TWI711699B - 重組偏性厭氣性革蘭氏陽性菌 - Google Patents

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Abstract

本發明之目的在於藉由抗TRAIL-R1抗體及抗TRAIL-R2抗體而誘導有效之癌細胞死亡，同時減輕對正常細胞之毒性。
本發明之重組偏性厭氣性革蘭氏陽性菌係將編碼包含3個以上之抗TRAIL-R1單鏈抗體及/或3個以上之抗TRAIL-R2單鏈抗體之融合蛋白質的核酸以可表現之狀態包含。

Description

重組偏性厭氣性革蘭氏陽性菌
本發明係關於一種以重組偏性厭氣性革蘭氏陽性菌為有效成分之抗腫瘤劑及腫瘤檢測用標記。
TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand，腫瘤壞死因子相關死亡誘導配體)屬於TNF超家族，係於各種癌細胞中誘導細胞死亡(apoptosis)之蛋白質。TRAIL係於活體內形成三聚物，於細胞內與具有死亡結構域(death domain)之TRAIL受體(TRAIL-R1、TRAIL-R2)結合。已知若結合TRAIL，則TRAIL受體凝集而形成三聚物，藉此，將細胞死亡訊息傳遞至細胞內。對於TRAIL之受體而言，除已知有上述TRAIL-R1、TRAIL-R2以外，亦已知有TRAIL-R3、TRAIL-R4、及作為可溶型受體之蝕骨細胞抑制因子(osteoprotegerin)(圖1)。TRAIL-R3、TRAIL-R4、及蝕骨細胞抑制因子完全或局部缺失死亡結構域，該等受體即便與TRAIL結合，亦不會誘導細胞死亡，因此被稱為誘餌受體(decoy receptor)。
TRAIL於正常細胞中難以導致細胞死亡，因此作為抗癌藥而得以進行開發。然而，為了利用TRAIL而於癌細胞中有效率地誘導細胞死亡，而必須開發如下系統，即有效率地與TRAIL-R1及TRAIL-R2結合而並非與上述誘餌受體結合，從而向細胞內傳遞細胞死亡訊息。因對TRAIL-R1及TRAIL-R2之促效性(agonist)抗體未與上述誘餌受體結合，故而可較TRAIL更有效地誘導細胞死亡，又於血中之半衰期較 長，因此可使投予間隔變長。所以，該等抗體目前處於臨床階段(非專利文獻1)。然而，HGS-ETR1(抗hTRAIL(人類TRAIL)-R1促效性抗體)及HGS-ETR2(抗hTRAIL-R2促效性抗體)為二價，因此於利用具有Fc受體之NK細胞或巨噬細胞之抗體未交聯之情況下，無法誘導TRAIL受體之三聚物形成(圖2a)。因此，有該等抗體於臨床試驗中未顯現顯著治療效果之問題(非專利文獻2)。
作為於NK細胞或巨噬細胞未參與之情況下可直接使癌細胞膜上之hTRAIL-R2分子凝集而傳遞細胞死亡訊息的強力促效性抗體，已知有HGS-TR2J(KMTR2)(非專利文獻3)(圖2b)。又，亦已知對hTRAIL-R2之美洲駝單鏈VHH抗體之三~五聚物於NK細胞或巨噬細胞未參與之情況下誘導對hTRAIL-R2表現癌細胞而言非常強力之細胞死亡(專利文獻1)(圖3)。另一方面，hTRAIL-R1及hTRAIL-R2不僅於癌細胞表現，於各種人類正常組織中亦表現，尤其是人類正常肝細胞對hTRAIL、抗hTRAIL-R促效性抗體為敏感性(非專利文獻4及非專利文獻5)，因此可認為hTRAIL-R促效性抗體導致作為副作用之肝損傷。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]PCT WO/2011/098520
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Ghobrial等人，2005, CA Cancer J Clin., 55(3), pp. 178 - 194
[非專利文獻2]Micheau等人，2013, Br J Pharmacol., 169(8), pp. 1723 - 1744
[非專利文獻3]Motoki等人，2005, Clin Cancer Res., 11(8), pp. 3126 - 3135
[非專利文獻4]Jo等人，2000, Nat Med., 6(5), pp. 564 - 567
[非專利文獻5]Mori等人，2004, Cell Death Differ., 11(2), pp. 203 - 207
本發明之目的在於藉由抗TRAIL-R1抗體及抗TRAIL-R2抗體而誘導有效之癌細胞死亡，同時減輕對正常細胞之毒性。
為解決上述課題而進行銳意研究之結果，本發明者發現具有強力促效劑活性之抗hTRAIL-R2 VHH抗體，並初次明確如下情況，即製作進行分泌之雙叉桿菌，藉由該重組雙叉桿菌之靜脈內投予，而可誘導於腫瘤局部之癌細胞死亡。又，本發明者取得可識別癌細胞膜上之hTRAIL-R1分子之新穎之抗hTRAIL-R1 VHH抗體。根據本發明，可藉由具有強力促效劑活性之抗hTRAIL-R1及抗hTRAIL-R2抗體之腫瘤部位局部投予，而減輕對正常細胞之毒性，並且有效地誘導癌細胞死亡。
本發明係基於上述研究結果者，具體而言，提供以下之發明。
(1)一種重組偏性厭氣性革蘭氏陽性菌，其將編碼包含訊息肽、以及3個以上之抗TRAIL-R1單鏈抗體及/或3個以上之抗TRAIL-R2單鏈抗體之融合蛋白質的核酸以可表現之狀態包含。
(2)如(1)記載之重組偏性厭氣性革蘭氏陽性菌，其中偏性厭氣性革蘭氏陽性菌為雙叉桿菌屬(Bifidobacterium)。
(3)如(1)或(2)記載之重組偏性厭氣性革蘭氏陽性菌，其中抗TRAIL-R1單鏈抗體之CDR1包含序列編號22所示之胺基酸序列；CDR2包含序列編號23所示之胺基酸序列；及CDR3包含序列編號24所示之胺基酸序列。
(4)如(1)至(3)中任一項記載之重組偏性厭氣性革蘭氏陽性菌，其中抗TRAIL-R2單鏈抗體之CDR1包含序列編號15所示之胺基酸序列；CDR2包含序列編號16所示之胺基酸序列；及CDR3包含序列編號17所示之胺基酸序列。
(5)如(1)至(4)中任一項記載之重組偏性厭氣性革蘭氏陽性菌，其中上述融合蛋白質進而包含功能性肽。
(6)如(5)記載之重組偏性厭氣性革蘭氏陽性菌，其中功能性肽為標記蛋白質。
(7)一種抗腫瘤劑，其以如(1)至(6)中任一項記載之重組偏性厭氣性革蘭氏陽性菌為有效成分。
(8)一種抗TRAIL-R1抗體，其CDR1包含序列編號22所示之胺基酸序列；CDR2包含序列編號23所示之胺基酸序列；及CDR3包含序列編號24所示之胺基酸序列。
本說明書包含作為本申請案之優先權之基礎之日本專利申請2014-003441號的說明書及/或圖式所記載之內容。
根據本發明，可藉由具有強力促效劑活性之抗hTRAIL-R1及抗hTRAIL-R2抗體之腫瘤部位局部投予，而減輕對正常細胞之毒性，並且誘導有效之癌細胞死亡。
圖1係TRAIL及其受體之結構、與細胞死亡誘導之訊息傳遞之概略圖。
圖2係表示對TRAIL-R之通常之抗體a與具有促效劑活性之抗體b的細胞死亡訊息於細胞內傳遞之差異之概略圖(於通常之抗體之情形 時，經由TRAIL之細胞死亡必需利用NK細胞或巨噬細胞c之交聯。於KMTR2抗體之情形時，經由TRAIL之細胞死亡無需利用NK細胞或巨噬細胞之交聯)。
圖3係表示單鏈VHH抗體之三~五聚物(該圖中為VHH4)於沒有利用NK細胞或巨噬細胞之交聯之情況下對hTRAIL-R表現癌細胞誘導細胞死亡的情況之概略圖。
圖4係表示純化hTRAIL-R1：Fc(a)、hTRAIL-R2：Fc(b(1))、及mTRAIL(小鼠TRAIL)-R2：Fc(b(2))之SDS-PAGE(SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳)圖像。
圖5係表示經純化之4E6單體之SDS-PAGE圖像。箭頭表示4E6單體。
圖6係表示4E6單體對hTRAIL-R2：Fc抗原之結合活性之利用ELISA之測定結果。
圖7係表示4E6單體與hTRAIL-R2：Fc抗原之解離常數之利用Biacore X-100之測定結果。
圖8係表示經純化之4P6單體之SDS-PAGE圖像。
圖9係表示4P6單體及4E6單體之結合特異性之利用ELISA之解析結果。
圖10係表示4P6單體與hTRAIL-R1：Fc抗原之解離常數之利用Biacore X-100之測定結果。
圖11係表示4P6單體及4E6單體之拮抗劑活性。
圖12係於大腸桿菌表現之4E6二聚物毒素(a)、4E6二聚物EGFP(b)、及4E6四聚物(c)之基因結構之模式圖。
圖13係表示經純化之大腸桿菌表現重組蛋白質(a：4E6二聚物毒素、b：4E6二聚物EGFP、及c：4E6四聚物)之SDS-PAGE圖像。
圖14係表示重組蛋白質(a：4E6二聚物毒素及4E6二聚物EGFP以 及b：4E6單體及4E6四聚物)對人類大腸癌細胞Colo205細胞之細胞死亡誘導活性。
圖15係表示利用4E6二聚物EGFP之癌細胞(a：Colo205細胞及b：BxPC-3細胞)之螢光染色。縱軸表示細胞數，橫軸表示4E6二聚物EGFP之螢光強度。
圖16係表示以大腸桿菌表現之抗hTRAIL-R2 VHH抗體四聚物(4E6四聚物)之對人類大腸癌細胞Colo205細胞(a)及胰腺癌細胞BxPC-3細胞(b)之細胞死亡誘導作用。
圖17係表示自雙叉桿菌培養上清液1mL純化之4E6四聚物、及4E6二聚物EGFP之SDS-PAGE圖像。4E6四聚物表示3次選殖之結果，4E6二聚物EGFP表示2次選殖之結果。
圖18係表示自雙叉桿菌培養上清液純化之4E6四聚物(4E6四聚物)之對Colo205細胞之癌細胞死亡誘導活性。
圖19係表示移植有Colo205細胞之裸小鼠之4E6四聚物分泌雙叉桿菌之抗腫瘤效果。腫瘤體積係以mm3且平均值+標準誤差(n=6)表示。
圖20係表示移植有Colo205細胞之裸小鼠於投予4E6四聚物分泌雙叉桿菌時之體重變化。體重係以平均值+標準偏差(n=6)表示。
圖21係表示移植有BxPC-3細胞之裸小鼠之4E6四聚物分泌雙叉桿菌之抗腫瘤效果。腫瘤體積係以mm3且平均值+標準誤差(n=6)表示。
圖22係表示移植有BxPC-3細胞之裸小鼠於投予4E6四聚物分泌雙叉桿菌時之體重變化。體重係以平均值+標準偏差(n=6)表示。
圖23係表示經純化之大腸桿菌表現重組蛋白質(4P6三聚物)之SDS-PAGE圖像。
圖24係表示於大腸桿菌表現之抗hTRAIL-R1 VHH抗體三聚物(4P6三聚物)之對人類大腸癌細胞Colo205細胞之細胞死亡誘導作用。
圖25係表示自雙叉桿菌培養上清液純化之4P6三聚物之SDS-PAGE圖像。
圖26係表示自雙叉桿菌培養上清液純化之抗hTRAIL-R1 VHH抗體三聚物(4P6三聚物)之對人類大腸癌細胞Colo205細胞(a)及胰腺癌細胞BxPC-3細胞(b)之細胞死亡誘導作用。
圖27係表示移植有BxPC-3-Luc#2細胞之裸小鼠之4P6三聚物分泌雙叉桿菌之抗腫瘤效果。腫瘤體積係以mm3且平均值+標準誤差(n=5)表示。
圖28係表示移植有BxPC-3-Luc#2細胞之裸小鼠於投予4P6三聚物分泌雙叉桿菌時之體重變化。體重係以平均值+標準誤差(n=5)表示。
以下，對本發明具體地進行說明。
1.重組偏性厭氣性革蘭氏陽性菌
1-1.概要及定義
本發明之第1態樣係重組偏性厭氣性革蘭氏陽性菌(以下，常常簡稱為「重組細菌」)。本發明之重組細菌係將編碼融合蛋白質之核酸以可表現之狀態包含之藥劑傳遞用載體。
所謂「偏性厭氣性革蘭氏陽性菌」，係指被分類為革蘭氏陽性菌之偏性厭氣性菌。此處，所謂「偏性厭氣性菌」，亦稱為絕對厭氣性菌，係具有於高氧存在下無法增殖而死滅之性質之細菌。因此，於哺乳動物之體內，可於低氧且厭氣狀態之消化器官內，主要是腸內增殖，但於存在溶氧之血液等體液中或通常之組織內無法增殖。所謂「革蘭氏陽性菌」，係藉由革蘭氏染色而被染色為紫色或深藍色之細菌的總稱。對於革蘭氏陽性菌而言，已知有桿菌、球菌、螺旋菌，於本說明書中並無特別限定。革蘭氏陽性菌不含有內毒素(endotoxin)， 因此於死亡後亦不會放出內毒素。所以，就安全性之方面而言，作為本發明之藥劑傳遞用載體較佳。作為本發明之重組細菌，例如雙叉桿菌屬(Bifidobacterium)(本說明書中，以下將雙叉桿菌屬總稱為「雙叉桿菌」)、芽胞梭菌屬(Clostridium)可適合。較佳為雙叉桿菌。其原因在於：雙叉桿菌不分泌外毒素(exotoxin)，又日常用作乳酸菌，對人體等之安全性得到確認。雙叉桿菌可為任意種類，但較佳為於人類之腸道內生長之種類，具體而言，為兩歧雙叉桿菌(B.bifidum)、長雙叉桿菌(B.longum)、短雙叉桿菌(B.brave)、嬰兒雙叉桿菌(B.infantis)及青春雙歧幹菌(B.adolescentis)。
