WO2015104994A1 - 組換え偏性嫌気性グラム陽性菌 - Google Patents

組換え偏性嫌気性グラム陽性菌 Download PDF

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西川　毅
裕一郎 平
郁子 平
功 石田
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    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Definitions

  • the present invention relates to an antitumor agent and a tumor detection marker comprising a recombinant obligate anaerobic Gram-positive bacterium as an active ingredient.
  • TRAIL TNF-related apoptosis-inducing ligand
  • TNF TNF-related apoptosis-inducing ligand
  • TRAIL belongs to the TNF superfamily and is a protein that induces cell death (apoptosis) in various cancer cells.
  • TRAIL forms a trimer in vivo and binds to a TRAIL receptor (TRAIL-R1, TRAIL-R2) having a death domain in the cell. It is known that when TRAIL binds, the TRAIL receptor aggregates to form a trimer, thereby transmitting a cell death signal into the cell.
  • TRAIL-R1 and TRAIL-R2 TRAIL-R3, TRAIL-R4, and osteoprotegerin, which is a soluble receptor, are known as TRAIL receptors (FIG. 1).
  • TRAIL-R3, TRAIL-R4, and osteoprotegerin are completely or partially deleted from the death domain, and these receptors do not induce cell
  • TRAIL is being developed as an antitumor drug because it is unlikely to cause cell death in normal cells.
  • TRAIL in order to efficiently induce cell death in cancer cells using TRAIL, it binds efficiently to TRAIL-R1 and TRAIL-R2 without binding to the decoy receptor, and enters the cell.
  • HGS-ETR1 anti-hTRAIL (human TRAIL) -R1 agonistic antibody
  • HGS-ETR2 anti-hTRAIL-R2 agonistic antibody
  • HGS-TR2J (KMTR2) is known as a potent agonist antibody that can directly agglutinate hTRAIL-R2 molecules on cancer cell membranes and transmit cell death signals without involvement of NK cells or macrophages (non-patent literature) 3) ( Figure 2b).
  • Lama single-chain VHH antibody trimer against hTRAIL-R2 can induce very strong cell death against hTRAIL-R2-expressing cancer cells without involvement of NK cells and macrophages.
  • Patent Document 1 FIG. 3
  • hTRAIL-R1 and hTRAIL-R2 are expressed not only in cancer cells but also in various human normal tissues.
  • hTRAIL and anti-hTRAIL-R agonist antibodies are thought to cause liver damage as a side effect.
  • An object of the present invention is to induce effective cancer cell death by anti-TRAIL-R1 antibody and anti-TRAIL-R2 antibody and at the same time reduce toxicity to normal cells.
  • the present inventors have produced bifidobacteria that express and secrete anti-hTRAIL-R2 VHH antibody having strong agonist activity, and intravenously administer this recombinant bifidobacteria It was revealed for the first time that cancer cell death can be induced in the tumor site. Further, the present inventor has obtained a novel anti-hTRAIL-R1 VHH antibody capable of recognizing hTRAIL-R1 molecules on cancer cell membranes. According to the present invention, it is possible to induce cancer cell death effectively while reducing toxicity to normal cells by locally administering anti-hTRAIL-R1 and anti-hTRAIL-R2 antibodies having strong agonist activity to the tumor site It becomes.
  • a recombinant bias comprising a signal peptide and a nucleic acid encoding a fusion protein comprising three or more anti-TRAIL-R1 single-chain antibodies and / or three or more anti-TRAIL-R2 single-chain antibodies in an expressible state.
  • Sexual anaerobic Gram-positive bacteria (2)
  • the recombinant obligate anaerobic gram-positive bacterium according to (1), wherein the obligate anaerobic gram-positive bacterium is a genus Bifidobacterium.
  • Anti-TRAIL-R1 single chain antibody CDR1 comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, CDR2 comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23, and CDR3 comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24.
  • the recombinant obligate anaerobic gram-positive bacterium according to (1) or (2).
  • Anti-TRAIL-R2 single chain antibody CDR1 comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, CDR2 comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, and CDR3 comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17.
  • the recombinant obligate anaerobic gram-positive bacterium according to any one of (1) to (3).
