열 번호 8) 및 프라이머 DNA 서열 2(서열 번호 9)의 DNA 서열을 가지는 프라이머를 사용하였다. 단리한 항체 유전자의 서열(4P6)은 Big Dye Terminator v3.1(Life Technologies)을 이용하여 사이클 시퀀스법에 의해 결정하였다. 그 결과, 단리한 항체는 CDR1이 서열 번호 22로 나타나는 아미노산 서열을 가지며, CDR2가 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열을 가지며, CDR3이 서열 번호 24로 나타나는 아미노산 서열을 가지고 있었다.

(2) 초파리 배양 세포 발현용 4P6 모노머 유전자 발현 카세트의 제작

KpnI 사이트, 번역 개시 컨센서스 서열(Cavener D.R., 1987, Nucleic Acids Res. 15, 1353-1361), Bip 분비 시그널(Life Technologies), 4P6 유전자, His-Tag 서열, Myc-Tag 서열, 종지 코돈, XhoI 사이트로 구성되는 DNA를 합성하였다.

(3) 항hTRAIL-R1 VHH 항체 모노머(4P6 모노머) 분비 발현 초파리 배양 세포의 제작과 재조합 단백질의 정제

pAc5.1/V5-HisA 플라스미드(Life Technologies)의 KpnI, XhoI 사이트의 사이에 상기 (2)의 유전자 발현 카세트를 삽입함으로써 4P6 모노머를 초파리 배양 세포인 S2세포로 분비 발현하는 벡터, pAc5.1/4P6 모노머를 작성하였다. 이 플라스미드를 인산 칼슘법에 의해 하이그로마이신 내성 유전자를 포함하는 pCoHygro 플라스미드와 19:1의 비로 S2세포에 도입하였다. 세포는 300μg/mL 하이그로마이신(Life Technologies), 10% 소 태아 혈청을 포함하는 Schneider's Drosophila Medium(Life Technologies)로 배양하여 약제 내성 세포를 얻었다. 약제 내성 세포는 20mM 글루타민을 포함하는 EXPRESS FIVE SFM(Life Technologies)으로 배양하여 배양 상청을 얻었다. 4P6 모노머는 HisTrap 칼럼(GE Healthcare)에 의해 정제하였다. 정제 단백질은 12.5% SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동하여 Oriole Fluorescent Gel Stain(Bio-Rad)로 염색하였다(도 8).

<실시예 5: 항hTRAIL-R1 VHH 항체 모노머(4P6 모노머)의 결합 특이성과 hTRAIL-R1의 친화성 측정>

(1) 4P6 모노머 및 4E6 모노머의 ELISA에 의한 결합 특이성 해석

4P6 모노머가 TRAIL-R1에 선택적으로 결합되는 것을 ELISA에 의해 조사하였다. 96웰의 Nunc 이뮤노플레이트(Thermo Scientific)에 0.1M NaHCO₃에 용해한 1μg/mL의 hTRAIL-R1: Fc, hTRAIL-R2: Fc, mTRAIL-R2: Fc(실시예 2 참조), Bovine serum albumin를 50μL 더하고 하룻밤 4℃에 두었다. SuperBlock(TBS) Blocking Buffer(Thermo Scientific)를 300μL 더하고 1시간 실온에 두었다. 각 웰의 용액을 제거한 후, 10μg/mL로 Blocking Buffer에 용해한 4P6 모노머 또는 4E6 모노머를 50μL/웰로 더하고 실온에 1시간 두었다. 0.05% Tween20을 포함하는 PBS로 3회 세정 후, 67ng/mL로 Blocking Buffer에 용해한 9E10 항Myc 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 50μL 더하고 실온에 1시간 두었다. 3회 세정 후, Blocking Buffer에 용해한 항마우스 IgG HRP를 50μL 더하고 1시간 실온에 두었다. 3회 세정 후, TMB 용액(와코 순약)을 50μL 더하고 10분간 실온에 두었다. 0.5M 황산을 50μL 더하고 450nm의 흡광도를 측정하였다. 각 샘플을 2웰씩 해석하여 측정값의 평균값과 오차를 산출하였다. 4P6 모노머는 hTRAIL-R1에, 4E6 모노머는 hTRAIL-R2에 각각 특이적으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다(도 9).

(2) 항hTRAIL-R1 VHH 항체 모노머(4P6 모노머)와 hTRAIL-R1 ECD(extracellular domain)의 해리 상수 측정

4P6 모노머와 재조합 인간 TRAIL-R1 ECD의 결합 친화성을 Biacore X-100(GE Healthcare)을 이용한 표면 플라즈몬 공명법으로 해석하였다. hTRAIL-R1: Fc(hTRAIL-R1: Fc, 실시예 2 참조)를 센서 칩(CM5)에 약 1000RU로 고정하였다. 측정은 Biacore X-100 부속의 설명서에 따라 싱글사이클 카이네틱스법으로 행하여 4P6 모노머를 0.1nM, 0.5nM, 2.5nM, 12.5nM, 62.5nM의 순으로 연속 첨가하여 측정하였다. 센서 그램 및 피팅 커브를 도 10에 나타낸다. K_D값(해리 상수)은 3.4×10^-11M이었다.

(3) 4P6 모노머 및 4E6 모노머의 안타고니스트 활성

4P6 모노머가 암세포의 hTRAIL-R1에 결합하여 세포사를 유도하는 hTRAIL에 대해 안타고니스트 활성을 나타내는지 해석하였다. 인간 대장암 Colo205 세포를 10% 소 태아 혈청(Tissue Culture Biologicals)을 첨가한 RPMI1640 배지(Sigma)에 현탁하고, Falcon 96웰 배양 플레이트(벡톤 디킨슨)에 3×10³cells/50μL 배지/웰로 세포를 더하였다. 하룻밤 배양하여 종농도 100ng/mL의 TRAIL과 4P6 모노머, 항hTRAIL-R2 VHH 항체(4E6 모노머)를 다양한 농도로 포함하는 배지를 50μL씩 첨가하였다. 나아가 하룻밤 배양하여 10μL의 생세포수 측정 시약 SF(나카라이테스크)를 더하고 2시간 배양 후 450nm의 흡광도를 측정하였다. 세포를 더하지 않은 배지만의 웰을 백그라운드로서 뺐다. 세포만의 웰을 100%로 하여 그 상대값을 데이터로 하였다. 각 농도 3웰의 평균값+표준편차로 나타내었다. 도 11에 도시된 바와 같이 4P6 모노머, 4E6 모노머 단독으로는 TRAIL에 의한 세포사를 억제할 수는 없었다. 그러나, 4P6 모노머와 4E6 모노머를 동시에 더하면 용량 의존적으로 세포사를 억제하였다. hTRAIL, 4P6 모노머, 4E6 모노머의 분자량은 거의 같기 때문에 VHH 항체 100ng/mL은 hTRAIL 100ng/mL와 몰 농도가 거의 같다. 이상의 결과로부터 4P6 모노머, 4E6 모노머는 각각 세포 표면의 hTRAIL-R1, hTRAIL-R2에 결합할 뿐만 아니라 안타고니스트로서 작용하는 것이 나타났다.