1-2.構成
本發明之偏性厭氣性革蘭氏陽性菌將編碼融合蛋白質之核酸(以下，常常稱為「融合基因」)以可表現之狀態包含。以下，針對以本發明之重組細菌為特徵之融合基因及使其為可表現之狀態的表現盒之構成，具體地進行說明。
1-2-1.融合基因之構成
本說明書中所謂「編碼融合蛋白質之核酸(融合基因)」，係指編碼藉由基因重組技術而使複數個基因等融合而構建成之融合蛋白質的外來性核酸。融合基因係以被插入下述之表現盒內之狀態被導入本發明之重組細菌內。
本說明書中所謂「融合蛋白質」，係包含訊息肽、3個以上之單鏈抗體、及任意之功能性肽，並將該等連結而成之細胞外分泌性蛋白質。訊息肽、單鏈抗體及功能性肽可直接連結，亦可經由連接肽而間接地連結。連接肽之長度或胺基酸序列只要不妨礙單鏈抗體及功能性肽之各功能，則無特別限定。例如較佳為20個胺基酸以下、或15個胺基酸以下且不會自我摺疊之胺基酸序列等。作為本發明所使用之連接肽，例如可列舉：IEGRMD連接肽(序列編號27)及(GGSGG)2連接肽 (序列編號28)。以下，針對構成融合蛋白質之訊息肽、單鏈抗體及功能性肽，具體地進行說明。
(1)訊息肽
訊息肽係細胞內所生物合成之蛋白質之細胞外移行所必須之肽。通常，於N末端側配置如Lys及Arg之具有正電荷之胺基酸，接著其配置如Ala、Leu、Val、Ile、Val、及Phe之疏水性較高之胺基酸序列。又，於訊息肽之C末端側亦可具有促進訊息肽之切斷與分泌之訊息序列後插入序列及/或包含自融合蛋白質將訊息肽切斷之訊息肽酶識別部位之胺基酸序列。訊息肽係發揮如下功能：使於本發明之細菌內表現之上述融合蛋白質經由存在於膜之轉位分子等而向細胞外分泌。訊息肽之胺基酸序列並無特別限定。可應用可於偏性厭氣性革蘭氏陽性菌內發揮功能之公知之所有訊息序列的胺基酸序列。又，訊息肽之胺基酸長度亦無特別限定。通常只要處於3個胺基酸~60個胺基酸之範圍內即可。其中，為了不使融合蛋白質之分子量變得過大，較佳為胺基酸長度較短之訊息肽。
訊息肽係配置於融合蛋白質之N末端側。
(2)單鏈抗體
於上述融合蛋白質中包含3個以上之單鏈抗體。本說明書中所謂「單鏈抗體」，係指由單鏈多肽構成，且可單獨識別標的物質並進行結合之抗體。其原因在於：由雙鏈以上構成之抗體因分子量過大，故而於偏性厭氣性革蘭氏陽性菌內未表現之可能性、或未構建具有抗體功能之適當之立體結構的可能性較高。因此，本發明之單鏈抗體較佳為每1個之分子量為35kDa以下之低分子抗體。不論天然抗體及人工抗體。
關於本發明之單鏈抗體，典型而言，由包含互補決定區域(CDR)及構架區(FR)之可變區域構成。互補決定區域係顯示可變性，向抗體 賦予結合特異性之區域。另一方面，構架區係可變區域之相對被保存之部分。完全可變區域包含藉由3個CDR而連結之4個FR。3個CDR自其N末端側依序稱為CDR1、CDR2、及CDR3，4個FR自其N末端側依序稱為FR1、FR2、FR3、及FR4。因此，於可變區域中，上述CDR與FR係自胺基酸末端向羧基末端方向以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及FR4之順序排列。
本說明書中所謂「天然抗體」，係指具有與任意之脊椎動物所產生之抗體相同之胺基酸序列的抗體。作為天然抗體之單鏈抗體之具體例，例如可列舉駝科之動物所產生之單鏈抗體(Hamers-Casterman C.,et al.,1993,Nature 363：446-448)(以下，於本說明書中稱為「駝科單鏈抗體」)。駝科單鏈抗體係沒有L鏈而僅由H鏈構成之抗體，因僅H鏈之VH區域可與抗原結合，故而分子量為約14kDa，只有通常抗體之10分之1程度。又，通常有抗原親和性較高，對熱、酸及鹼之耐性較高之性質(Deffar,K.,et al.,2009,African Journal of Biotechnology 8(12)：2645-2652)。因此，非常適合用作本發明中之單鏈抗體。關於駝科之動物種類，只要可產生駝科單鏈抗體，則不問其種類。例如可應用來自美洲駝、羊駝、駱駝等中之任一動物種類之抗體。
本說明書中所謂「人工抗體」，係人工構建而成之抗體。例如除向上述天然抗體之胺基酸序列導入適當之變異而成之單鏈抗體外，亦可列舉於自然界原則上不存在之結構上進行了改變之單鏈抗體。作為此種人工抗體之具體例，可列舉：嵌合抗體、人源化抗體、單鏈Fv(scFv：single chain Fragment of variable region)(Pierce Catalog and Handbook,1994-1995,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)、二聚體(diabody)、三聚體(triabody)或四聚體(tetrabody)等。
所謂「嵌合抗體」，係指抗體分子之可變區域與恆定區域分別來自不同種類之動物之抗體。嵌合抗體之製作可使用公知之方法而進 行，例如可藉由如下方式獲得：將編碼抗體V區域之核酸與編碼人類抗體C區域之核酸進行連結，將其編入表現載體而導入宿主從而產生。
所謂「人源化抗體」，係亦稱為重構(reshaped)人類抗體之改變抗體。人源化抗體係藉由將來自免疫動物之抗體之CDR向人類抗體之互補決定區域進行移植而構建。亦已知其通常之基因重組方法。
單鏈Fv係具有於免疫球蛋白分子中，藉由充分長度之柔軟性連結子而連結位於L鏈與H鏈之可變區域(即，各VL及VH)並包含於1根多肽鏈中之結構的分子量約35kDa以下之合成抗體。於單鏈Fv內兩個可變區域可相互自我集合而形成1個功能性抗原結合部位。
於上述融合蛋白質中，關於單鏈抗體，為了使TRAIL凝集而形成三聚物，而必須含有3個以上之單鏈抗體。其中，若抗體數量變多，則融合蛋白質之分子量變大，因此通常為數個，例如3~6個，較佳為3~5個或3~4個。各單鏈抗體較理想為由適當之連接肽連結。關於連接肽之長度或胺基酸序列，只要不抑制各單鏈抗體之抗原結合活性，則無特別限定。
上述融合蛋白質包含3個以上之識別同一抗原之單鏈抗體。例如於以hTRAIL-R1為抗原之情形時，上述融合蛋白質包含3個以上之均識別同一hTRAIL-R1之單鏈抗體。
於本發明中，所謂抗體之「價」，係指抗體1分子所具有之抗原結合部位之數量。例如IgG係於1分子具有2個抗原結合部位之2價之抗體。上述單鏈抗體係每1分子具有1個抗原結合部位之1價之抗體。本發明之融合蛋白質包含3個以上之單鏈抗體，因此作為整體，為3價以上。
單鏈抗體只要於融合蛋白質中為訊息肽之C末端側，則與下述之功能性肽之順序並無特別限制，較佳為配置於功能性肽之N末端側。
本發明中之單鏈抗體之標的物質係TRAIL-R1或TRAIL-R2。如上所述，本發明之重組細菌可僅於厭氣性環境下增殖，因此於活體內成為厭氣環境下之細胞作為標的細胞較佳。具體而言，可列舉腫瘤細胞或腸道上皮細胞作為較佳之標記細胞。以下，針對抗TRAIL-R1抗體及抗TRAIL-R2抗體，具體地進行說明。
(i)抗TRAIL-R1抗體
本發明中，所謂「抗TRAIL-R1單鏈抗體」，係指針對TRAIL-R1(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 1，TRAIL受體1)之單鏈抗體。本發明所使用之抗TRAIL-R1單鏈抗體只要為與TRAIL-R1特異性地結合者，則沒有特別限定。作為本發明所使用之抗TRAIL-R1單鏈抗體，例如可列舉於本說明書之實施例中取得並使用之4P6。4P6係來自羊駝之單鏈VHH抗體，且其CDR1包含序列編號22所示之胺基酸序列，CDR2包含序列編號23所示之胺基酸序列，及CDR3包含序列編號24所示之胺基酸序列。本發明中所使用之抗TRAIL-R1單鏈抗體之構架區之序列並無特別限定，例如可使用Maass D.R.,et al.,2007,J Immunol Methods.324：13-25所記載之羊駝單鏈抗體(例如，上述文獻所記載之Clone A02)之構架區的序列。因此，抗TRAIL-R1單鏈抗體並無限定，例如FR1可包含序列編號18所示之胺基酸序列，FR2可包含序列編號19所示之胺基酸序列，FR3可包含序列編號20所示之胺基酸序列，及FR4可包含序列編號21所示之胺基酸序列。
關於本發明所使用之融合蛋白質，尤其理想為具有與TRAIL-R1結合而誘導細胞死亡之促效劑活性。TRAIL-R1係藉由凝集成三聚物以上而誘導細胞死亡，因此為了使TRAIL-R1活化，上述融合蛋白質尤佳為如上述般包含3個以上、4個以上、5個以上、或6個以上、例如3個、4個、5個、或6個之抗TRAIL-R1單鏈抗體。
作為本發明之一態樣，可列舉一種抗TRAIL-R1抗體，其CDR1包 含序列編號22所示之胺基酸序列，CDR2包含序列編號23所示之胺基酸序列，及CDR3包含序列編號24所示之胺基酸序列。該抗體之構架區之序列並無特別限定，例如可使用上述之Maass D.R之文獻所記載之序列，因此，FR1可包含序列編號18所示之胺基酸序列，FR2可包含序列編號19所示之胺基酸序列，FR3可包含序列編號20所示之胺基酸序列，及FR4可包含序列編號21所示之胺基酸序列。為了使TRAIL-R1活化，該抗體較佳為3價以上。又，該抗體可為如上述之人工抗體，例如嵌合抗體或人源化抗體。
對TRAIL-R1之促效性抗體係經由TRAIL-R1而誘導細胞死亡，因此本發明之抗體可用作細胞死亡誘導劑。
(ii)抗TRAIL-R2抗體
本發明中所謂「抗TRAIL-R2單鏈抗體」，係指針對TRAIL-R2(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 2，TRAIL受體2)之單鏈抗體。本發明所使用之抗TRAIL-R2單鏈抗體只要為與TRAIL-R2特異性地結合者，則沒有特別限定。作為本發明所使用之抗TRAIL-R2單鏈抗體，例如可列舉上述文獻WO2011/098520所記載之4E6。4E6係美洲駝單鏈VHH抗體，且其CDR1包含序列編號15所示之胺基酸序列，CDR2包含序列編號16所示之胺基酸序列，及CDR3包含序列編號17所示之胺基酸序列。
關於本發明所使用之融合蛋白質，尤其理想為具有與TRAIL-R2結合而誘導細胞死亡之促效劑活性。TRAIL-R2係藉由凝集成三聚物以上而誘導細胞死亡，因此為了使TRAIL-R2活化，上述融合蛋白質尤佳為如上述般包含3個以上、4個以上、5個以上、或6個以上、例如3個、4個、5個、或6個之抗TRAIL-R2單鏈抗體。
對TRAIL-R2之促效性抗體係經由TRAIL-R2而誘導細胞死亡，因此本發明之抗體可用作細胞死亡誘導劑。
(3)功能性肽
於上述融合蛋白質中任意包含功能性肽。本說明書中所謂「功能性肽」，係指於活體內或細胞內具有特定之生物活性、例如酶活性、觸媒活性、作為基質之功能、或生物學上抑制或亢進功能(例如細胞毒殺活性)之肽。具體而言，例如可列舉：螢光蛋白質或發光蛋白質、酶、或外毒素。
功能性肽所來自之生物種類可任意。又，功能性肽可為天然型或非天然型中之任一種。所謂天然型之功能性多肽，係指存在於自然界之肽。另一方面，所謂非天然型之功能性多肽，係指基於天然型之功能性多肽之胺基酸序列，於不喪失該功能性肽所具有之特有功能的範圍內向胺基酸序列導入適當之變異(進行了胺基酸之加成、缺失、取代者)而成之改變肽。
於上述融合蛋白質中，功能性肽亦可包含兩個以上。其中，於包含複數個功能性肽之情形時，融合蛋白質整體之分子量變得過大，因此功能性肽之總分子量可設為80kDa以下、較佳為40kDa以下。於包含兩個以上之功能性肽之情形時，各功能性肽之種類可相同亦可不同。例如可列舉：將外毒素與酶、或將外毒素與螢光蛋白質或發光蛋白質組合而成之功能性肽。於包含兩個以上之功能性肽之情形時，各功能性肽亦可直接連結，但較佳為利用適當之連接肽，將各功能性肽以可有效率地發揮獨自之功能之方式進行連結。連接肽之長度或胺基酸序列只要不妨礙功能性肽之功能，則無特別限定。可藉由使1個融合蛋白質包含兩個以上之不同功能性肽，而向單鏈抗體所識別之標的物質賦予不同之功能。
功能性肽只要於融合蛋白質中為訊息肽之C末端側，則無特別限制，但較佳為配置於上述單鏈抗體之C末端側。
以下，針對於本發明之重組細菌中可作為功能性肽發揮功能之 上述螢光蛋白質或發光蛋白質、酶、或者外毒素，具體地進行說明。(i)螢光蛋白質或發光蛋白質(標記蛋白質)
關於作為功能性肽之螢光蛋白質之種類，只要鹼基序列已知，則其種類無關緊要。可為上述天然型及非天然型中之任一種。其中，就上述理由而言，較佳為胺基酸長度較短者。又，激發波長、螢光波長亦無特別限定。該等波長只要視狀況及需要而適當選擇即可。作為具體之螢光蛋白質，例如可列舉：CFP、RFP、DsRed、YFP、PE、PerCP、APC、GFP等。