  • effective cancer cell death can be induced while reducing toxicity to normal cells by locally administering anti-hTRAIL-R1 and anti-hTRAIL-R2 antibodies having potent agonist activity to the tumor site It becomes.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the structure of TRAIL and its receptor and signal transduction for cell death induction.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a difference in intracellular transmission of a cell death signal between a normal antibody a against TRAIL-R and an antibody b having agonist activity (in the case of a normal antibody, NK cells undergo apoptosis via TRAIL). And cross-links by macrophages c. In the case of KMTR2 antibody, TRAIL-mediated apoptosis does not require cross-links by NK cells or macrophages).
  • FIG. 3 shows that single-chain VHH antibody tri- to 5-mer (VHH4 in this figure) induces apoptosis in hTRAIL-R expressing cancer cells without cross-linking by NK cells and macrophages.
  • FIG. Figure 4 shows SDS-PAGE (SDS polyacrylamide) of purified hTRAIL-R1: Fc (a), hTRAIL-R2: Fc (b (1)), and mTRAIL (mouse TRAIL) -R2: Fc (b (2)). Gel electrophoresis) image is shown.
  • FIG. 5 shows an SDS-PAGE image of the purified 4E6 monomer. Arrow indicates 4E6 monomer.
  • FIG. 6 shows the measurement result by ELISA of the binding activity of 4E6 monomer to hTRAIL-R2: Fc antigen.
  • FIG. 7 shows the measurement results of the dissociation constant of 4E6 monomer and hTRAIL-R2: Fc antigen using Biacore® X-100.
  • FIG. 8 shows an SDS-PAGE image of the purified 4P6 monomer.
  • FIG. 9 shows the analysis results by ELISA of the binding specificity of 4P6 monomer and 4E6 monomer.
  • FIG. 10 shows the measurement results of the dissociation constant between 4P6 monomer and hTRAIL-R1: Fc antigen using Biacore® X-100.
  • FIG. 11 shows the antagonist activity of 4P6 monomer and 4E6 monomer.
  • FIG. 12 is a schematic diagram of gene structures of 4E6 dimer Toxin (a), 4E6 dimer EGFP (b), and 4E6 tetramer (c) expressed in E. coli.
  • FIG. 13 shows SDS-PAGE images of purified recombinant proteins expressed in E. coli (a: 4E6 dimer Toxin, b: 4E6 dimer EGFP, and c: 4E6 tetramer).
  • FIG. 14 shows the cell death-inducing activity of recombinant proteins (a: 4E6 dimer Toxin and 4E6 dimer EGFP and b: 4E6 monomer and 4E6 tetramer) against human colon cancer cells Colo205 cells.
  • FIG. 15 shows fluorescent staining of cancer cells (a: Colo205 cells and b: BxPC-3 cells) with 4E6 dimer EGFP.
  • the vertical axis represents the number of cells, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity of 4E6 dimer EGFP.
  • FIG. 16 shows the cell death inducing action of anti-hTRAIL-R2 VHH antibody tetramer (4E6 tetramer) expressed in E. coli on human colon cancer cells Colo205 cells (a) and pancreatic cancer cells BxPC-3 cells (b).
  • FIG. 17 shows SDS-PAGE images of 4E6 tetramer and 4E6 dimer EGFP purified from 1 mL of Bifidobacterium culture supernatant.
  • FIG. 18 shows the cancer cell death-inducing activity of 4E6 tetramer (4E6 tetramer) purified from the culture supernatant of Bifidobacterium on Colo205 cells.
  • FIG. 23 shows an SDS-PAGE image of the purified recombinant protein expressed in E. coli (4P6 trimer).
  • FIG. 24 shows the cell death-inducing action of anti-hTRAIL-R1 VHH antibody trimer (4P6 trimer) expressed in E. coli on human colon cancer cells Colo205 cells.
  • FIG. 25 shows an SDS-PAGE image of 4P6 trimer purified from the culture supernatant of Bifidobacterium.
  • Figure 26 shows cell death induction of anti-hTRAIL-R1 VHH antibody trimer (4P6 trimer) purified from bifidobacteria culture supernatant on human colon cancer cells Colo205 cells (a) and pancreatic cancer cells BxPC-3 cells (b) Shows the effect.
  • FIG. 24 shows the cell death-inducing action of anti-hTRAIL-R1 VHH antibody trimer (4P6 trimer) expressed in E. coli on human colon cancer cells Colo205 cells.