이상과 같이 hTRAIL-R1에 대해 특이적으로 결합하여 안타고니스트로서도 작용할 수 있는 신규 항체인 4P6을 취득할 수 있었다.

<실시예 6: 4E6 다이머 Toxin, 4E6 다이머 EGFP 및 4E6 테트라머, 재조합 E. coli BL21(DE3)의 제작 및 재조합 단백질의 발현·정제>

(1) 유전자 발현 카세트의 제작

(1-1) 대장균 발현용 항hTRAIL-R2 VHH 항체 다이머 녹농균 외독소 A서브유닛 융합체(4E6 다이머 Toxin) 유전자 발현 카세트의 제작

대장균 발현용 4E6 다이머 Toxin 유전자는 pBluescriptII(+) 플라스미드에 삽입된 비피더스균 발현용 4E6 다이머 Toxin 유전자 발현 카세트(서열 번호 2)를 주형으로 하여 프라이머 DNA 서열 5(서열 번호 12) 및 6(서열 번호 13)을 이용하여 PCR에 의한 증폭을 행하였다. PCR 조건은 DNA 폴리메라아제로서 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(다카라 바이오)를 이용하여 95℃ 1분을 1사이클, 98℃ 10초, 60℃ 15초, 68℃ 2분을 25사이클로 실시하였다. 증폭 산물은 MinElute 칼럼(Qiagen)을 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라 정제하고 NdeI 및 NotI에서 제한 효소 소화 후 1.2% 아가로스로 전기 영동을 하고, 겔로부터 목적의 밴드를 잘라내어 DNA 겔 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라 정제 단리하였다. 이를 pET-22b(+)(Novagen)의 NdeI와 NotI 부위에 삽입하고, N말단에 Strep Tag(Schmidt T.G., Skerra A., 2007, Nat Protoc. 2(6): 1528-1535)를 가지며, 2개의 VHH 모노머끼리를 (GGSGG)₂ 링커 펩티드(서열 번호 28)로 연결하고, 4E6 다이머의 C말단에 XbaI 서열(SerArg)을 통해 녹농균 외독소 서브유닛 A(Toxin)를 결합시킨 4E6 다이머 Toxin를 구축하였다(도 12a).

(1-2) 대장균 발현용 항hTRAIL-R2 VHH 항체 다이머 녹색 형광 단백질 융합체(4E6 다이머 EGFP) 유전자 발현 카세트의 제작

대장균 발현용 4E6 다이머 EGFP 유전자는 pBluescriptII(+) 플라스미드에 삽입된 비피더스균 발현용 4E6 다이머 Toxin 유전자 발현 카세트(서열 번호 3)를 주형으로 하여 프라이머 DNA 서열 5(서열 번호 12) 및 7(서열 번호 14)을 이용하여 PCR에 의한 증폭을 행하였다. PCR 조건은 DNA 폴리메라아제로서 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(다카라 바이오)를 이용하여 95℃ 1분을 1사이클, 98℃ 10초, 60℃ 15초, 68℃ 2분을 25사이클로 실시하였다. 증폭 산물은 MinElute 칼럼(Qiagen)을 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라 정제하고 NdeI 및 NotI에서 제한 효소 소화 후 1.2% 아가로스로 전기 영동을 하고, 겔로부터 목적의 밴드를 잘라내어 DNA 겔 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라 정제 단리하였다. 이를 pET-22b(+)(Novagen)의 NdeI와 NotI 부위에 삽입하고, N말단에 Strep Tag를 가지며, 2개의 VHH 모노머끼리를 (GGSGG)₂ 링커 펩티드(서열 번호 28)로 연결하고, 4E6 다이머의 C말단에 XbaI 서열(SerArg)을 통해 N말단에 (GGSGG)₂ 링커 펩티드(서열 번호 28)를 결합한 녹색 형광 단백질(EGFP)을 결합시킨 4E6 다이머 EGFP를 구축하였다(도 12b).

(1-3) 대장균 발현용 항hTRAIL-R2 VHH 항체 테트라머(4E6 테트라머) 유전자 발현 카세트의 제작

대장균 발현용 4E6 테트라머 유전자는 pEX-K 플라스미드에 삽입된 비피더스균 발현용 4E6 테트라머 유전자 발현 카세트(서열 번호 1)를 주형으로 하여 프라이머 DNA 서열 3(서열 번호 10) 및 4(서열 번호 11)를 이용하여 PCR에 의한 증폭을 행하였다. PCR 조건은 DNA 폴리메라아제로서 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(다카라 바이오)를 이용하여 95℃ 1분을 1사이클, 98℃ 10초, 60℃ 15초, 68℃ 2분을 25사이클로 실시하였다. 증폭 산물은 MinElute 칼럼(Qiagen)을 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라 정제하고 NdeI 및 NotI에서 제한 효소 소화 후 1.2% 아가로스로 전기 영동을 하고, 겔로부터 목적의 밴드를 잘라내어 DNA 겔 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라 정제 단리하였다. 이를 pET-22b(+)(Novagen)의 NdeI와 NotI 부위에 삽입하고, N말단에 Strep Tag를 가지며, 4개의 VHH 모노머끼리를 3개의 (GGSGG)₂ 링커 펩티드(서열 번호 28)로 연결한 4E6 테트라머를 구축하였다(도 12c).

(2) 대장균에서의 재조합 단백질의 발현

상기와 같이 제작한 4E6 테트라머, 4E6 다이머 Toxin 및 4E6 다이머 EGFP 유전자를 pET22b(+)의 NdeI와 NotI 부위에 삽입하였다. E.coli RosettaGami(DE3)2(Novagen)에 본 발현 벡터 플라스미드 DNA를 도입하고, 부속 매뉴얼에 따라 재조합 대장균을 200mL의 100μg/mL 암피실린(시그마 알드리치)이 들어간 2YT 배지를 이용하여 37℃에서 배양하고, OD₆₀₀=0.4~0.5에 이르렀을 때에 1mM IPTG(이소프로필-β-티오갈락토피라노시드, 다카라 바이오)를 첨가하여 30℃에서 3시간 배양하였다. 배양 종료 후, 대장균을 회수하여 20mL의 추출 버퍼(50mM Na Phosphate pH 7.8, 300mM NaCl, EDTA-Free protease inhibitor cocktail(Roche))에 재현탁하여 얼음 중에서 Sonifier 250(Branson)을 이용하여 Output Control 2, Duty cycle 80%의 조건으로 초음파 처리를 1분간 2회 행하여 균체를 파쇄하였다. 처리 후의 현탁액을 15000rpm으로 4℃에서 20분 원심하여 상청을 회수하였다. 융합 단백질의 정제에는 HisTrap 칼럼(GE 헬스케어)을 이용하였다. 초음파 처리 현탁액의 원심 상청을 그대로 HisTrap 칼럼에 걸고 결합 버퍼(20mM Na Phosphate, 0.5M NaCl, 20mM Imidazole pH 7.4)로 칼럼을 세정한 후, 500mM Imidazole을 포함하는 용출액으로 융합 단백질을 용출시켰다. 정제 샘플을 10% 아크릴아미드 SDS 전기 영동에 제공하고 CBB로 염색하여 정제된 재조합 단백질을 확인하고, BSA(소 혈청 알부민 단백질)의 염색과 비교하여 목적의 단백질 밴드의 농도를 산출하였다(도 13a-c). 4E6 다이머 Toxin, 4E6 다이머 EGFP, 4E6 테트라머의 농도는 각각 0.8mg/mL, 1.2mg/mL, 1.6mg/mL로 산정되었다.