又，關於發光蛋白質，只要鹼基序列已知，則其種類無關緊要。與上述螢光蛋白質同樣地，可為天然型及非天然型中之任一種，但較佳為胺基酸長度較短者。作為具體之發光蛋白質，例如可列舉：水母素(aequorin)等。
(ii)酶
關於作為功能性肽之酶之種類，只要鹼基序列已知，則其種類無關緊要。可為直接作用於標的物質之酶，亦可為未直接作用於標的物質而於其周邊發揮功能之酶。作為後者之具體例，可列舉：有助於發光之螢光素酶、過氧化酶(例如辣根過氧化酶)等。於上述單鏈抗體連結有酶之融合蛋白質可作為免疫酶(Immuno enzyme)發揮功能。
(iii)外毒素
所謂「外毒素」(exotoxin)，係細菌向菌體外分泌之毒性蛋白質。外毒素只要具有細胞毒殺活性，且其鹼基序列已知，則不問其種類。例如可列舉：綠膿桿菌毒素(Pseudomonas toxin；PT)及其衍生物、例如自PT將細胞接著區域去除之外毒素A、白喉毒素(Diphtheria toxin：DT)及其衍生物、以及蓖麻毒蛋白(Ricin)及其衍生物(Brinkmann U.& Pastan I.,1994,Biochimica et Biophysica Acta,1198(1)：27-45)。關於綠膿桿菌外毒素A，已知藉由向癌細胞內滲入後， 使EF-2進行ADP核糖基化而進行惰性化，而抑制蛋白質合成，從而發揮較強之殺細胞效果。於上述單鏈抗體連結有外毒素之融合蛋白質可作為(免疫毒素(Immuno toxin)發揮功能。
1-2-2.表現盒之構成
本說明書中所謂「表現盒」，係指包含上述融合基因，且可將其作為融合蛋白質而設為可表現之狀態的表現系統。本說明書中所謂「可表現之狀態」，係指將該表現盒所包含之融合基因以於重組細菌內可表現之方式配置於基因表現所必須之元件之控制下的狀態。基因表現所必須之元件可列舉：啟動子及終止子。
啟動子只要為於重組細菌內可作動之啟動子，則無特別限制，較佳為來自所使用之偏性厭氣性革蘭氏陽性菌之啟動子。例如於偏性厭氣性革蘭氏陽性菌使用雙叉桿菌之長雙叉桿菌之情形時，可列舉長雙叉桿菌之hup基因啟動子(序列編號25)。又，對於啟動子而言，根據其表現控制之性質，已知有過度表現型啟動子、組成型啟動子、部位特異型啟動子、階段特異型啟動子、或誘導型啟動子等。本發明中之表現盒所使用之啟動子可為任意之啟動子，並無特別限定。只要視需要進行適當選擇即可。較佳為過度表現型啟動子或組成型啟動子。上述表現盒中，啟動子係配置於較上述融合基因之起始密碼子上游之5'側。
終止子只要為於重組細菌內可將藉由上述啟動子而轉錄之基因之轉錄終止的序列，則無特別限定。例如可列舉如組織蛋白之蛋白質終止子(HUT)(序列編號26)。較佳為來自與啟動子同一生物種類之終止子，更佳為於啟動子所來自之生物種類之基因組上，與該啟動子成為一組之終止子。於上述表現盒中，終止子係配置於較上述融合基因之終止密碼子下游之3'側。
為了使上述融合蛋白質於重組細菌內穩定地表現，而可將包含 表現盒之載體作為表現載體而導入上述重組細菌體內。或者，亦可經由同源性重組而插入上述重組細菌之基因組內。於使用表現載體之情形時，載體可使用質體等。載體係使用於本發明之重組細菌內可複製，又於菌體內得以穩定保持之包含適當之選拔標記基因者。載體亦可為即便於大腸桿菌等其他細菌內亦可複製之梭子載體。例如可列舉：pKKT427、pBESAF2、pPSAB1等。於向重組細菌之基因組內插入之情形時，亦可僅將融合基因以成為於重組細菌之基因組中可表現之狀態之方式插入。即，亦可於重組細菌之內在性之啟動子或終止子之控制下插入融合基因。
表現盒可為於1個表現盒內包含1個融合基因之單順反子，亦可為包含兩個以上之融合基因之多順反子。
1-3.重組偏性厭氣性革蘭氏陽性菌之製造方法
本發明之重組細菌可使用該領域中所公知之分子遺傳學方法而進行製造。例如，若為上述融合基因，則只要使用例如Green and Sambrook,Molecular Cloning,4th Ed(2012),Cold Spring Harbor Laboratory Press或Ausubelet al.,Short Protocols in Molecular Biology,3rd Ed.,A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995),John Wiley & Sons所記載之方法，構建分別編碼訊息肽、及單鏈抗體之核酸即可。
於取得上述單鏈抗體中，可使用編碼與TRAIL-R1或TRAIL-R2結合之抗體之基因之鹼基序列資訊。該抗體之鹼基序列資訊例如亦可基於上述之CDR及FR之鹼基序列。
於新製作對TRAIL-R1或TRAIL-R2之抗體之情形時，對該等之單株抗體之製作只要依據該領域中公知之方法進行即可。以下，表示其製作例。
將設為標的之TRAIL-R1或TRAIL-R2之細胞外區域作為免疫原向 駝科動物投予而進行免疫。若需要，則亦可為了有效地進行免疫而添加佐劑。作為佐劑之例，可列舉：市售之完全弗氏佐劑(FCA)、不完全弗氏佐劑(FIA)等，可將該等單獨或混合使用。關於免疫原溶液之1次投予量，只要上述動物每匹含有約50~200μg之免疫原即可。免疫之間隔並無特別限定，初次免疫後，以數日至數週之間隔，較佳為以1~4週之間隔進行2~10次、較佳為5~7次追加免疫。初次免疫後，藉由ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，酶聯免疫吸附測定)法等反覆進行免疫動物之血清中之抗體效價之測定。繼而，自經免疫之動物採取抗體產生細胞。作為抗體產生細胞，可列舉：脾臟細胞、淋巴結細胞、末梢血液細胞等，較佳為末梢血液細胞。繼而，自末梢血液細胞提取RNA，使用寡聚胸苷酸(oligo(dT))引子及無規6mer引子而合成cDNA。自該cDNA，藉由PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應)而擴增駝科單鏈抗體之可變區域(VHH區域)之基因，將上述基因組入pCANTAB6(McCafferty J.,et al.,1994,Appl.Biochem.Biotech.,47,157-173)等噬菌體載體，利用電穿孔法導入至大腸桿菌TG1。使M13K07輔助噬菌體(helper phage)感染上述大腸桿菌TG1，將噬菌體進行回收，藉此取得駝科單鏈抗體可變區域(VHH區域)表現噬菌體基因庫。標準而言，成為1×107pfu種類以上之基因庫。
於對表現對標的抗原之抗體之噬菌體進行篩選時，進行生物淘選(biopanning)。其係藉由將如下操作進行3次至5次而將對標的抗原特異性之噬菌體進行濃縮之方式，上述操作係使固定化之標的抗原與抗體噬菌體基因庫反應，於藉由清洗而將未結合之噬菌體去除後，使所結合之噬菌體溶出並使之感染大腸桿菌而進行增殖。使所篩選之噬菌體再次感染於大腸桿菌TG1後，將包含VHH插入pCANTAB噬菌體載體之TG1選殖進行單離，使KO7輔助噬菌體感染於各TG1選殖，而獲 得呈現VHH抗體之選殖化噬菌體。自該等中選擇與抗原進行反應之選殖。自所取得之噬菌體可獲得抗體之鹼基序列。
融合基因係使用分子遺傳學方法以可表現之方式被插入上述表現盒內。表現盒視需要例如被導入質體等載體中。向載體導入表現盒時可採用如下方法等，即利用適當之限制酶將表現盒之5'末端及3'末端切斷，插入載體內之多選殖位點等所對應之限制部位。又，於載體為於本發明之重組細菌內可表現之表現用載體的情形時，亦可藉由將上述融合基因插入該表現用載體之表現控制區域內(載體內之啟動子及終止子間之多選殖位點等)，而於構建表現盒之同時構建目標之表現載體。關於該等具體之方法，例如請參照上述Green and Sambrook(2012)所記載之方法。
目標之重組細菌可藉由如下方式進行製造，即將上述表現載體、表現盒或融合基因導入作為藥劑傳遞用載體之偏性厭氣性革蘭氏陽性菌。關於將表現載體等向目標之偏性厭氣性革蘭氏陽性菌內導入之方法，只要使用該領域中公知之分子生物學方法即可。例如可使用電穿孔法(electroporation method)或磷酸鈣法之公知之方法。關於該等具體之方法，例如請參照上述Green and Sambrook(2012)所記載之方法。
2.抗腫瘤劑
2-1.概要
本發明之第2態樣係抗腫瘤劑。本發明中所謂「抗腫瘤劑」，係指對腫瘤細胞具有細胞毒殺活性，使該細胞細胞死亡，其結果可抑制腫瘤細胞之增殖之藥劑。其中，關於該抗腫瘤劑之藥效，只要可抑制腫瘤細胞之增殖即可，亦可不消滅腫瘤細胞。
本發明之抗腫瘤劑之特徵在於：將第1態樣之重組細菌設為有效成分。根據本發明之抗腫瘤劑，作為有效成分之重組細菌僅於腫瘤內 增殖，於腫瘤內分泌3個以上之抗TRAIL-R1單鏈抗體及/或3個以上之抗TRAIL-R2單鏈抗體，藉此可有效率地誘導腫瘤中之細胞死亡，而使腫瘤消退。
2-2.構成
本發明之抗腫瘤劑係如上述般以第1態樣之重組細菌為有效成分。關於該情形時之重組細菌，其融合基因編碼識別作為標的細胞之腫瘤細胞之表面抗原之一種，即TRAIL-R1並進行結合之單鏈抗體及/或識別作為標的細胞之腫瘤細胞之表面抗原之一種，即TRAIL-R2並進行結合之單鏈抗體。因此，本發明之抗腫瘤劑之作為有效成分之重組細菌係分泌細胞外分泌性抗腫瘤細胞融合蛋白質。
成為本發明之抗腫瘤劑之標的之腫瘤只要為表現TRAIL-R1及/或TRAIL-R2者，則不問良性、惡性，可為任一種腫瘤。例如可列舉：腦腫瘤、甲狀腺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、大腸癌、喉癌、肺癌、肝臟癌、腎癌、腎上腺癌、胰腺癌、膽道癌、子宮頸癌、子宮體癌、卵巢癌、乳癌、前列腺癌、膀胱癌、纖維肉瘤、肥大細胞瘤或黑色素瘤作為標的腫瘤。
於本發明之重組細菌表現融合基因之情形時，作為其產物之細胞外分泌性抗腫瘤細胞融合蛋白質係向細胞外分泌。所分泌之融合蛋白質係於單鏈抗體部分與作為標的物質之腫瘤細胞結合，使TRAIL-R1及/或TRAIL-R2多聚物化，藉此誘導細胞死亡。
本發明之作為有效成分之重組細菌以活菌狀態含於抗腫瘤劑中。本發明之第1態樣所記載之重組細菌於高濃度之氧存在下無法增殖而立刻死滅。因此，於活體內，可僅於氧分壓較低之部位增殖、生存。作為上述部位之代表例，可列舉：進展期癌中顯現之腫瘤(實體癌)之中心部位或腸道內。因此，本發明之抗腫瘤劑於藉由注射等而進行體內投予之情形時，可成為腫瘤選擇傳遞性較高之抗腫瘤劑。
又，本發明之抗腫瘤劑於不妨礙或抑制作為有效成分之重組細菌之生存、增殖、融合蛋白質之表現及分泌的範圍內，可與其他抗腫瘤劑併用。
本發明之抗腫瘤劑以將重組細菌以活菌狀態進行維持或保存為前提，原則上可利用該領域中公知之方法而進行製劑化。例如只要使用Remington's Pharmaceutical Sciences(Merck Publishing Co.,Easton,Pa.)所記載之方法即可。具體之製劑化之方法係根據投予方法而不同。投予方法大致分為經口投予與非經口投予，但於本發明之抗腫瘤劑之情形時，更佳為非經口投予。
於將本發明之抗腫瘤劑進行非經口投予之情形時，作為其具體例，可列舉：利用注射之投予。於利用注射將本發明之抗腫瘤劑進行投予之情形時，可以懸濁液劑之方式進行製備，該懸濁液劑係將重組細菌與製藥上可容許之溶劑進行混合，並視需要添加製藥上可容許之載體而成。
「製藥上可容許之溶劑」亦可為水或其以外之藥學上可容許之水溶液、或油性液中之任一種。作為水溶液，例如可列舉：包含生理鹽水、葡萄糖或其他補助劑之等張液。作為補助劑，例如可列舉：D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉、其他低濃度之非離子性界面活性劑(例如，聚山梨糖醇酯80(TM)、HCO-60)、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯類等。作為油性液，可列舉：芝麻油、大豆油，亦可與作為溶解輔助劑之苯甲酸苄酯或苄醇併用。又，亦可與緩衝劑，例如磷酸鹽緩衝液、乙酸鈉緩衝液；鎮靜劑，例如鹽酸普魯卡因；穩定劑，例如苄醇、苯酚；及抗氧化劑進行調配。
注射劑只要藉由如下方式進行製劑化即可，即適當與製藥上所容許之賦形劑、乳化劑、懸濁劑、界面活性劑、穩定劑、pH值調節劑等組合，並以通常所准許之製藥實施所要求之單位用量形態進行混 和。