  • FIG. 25 shows an
  • a first aspect of the present invention is a recombinant obligate anaerobic Gram positive bacterium (hereinafter often abbreviated as “recombinant bacterium”).
  • the recombinant bacterium of the present invention is a carrier for drug delivery containing a nucleic acid encoding a fusion protein in a state capable of being expressed.
  • “An obligate anaerobic gram-positive bacterium” refers to an obligate anaerobic bacterium classified as a gram-positive bacterium.
  • the “obligate anaerobic bacterium” is also called an absolute anaerobic bacterium and refers to a bacterium having a property of being unable to grow in the presence of high oxygen and dying. Therefore, in a mammalian body, it can grow in a hypoxic and anaerobic digestive organ, mainly in the intestine, but cannot grow in a body fluid such as blood containing dissolved oxygen or in a normal tissue.
  • “Gram-positive bacteria” is a general term for bacteria that are stained purple or amber by Gram staining.
  • Gram-positive bacteria As Gram-positive bacteria, koji molds, cocci and spiral bacteria are known, but there is no particular limitation in this specification. Gram-positive bacteria do not release endotoxin after death because they do not contain endotoxin. Therefore, it is preferable as a carrier for drug delivery of the present invention in terms of safety.
  • the recombinant bacterium of the present invention include Bifidobacterium (in this specification, the Bifidobacterium is hereinafter collectively referred to as “Bifidobacterium”) and Clostridium. Can do. Bifidobacteria are preferable.
  • the bifidobacteria may be any species, but is preferably a species that inhabits the human intestinal tract, specifically B. B. bifidum, B. Longum, B. B. brave, B. Infantis (B..infantis) and B. It is B. adolescentis.
  • the obligate anaerobic gram-positive bacterium of the present invention contains a nucleic acid encoding a fusion protein (hereinafter, often referred to as “fusion gene”) in a state capable of being expressed.
  • fusion gene a nucleic acid encoding a fusion protein
  • nucleic acid encoding a fusion protein refers to an exogenous nucleic acid encoding a fusion protein constructed by fusing a plurality of genes and the like by gene recombination technology. .
  • the fusion gene is introduced into the recombinant bacterium of the present invention in a state of being inserted into an expression cassette described later.
  • a “fusion protein” is an extracellular secreted protein comprising a signal peptide, three or more single-chain antibodies, and optionally a functional peptide, which are linked together.
  • the signal peptide, single chain antibody and functional peptide may be directly linked or indirectly linked via a linker peptide.
  • the length and amino acid sequence of the linker peptide are not particularly limited as long as the functions of the single-chain antibody and the functional peptide are not inhibited. For example, an amino acid sequence that is 20 amino acids or less or 15 amino acids or less and does not self-fold is suitable.
  • linker peptide used in the present invention examples include IEGRMD linker peptide (SEQ ID NO: 27) and (GGSGG) 2 linker peptide (SEQ ID NO: 28).
  • IEGRMD linker peptide SEQ ID NO: 27
  • GGSGG GGSGG 2 linker peptide
  • a signal peptide is a peptide necessary for extracellular transfer of a protein biosynthesized in a cell.
  • a positively charged amino acid such as Lys and Arg is arranged on the N-terminal side, followed by a highly hydrophobic amino acid sequence such as Ala, Leu, Val, Ile, Val, and Phe.
  • the C-terminal side of the signal peptide may have an amino acid sequence including an insertion sequence after the signal sequence that promotes cleavage and secretion of the signal peptide and / or a signal peptidase recognition site that cleaves the signal peptide from the fusion protein. Good.
  • the signal peptide has a function of secreting the fusion protein expressed in the bacterium of the present invention outside the cell via a translocator or the like present in the membrane.
  • the amino acid sequence of the signal peptide is not particularly limited. Any known signal sequence amino acid sequence that can function in obligate anaerobic gram-positive bacteria can be used.
  • the amino acid length of the signal peptide is not particularly limited. Usually, it may be in the range of 3 to 60 amino acids. However, a signal peptide having a short amino acid length is preferred so that the molecular weight of the fusion protein does not become too large.
  • the signal peptide is placed on the N-terminal side of the fusion protein.
  • the fusion protein includes three or more single chain antibodies.