<실시예 7: 4E6 다이머 Toxin 및 4E6 테트라머의 암세포사 유도 활성의 측정>

4E6 다이머 Toxin 융합 단백질이 배양 hTRAIL-R2 발현 인간 암세포(Colo205, American Type Culture Collection에서 입수)에 대해 세포사 유도 작용이 있는지를 조사하였다. Falcon 96웰 배양 플레이트(벡톤 디킨슨)에 5×10⁴cells/50μL 배지(0.2% 소 태아 혈청(Tissue Culture Biologicals)을 포함하는 RPMI1640 배지)/웰로 세포를 더하고 2시간 배양 후, 상기와 같이 정제한 4E6 다이머 Toxin, 4E6 다이머 EGFP를 종농도로 2000, 800, 160, 32, 6.4, 1.28, 0.256, 0.0512ng/mL이 되는 배지(2×종농도)를 50μL씩 첨가하였다. 배양 2일째에 10μL의 MTT 시약(나카라이테스크)을 더하였다. 나아가 2시간 배양 후에 100μL/웰로 가용화액을 더하고 피펫팅으로 세포를 용해하여 OD₅₇₀nm의 흡광도를 측정하였다. 세포 무첨가 배지의 웰의 측정값을 백그라운드 값으로 하여 전체 측정값에서 뺐다. 항체를 첨가하지 않은 컨트롤의 웰을 100%로 하여 그 상대값으로 나타내었다. 어세이는 트리플리케이트로 행하여 3웰의 평균값을 취하였다. 도 14a에 도시된 바와 같이, 항TRAIL-R2 VHH 항체 다이머와 Toxin 융합체, 즉 이뮤노톡신은 전혀 세포사를 유도하지 않았다.

4E6 다이머가 세포에 결합되어 있는 것을 확인하기 위해 이하의 시험을 행하였다. 즉, 인간 대장암 Colo205 세포, 췌장암 BxPC-3 세포에 대해 각 2×10⁵ 세포를 10μg/mL 4E6 다이머 EGFP와 2% 소 태아 혈청을 포함하는 인산 완충 생리식염수(pH 7.4) 50μL 중에서 얼음 상에서 30분 반응시켰다. 상기 혈청이 들어간 인산 완충 생리식염수로 2회 세정하여 FACSVerse(BD Biosciences)로 세포의 형광 강도를 해석하였다. 2개의 세포 모두 4E6 다이머 EGFP에 의해 염색되었다. 한편, 대조 다이머 EGFP에서는 어느 쪽의 세포도 염색되지 않았다(도 15). 따라서, 4E6 다이머는 세포에 결합된다고 생각된다.

이상의 결과로부터 4E6 다이머 Toxin는 세포막 상의 TRAIL-R2에 결합되지만, TRAIL-R2 분자를 3량체 이상으로 응집시키지 못하고 세포 내에도 도입되지 않기 때문에 Colo205 세포에 세포사를 유도할 수 없다고 생각되었다.

이어서 4E6 모노머 및 4E6 테트라머의 세포사 유도 작용이 있는지를 조사하기 위해 상기와 같이 정제한 4E6 모노머, 4E6 테트라머를 종농도로 25000, 5000, 1000, 200, 40, 8, 1.6, 0.32pg/mL이 되는 배지(2×종농도)를 50μL씩 첨가하였다. 그 결과, 4E6 모노머는 세포사를 일으키지 않았지만, TRAIL-R2 분자를 3량체 이상으로 응집시키는 활성을 가지는 4E6 테트라머는 Colo205 세포에 강력한 세포사를 유도하였다(도 14b).

이러한 결과는 TRAIL-R을 3량체 이상으로 응집시키는 활성을 가지는 항hTRAIL-R VHH 항체 테트라머가 항hTRAIL-R VHH 항체 다이머 Toxin보다 효율적으로 암세포사를 유도할 수 있는 것을 나타내고 있다.

<실시예 8: 대장균으로 발현한 4E6 테트라머의 인간 대장암 세포 및 췌장암 세포에 대한 세포사 유도 작용>

인간 대장암 세포 Colo205 및 췌장암 세포 BxPC-3(American Type Culture Collection에서 입수)에 대한 4E6 테트라머의 암세포사 유도 작용을 검토하였다. 세포는 10% 소 태아 혈청(Tissue Culture Biologicals)을 첨가한 RPMI1640 배지(Sigma)에 현탁하고, Falcon 96웰 배양 플레이트(벡톤 디킨슨)에 3×10³cells/50μL/웰로 세포를 더하고 하룻밤 배양 후, 4E6 테트라머, hTRAIL(와코 순약)을 포함하는 배지를 50μL씩 첨가하였다. Colo205 세포는 하룻밤, BxPC-3 세포는 이틀밤 배양 후, 10μL의 생세포수 측정 시약 SF(나카라이테스크)를 더하고 추가로 4~6시간 배양하여 450nm의 흡광도를 측정하였다. 세포를 더하지 않은 배지만의 웰을 백그라운드로 하여 뺐다. 세포만의 웰을 100%로 하여 그 상대값을 데이터로 하였다. 각 농도 3웰의 평균값+표준편차로 나타내었다. 도 16에 도시된 바와 같이 4E6 테트라머는 농도 의존적으로 Colo205 세포, BxPC-3 세포의 세포사를 유도하여 IC₅₀은 각각 2pmol/L, 8pmol/L이었다. 대장균으로 제작한 hTRAIL의 IC₅₀은 400pmol/L이며, 4E6 테트라머는 hTRAIL보다 저농도로 세포사를 유도할 수 있는 것을 알 수 있었다.

<실시예 9: 4E6 테트라머 및 4E6 다이머 EGFP의 비피더스균에서의 분비 발현과 정제>

(1) 일렉트로포레이션에 의한 재조합 비피더스균의 제작

4E6 테트라머 및 4E6 다이머 EGFP를 비피더스균으로 분비 발현하기 위한 벡터 유전자 카세트(실시예 1 참조)를 pKKT427 벡터(Yasui K., et al., Nucleic Acids Res. 2009)의 HindIII와 NotI의 사이에 삽입하고, B.longum 105-A에 일렉트로포레이션법에 의해 도입하였다. 일렉트로포레이션은 2.4kV, 25μF, 200옴의 조건으로 행하였다.