關於注射，例如可列舉：血管內注射、淋巴管內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等，但就作為本發明之抗腫瘤劑之有效成分之重組細菌於腫瘤內增殖，而抑制該腫瘤細胞之增殖之機制而言，於腫瘤巢之位置並未明確之情形時，較佳為作為全身投予之血管內注射或淋巴管內注射等循環器官內投予。血管內注射有靜脈內注射及動脈內注射等，於投予本發明之抗腫瘤劑之情形時，可為任意。另一方面，於確定腫瘤巢之位置之情形時，除上述全身投予外，亦可為向腫瘤直接投予之局部投予。
關於將本發明之抗腫瘤劑進行經口投予之情形，除作為有效成分之重組細菌外，亦可添加製藥上可容許之載體。
所謂「製藥上可容許之載體」，係指為了使藥劑之製劑化或向活體之應用變容易，又維持作為有效成分之重組細菌之生存，而於不妨礙或抑制其菌體之作用之範圍內所添加之物質。例如可列舉：賦形劑、結合劑、崩解劑、填充劑、乳化劑、流動添加調節劑或潤滑劑。
作為「賦形劑」，例如可列舉：如單糖、二糖類、環糊精及多糖類之糖(具體而言，並無限定，包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、糊精、麥芽糊精、澱粉及纖維素)、金屬鹽(例如，磷酸鈉或磷酸鈣、硫酸鈣、硫酸鎂)、檸檬酸、酒石酸、甘胺酸、低、中、高分子量之聚乙二醇(PEG)、普朗尼克、或者該等之組合。
作為「結合劑」，例如可列舉：使用玉米、小麥、大米、或馬鈴薯之澱粉之澱粉糊、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉及/或聚乙烯吡咯啶酮等。
作為「崩解劑」，例如可列舉：上述澱粉、或羧甲基澱粉、交聯聚乙烯吡咯啶酮、瓊脂、海藻酸或海藻酸鈉或該等之鹽。
作為「填充劑」，例如可列舉：上述糖及/或磷酸鈣(例如，磷酸三鈣、或磷酸氫鈣)。
作為「乳化劑」，例如可列舉：山梨醇酐脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯。
作為「流動添加調節劑」及「潤滑劑」，例如可列舉：矽酸鹽、滑石、硬脂酸鹽或聚乙二醇。
除上述以外，亦可視需要而包含矯味矯臭劑、懸濁劑、稀釋劑、界面活性劑、增量劑、附濕劑、保濕劑(例如甘油、澱粉等)、吸附劑(例如澱粉、乳糖、高嶺土、膨潤土、膠狀矽酸等)、崩解抑制劑(例如白糖、硬脂、可可脂、氫化油等)、塗佈劑、著色劑、保存劑、抗氧化劑、香料、調味劑、甜味劑、緩衝劑等。只要視需要，適當使用一個或兩個以上之如上述之載體即可。
作為經口疫苗劑之劑形，例如可列舉：固形劑(包括片劑、丸劑、舌下片劑、膠囊劑、滴劑)、顆粒劑、粉劑、散劑、液劑等。進而關於固形劑，可視需要而製成該領域中公知之實施了包衣之劑形，例如糖衣藥丸、明膠包衣錠、腸溶錠、膜衣錠、雙層錠、多層錠。關於劑形之具體形狀、尺寸，均只要各劑形處於該領域中公知之劑形之範圍內即可，並無特別限定。
關於本發明之抗腫瘤劑中之重組細菌之含量，只要為原則上可以1次投予而達到該菌體可於標的腫瘤中生存且增殖之狀態的量，且基本上或完全不會對應用其之受檢體產生有害之副作用的量即可。此種含量係根據抗腫瘤劑之標的細胞之種類、癌之進展度、腫瘤之大小、全身之腫瘤巢數、抗腫瘤劑之劑形及投予方法而不同，因此可考慮各條件而適當決定。
本說明書之抗腫瘤劑之投予對象係具有腫瘤或者具有腫瘤之可能性較高之受檢體。本說明書中所謂「受檢體」，係指應用本發明之 抗腫瘤劑之動物。例如哺乳動物，較佳為人類、狗、貓、馬、小鼠、大鼠、兔、牛、猴等，更佳為人類。
2-3.效果
根據本發明之抗腫瘤劑，作為有效成分之重組細菌僅於氧分壓較低之腫瘤內生存及增殖，而分泌抗腫瘤細胞融合蛋白質。因此，可將該融合蛋白質有效率地傳遞至腫瘤細胞，且使該融合蛋白質連續地發揮作用。又，藉由融合蛋白質之作用而抑制腫瘤細胞之增殖，若由於腫瘤消退而組織中之氧分壓變高，則作為偏性厭氣性革蘭氏陽性菌之重組細菌變得無法生存，因此可自動地自活體內排除。藉此，可提供一種較先前之細菌療法安全且簡便之治療法，該治療法係針對實體癌，利用非病原性之偏性厭氣性菌，於不投予其他抗腫瘤藥之情況下可藉由單獨向靜脈內進行投予而發揮抗腫瘤效果。
又，本發明之抗腫瘤劑具有如下優點：因可靜脈內注射，故而對受檢體之侵入性亦較低。
3.腫瘤檢測用標記
3-1.概要
本發明之第3態樣係腫瘤檢測用標記。本發明中所謂「腫瘤檢測用標記」，係可於活體內檢測出腫瘤之標記。
本發明之腫瘤檢測用標記之特徵在於：以第1態樣之重組細菌為有效成分。根據本發明之腫瘤檢測用標記，藉由作為有效成分之重組細菌僅於腫瘤內增殖，並於腫瘤內分泌酶、螢光蛋白質或發光蛋白質，而可檢測活體內之腫瘤之位置或大小。
3-2.構成
基本構成係依照第2態樣之抗腫瘤劑。因此，此處主要對與上述抗腫瘤劑不同之方面進行說明，關於重複之構成，原則上省略。
本發明之腫瘤檢測用標記係如上述般以第1態樣之重組細菌為有 效成分。關於該情形時之重組細菌，其融合基因編碼識別作為標的細胞之腫瘤細胞之表面抗原並進行結合之單鏈抗體，且功能性肽為標記蛋白質或誘導標記化之蛋白質。作為標記蛋白質，例如可列舉：上述之螢光蛋白質或發光蛋白質。又，作為誘導標記化之蛋白質，可列舉：如螢光素或發光胺之以發光素或螢光素為基質之酶(螢光素酶或過氧化酶)。因此，作為本發明之腫瘤檢測用標記之有效成分之重組細菌變得分泌細胞外分泌性抗腫瘤細胞免疫標記(免疫標記子)。
於本發明之重組細菌表現融合基因之情形時，作為其產物之細胞外分泌性抗腫瘤細胞免疫標記係向細胞外分泌。所分泌之免疫標記係於單鏈抗體部分與作為標的物質之腫瘤細胞之細胞膜上之TRAIL-R1或TRAIL-R2結合，從而該細胞被標記化。具體而言，於功能性肽為如發光蛋白質或螢光蛋白質之標記蛋白質的情形時，藉由與單鏈抗體部分連結之該等標記蛋白質而將腫瘤細胞直接標記化。另一方面，於功能性肽為酶之情形時，藉由與單鏈抗體部分連結之酶而將腫瘤細胞進行酶標記。
本發明之腫瘤檢測用標記可與第2態樣之抗腫瘤劑併用。於該情形時，作為有效成分之重組細菌可為使腫瘤檢測用標記與抗腫瘤劑作為各自獨立之分子進行分泌，即分泌包含識別同一標的物質之單鏈抗體之不同之融合蛋白質的相同或不同之重組細菌，亦可為分泌於功能性蛋白質部分包含外毒素與標記蛋白質或酶之1個融合蛋白質的重組細菌。於該等情形時，變得可於將同一腫瘤細胞進行標記化之同時，藉由外毒素之作用而毒殺腫瘤細胞。
又，亦可於不妨礙或抑制作為有效成分之重組細菌之生存、增殖、免疫標記之表現、及分泌之範圍內，與其他抗腫瘤劑併用。
3-3.檢測
於將本發明之腫瘤檢測用標記投予至受檢體之情形時，只要該 個體具有腫瘤，則作為有效成分之重組細菌於該腫瘤內增殖並分泌抗腫瘤細胞免疫標記。所分泌之免疫標記將腫瘤細胞進行標記化。關於被標記化之腫瘤細胞之檢測，於免疫標記為如發光蛋白質或螢光蛋白質之標記蛋白質之情形時，只要檢測該標記蛋白質本身所發出之光或螢光即可，又於免疫標記為酶標記之情形時，只要檢測被投予至活體內之螢光素等基質之由酶反應引起之發光或螢光即可。免疫標記之檢測方法並無特別限定。因腫瘤大多存在於活體內部，故而可藉由開腹等手術而使腫瘤露出後檢測免疫標記，亦可自體外非侵入性地檢測活體內之發光或螢光。較佳為自體外進行檢測之方法。作為自體外檢測來自免疫標記之發光或螢光之方法，並無限定，例如可使用體內生物影像法。例如，可使用Katz,M.H.et al.,2003,Cancer Res.63：5521-5525、Schmitt,C.A.et al.,2002,Cancer Cell,1：289-298,Katz,M.H.et al.,2003,J.Surg.Res.,113：151-160等所記載之方法而進行檢測。亦可藉由市售之IVIS Imaging System(Caliper)或與其類似之裝置而進行檢測。
3-4.效果
根據本發明之腫瘤檢測用標記，可基於免疫標記而自活體外部監測活體內之腫瘤之位置及大小。又，可藉由將本發明之腫瘤檢測用標記與第2態樣之抗腫瘤劑進行併用，而利用免疫毒素抑制腫瘤細胞之增殖，並且利用免疫標記自活體外部檢測活體內之腫瘤，藉此變得可經時監測腫瘤之消退或治療效果。
[實施例] <實施例1：雙叉桿菌表現用抗人類TRAIL-R2基因表現盒之製作>
(1)雙叉桿菌表現用抗hTRAIL-R2 VHH抗體四聚物(4E6四聚物)之基因表現盒
使用來自長雙岐桿菌hup基因之啟動子區域(序列編號25)、來自 長雙岐桿菌之usp分泌訊息序列(序列編號29)、DTY(訊息序列後插入序列)、WO/2011/098520所記載之4E6之胺基酸序列、來自8C7 EGFP基因之(GGSGG)2連接肽(序列編號28)、及來自如組織蛋白之蛋白質之終止子(HUT)(序列編號26)，而DNA合成於C末端加成有編碼His-Tag序列之DNA之基因(序列編號1)。
(2)雙叉桿菌表現用抗hTRAIL-R2 VHH抗體二聚物綠膿桿菌外毒素A次單元融合體(4E6二聚物毒素)之基因表現盒
使用來自長雙岐桿菌hup基因之啟動子區域(序列編號25)、來自長雙岐桿菌之usp分泌訊息序列(序列編號29)、DTY(訊息序列後插入序列)、WO/2011/098520所記載之4E6之胺基酸序列、來自8C7 EGFP基因之(GGSGG)2連接肽(序列編號28)、綠膿桿菌外毒素A(被編碼為pJH8(自ATCC購入)之ExotoxinA之DNA序列)、及來自如組織蛋白之蛋白質之終止子(HUT)(序列編號26)，而DNA合成於C末端加成有編碼His-Tag序列之DNA之基因(序列編號2)。
(3)雙叉桿菌表現用抗hTRAIL-R2 VHH抗體二聚物綠色螢光蛋白質融合體(4E6二聚物EGFP)之基因表現盒
使用來自長雙岐桿菌hup基因之啟動子區域(序列編號25)、來自長雙岐桿菌之usp分泌訊息序列(序列編號29)、DTY(訊息序列後插入序列)、及來自如組織蛋白之蛋白質之終止子(HUT)(序列編號26)，而於4E6二聚物基因之3'末端加成來自8C7 EGFP基因之(GGSGG)2連接肽(序列編號28)+EGFP(Zhang G.et al.,1996,Biochem Biophys Res Commun,227(3)：707-711)基因+編碼His-Tag序列之DNA序列(序列編號3)。
<實施例2：hTRAIL-R1：Fc、hTRAIL-R2：Fc、mTRAIL-R2：Fc分泌表現果蠅培養細胞之製作與重組蛋白質之純化>
(1)基因表現盒之製作
(1-1)果蠅培養細胞表現用人類TRAIL-R1：羊駝Fc(hTRAIL-R1：Fc)之基因表現盒
合成由KpnI酶切位點、轉譯起始一致序列(Cavener D.R.,1987,Nucleic Acids Res.15,1353-1361)、Bip分泌訊息(Life Technologies)、hTRAIL-R1細胞外區域(寄存編號AAC51226、109~239胺基酸)、IEGRMD連結子(序列編號27)、Lama pacos(alpaca)IgG1 Fc(寄存編號AM773729、102~335胺基酸)、His-Tag序列、終止密碼子、XhoI酶切位點所構成之DNA。(序列編號4)
(1-2)果蠅培養細胞表現用人類TRAIL-R2：羊駝Fc(hTRAIL-R2：Fc)之基因表現盒
合成由KpnI酶切位點、轉譯起始一致序列(Cavener D.R.,1987,Nucleic Acids Res.15,1353-1361)、Bip分泌訊息(Life Technologies)、hTRAIL-R2細胞外區域(寄存編號Q6FH58、54~182胺基酸)、IEGRMD連結子(序列編號27)、Lama pacos(alpaca)IgG1 Fc(寄存編號AM773729、102~335胺基酸)、His-Tag序列、終止密碼子、XhoI酶切位點所構成之DNA。(序列編號5)
(1-3)果蠅培養細胞表現用小鼠TRAIL-R2：羊駝Fc(mTRAIL-R2：Fc)之基因表現盒
合成由KpnI酶切位點、轉譯起始一致序列(Cavener D.R.,1987,Nucleic Acids Res.15,1353-1361)、Bip分泌訊息(Life Technologies)、mTRAIL-R2細胞外區域(寄存編號Q9QZM4、52~177胺基酸)、IEGRMD連結子(序列編號27)、Lama pacos(alpaca)IgG1 Fc(寄存編號AM773729、102~335胺基酸)、His-Tag序列、終止密碼子、XhoI酶切位點所構成之DNA。(序列編號6)
(2)hTRAIL-R1：Fc、hTRAIL-R2：Fc、mTRAIL-R2：Fc分泌表現果蠅培養細胞之製作與重組蛋白質之純化