  • single-chain antibody refers to an antibody that is composed of a single-chain polypeptide and that can recognize and bind to a target substance alone. This is because an antibody composed of two or more chains is too large in molecular weight to be expressed in an obligate anaerobic gram-positive bacterium, or an appropriate three-dimensional structure having an antibody function is not likely to be constructed.
  • the single-chain antibody of the present invention is preferably a low-molecular antibody having a molecular weight of 35 kDa or less per one. Natural antibodies and artificial antibodies do not matter.
  • the single-chain antibody of the present invention is typically composed of a variable region comprising a complementarity determining region (CDR) and a framework region (FR).
  • the complementarity determining region is a region that exhibits variability and imparts binding specificity to the antibody.
  • the framework area is a relatively stored part of the variable area.
  • a complete variable domain contains 4 FRs linked by 3 CDRs.
  • the three CDRs are called CDR1, CDR2, and CDR3 in that order from the N end, and the four FRs are called FR1, FR2, FR3, and FR4 in that order from the N end. Therefore, in the variable region, the CDR and FR are arranged in the order of FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, and FR4 from the amino acid terminal to the carboxy terminal.
  • natural antibody refers to an antibody having the same amino acid sequence as an antibody produced by any vertebrate.
  • single-chain antibodies of natural antibodies include single-chain antibodies produced by camelids (Hamers-Casterman C., et al., 1993, Nature 363: 446-448) (below) In this specification, it is referred to as “camelid single chain antibody”).
  • Camelid single-chain antibody is an antibody composed of only the H chain without the L chain, and since it can bind to the antigen only in the V H region of the H chain, the molecular weight is about 14 kDa, 10 minutes that of a normal antibody. There is only about 1 of.
  • camelids In addition, it generally has high antigen affinity and high resistance to heat, acid and base (Deffar, K., et al., 2009, African Journal of Biotechnology 8 (12): 2645-2652). Therefore, it is very suitable as a single chain antibody in the present invention.
  • the species of camelids is not limited as long as it can produce single-chain camelid antibodies.
  • antibodies derived from any animal species such as llama, alpaca, camel and the like can be used.
  • artificial antibody is an artificially constructed antibody.
  • a single-chain antibody in which an appropriate mutation is introduced into the amino acid sequence of the natural antibody a single-chain antibody in which a structural modification that does not exist in nature exists in principle.
  • specific examples of such artificial antibodies include chimeric antibodies, humanized antibodies, single chain Fv (scFv: single chain Fragment of variable region) (Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) , A diabody, a triabody, a tetrabody, and the like.
  • Chimeric antibody refers to an antibody in which the variable region and constant region of an antibody molecule are derived from different animals.
  • a chimeric antibody can be prepared by a known method. For example, a nucleic acid encoding an antibody V region and a nucleic acid encoding a human antibody C region are ligated, incorporated into an expression vector, and introduced into a host. It is obtained by making it produce.
  • a “humanized antibody” is a modified antibody, also called a reshaped human antibody.
  • Humanized antibodies are constructed by grafting the CDRs of antibodies from immunized animals to the complementarity determining regions of human antibodies. The general gene recombination technique is also known.
  • Single-chain Fv is a single polypeptide chain that connects variable regions located in the L and H chains (ie, V L and V H , respectively) by a sufficiently long flexible linker in an immunoglobulin molecule. Is a synthetic antibody having a molecular weight of about 35 kDa or less. Within a single chain Fv, both variable regions can self-assemble with each other to form one functional antigen binding site.
  • the fusion protein In the fusion protein, three or more single-chain antibodies must be contained in order to aggregate TRAIL to form a trimer. However, since the molecular weight of the fusion protein increases as the number of antibodies increases, usually several, for example, 3-6, 3-5, or 3-4 are preferred. It is desirable that individual single chain antibodies are linked with an appropriate linker peptide.
  • the length and amino acid sequence of the linker peptide are not particularly limited as long as the antigen binding activity of each single chain antibody is not inhibited.
  • the fusion protein contains three or more single chain antibodies that recognize the same antigen.
  • the fusion protein includes three or more single-chain antibodies that recognize the same hTRAIL-R1.
  • the “valence” of an antibody refers to the number of antigen-binding sites possessed by one antibody molecule.