(2) 비피더스균으로 분비 발현된 4E6 테트라머, 4E6 다이머 EGFP의 정제

(1)에서 얻은 재조합 비피더스균을 스펙티노마이신 100μg/mL을 포함하는 MRS 액체 배지(Lactobacilli MRS Broth, Difco Laboratories, Detroit, MI), 50mM 자당, 3.4mg/mL L-아스코르빈산 나트륨염 및 0.2mg/mL L-시스테인 염산염에 더하고 하룻밤 혐기 배양하였다. 혐기 배양은 탈산소제인 아네로팩 켄키(미츠비시 가스 화학, 도쿄, 일본)를 넣은 밀폐 용기를 사용함으로써 행하였다. 하룻밤 배양한 배양액은 흡광도(600nm)를 측정하여 흡광도가 0.1이 되도록 새로운 액체 배지에 더하였다. 6~7시간 혐기 배양하고 4℃, 9,400×g로 10분 원심하여 배양 상청을 채취하였다. 재조합 단백질의 정제는 HisTrap 칼럼(GE Healthcare)으로 행하였다. 배양 상청을 HisTrap 칼럼에 걸고 결합 버퍼(50mM Na Phosphate, 0.3M NaCl, 20mM Imidazole pH 7.8)로 칼럼을 세정한 후, 500mM Imidazole을 포함하는 용출액으로 단백질을 용출하였다. 배양 상청 1mL로부터 정제한 양에 상당하는 정제 단백질을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동하여 Oriole Fluorescent Gel Stain(Bio-Rad)로 염색하였다(도 17). 4E6 테트라머, 4E6 다이머 EGFP 모두 추정 분자량 부근(약 60kDa)에 검출되었다. 배양 상청 중의 분비량은 4E6 테트라머는 400ng/mL, 4E6 다이머 EGFP는 3.2ng/mL로 추측되었다. 이상의 결과로부터 모든 재조합 단백질이 분비되고, 4E6 테트라머가 4E6 다이머 EGFP와 비교하여 효율적으로 분비 발현되는 것을 알 수 있었다.

<실시예 10: 비피더스균으로 분비 발현한 항hTRAIL-R2 VHH 항체 테트라머(4E6 테트라머)의 암세포사 유도 활성>

인간 대장암 Colo205 세포(American Type Culture Collection)에 대한 4E6 테트라머의 암세포사 유도 활성을 검토하였다. 세포는 10% 소 태아 혈청(Tissue Culture Biologicals)을 첨가한 RPMI1640 배지(Sigma)에 현탁하고, Falcon 96웰 배양 플레이트(벡톤 디킨슨)에 3×10³cells/50μL배지/웰로 세포를 더하였다. 하룻밤 배양하여 4E6 테트라머, TRAIL을 종농도 0.3pM~10nM로 포함하는 배지를 50μL씩 첨가하였다. 나아가 하룻밤 배양하여 10μL의 생세포수 측정 시약 SF(나카라이테스크)를 더하고 6시간 배양 후 450nm의 흡광도를 측정하였다. 세포를 더하지 않은 배지만의 웰을 백그라운드로 하여 뺐다. 세포만의 웰을 100%로 하여 그 상대값을 데이터로 하였다. 각 농도 3웰의 평균값+표준편차로 나타내었다. 도 18에 도시된 바와 같이 4E6 테트라머는 농도 의존적으로 증식을 억제하여 IC₅₀은 0.02nmol/L이었다. 한편, 대장균으로 제작한 hTRAIL(와코 순약)의 IC₅₀은 0.4nmol/L이었다. 따라서, 비피더스균으로 분비 발현된 4E6 테트라머는 hTRAIL보다 세포사 유도 활성이 높은 것을 알 수 있었다.

<실시예 11: Colo205 세포 이식 Xenograft model에서의 재조합 B.longum의 정맥 내 투여에 의한 항종양 효과의 검토>

누드 마우스의 피하에 인간 대장암 Colo205 세포를 이식하여 고형암을 형성시킨 Xenograft model에 있어서, 항hTRAIL-R2 VHH 항체 테트라머(4E6 테트라머)를 분비 발현하는 재조합 B.longum 105-A를 정맥 내에 투여한 경우의 항종양 효과를 검토하였다. 구체적으로 6주령의 암컷 KSN/Slc 누드 마우스에 2×10⁶의 Colo205 세포를 피하 이식하고, 9일 후에 각 군(n=6, 무처리(무처치), 4E6 테트라머, 4E6 다이머 EGFP)의 종양 덩어리 부피가 약 280㎣가 되도록 군을 나눈 후, 실시예 9에 따라 제작한 재조합 비피더스균을 1마리당 1.5×10⁹개로 정맥 내에 투여하였다. 사용한 B.longum 105-A는 원심 및 생리식염수에의 재현탁에 의해 조제하였다. 체내의 B.longum 105-A의 영양 보조를 위해 매일 1mL의 20% 락트로스를 복강 내에 투여하였다. 종양 직경은 비피더스균을 투여한 날로부터 0, 2, 4, 7, 11, 14, 18, 21일 후에 노기스를 이용하여 계측하였다. 종양 부피는 「(단직경)²×(장직경)/2」의 계산식으로 산출하였다. 결과를 도 19에 나타낸다. 비피더스균 투여 후 21일째에 4E6 테트라머를 분비 발현하는 재조합 비피더스균은 무처리와 비교하여 종양 증식을 51% 억제하였다. 한편, 음성 대조로 한 4E6 다이머 EGFP 분비 비피더스균 투여군에서는 종양 증식 억제 효과는 볼 수 없었다.

종양 직경의 계측과 동시에 비피더스균을 투여한 날로부터 0, 2, 4, 7, 11, 14, 18, 21일 후에 각 군의 체중을 계측하였다. 도 20에 도시된 바와 같이 무처리, 4E6 다이머 EGFP군과 비교하여 4E6 테트라머군에서 체중 감소는 검출되지 않았다. 이러한 결과로부터 4E6 테트라머는 체중 감소를 야기하는 부작용을 발생하지 않고 세포사 유도 활성에 의해 종양 증식을 억제한다고 생각된다.