為了獲得將hTRAIL-R1、hTRAIL-R2、mTRAIL-R2之細胞外區域與羊駝IgG1之Fc融合而成之蛋白質，而製作將該等重組蛋白質於作為果蠅培養細胞之S2細胞中分泌表現之載體、pAc5.1/hTRAIL-R1 Fc、pAc5.1/hTRAIL-R2 Fc、pAc5.1/mTRAIL-R2 Fc。於pAc5.1/V5-HisA質體(Life Technologies)之KpnI、XhoI酶切位點插入重組蛋白質之S2分泌表現基因盒。藉由磷酸鈣法，與包含潮黴素耐性基因之pCoHygro質體(Life Technologies)以19：1之比例導入S2細胞。細胞係於包含300μg/mL潮黴素(Life Technologies)、10%胎牛血清(Tissue Culture Biologicals)之Schneider's果蠅細胞培養基(Life Technologies)中進行培養，而獲得藥劑耐性細胞。藥劑耐性細胞(1×107細胞/mL)係於包含20mM麩醯胺之EXPRESS FIVE SFM(Life Technologies)中進行培養，於第7天回收培養上清液。重組蛋白質係使用TALON樹脂(TAKARA BIO)進行純化。具體而言，向填充有TALON樹脂之管柱添加培養上清液後，利用清洗緩衝劑(25mM HEPES pH值7.4，0.3M NaCl，5mM咪唑)進行清洗，於溶出緩衝劑(25mM HEPES pH值7.4，0.3M NaCl，150mM咪唑)中使重組蛋白質溶出。純化蛋白質係進行SDS-聚丙烯醯胺電泳，利用Coomassie Brilliant Blue(CBB，庫馬斯亮藍)R-250(Bio-Rad)進行染色，而確認各蛋白質之純化(圖4)。
<實施例3：E.coli BL21(DE3)中之重組4E6單體蛋白質之表現‧純化、及結合活性>
(1)大腸桿菌表現用抗hTRAIL-R2 VHH抗體/Myc-Tag(4E6單體)基因表現盒之製作
基於WO/2011/098520所記載之4E6 VHH單體之胺基酸序列資訊，而DNA合成大腸桿菌表現用之基因(序列編號7)。
(2)4E6單體之利用大腸桿菌之表現‧純化
表現4E6單體之載體係插入pET22b(+)之NdeI與NotI部位。向 E.coli BL21StarTM(DE3)One Shot(Life technologies)導入本表現載體質體DNA。依據附屬指南，使用添加有100mL之100μg/mL安比西林(Sigma-Aldrich)之2YT培養基，於37℃下培養重組大腸桿菌，於達到OD600=0.4~0.5時，添加0.5mM IPTG(異丙基-β-硫代半乳呋喃糖苷、TAKARA BIO)，於30℃下培養3小時。培養結束後，回收大腸桿菌，於10mL之提取緩衝劑(50mM磷酸鈉(Na Phosphate)pH值7.8，300mM NaCl，無EDTA之蛋白酶抑制劑混合液(Roche))中進行再懸濁。於冰中使用Sonifier 250(Branson)，於Output Control 2、Duty cycle 80%之條件下進行超音波處理1分鐘並進行2次，而使菌體破碎。於4℃下將處理後之懸濁液以15000rpm進行20分鐘離心處理，回收上清液。融合蛋白質之純化係使用His Trap管柱(GE Healthcare UK)。將超音波處理懸濁液之離心上清液直接灌至His Trap管柱，利用結合緩衝劑(20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，20mM咪唑(Imidazole)pH值7.4)將管柱進行清洗後，於包含500mM咪唑之溶出液中使融合蛋白質溶出。將純化樣品供於15%丙烯醯胺SDS電泳，利用CBB進行染色，確認被純化為約15KDa之4E6單體蛋白質，與BSA(牛血清白蛋白蛋白質)之染色進行比較，而算出4E6單體之濃度。其結果為，4E6單體之濃度為~3μg/μl(圖5)。
(3)利用ELISA確認4E6單體向hTRAIL-R2：Fc抗原之結合活性
hTRAIL-R2：Fc係如實施例2般進行製備。向96孔IMMUNO PLATE(Nunc)，以50μL/孔之方式添加0.1M NaHCO3(空白組)、或包含1μg/mL或10μg/mL之BSA之0.1M NaHCO3(BSA陰性抗原)、或包含1μg/mL或10μg/mL之hTRAIL-R2：Fc之0.1M NaHCO3，於4℃下放置一夜。向其添加350μL/孔之SuperBlock-PBS(Thermo Scientific)，於室溫下放置1小時。利用400μL/孔之PBS-T(包含0.05%吐溫20之磷酸緩衝生理鹽水)進行清洗後，添加40μL/孔之包含1μg/mL之4E6單體之 SuperBlock-PBS，於室溫下反應1小時。再次利用400μL/孔之PBS-T清洗3次，添加利用40μL/孔之SuperBlock-PBS稀釋了500倍之抗Myc小鼠單株抗體9E10(Santa Cruz Biotechnology)，於室溫下反應1小時。利用400μL/孔之PBS-T清洗3次，以40μL/孔之方式添加抗小鼠IgG山羊抗體HRP，於室溫下放置1小時。其後，利用400μL/孔之PBS-T清洗3次，以50μL/孔添加TMB試劑(和光純藥)，反應10分鐘左右後，利用0.5M硫酸使反應停止。其後，對450nm之吸光度進行測定，算出進行三次重複所測得之平均值與標準偏差。純化之4E6單體蛋白質係與hTRAIL-R2：Fc特異性地結合(圖6)。
(4)4E6單體與hTRAIL-R2 ECD(extracellular domain，細胞外區域)之解離常數(KD)之測定
利用使用Biacore X-100(GE healthcare)之表面電漿子共振法，對4E6單體與hTRAIL-R2：Fc(參照實施例2)之結合親和性進行解析。測定係依據Biacore X-100所附屬之說明書，利用多循環動力學法而進行，且以0.919nM、1.838nM、3.675nM、7.35nM、14.7nM、29.4nM、58.8nM、及117.6nM對4E6單體進行測定。
將各濃度下之感測圖及擬合曲線示於圖7。4E6單體與重組人類TRAIL-R2：Fc抗原之KD值為7.5×10-11M。
<實施例4：新穎抗hTRAIL-R1 VHH抗體(4P6單體)之取得>
(1)新穎抗hTRAIL-R1 VHH抗體(4P6單體)基因之單離
抗TRAIL-R1 VHH抗體在此之前並未為人所知，因此藉由以下之方法而製作。即，以Maass等人之文獻(J Immunol Methods.,2007,324,13-25)為參考，藉由噬菌體顯示法而將與hTRAIL-R1：人類Fc(R&D Systems)結合之VHH抗體基因單離。將100μg之hTRAIL-R1：羊駝Fc每隔1~2週對羊駝進行6次免疫，8週後，回收白血球，使用RNeasy(Qiagen、Venlo、Netherland)提取RNA。藉由PrimeScriptII 1st strand cDNA synthesis kit(TAKARA BIO)，使用寡聚胸苷酸引子、無規6引子，自該RNA合成cDNA。VHH抗體基因係藉由PrimeSTAR GXL DNA polymerase(TAKARA BIO)，以將95℃ 1分鐘進行1個循環，將98℃ 10秒鐘、55℃ 15秒鐘、68℃ 1分鐘進行25個循環之方式進行PCR而擴增。針對該擴增產物，以將95℃ 1分鐘進行1個循環，將98℃ 10秒鐘、60℃ 15秒鐘、68℃ 1秒鐘進行20個循環之方式同樣地進行PCR而擴增抗體基因。PCR係使用具有引子DNA序列1(序列編號8)及引子DNA序列2(序列編號9)之DNA序列之引子。所單離之抗體基因之序列(4P6)係使用BigDye Terminator v3.1(Life Technologies)，藉由循環測序法而決定。其結果為，所單離之抗體之CDR1具有序列編號22所示之胺基酸序列，CDR2具有序列編號23所示之胺基酸序列，及CDR3具有序列編號24所示之胺基酸序列。
(2)果蠅培養細胞表現用4P6單體基因表現盒之製作
合成由KpnI酶切位點、轉譯起始一致序列(Cavener D.R.,1987,Nucleic Acids Res.15,1353-1361)、Bip分泌訊息(Life Technologies)、4P6基因、His-Tag序列、Myc-Tag序列、終止密碼子、XhoI酶切位點所構成之DNA。
(3)抗hTRAIL-R1 VHH抗體單體(4P6單體)分泌表現果蠅培養細胞之製作與重組蛋白質之純化
於pAc5.1/V5-HisA質體(Life Technologies)之KpnI、XhoI酶切位點之間插入上述(2)之基因表現盒，藉此製作將4P6單體於作為果蠅培養細胞之S2細胞中進行分泌表現之載體、pAc5.1/4P6單體。藉由磷酸鈣法，將該質體與包含潮黴素耐性基因之pCoHygro質體以19：1之比例導入S2細胞。細胞係於包含300μg/mL潮黴素(Life Technologies)、10%胎牛血清之Schneider's果蠅細胞培養基(Life Technologies)中進行培養，而獲得藥劑耐性細胞。藥劑耐性細胞係於包含20mM麩醯胺之 EXPRESS FIVE SFM(Life Technologies)中進行培養，而獲得培養上清液。4P6單體係藉由HisTrap管柱(GE Healthcare)進行純化。純化蛋白質係進行12.5% SDS-聚丙烯醯胺電泳，利用Oriole Fluorescent Gel Stain(Bio-Rad)進行染色(圖8)。
<實施例5：抗hTRAIL-R1 VHH抗體單體(4P6單體)之結合特異性及與hTRAIL-R1之親和性之測定>
(1)4P6單體及4E6單體之利用ELISA之結合特異性之解析
藉由ELISA而研究4P6單體選擇性地與TRAIL-R1結合之情況。向96孔之NUNC-IMMUNO PLATE(Thermo Scientific)添加溶解於0.1M NaHCO3之1μg/mL之hTRAIL-R1：Fc、hTRAIL-R2：Fc、mTRAIL-R2：Fc(參照實施例2)、牛血清血蛋白(Bovine serum albumin)50μL，於4℃下放置一夜。添加SuperBlock(TBS)填充緩衝液(Blocking Buffer)(Thermo Scientific)300μL，於室溫下放置1小時。將各孔之溶液去除後，將以10μg/mL溶解於填充緩衝液之4P6單體或4E6單體以50μL/孔之方式進行添加，於室溫下放置1小時。利用包含0.05%吐溫20之PBS清洗3次後，添加50μL之以67ng/mL溶解於填充緩衝液之9E10抗Myc抗體(Santa Cruz Biotechnology)，於室溫下放置1小時。清洗3次後，添加50μL之溶解於填充緩衝液之抗小鼠IgG HRP，於室溫下放置1小時。清洗3次後，添加TMB溶液(和光純藥)50μL，於室溫下放置10分鐘。添加50μL之0.5M硫酸，測定450nm之吸光度。將各樣品每2孔進行解析，算出測定值之平均值與誤差。可確認4P6單體與hTRAIL-R1特異性地結合，4E6單體與hTRAIL-R2特異性地結合(圖9)。
(2)抗hTRAIL-R1 VHH抗體單體(4P6單體)與hTRAIL-R1 ECD(extracellular domain，細胞外區域)之解離常數之測定
利用使用Biacore X-100(GE Healthcare)之表面電漿子共振法，對 4P6單體與重組人類TRAIL-R1 ECD之結合親和性進行解析。將hTRAIL-R1：Fc(hTRAIL-R1：Fc，參照實施例2)以約1000RU固定於感測片(CM5)。測定係依據BiacoreX-100所附屬之說明書，利用單循環動力學(single cycle kinetics)法而進行，以0.1nM、0.5nM、2.5nM、12.5nM、62.5nM之順序連續地添加4P6單體而進行測定。將感測圖及擬合曲線示於圖10。KD值(解離常數)為3.4×10-11M。
(3)4P6單體及4E6單體之拮抗劑活性
對4P6單體是否與癌細胞之hTRAIL-R1結合而對誘導細胞死亡之hTRAIL顯現拮抗劑活性進行解析。使人類大腸癌Colo205細胞於添加有10%胎牛血清(Tissue Culture Biologicals)之RPMI1640培養基(Sigma)中懸濁，向Falcon 96孔培養皿(Becton Dickinson)，以3×103cells/50μL培養基/孔之方式添加細胞。培養一夜，添加各50μL之最終濃度100ng/mL之TRAIL、與以各種濃度包含4P6單體、抗hTRAIL-R2 VHH抗體(4E6單體)之培養基。進而培養一夜，添加10μL之活細胞數測定試劑SF(Nacalai Tesque)，培養2小時後測定450nm之吸光度。將未添加細胞之僅培養基之孔作為背景並扣除。將僅細胞之孔設為100%，並以其相對值為資料。以各濃度3孔之平均值+標準偏差進行表示。如圖11所示，4P6單體、4E6單體單獨無法抑制由TRAIL引起之細胞死亡。然而，若同時添加4P6單體與4E6單體，則抑制劑量依賴性之細胞死亡。hTRAIL、4P6單體、4E6單體之分子量基本上相等，因此VHH抗體100ng/mL與hTRAIL 100ng/mL莫耳濃度基本上相等。根據以上之結果而表示如下情況，即4P6單體、4E6單體不僅分別與細胞表面之hTRAIL-R1、hTRAIL-R2結合，而且作為拮抗劑發揮作用。