  • IgG is a divalent antibody having two antigen-binding sites per molecule.
  • the single chain antibody is a monovalent antibody having one antigen-binding site per molecule. Since the fusion protein of the present invention contains three or more single chain antibodies, it is trivalent or more as a whole.
  • the order of the single-chain antibody with the functional peptide described later is not particularly limited as long as it is the C-terminal side of the signal peptide in the fusion protein, but it is preferably arranged on the N-terminal side of the functional peptide.
  • the target substance of the single chain antibody in the present invention is TRAIL-R1 or TRAIL-R2.
  • TRAIL-R1 or TRAIL-R2 As described above, since the recombinant bacterium of the present invention can grow only in an anaerobic environment, cells that are in an anaerobic environment in vivo are suitable as target cells. Specifically, suitable labeled cells include tumor cells or intestinal epithelial cells.
  • the anti-TRAIL-R1 antibody and the anti-TRAIL-R2 antibody will be specifically described.
  • anti-TRAIL-R1 single chain antibody refers to a single chain antibody against TRAIL-R1 (TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 1, TRAIL receptor 1).
  • the anti-TRAIL-R1 single chain antibody used in the present invention is not particularly limited as long as it specifically binds to TRAIL-R1.
  • Examples of the anti-TRAIL-R1 single chain antibody used in the present invention include 4P6 obtained and used in the examples of the present specification.
  • 4P6 is an alpaca-derived single chain VHH antibody
  • CDR1 includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22
  • CDR2 includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23
  • CDR3 includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24.
  • the sequence of the framework region of the anti-TRAIL-R1 single chain antibody used in the present invention is not particularly limited.
  • the alpaca unit described in Maass DR, et al., 2007, J Immunol Methods. 324: 13-25 is used.
  • the sequence of the framework region of a chain antibody for example, Clone A02 described in the above document
  • Clone A02 described in the above document
  • the anti-TRAIL-R1 single chain antibody includes, but is not limited to, for example, FR1 includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, FR2 includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, and FR3 includes SEQ ID NO: The amino acid sequence shown by 20 may be included, and FR4 may contain the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 21.
  • the fusion protein used in the present invention preferably has an agonist activity that binds to TRAIL-R1 and induces apoptosis. Since TRAIL-R1 induces apoptosis by aggregating into a trimer or more, in order to activate TRAIL-R1, the fusion protein is 3 or more, 4 or more, 5 or more as described above, Alternatively, it is particularly preferred to include 6 or more, such as 3, 4, 5, or 6 anti-TRAIL-R1 single chain antibodies.
  • anti-TRAIL- wherein CDR1 comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, CDR2 comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23, and CDR3 comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24.
  • R1 antibody may be mentioned.
  • the sequence of the framework region of the antibody is not particularly limited.
  • FR1 includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, and FR2 is a sequence.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 may be included, FR3 may contain the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, and FR4 may contain the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21.
  • the antibody is preferably trivalent or higher.
  • the antibody may be an artificial antibody as described above, such as a chimeric antibody or a humanized antibody.
  • the antibody of the present invention can be used as an apoptosis inducer.
  • anti-TRAIL-R2 single chain antibody refers to a single chain antibody against TRAIL-R2 (TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 2, TRAIL receptor 2).
  • the anti-TRAIL-R2 single chain antibody used in the present invention is not particularly limited as long as it specifically binds to TRAIL-R2.
  • Examples of the anti-TRAIL-R2 single chain antibody used in the present invention include 4E6 described in the above-mentioned document WO2011 / 098520.
  • 4E6 is a llama single chain VHH antibody
  • CDR1 includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15
  • CDR2 includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16
  • CDR3 includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17. Including.
  • the fusion protein used in the present invention preferably has an agonistic activity that binds to TRAIL-R2 and induces apoptosis. Since TRAIL-R2 induces apoptosis by aggregating to a trimer or more, in order to activate TRAIL-R2, the fusion protein is 3 or more, 4 or more, 5 or more as described above, Alternatively, it is particularly preferred to include 6 or more, such as 3, 4, 5, or 6 anti-TRAIL-R2 single chain antibodies.
  • the antibody of the present invention can be used as an apoptosis inducer.
  • the fusion protein optionally includes a functional peptide.