<실시예 12: BxPC-3 세포 이식 Xenograft model에서의 재조합 B.longum의 정맥 내 투여에 의한 항종양 효과의 검토>

누드 마우스의 피하에 인간 췌장암 BxPC-3 세포를 이식하여 고형암을 형성시킨 Xenograft model에 있어서, 항hTRAIL-R2 VHH 항체 테트라머(4E6 테트라머)를 분비 발현하는 재조합 B.longum 105-A를 정맥 내에 투여한 경우의 항종양 효과를 검토하였다. 구체적으로 8주령의 암컷 KSN/Slc 누드 마우스에 2×10⁶의 BxPC-3 세포를 피하 이식하고, 8일 후에 각 군(n=6, 무처리, 4E6 테트라머, 4E6 다이머 EGFP)의 종양 덩어리 부피가 약 230㎣이 되도록 군을 나눈 후, 실시예 9에 따라 제작한 재조합 비피더스균을 1마리당 1.5×10⁹개로 정맥 내에 투여하였다. 사용한 B.longum 105-A는 원심 및 생리식염수에의 재현탁에 의해 조제하였다. 체내의 B.longum 105-A의 영양 보조를 위해 매일 1mL의 20% 락트로스를 복강 내에 투여하였다. 종양 직경은 비피더스균을 투여한 날로부터 0, 3, 6, 10, 13, 17일 후에 노기스를 이용하여 계측하였다. 종양 부피는 「(단직경)²×(장직경)/2」의 계산식으로 산출하였다. 결과를 도 21에 나타낸다. 비피더스균 투여 후 17일째에 4E6 테트라머를 분비 발현하는 재조합 비피더스균은 무처리와 비교하여 종양 증식을 52% 억제하였다. 한편, 음성 대조인 4E6 다이머 EGFP 분비 비피더스균 투여군에서는 종양 증식 억제 효과는 볼 수 없었다.

종양 직경의 계측과 동시에 비피더스균을 투여한 날로부터 0, 3, 6, 10, 13, 17일 후에 각 군의 체중을 계측하였다. 도 22에 도시된 바와 같이 무처리, 4E6 다이머 EGFP군과 비교하여 4E6 테트라머군에서 체중 감소는 검출되지 않았다. 이러한 결과로부터 4E6 테트라머는 체중 감소를 야기하는 부작용을 발생하지 않고 세포사 유도 활성에 의해 종양 증식을 억제한다고 생각된다.

<실시예 13: 4P6 트리머 재조합 E.coli BL21(DE3)의 제작 및 재조합 단백질의 발현·정제>

(1) 대장균 발현용 항hTRAIL-R1 VHH 항체 트리머(4P6 트리머) 유전자 발현 카세트의 제작

N말단에 Strep Tag, C말단에 His-Tag 서열을 가지며, 실시예 4(1)에 따라 취득한 항hTRAIL-R1 VHH 항체의 3개의 모노머끼리를 2개의 (GGSGG)₂ 링커 펩티드(서열 번호 28)로 연결한 4P6 트리머를 코딩하는 유전자를 pET-22b(+)(Novagen)의 NdeI와 NotI 부위에 삽입하여 대장균 발현용 4P6 트리머 유전자 발현 카세트를 구축하였다(실시예 6 참조).

(2) 대장균에서의 재조합 단백질의 발현

상기와 같이 제작한 플라스미드 벡터를 E.coli BL21Star™(DE3) One Shot(Life Technologies)에 도입하였다. 부속 매뉴얼에 따라 재조합 대장균을 200mL의 100μg/mL 암피실린(시그마 알드리치)이 들어간 2YT 배지를 이용하여 37℃에서 배양하고, OD₆₀₀=0.4~0.5에 이르렀을 때에 1mM IPTG(이소프로필-β-티오갈락토피라노시드, 다카라 바이오)를 첨가하여 30℃에서 3시간 배양하였다. 배양 종료 후, 대장균을 회수하여 20mL의 추출 버퍼(50mM Na Phosphate pH 7.8, 300mM NaCl, EDTA-Free protease inhibitor cocktail(Roche))에 재현탁하였다. 얼음 중에서 Sonifier 250(Branson)을 이용하여 Output Control 2, Duty cycle 80%의 조건으로 초음파 처리를 1분간 2회 행하여 균체를 파쇄하였다. 처리 후의 현탁액을 9,400×g로 4℃에서 20분 원심하여 상청을 회수하였다. 융합 단백질의 정제에는 His Trap 칼럼(GE Healthcare UK)을 이용하였다. 초음파 처리 현탁액의 원심 상청을 그대로 His Trap 칼럼에 걸고 결합 버퍼(20mM 인산 나트륨, 0.5M NaCl, 20mM Imidazole pH 7.4)로 칼럼을 세정한 후, 500mM Imidazole을 포함하는 용출액으로 융합 단백질을 용출시켰다. 나아가 용출 프랙션은 Strep-Tactin 칼럼(IBA)에 첨가하고 부속 매뉴얼에 따라 정제하였다. 50ng의 BSA에 상당하는 정제 단백질을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동하여 Oriole Fluorescent Gel Stain(Bio-Rad)로 염색하였다(도 23). 4P6 트리머는 추정 분자량 부근(약 42kDa)에 검출되었다. 이상의 결과로부터 4P6 트리머는 대장균에서 발현, 정제할 수 있는 것을 알 수 있었다.

<실시예 14: 대장균에서 발현한 4P6 트리머의 암세포사 유도 활성의 측정>

인간 대장암 Colo205 세포(American Type Culture Collection)에 대한 4P6 트리머의 암세포사 유도 활성을 검토하였다. 세포는 10% 소 태아 혈청(Tissue Culture Biologicals)을 첨가한 RPMI1640 배지(Sigma)에 현탁하고, Falcon 96웰 배양 플레이트(벡톤 디킨슨)에 3×10³cells/50μL배지/웰로 세포를 더하였다. 하룻밤 배양 후, 4P6 트리머를 종농도 10pM~10nM로 포함하는 배지를 50μL씩 첨가하였다. 나아가 이틀밤 배양 후, 10μL의 생세포수 측정 시약 SF(나카라이테스크)를 더하고 4시간 배양 후 450nm의 흡광도를 측정하였다. 세포를 더하지 않은 배지만의 웰을 백그라운드로 하여 뺐다. 세포만의 웰을 100%로 하여 그 상대값을 데이터로 하였다. 각 농도 3웰의 평균값+표준편차로 나타내었다. 도 24에 도시된 바와 같이 4P6 트리머는 농도 의존적으로 Colo205 세포의 증식을 억제하여 IC₅₀은 0.4nmol/L이었다. 대장균으로 제작한 hTRAIL(와코 순약)의 IC₅₀은 0.4nmol/L이며, 대장균으로 발현한 4P6 트리머는 hTRAIL와 동일한 정도의 세포사 유도 활성을 나타내었다.

<실시예 15: 항hTRAIL-R1 VHH 항체 트리머(4P6 트리머)의 비피더스균에서의 분비 발현과 정제>

(1) 일렉트로포레이션에 의한 재조합 비피더스균의 제작

실시예 1(1)에서의 발현 카세트의 4E6 테트라머의 부분을 실시예 4(1)에 따라 취득한 4P6 트리머로 치환하여 제작한, 4P6 트리머를 비피더스균으로 분비 발현하기 위한 벡터 유전자 카세트를 pKKT427 벡터(Yasui K., et al., Nucleic Acids Res. 2009)의 HindIII와 NotI의 사이에 삽입하고 B.longum 105-A에 일렉트로포레이션법에 의해 도입하였다. 일렉트로포레이션은 2.4kV, 25μF, 200옴의 조건으로 행하였다.