可以上述方式取得與hTRAIL-R1特異性地結合，且作為拮抗劑亦可發揮作用之作為新穎抗體的4P6。
<實施例6：4E6二聚物毒素、4E6二聚物EGFP、及4E6四聚物、重 組E.coli BL21(DE3)之製作及重組蛋白質之表現‧純化>
(1)基因表現盒之製作
(1-1)大腸桿菌表現用抗hTRAIL-R2 VHH抗體二聚物綠膿桿菌外毒素A次單元融合體(4E6二聚物毒素)基因表現盒之製作
大腸桿菌表現用4E6二聚物毒素基因係以插入pBluescriptII(+)質體而成之雙叉桿菌表現用4E6二聚物毒素基因表現盒(序列編號2)為模板，使用引子DNA序列5(序列編號12)及6(序列編號13)而進行利用PCR之擴增。關於PCR之條件，係使用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(TAKARA BIO)作為DNA聚合酶，以將95℃ 1分鐘進行1個循環，將98℃ 10秒鐘、60℃ 15秒鐘、68℃ 2分鐘進行25個循環之方式實施PCR。擴增產物係使用MinElute管柱(Qiagen)，依據隨附之操作說明而進行純化，利用NdeI及NotI進行限制酶消化後，利用1.2%瓊脂糖進行電泳，自凝膠切下目標之蛋白質帶，使用DNA凝膠提取套組(Qiagen)，依據隨附之操作說明而進行純化單離。將其插入pET-22b(+)(Novagen)之NdeI與NotI部位，而構建於N末端具有Strep Tag(Schmidt T.G.,Skerra A.,2007,Nat Protoc.2(6)：1528-1535)，利用(GGSGG)2連接肽(序列編號28)將2個VHH單體彼此連結，且於4E6二聚物之C末端經由XbaI序列(SerArg)而結合有綠膿桿菌外毒素次單元A(Toxin)之4E6二聚物毒素(圖12a)。
(1-2)大腸桿菌表現用抗hTRAIL-R2 VHH抗體二聚物緑色螢光蛋白質融合體(4E6二聚物EGFP)基因表現盒之製作
大腸桿菌表現用4E6二聚物EGFP基因係以插入pBluescriptII(+)質體而成之雙叉桿菌表現用4E6二聚物毒素基因表現盒(序列編號3)為模板，使用引子DNA序列5(序列編號12)及7(序列編號14)而進行利用PCR之擴增。關於PCR之條件，係使用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(TAKARA BIO)作為DNA聚合酶，以將95℃ 1分鐘進行1個 循環，將98℃ 10秒鐘、60℃ 15秒鐘、68℃ 2分鐘進行25個循環之方式實施PCR。擴增產物係使用MinElute管柱(Qiagen)，依據隨附之操作說明而進行純化，利用NdeI及NotI進行限制酶消化後，利用1.2%瓊脂糖進行電泳，自凝膠切下目標之蛋白質帶，使用DNA凝膠提取套組(Qiagen)，依據隨附之操作說明而進行純化單離。將其插入pET-22b(+)(Novagen)之NdeI與NotI部位，而構建於N末端具有Strep Tag，利用(GGSGG)2連接肽(序列編號28)將2個VHH單體彼此連結，且於4E6二聚物之C末端經由XbaI序列(SerArg)而結合有於N末端結合有(GGSGG)2連接肽(序列編號28)之綠色螢光蛋白質(EGFP)的4E6二聚物EGFP(圖12b)。
(1-3)大腸桿菌表現用抗hTRAIL-R2 VHH抗體四聚物(4E6四聚物)基因表現盒之製作
大腸桿菌表現用4E6四聚物基因係以插入pEX-K質體而成之雙叉桿菌表現用4E6四聚物基因表現盒(序列編號1)為模板，使用引子DNA序列3(序列編號10)及4(序列編號11)而進行利用PCR之擴增。關於PCR之條件，係使用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(TAKARA BIO)作為DNA聚合酶，以將95℃ 1分鐘進行1個循環，將98℃ 10秒鐘、60℃ 15秒鐘、68℃ 2分鐘進行25個循環之方式實施PCR。擴增產物係使用MinElute管柱(Qiagen)，依據隨附之操作說明而進行純化，利用NdeI及NotI進行限制酶消化後，利用1.2%瓊脂糖進行電泳，自凝膠切下目標之蛋白質帶，使用DNA凝膠提取套組(Qiagen)，依據隨附之操作說明而進行純化單離。將其插入pET-22b(+)(Novagen)之NdeI與NotI部位，而構建於N末端具有Strep Tag，利用3個(GGSGG)2連接肽(序列編號28)而將4個VHH單體彼此連結之4E6四聚物(圖12c)。
(2)大腸桿菌中之重組蛋白質之表現
將以上述方式製作之4E6四聚物、4E6二聚物毒素、及4E6二聚物 EGFP基因插入pET22b(+)之NdeI與NotI部位。向E.coli RosettaGami(DE3)2(Novagen)導入本表現載體質體DNA，依據附屬指南，使用添加有200mL之100μg/mL安比西林(Sigma-Aldrich)之2YT培養基，於37℃下培養重組大腸桿菌，於達到OD600=0.4~0.5時，添加1mM IPTG(異丙基-β-硫代半乳呋喃糖苷，TAKARA BIO)，並於30℃下培養3小時。培養結束後，回收大腸桿菌，於20mL之提取緩衝劑(50mM磷酸鈉(NaPhosphate)pH值7.8，300mM NaCl，EDTA-Free protease inhibitor cocktail(Roche))中進行再懸濁，於冰中使用Sonifier 250(Branson)，於Output Control 2、Duty cycle 80%之條件下進行超音波處理1分鐘並進行2次而使菌體破碎。於4℃下，將處理後之懸濁液以15000rpm進行20分鐘離心處理，回收上清液。融合蛋白質之純化係使用HisTrap管柱(GE healthcare)。將超音波處理懸濁液之離心上清液直接灌至HisTrap管柱，利用結合緩衝劑(20mM磷酸鈉(NaPhosphate)，0.5M NaCl，20mM咪唑(Imidazole)pH值7.4)將管柱進行清洗後，於包含500mM咪唑(Imidazole)之溶出液中使融合蛋白質溶出。將純化樣品供於10%丙烯醯胺SDS電泳，利用CBB進行染色，確認經純化之重組蛋白質，與BSA(牛血清白蛋白蛋白質)之染色進行比較，算出目標蛋白質帶之濃度(圖13a-c)。4E6二聚物毒素、4E6二聚物EGFP、4E6四聚物之濃度分別推算為0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL。
<實施例7：4E6二聚物毒素及4E6四聚物之癌細胞死亡誘導活性之測定>
對4E6二聚物毒素融合蛋白質對培養hTRAIL-R2表現人類癌細胞(Colo205，自American Type Culture Collection(美國菌種中心)獲取)是否具有細胞死亡誘導作用進行調查。向Falcon 96孔培養皿(Becton Dickinson)，以5×104cells/50μL培養基(包含0.2%胎牛血清(Tissue Culture Biologicals)之RPMI1640培養基)/孔之方式添加細胞，培養2小時後，將如上述般純化之4E6二聚物毒素、4E6二聚物EGFP以最終濃度計成為2000、800、160、32、6.4、1.28、0.256、0.0512ng/mL之培養基(2×最終濃度)各添加50μL。於培養第2天添加10μL之MTT試劑(Nacalai Tesque)。進而培養2小時後以100μL/孔之方式添加可溶化液，於移液中使細胞溶解，對OD570nm之吸光度進行測定。將未添加細胞之培養基之孔之測定值設為背景值並自總測定值扣除。將未添加抗體之對照之孔設為100%，以其相對值進行表示。檢定係於3個孔(triplicate)中進行，取3個孔之平均值。如圖14a所示，抗TRAIL-R2 VHH抗體二聚物與Toxin融合體，即免疫毒素完全不會誘導細胞死亡。
為了確認4E6二聚物與細胞結合而進行以下之試驗。即，關於人類大腸癌Colo205細胞、胰腺癌BxPC-3細胞，於冰上使各2×105細胞於包含10μg/mL 4E6二聚物EGFP與2%胎牛血清之磷酸緩衝生理鹽水(pH值7.4)50μL中反應30分鐘。利用上述添加有血清之磷酸緩衝生理鹽水清洗2次，利用FACSVerse(BD Biosciences)對細胞之螢光強度進行解析。2個細胞均被4E6二聚物EGFP染色。另一方面，於對照二聚物EGFP中，任一細胞均未被染色(圖15)。因此，可認為4E6二聚物與細胞結合。
根據以上之結果，可認為4E6二聚物毒素係與細胞膜上之TRAIL-R2結合，但無法使TRAIL-R2分子凝集為三聚物以上，又不會滲入細胞內，因此無法於Colo205細胞誘導細胞死亡。
繼而，為了對4E6單體及4E6四聚物是否有細胞死亡誘導作用進行調查，而將如上述般純化之4E6單體、4E6四聚物以最終濃度計成為25000、5000、1000、200、40、8、1.6、0.32pg/mL之培養基(2×最終濃度)各添加50μL。其結果為，4E6單體未導致細胞死亡，但具有 使TRAIL-R2分子凝集為三聚物以上之活性之4E6四聚物於Colo205細胞誘導強力之細胞死亡(圖14b)。
該等結果表示如下情況：具有使TRAIL-R凝集為三聚物以上之活性之抗hTRAIL-R VHH抗體四聚物與抗hTRAIL-R VHH抗體二聚物毒素相比，可有效率地誘導癌細胞死亡。
<實施例8：以大腸桿菌表現之4E6四聚物對人類大腸癌細胞及胰腺癌細胞之細胞死亡誘導作用>
對4E6四聚物對人類大腸癌細胞Colo205及胰腺癌細胞BxPC-3(自American Type Culture Collection(美國菌種中心)獲取)之癌細胞死亡誘導作用進行研究。細胞係於添加有10%胎牛血清(Tissue Culture Biologicals)之RPMI1640培養基(Sigma)中進行懸濁，向Falcon 96孔培養皿(Becton Dickinson)，以3×103cells/50μL/孔之方式添加細胞，培養一夜後，將包含4E6四聚物、hTRAIL(和光純藥)之培養基各添加50μL。Colo205細胞係培養一夜，BxPC-3細胞係培養兩夜，之後添加10μL之活細胞數測定試劑SF(Nacalai Tesque)，進而培養4~6小時，對450nm之吸光度進行測定。將未添加細胞之僅培養基之孔作為背景並扣除。將僅細胞之孔設為100%，以其相對值為資料。以各濃度3孔之平均值+標準偏差進行表示。如圖16所示，4E6四聚物係濃度依賴性地誘導Colo205細胞、BxPC-3細胞之細胞死亡，IC50分別為2pmol/L、8pmol/L。可知利用大腸桿菌製作之hTRAIL之IC50為400pmol/L，4E6四聚物可以較hTRAIL低之濃度誘導細胞死亡。
<實施例9：4E6四聚物及4E6二聚物EGFP之於雙叉桿菌中之分泌表現與純化>
(1)利用電穿孔法之重組雙叉桿菌之製作
將用以於雙叉桿菌中分泌表現4E6四聚物及4E6二聚物EGFP之載體基因盒(參照實施例1)插入pKKT427載體(Yasui K.,et al.,Nucleic Acids Res.2009)之HindIII與NotI之間，藉由電穿孔法而向B.longum 105-A導入。電穿孔法係於2.4kV、25μF、200歐姆之條件下進行。
(2)於雙叉桿菌中所分泌表現之4E6四聚物、4E6二聚物EGFP之純化
將(1)中所獲得之重組雙叉桿菌添加於包含觀黴素100μg/mL之MRS液體培養基(Lactobacilli MRS Broth，Difco Laboratories,Detroit,MI)、50mM蔗糖、3.4mg/mL L-抗壞血酸鈉鹽、及0.2mg/mL L-半胱胺酸鹽酸鹽中，進行一夜厭氣培養。厭氣培養係藉由使用裝有作為脫氧劑之AnaeroPack‧kenki(三菱瓦斯化學，東京，日本)之密閉容器而進行。關於經一夜培養之培養液，係對吸光度(600nm)進行測定，以吸光度成為0.1之方式添加於新的液體培養基中。進行6~7小時厭氣培養，以4℃、9,400×g進行10分鐘離心處理，採取培養上清液。重組蛋白質之純化係利用HisTrap管柱(GE Healthcare)進行。將培養上清液灌至HisTrap管柱，利用結合緩衝劑(50mM磷酸鈉(NaPhosphate)，0.3M NaCl，20mM咪唑(Imidazole)pH值7.8)對管柱進行清洗後，於包含500mM咪唑(Imidazole)之溶出液中使蛋白質溶出。將相當於自培養上清液1mL純化之量之純化蛋白質進行SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳，利用Oriole Fluorescent Gel Stain(Bio-Rad)進行染色(圖17)。4E6四聚物、4E6二聚物EGFP均於推定分子量附近(約60kDa)被檢測到。關於培養上清液中之分泌量，估算4E6四聚物為400ng/mL，4E6二聚物EGFP為3.2ng/mL。根據以上之結果，可知分泌任一種重組蛋白質，且4E6四聚物與4E6二聚物EGFP相比，效率良好地分泌表現。
<實施例10：於雙叉桿菌分泌表現之抗hTRAIL-R2 VHH抗體四聚物(4E6四聚物)之癌細胞死亡誘導活性>
對4E6四聚物對人類大腸癌Colo205細胞(American Type Culture Collection，美國菌種中心)之癌細胞死亡誘導活性進行研究。細胞係於添加有10%胎牛血清(Tissue Culture Biologicals)之RPMI1640培養基 (Sigma)中懸濁，向Falcon 96孔培養皿(Becton Dickinson)，以3×103cells/50μl培養基/孔之方式添加細胞。培養一夜，將以最終濃度0.3pM~10nM包含4E6四聚物、TRAIL之培養基各添加50μL。進而培養一夜，添加10μL之活細胞數測定試劑SF(Nacalai Tesque)，培養6小時後測定450nm之吸光度。將未添加細胞之僅培養基之孔作為背景並扣除。將僅細胞之孔設為100%，以其相對值為資料。以各濃度3孔之平均值+標準偏差進行表示。如圖18所示，4E6四聚物係濃度依賴性地抑制增殖，IC50為0.02nmol/L。另一方面，由大腸桿菌製作之hTRAIL(和光純藥)之IC50為0.4nmol/L。因此，可知於雙叉桿菌分泌表現之4E6四聚物之細胞死亡誘導活性高於hTRAIL。
<實施例11：Colo205細胞移植異種移植模型(Xenograft model)中之重組長雙岐桿菌之利用靜脈內投予之抗腫瘤效果的研究>
對於向裸小鼠之皮下移植人類大腸癌Colo205細胞而形成實體癌之異種移植模型(Xenograft model)中，將分泌表現抗hTRAIL-R2 VHH抗體四聚物(4E6四聚物)之重組長雙岐桿菌105-A向靜脈內進行投予之情形的抗腫瘤效果進行研究。具體而言，向6週齡之雌性KSN/Slc裸小鼠皮下移植2×106之Colo205細胞，以9天後各群(n=6，未處理、4E6四聚物、4E6二聚物EGFP)之腫瘤塊之體積成為約280mm3之方式進行群分後，將依據實施例9而製作之重組雙叉桿菌以每匹1.5×109個之方式向靜脈內進行投予。所使用之長雙岐桿菌105-A係藉由離心及向生理鹽水之再懸濁而進行製備。為了體內之長雙岐桿菌105-A之營養輔助，而每天將1mL之20%乳酮糖向腹腔內進行投予。腫瘤徑係於自投予雙叉桿菌之日起0、2、4、7、11、14、18、21日天後使用游標卡尺而進行測量。腫瘤體積係利用「(短徑)2×(長徑)/2」之計算式而算出。將結果示於圖19。於雙叉桿菌投予後第21天，分泌表現4E6四聚物之重組雙叉桿菌與未處理群相比，抑制腫瘤增殖51%。另一方面， 於作為陰性對照之4E6二聚物EGFP分泌雙叉桿菌投予群中，未發現腫瘤增殖抑制效果。
於測量腫瘤徑之同時，於投予雙叉桿菌之日起0、2、4、7、11、14、18、21天後對各群之體重進行測量。如圖20所示，與未處理群、4E6二聚物EGFP群相比，於4E6四聚物群中未檢測到體重減少。根據該等結果，可認為4E6四聚物於不產生如引起體重減少之副作用之情況下藉由細胞死亡誘導活性而抑制腫瘤增殖。
<實施例12：BxPC-3細胞移植異種移植模型(Xenograft model)中之重組長雙岐桿菌之利用靜脈內投予之抗腫瘤效果的研究>
對於向裸小鼠之皮下移植人類胰腺癌BxPC-3細胞而形成實體癌之異種移植模型(Xenograft model)中，將分泌表現抗hTRAIL-R2 VHH抗體四聚物(4E6四聚物)之重組長雙岐桿菌105-A向靜脈內進行投予之情形的抗腫瘤效果進行研究。具體而言，向8週齡之雌性KSN/Slc裸小鼠皮下移植2×106之BxPC-3細胞，以8天後各群(n=6，未處理、4E6四聚物、4E6二聚物EGFP)之腫瘤塊之體積成為約230mm3之方式進行群分後，將依據實施例9而製作之重組雙叉桿菌以每匹1.5×109個之方式向靜脈內進行投予。所使用之長雙岐桿菌105-A係藉由離心及向生理鹽水之再懸濁而進行製備。為了體內之長雙岐桿菌105-A之營養輔助，而每天將1mL之20%乳酮糖向腹腔內進行投予。腫瘤徑係於自投予雙叉桿菌之日起0、3、6、10、13、17天後使用游標卡尺而進行測量。腫瘤體積係利用「(短徑)2×(長徑)/2」之計算式而算出。將結果示於圖21。於雙叉桿菌投予後第17天，分泌表現4E6四聚物之重組雙叉桿菌與未處理群相比，抑制腫瘤增殖52%。另一方面，於作為陰性對照之4E6二聚物EGFP分泌雙叉桿菌投予群中，未發現腫瘤增殖抑制效果。
於測量腫瘤徑之同時，於投予雙叉桿菌之日起0、3、6、10、 13、17天後對各群之體重進行測量。如圖22所示，與未處理群、4E6二聚物EGFP群相比，於4E6四聚物群中未檢測到體重減少。根據該等結果，可認為4E6四聚物於不產生如引起體重減少之副作用之情況下藉由細胞死亡誘導活性而抑制腫瘤增殖。
<實施例13：4P6三聚物重組E.coli BL21(DE3)之製作及重組蛋白質之表現‧純化>
(1)大腸桿菌表現用抗hTRAIL-R1 VHH抗體三聚物(4P6三聚物)基因表現盒之製作
將編碼於N末端具有Strep Tag、於C末端具有His-Tag序列，且利用2個(GGSGG)2連接肽(序列編號28)將依據實施例4(1)而取得之抗hTRAIL-R1 VHH抗體之3個單體彼此連結之4P6三聚物的基因導入pET-22b(+)(Novagen)之NdeI與NotI部位，而構建大腸桿菌表現用4P6三聚物基因表現盒(參照實施例6)。
(2)大腸桿菌中之重組蛋白質之表現
將以上述方式製作之質體載體導入E.coli BL21StarTM(DE3)One Shot(Life technologies)。依據附屬指南，使用添加有200mL之100μg/mL安比西林(Sigma-Aldrich)之2YT培養基，於37℃下培養重組大腸桿菌，於達到OD600=0.4~0.5時，添加1mM IPTG(異丙基-β-硫代半乳呋喃糖苷，TAKARA BIO)，於30℃下培養3小時。培養結束後，回收大腸桿菌，於20mL之提取緩衝劑(50mM磷酸鈉(Na Phosphate)pH值7.8，300mM NaCl，EDTA-Free protease inhibitor cocktail(Roche))中進行再懸濁。於冰中使用Sonifier 250(Branson)，於Output Control 2、Duty cycle 80%之條件下進行1分鐘超音波處理並進行2次，而使菌體破碎。於4℃下，以9,400×g對處理後之懸濁液進行20分鐘離心處理，回收上清液。融合蛋白質之純化係使用His Trap管柱(GE Healthcare UK)。將超音波處理懸濁液之離心上清液直接灌至 His Trap管柱，利用結合緩衝劑(20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，20mM咪唑(Imidazole)pH值7.4)將管柱進行清洗後，於包含500mM咪唑(Imidazole)之溶出液中使融合蛋白質溶出。進而，溶出組分係添加於Strep-Tactin管柱(IBA)，依據附屬指南而進行純化。將相當於50ng之BSA之純化蛋白質進行SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳，利用Oriole Fluorescent Gel Stain(Bio-Rad)進行染色(圖23)。4P6三聚物係於推定分子量附近(約42kDa)被檢測到。根據以上結果，可知4P6三聚物可於大腸桿菌表現、純化。
<實施例14：於大腸桿菌表現之4P6三聚物之癌細胞死誘導活性之測定>
對4P6三聚物對人類大腸癌Colo205細胞(American Type Culture Collection，美國菌種中心)之癌細胞死亡誘導活性進行研究。細胞係於添加有10%胎牛血清(Tissue Culture Biologicals)之RPMI1640培養基(Sigma)中懸濁，向Falcon 96孔培養皿(Becton Dickinson)，以3×103cells/50μl培養基/孔之方式添加細胞。培養一夜後，將以最終濃度10pM~10nM包含4P6三聚物之培養基各添加50μL。進而培養兩夜後，添加10μL之活細胞數測定試劑SF(Nacalai Tesque)，於培養4小時後對450nm之吸光度進行測定。將未添加細胞之僅培養基之孔作為背景並扣除。將僅細胞之孔設為100%，以其相對值為資料。以各濃度3孔之平均值+標準偏差進行表示。如圖24所示，4P6三聚物係濃度依賴性地抑制Colo205細胞之增殖，IC50為0.4nmol/L。由大腸桿菌製作之hTRAIL(和光純藥)之IC50為0.4nmol/L，於大腸桿菌表現之4P6三聚物顯示與hTRAIL相同程度之細胞死亡誘導活性。
<實施例15：抗hTRAIL-R1 VHH抗體三聚物(4P6三聚物)之於雙叉桿菌中之分泌表現與純化>
(1)利用電穿孔法之重組雙叉桿菌之製作
將實施例1(1)中之表現盒之4E6四聚物之部分置換為依據實施例4(1)而取得的4P6之三聚物而進行製作，將用以於雙叉桿菌分泌表現4P6三聚物之載體基因盒插入pKKT427載體(Yasui K.,et al.,Nucleic Acids Res.2009)之HindIII與NotI之間，並藉由電穿孔法向長雙岐桿菌105-A導入。電穿孔法係於2.4kV、25μF、200歐姆之條件下進行。
(2)於雙叉桿菌分泌表現之4P6三聚物之純化
將(1)中所獲得之重組雙叉桿菌添加於包含觀黴素100μg/mL之MRS液體培養基(Lactobacilli MRS Broth，Difco Laboratories,Detroit,MI)、50mM蔗糖、3.4mg/mL L-抗壞血酸鈉鹽、及0.2mg/mL L-半胱胺酸鹽酸鹽，進行一夜厭氣培養。厭氣培養係藉由使用裝有作為脫氧劑之AnaeroPack‧kenki(三菱瓦斯化學，東京，日本)之密閉容器而進行。經一夜培養之培養液係對吸光度(600nm)進行測定，以吸光度成為0.1之方式添加於新的液體培養基。進行7小時厭氣培養，於4℃、9,400×g下進行10分鐘離心處理，採取培養上清液。重組蛋白質之純化係利用HisTrap管柱(GE Healthcare)進行。將培養上清液灌至HisTrap管柱，利用結合緩衝劑(50mM磷酸鈉(NaPhosphate)，0.3M NaCl，20mM咪唑(Imidazole)pH值7.8)將管柱清洗後，於包含500mM咪唑(Imidazole)之溶出液中使蛋白質溶出。將相當於自培養上清液0.6mL純化之量之純化蛋白質進行SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳，利用Oriole Fluorescent Gel Stain(Bio-Rad)進行染色(圖25)。4P6三聚物係於推定分子量附近(約42kDa)被檢測到。使用BSA進行定量之結果，4P6三聚物之培養上清液中之分泌量係被估算為30ng/mL。根據以上之結果，可知4P6三聚物於雙叉桿菌分泌表現。
<實施例16：於雙叉桿菌分泌表現之抗hTRAIL-R1 VHH抗體三聚物(4P6三聚物)之癌細胞死誘導活性>