(2) 비피더스균으로 분비 발현된 4P6 트리머의 정제

(1)에서 얻은 재조합 비피더스균을 스펙티노마이신 100μg/mL을 포함하는 MRS 액체 배지(Lactobacilli MRS Broth, Difco Laboratories, Detroit, MI), 50mM 자당, 3.4mg/mL L-아스코르빈산 나트륨염 및 0.2mg/mL L-시스테인 염산염에 더하고 하룻밤 혐기 배양하였다. 혐기 배양은 탈산소제인 아네로팩 켄키(미츠비시 가스 화학, 도쿄, 일본)를 넣은 밀폐 용기를 사용함으로써 행하였다. 하룻밤 배양한 배양액은 흡광도(600nm)를 측정하여 흡광도가 0.1이 되도록 새로운 액체 배지에 더하였다. 7시간 혐기 배양하고 4℃, 9,400×g로 10분 원심하여 배양 상청을 채취하였다. 재조합 단백질의 정제는 HisTrap 칼럼(GE Healthcare)으로 행하였다. 배양 상청을 HisTrap 칼럼에 걸고 결합 버퍼(50mM Na Phosphate, 0.3M NaCl, 20mM Imidazole pH 7.8)로 칼럼을 세정한 후, 500mM Imidazole를 포함하는 용출액으로 단백질을 용출하였다. 배양 상청 0.6mL로부터 정제한 양에 상당하는 정제 단백질을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동하여 Oriole Fluorescent Gel Stain(Bio-Rad)로 염색하였다(도 25). 4P6 트리머는 추정 분자량 부근(약 42kDa)에 검출되었다. BSA를 이용하여 정량한 결과, 4P6 트리머의 배양 상청 중의 분비량은 30ng/mL로 추측되었다. 이상의 결과로부터 4P6 트리머는 비피더스균으로 분비 발현되는 것을 알 수 있었다.

<실시예 16: 비피더스균으로 분비 발현한 항hTRAIL-R1 VHH 항체 트리머(4P6 트리머)의 암세포사 유도 활성>

인간 대장암 Colo205 세포(American Type Culture Collection) 및 췌장암 BxPC-3 세포(American Type Culture Collection)에 대한 4P6 트리머의 암세포사 유도 활성을 검토하였다. 세포는 10% 소 태아 혈청(Tissue Culture Biologicals)을 첨가한 RPMI1640 배지(Sigma)에 현탁하고, Falcon 96웰 배양 플레이트(벡톤 디킨슨)에 3×10³cells/50μL배지/웰로 세포를 더하였다. 하룻밤 배양하고 4P6 트리머를 종농도 0.3pM~10nM로 포함하는 배지를 50μL씩 첨가하였다. 나아가 이틀밤 배양하고 10μL의 생세포수 측정 시약 SF(나카라이테스크)를 가하고 2시간 배양 후 450nm의 흡광도를 측정하였다. 세포를 더하지 않은 배지만의 웰을 백그라운드로 하여 뺐다. 세포만의 웰을 100%로 하여 그 상대값을 데이터로 하였다. 각 농도 3웰의 평균값+표준편차로 나타내었다. 도 26a에 도시된 바와 같이 4P6 트리머는 농도 의존적으로 Colo205 세포의 증식을 억제하여 IC₅₀은 0.08nmol/L이었다. 대장균으로 제작한 hTRAIL(와코 순약)의 IC₅₀은 0.4nmol/L이며 비피더스균으로 분비 발현된 4P6 트리머는 hTRAIL보다 세포사 유도 활성이 높은 것을 알 수 있었다. 도 26b에 도시된 바와 같이 4P6 트리머는 농도 의존적으로 BxPC-3 세포의 증식도 억제하였다.

<실시예 17: BxPC-3-Luc#2 세포 이식 Xenograft model에서의 4P6 트리머를 분비 발현하는 재조합 B.longum의 정맥 내 투여에 의한 항종양 효과의 검토>

누드 마우스의 피하에 인간 췌장암 BxPC-3-Luc#2 세포(JCRB 세포 뱅크에서 입수)를 이식하여 고형암을 형성시킨 Xenograft model에 있어서 항hTRAIL-R1 VHH 항체 트리머(4P6 트리머)를 분비 발현하는 재조합 B.longum 105-A를 정맥 내에 투여한 경우의 항종양 효과를 검토하였다. 구체적으로 6주령의 암컷 KSN/Slc 누드 마우스에 3×10⁶의 BxPC-3-Luc#2 세포를 피하 이식하고 15일 후에 각 군(n=5, 무처리, 4P6 트리머, pKKT427 벡터만)의 종양 덩어리 부피가 약 135㎣이 되도록 군을 나눈 후, 실시예 15에 따라 제작한 재조합 비피더스균을 1마리당 3×10⁸개로 정맥 내에 투여하였다. 사용한 B.longum 105-A는 원심 및 생리식염수에의 재현탁에 의해 조제하였다. 체내의 B.longum 105-A의 영양 보조를 위해 매일 1mL의 20% 락트로스를 복강 내에 투여하였다. 종양 직경은 종양을 이식한 날로부터 15, 19, 21, 24, 28, 31, 35일 후에 노기스를 이용하여 계측하였다. 종양 부피는 「(단직경)²×(장직경)/2」의 계산식으로 산출하였다. 결과를 도 27에 나타낸다. 비피더스균 투여 후 20일째에 4P6 트리머를 분비 발현하는 재조합 비피더스균은 무처리와 비교하여 종양 증식을 65% 억제하였다. 한편, 음성 대조인 pKKT427 도입 비피더스균 투여군에서는 종양 증식 억제 효과는 볼 수 없었다.

종양 직경의 계측과 동시에 종양을 이식한 날로부터 15, 19, 21, 24, 28, 31, 35일 후에 각 군의 체중을 계측하였다. 도 28에 도시된 바와 같이 무처리, pKKT427 도입 비피더스균군과 비교하여 4P6 트리머군에서 체중 감소는 검출되지 않았다. 이러한 결과로부터 4P6 트리머는 체중 감소를 야기하는 부작용을 발생하지 않고 세포사 유도 활성에 의해 종양 증식을 억제한다고 생각된다.

본 발명에 의해 정상세포에의 독성을 경감하면서 강력한 아고니스트 활성을 가지는 항hTRAIL-R1 및 R2 항체의 종양 부위 국소 투여에 의해 효과적인 암세포사를 유도하는 것이 가능해진다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고하여 본 명세서에 도입하는 것으로 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Teikyo Heisei University <120> Recombinant Bifidobacterium expressing antibody introducing apotopsis of cancer cells <130> PH-6058-PCT <150> JP 2014-003441 <151> 2014-01-10 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2064 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 1 aagctttggg cgcggcggcc atgaagtggc ttgacaagca caatctcgtc tgatttttgc 60 ccttgccctc ccctcgaaaa aaacacataa atcctatata aaatgcgggt tttcgcagtc 120 acatgcgcta ttatcattga ttgaacgggc aaagcaacaa atgccgcccc ctgaccaaga 180 aggatgcttt atgaccaatg tgcgcgtcat caagcctgca ctggccgccc tggttgccgc 240 cgccgcatgc gtgggcgggc tggcctttag cagcgcgcag ccggcccagg ctgacaccta 300 tgaagtccag ctggtagaga gcggaggcgg cagcgtacag gccggggaca gcctgagact 360 gtcctgcgcg gctagtggcc gtacctttgg ctccataagg gttgggtggt tccgccaaac 420 cccgggcaag gagcgtgagt ttgtcgcggc cataaaccgc aacgatggta cgacctatta 480 tgccgacagc gtcaagggcc ggttcaccat cagtcgtgac aacgctaaga acactgttta 540 catgcagatg gcatccctga agcccgagga taccgccgtg tactattgcg 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1440 tgtcccggtg ggcgccgtgt attggggtca aggcacccag gtcaccgtca gttcgggcgg 1500 ctccggagga ggcggctccg gaggcgaagt gcagctggtc gaatccggcg gtggttcggt 1560 gcaggccgga gactccctcc gcctgtcctg tgcggcgtcc ggacgtacct tcggatccat 1620 tcgcgtcgga tggtttcgtc agacaccggg caaggaaaga gagttcgtgg cggccattaa 1680 tcggaatgac ggaaccacgt attatgcaga ctcggttaag gggcgcttca ctatcagccg 1740 cgataacgcc aagaacacgg tctacatgca aatggcctcc ctcaaacccg aggatacggc 1800 cgtttattac tgtgcggctg gcttgcagta taacaggtcg gccgacagag tccccgtggg 1860 cgctgtctat tggggccagg gcacccaggt aacggtttcc tcccaccacc atcaccacca 1920 ttgaactagt ccttctgctc gtagcgatta cttcgagcat tactgacgac aaagaccccg 1980 accgagatgg tcggggtctt tttgttgtgg tgctgtgacg tgttgtccaa ccgtattatt 2040 ccggactaga tcagcggcgg ccgc 2064 <210> 2 <211> 2340 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 2 aagctttggg cgcggcggcc atgaagtggc ttgacaagca caatctcgtc tgatttttgc 60 ccttgccctc ccctcgaaaa aaacacataa atcctatata aaatgcgggt tttcgcagtc 120 acatgcgcta ttatcattga ttgaacgggc 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tattattccg 1980 gactagatca gcggcggccg c 2001 <210> 4 <211> 1204 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 4 ggtacccaac atgaagttat gcatattact ggccgtcgtg gcctttgttg gcctctcgct 60 cggggcaacc atcaaacttc atgatcaatc aattggcaca cagcaatggg aacatagccc 120 tttgggagag ttgtgtccac caggatctca tagatcagaa catcctggag cctgtaaccg 180 gtgcacagag ggtgtgggtt acaccaatgc ttccaacaat ttgtttgctt gcctcccatg 240 tacagcttgt aaatcagatg aagaagagag aagtccctgc accacgacca ggaacacagc 300 atgtcagtgc aaaccaggaa ctttccggaa tgacaattct gctgagatgt gccggaagtg 360 cagcagaggg tgccccagag ggatggtcaa ggtcaaggat tgtacgccct ggagtgacat 420 cgagtgtgtc cacaaagaat caggcaatgg acataatatt gaagggagaa tggatcccca 480 acctcaatcc caaccagaat gccggtgtcc caaatgtcca gcccctgagc tcctgggagg 540 gccctcagtc ttcatcttcc ccccgaaacc caaggacgtc ctctccattt ctgggaggcc 600 cgaggtcacg tgcgttgtgg tagacgtggg ccaggaagac cccgaggtta gtttcaactg 660 gtacattgat ggcgctgagg tgcgaacggc caacacgaag ccaaaagagg aacagttcaa 720 cagcacgtac cgcgtggtca gcgtcctgcc catccggcac caggactggc tgacggggaa 780 ggaattcaag tgcaaggtca acaacaaagc tctcccagcc cccatcgaga ggaccatctc 840 caaggccaaa gggcagaccc gggagccgca ggtgtacgcc ctggccccac accgggaaga 900 gctggccaag gacaccgtga gcgtaacatg cctggtaaaa gacttctacc cagttgacat 960 caacattgag tggcagagga acgggcagcc agagtcagag ggcacctacg ccaccacgcc 1020 gccacagctg gacaacgacg ggacctactt cctctacagc aagctctcgg tgggaaagaa 1080 cacgtggcag cggggagaaa ccttcacctg tgtggtgatg cacgaggccc tgcccaacca 1140 ctacacccag aaatctatca cccagtcttc gggtaaacat catcaccatc accattgact 1200 cgag 1204 <210> 5 <211> 1198 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 5 ggtacccaac atgaagttat gcatattact ggccgtcgtg gcctttgttg gcctctcgct 60 cggggctctg atcacccaac aagacctagc tccccagcag agagcggccc cacaacaaaa 120 gaggtccagc ccctcagagg gattgtgtcc acctggacac catatctcag aagacggtag 180 agattgcatc tcctgcaaat atggacagga ctatagcact cactggaatg acctcctttt 240 ctgcttgcgc tgcaccaggt gtgattcagg tgaagtggag ctaagtccct gcaccacgac 300 cagaaacaca gtgtgtcagt gcgaagaagg caccttccgg gaagaagatt ctcctgagat 360 gtgccggaag tgccgcacag ggtgtcccag agggatggtc aaggtcggtg attgtacacc 420 ctggagtgac atcgaatgtg tccacaaaga aattgaaggg agaatggatc cccaacctca 480 atcccaacca gaatgccggt gtcccaaatg tccagcccct gagctcctgg gagggccctc 540 agtcttcatc ttccccccga aacccaagga cgtcctctcc atttctggga ggcccgaggt 600 cacgtgcgtt gtggtagacg tgggccagga agaccccgag gttagtttca actggtacat 660 tgatggcgct gaggtgcgaa cggccaacac gaagccaaaa gaggaacagt tcaacagcac 720 gtaccgcgtg gtcagcgtcc tgcccatccg gcaccaggac tggctgacgg ggaaggaatt 780 caagtgcaag gtcaacaaca aagctctccc agcccccatc gagaggacca tctccaaggc 840 caaagggcag acccgggagc cgcaggtgta cgccctggcc ccacaccggg aagagctggc 900 caaggacacc gtgagcgtaa catgcctggt aaaagacttc tacccagttg acatcaacat 960 tgagtggcag aggaacgggc agccagagtc agagggcacc tacgccacca cgccgccaca 1020 gctggacaac gacgggacct acttcctcta cagcaagctc tcggtgggaa agaacacgtg 1080 gcagcgggga gaaaccttca cctgtgtggt gatgcacgag gccctgccca accactacac 1140 ccagaaatct atcacccagt cttcgggtaa acatcatcac catcaccatt gactcgag 1198 <210> 6 <211> 1189 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 6 ggtacccaac atgaagttat gcatattact ggccgtcgtg gcctttgttg gcctctcgct 60 cggggctaac ccagcccata atcgtccagc tggcctacag cggccggagg agagcccatc 120 aagaggaccc tgtctagcag gccagtacct gtcagaaggg aactgcaagc cttgcagaga 180 gggtattgac tacaccagcc attccaacca ttctctggat tcatgtattc tctgcacagt 240 ctgtaaggaa gataaagtcg tagaaacccg atgcaacata accacaaata cggtgtgtcg 300 atgcaaacca ggcacctttg aagataaaga ctcccctgag atctgccagt catgctctaa 360 ctgcactgac ggggaagagg aactgacttc ctgtaccccc agagaaaacc ggaagtgtgt 420 ctccaaaacg gcttgggcat