對4P6三聚物對人類大腸癌Colo205細胞(American Type Culture Collection，美國菌種中心)及胰腺癌BxPC-3細胞(American Type Culture Collection，美國菌種中心)之癌細胞死亡誘導活性進行研究。細胞係於添加有10%胎牛血清(Tissue Culture Biologicals)之RPMI1640培養基(Sigma)中懸濁，向Falcon 96孔培養皿(Becton Dickinson)，以3×103cells/50μl培養基/孔之方式添加細胞。培養一夜後，將以最終濃度0.3pM~10nM包含4P6三聚物之培養基各添加50μL。進而培養兩夜，添加10μL之活細胞數測定試劑SF(Nacalai Tesque)，培養2小時後對450nm之吸光度進行測定。將未添加細胞之僅培養基之孔作為背景並扣除。將僅細胞之孔設為100%，以其相對值為資料。以各濃度3孔之平均值+標準偏差進行表示。如圖26a所示，4P6三聚物係濃度依賴性地抑制Colo205細胞之增殖，IC50係0.08nmol/L。可知利用大腸桿菌製作之hTRAIL(和光純藥)之IC50為0.4nmol/L，於雙叉桿菌所分泌表現之4P6三聚物之細胞死亡誘導活性高於hTRAIL。如圖26b所示，4P6三聚物亦濃度依賴性地抑制BxPC-3細胞之增殖。
<實施例17：BxPC-3-Luc#2細胞移植異種移植模型(Xenograft model)中之分泌表現4P6三聚物之重組長雙岐桿菌之利用靜脈內投予之抗腫瘤效果的研究>
對於向裸小鼠之皮下移植人類胰腺癌BxPC-3-Luc#2細胞(自JCRB細胞庫獲取)而形成實體癌之異種移植模型(Xenograft model)中，將分泌表現抗hTRAIL-R1 VHH抗體三聚物(4P6三聚物)之重組長雙岐桿菌105-A向靜脈內進行投予之情形的抗腫瘤效果進行研究。具體而言，向6週齡之雌性KSN/Slc裸小鼠皮下移植3×106之BxPC-3-Luc#2細胞，以15天後各群(n=5，未處理、4P6三聚物、僅pKKT427載體)之腫瘤塊之體積成為約135mm3之方式進行群分後，將依據實施例15而製作之重組雙叉桿菌以每匹3×108個之方式向靜脈內進行投予。所使用之長雙岐桿菌105-A係藉由離心及向生理鹽水之再懸濁而進行製備。為了 體內之長雙岐桿菌105-A之營養輔助，而每天將1mL之20%乳酮糖向腹腔內進行投予。腫瘤徑係於自移植腫瘤之日起15、19、21、24、28、31、35天後使用游標卡尺而進行測量。腫瘤體積係利用「(短徑)2×(長徑)/2」之計算式而算出。將結果示於圖27。於雙叉桿菌投予後第20天，分泌表現4P6三聚物之重組雙叉桿菌與未處理群相比，抑制腫瘤增殖65%。另一方面，於作為陰性對照之導入pKKT427之雙叉桿菌投予群中，未發現腫瘤增殖抑制效果。
於測量腫瘤徑之同時，於移植腫瘤之日起15、19、21、24、28、31、35天後對各群之體重進行測量。如圖28所示，與未處理群、導入pKKT427之雙叉桿菌群相比，於4P6三聚物群中未檢測到體重減少。根據該等結果，可認為4P6三聚物於不產生如引起體重減少之副作用之情況下藉由細胞死亡誘導活性而抑制腫瘤增殖。
[產業上之可利用性]
根據本發明，可一面減輕對正常細胞之毒性，一面藉由具有強力促效劑活性之抗hTRAIL-R1及R2抗體之腫瘤部位局部投予而誘導有效之癌細胞死亡。
將本說明書中所引用之全部出版物、專利及專利申請直接作為參考而併入本說明書中。
<110> 學校法人帝京平成大學
<120> 癌細胞之重組雙叉桿菌表現抗體引入細胞死亡
<130> PH-6058TW
<150> JP 2014-003441
<151> 2014-01-10
<160> 29
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2064
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 1
Figure 103145567-A0202-12-0048-1
Figure 103145567-A0202-12-0049-2
Figure 103145567-A0202-12-0050-3
<210> 2
<211> 2340
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 2
Figure 103145567-A0202-12-0050-4
Figure 103145567-A0202-12-0051-5
Figure 103145567-A0202-12-0052-6
<210> 3
<211> 2001
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 3
Figure 103145567-A0202-12-0052-7
Figure 103145567-A0202-12-0053-8
Figure 103145567-A0202-12-0054-9
<210> 4
<211> 1204
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 4
Figure 103145567-A0202-12-0054-10
Figure 103145567-A0202-12-0055-11
<210> 5
<211> 1198
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 5
Figure 103145567-A0202-12-0055-12
Figure 103145567-A0202-12-0056-13
<210> 6
<211> 1189
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 6
Figure 103145567-A0202-12-0056-14
Figure 103145567-A0202-12-0057-15
<210> 7
<211> 440
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 7
Figure 103145567-A0202-12-0057-16
Figure 103145567-A0202-12-0058-17
<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 8
Figure 103145567-A0202-12-0058-18
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 9
Figure 103145567-A0202-12-0058-19
<210> 10
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 10
Figure 103145567-A0202-12-0059-20
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 11
Figure 103145567-A0202-12-0059-21
<210> 12
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 12
Figure 103145567-A0202-12-0059-22
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 13
Figure 103145567-A0202-12-0059-23
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 14
Figure 103145567-A0202-12-0060-24
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組結構
<400> 15
Figure 103145567-A0202-12-0060-25
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組結構
<400> 16
Figure 103145567-A0202-12-0060-26
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組結構
<400> 17
Figure 103145567-A0202-12-0061-27
<210> 18
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組結構
<400> 18
Figure 103145567-A0202-12-0061-28
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組結構
<400> 19
Figure 103145567-A0202-12-0062-29
<210> 20
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組結構
<400> 20
Figure 103145567-A0202-12-0062-30
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組結構
<400> 21
Figure 103145567-A0202-12-0062-31
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組結構
<400> 22
Figure 103145567-A0202-12-0063-32
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組結構
<400> 23
Figure 103145567-A0202-12-0063-33
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組結構
<400> 24
Figure 103145567-A0202-12-0063-34
<210> 25
<211> 184
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 自長雙岐桿菌hup啟動子獲得之合成DNA
<400> 25
Figure 103145567-A0202-12-0064-35
<210> 26
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 自HUT終止子獲得之合成DNA
<400> 26
Figure 103145567-A0202-12-0064-36
<210> 27
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 27
Figure 103145567-A0202-12-0065-37
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成物
<400> 28
Figure 103145567-A0202-12-0065-38
<210> 29
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 自長雙岐桿菌usp分泌訊息序列獲得之合成DNA
<400> 29
Figure 103145567-A0202-12-0065-39

Claims (6)

  1. 一種重組偏性厭氣性革蘭氏陽性菌，其係將編碼包含訊息肽、以及3個以上之抗TRAIL-R1單鏈抗體及/或3個以上之抗TRAIL-R2單鏈抗體之融合蛋白質的核酸以可表現之狀態包含，且上述抗TRAIL-R1單鏈抗體之CDR1包含序列編號22所示之胺基酸序列；CDR2包含序列編號23所示之胺基酸序列；及CDR3包含序列編號24所示之胺基酸序列；及/或上述抗TRAIL-R2單鏈抗體之CDR1包含序列編號15所示之胺基酸序列；CDR2包含序列編號16所示之胺基酸序列；及CDR3包含序列編號17所示之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之重組偏性厭氣性革蘭氏陽性菌，其中偏性厭氣性革蘭氏陽性菌為雙叉桿菌屬(Bifidobacterium)。
  3. 如請求項1或2之重組偏性厭氣性革蘭氏陽性菌，其中上述融合蛋白質進而包含功能性肽。
  4. 如請求項3之重組偏性厭氣性革蘭氏陽性菌，其中功能性肽為標記蛋白質。
  5. 一種抗腫瘤劑，其係以如請求項1或2之重組偏性厭氣性革蘭氏陽性菌為有效成分。
  6. 一種抗TRAIL-R1抗體，其中CDR1包含序列編號22所示之胺基酸序列；CDR2包含序列編號23所示之胺基酸序列；及CDR3包含序列編號24所示之胺基酸序列。
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