ctattgaagg gagaatggat ccccaacctc aatcccaacc 480 agaatgccgg tgtcccaaat gtccagcccc tgagctcctg ggagggccct cagtcttcat 540 cttccccccg aaacccaagg acgtcctctc catttctggg aggcccgagg tcacgtgcgt 600 tgtggtagac gtgggccagg aagaccccga ggttagtttc aactggtaca ttgatggcgc 660 tgaggtgcga acggccaaca cgaagccaaa agaggaacag ttcaacagca cgtaccgcgt 720 ggtcagcgtc ctgcccatcc ggcaccagga ctggctgacg gggaaggaat tcaagtgcaa 780 ggtcaacaac aaagctctcc cagcccccat cgagaggacc atctccaagg ccaaagggca 840 gacccgggag ccgcaggtgt acgccctggc cccacaccgg gaagagctgg ccaaggacac 900 cgtgagcgta acatgcctgg taaaagactt ctacccagtt gacatcaaca ttgagtggca 960 gaggaacggg cagccagagt cagagggcac ctacgccacc acgccgccac agctggacaa 1020 cgacgggacc tacttcctct acagcaagct ctcggtggga aagaacacgt ggcagcgggg 1080 agaaaccttc acctgtgtgg tgatgcacga ggccctgccc aaccactaca cccagaaatc 1140 tatcacccag tcttcgggta aacatcatca ccatcaccat tgactcgag 1189 <210> 7 <211> 440 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 7 catatggagg tccagttagt agaatccggc ggtggctcag tacaagcggg cgattcactg 60 cgcctgagct gtgcggcgtc cggccgtacc tttggctcta tccgcgtagg ttggtttcgc 120 cagacgccgg gcaaagaacg cgaatttgtg gctgcgatta accgcaatga tgggaccacg 180 tactatgcgg actccgtcaa aggtcgcttc acgatttctc gcgataacgc caaaaatacg 240 gtgtatatgc agatggcatc cctgaaacca gaagataccg ccgtgtacta ttgtgcggca 300 ggtctgcagt ataatcgctc cgccgaccgc gttccagtag gtgccgtcta ctggggtcag 360 ggtacccagg taaccgttag ttcgaagctt gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg 420 aatggggccg cagcggccgc 440 <210> 8 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 8 ggtaaaggcc cagccggcca tggccgaggt gcagctcgtg gagtctggg 49 <210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 9 ttgcaagcaa ttgcggccgc tgaggagacg gtgacctggg t 41 <210> 10 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 10 cccatatgtg gtcccatccg cagtttgaaa aagacaccta tgaagtccag ctggta 56 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 11 aattgcggcc gctcaatggt ggtgatggtg gtggga 36 <210> 12 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 12 cccatatgtg gtcccatccg cagtttgaaa aagacaccta tgaagtccag ctggtg 56 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 13 aattgcggcc gccttcaggt cctggcgggg cggttt 36 <210> 14 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 14 ttgcaagcaa ttgcggccgc cttgtacagc tcgtccattc ccag 44 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 15 Ser Ile Arg Val Gly 1 5 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 16 Ala Ile Asn Arg Asn Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 17 Gly Leu Gln Tyr Asn Arg Ser Ala Asp Arg Val Pro Val Gly Ala Val 1 5 10 15 Tyr <210> 18 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 18 Gln Gly Ile Lys Ala Arg Ser Gln Phe Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 1 5 10 15 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser 20 25 30 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 19 Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Leu 1 5 10 15 Cys <210> 20 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 20 Asn Val Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 1 5 10 15 Asp Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp 20 25 30 Thr Ser Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 21 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 22 Gly Arg Thr Phe Ser Ser Asn Val 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 23 Ile Arg Trp Arg Gly Asp Ser Thr 1 5 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Recombinant construct <400> 24 Ala Ala Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 <210> 25 <211> 184 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA derived from hup promoter of Bifidobacterium longum <400> 25 tgggcgcggc ggccatgaag tggcttgaca agcacaatct cgtctgattt ttgcccttgc 60 cctcccctcg aaaaaaacac ataaatccta tataaaatgc gggttttcgc agtcacatgc 120 gctattatca ttgattgaac gggcaaagca acaaatgccg ccccctgacc aagaaggatg 180 cttt 184 <210> 26 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA derived from HUT terminator <400> 26 ccttctgctc gtagcgatta cttcgagcat tactgacgac aaagaccccg accgagatgg 60 tcggggtctt tttgttgtgg tgctgtgacg tgttgtccaa ccgtattatt ccggactaga 120 tcagcg 126 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 27 Ile Glu Gly Arg Met Asp 1 5 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 28 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 29 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA derived from usp secretory signal sequence of Bifidobacterium longum <400> 29 atgaccaatg tgcgcgtcat caagcctgca ctggccgccc tggttgccgc cgccgcatgc 60 gtgggcgggc tggcctttag cagcgcgcag ccggcccagg ct 102

Claims (8)

1. 시그널 펩티드와 3개 이상의 항TRAIL-R1 단일쇄 항체 및/또는 3개 이상의 항TRAIL-R2 단일쇄 항체를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 발현 가능한 상태로 포함하는 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
2. 청구항 1에 있어서,
   편성 혐기성 그램 양성균이 비피도박테리움속(Bifidobacterium)인 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
   항TRAIL-R1 단일쇄 항체가
   CDR1이 서열 번호 22로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고,
   CDR2가 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고,
   CDR3이 서열 번호 24로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
   항TRAIL-R2 단일쇄 항체가
   CDR1이 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고,
   CDR2가 서열 번호 16으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고,
   CDR3이 서열 번호 17로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 융합 단백질이 기능성 펩티드를 더 포함하는 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
6. 청구항 5에 있어서,
   기능성 펩티드가 표지 단백질인 재조합 편성 혐기성 그램 양성균.
7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 기재된 재조합 편성 혐기성 그램 양성균을 유효 성분으로 하는 항종양제.
8. CDR1이 서열 번호 22로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고,
   CDR2가 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열을 포함하고,
   CDR3이 서열 번호 24로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 항TRAIL-R1 항체.

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