  • the term “functional peptide” refers to a specific biological activity, for example, enzyme activity, catalytic activity, function as a substrate, or biological inhibition or enhancement function (for example, cytotoxicity) in vivo or in cells. Activity). Specific examples include fluorescent proteins or photoproteins, enzymes, or exotoxins.
  • the functional peptide may be either a natural type or a non-natural type.
  • a natural functional polypeptide refers to a peptide that exists in nature.
  • a non-natural functional polypeptide refers to an appropriate mutation (amino acid sequence) in the amino acid sequence based on the amino acid sequence of the natural functional polypeptide, as long as the specific function of the functional peptide is not lost.
  • a modified peptide introduced with addition, deletion, or substitution).
  • two or more functional peptides may be contained. However, when a plurality of functional peptides are included, the total molecular weight of the functional peptide is 80 kDa or less, preferably 40 kDa or less, because the total molecular weight of the fusion protein becomes too large.
  • the type of each functional peptide may be the same or different. For example, a functional peptide combining exotoxin and enzyme, or exotoxin and fluorescent protein or photoprotein can be mentioned.
  • each functional peptide may be directly linked, but an appropriate linker peptide may be used so that each functional peptide can efficiently perform its own function.
  • the length and amino acid sequence of the linker peptide are not particularly limited as long as the function of the functional peptide is not inhibited. By including two or more different functional peptides in one fusion protein, different functions can be imparted to the target substance recognized by the single-chain antibody.
  • the functional peptide is not particularly limited as long as it is a C-terminal side of the signal peptide in the fusion protein, but it is preferably arranged on the C-terminal side of the single chain antibody.
  • fluorescent protein or photoprotein labeled protein
  • the type of fluorescent protein as a functional peptide is not particularly limited as long as the base sequence is known. Either the natural type or the non-natural type may be used. However, those having a short amino acid length are preferred for the above reasons. Further, the excitation wavelength and the fluorescence wavelength are not particularly limited. These wavelengths may be appropriately selected according to the situation and necessity. Specific examples of the fluorescent protein include CFP, RFP, DsRed, YFP, PE, PerCP, APC, and GFP.
  • the type of photoprotein is not particularly limited as long as the base sequence is known. Similar to the fluorescent protein, it may be either a natural type or a non-natural type, but preferably has a short amino acid length. Specific examples of the photoprotein include aequorin and the like.
  • the type of enzyme as a functional peptide is not particularly limited as long as the base sequence is known.
  • An enzyme that acts directly on the target substance may be used, or an enzyme that does not act directly on the target substance and functions in the vicinity thereof. Specific examples of the latter include luciferase and peroxidase (for example, horseradish peroxidase) that contribute to luminescence.
  • a fusion protein in which an enzyme is linked to the single chain antibody can function as an immunoenzyme (immunoenzyme).
  • Exotoxin is a toxic protein secreted by bacteria outside the cell.
  • the type of exotoxin is not limited as long as it has cytotoxic activity and its base sequence is known.
  • Pseudomonas toxin (PT) and its derivatives such as exotoxin A from which the cell adhesion domain has been removed from PT, diphtheria toxin (DT) and its derivatives, and ricin and Its derivatives are mentioned (Brinkmann U. & Pastan I., 1994, Biochimica et Biophysica Acta, 1198 (1): 27-45).
  • Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is known to exert a strong cell-killing effect by being inactivated by ADP-ribosylation of EF-2 after incorporation into cancer cells.
  • a fusion protein in which an exotoxin is linked to the single chain antibody can function as an immunotoxin (immunotoxin).
  • the “expression cassette” refers to an expression system that contains the fusion gene and can make it expressable as a fusion protein.
  • the “expressable state” means a state in which the fusion gene contained in the expression cassette is placed under the control of elements necessary for gene expression so that the fusion gene can be expressed in a recombinant bacterium.
  • Elements necessary for gene expression include a promoter and a terminator.
  • the promoter is not particularly limited as long as it is a promoter operable in a recombinant bacterium, but a promoter derived from an obligate anaerobic gram-positive bacterium to be used is preferable.
  • a promoter derived from an obligate anaerobic gram-positive bacterium to be used is preferable.
  • the hup gene promoter (SEQ ID NO: 25) of B. longum can be mentioned.
  • overexpression promoters, constitutive promoters, site-specific promoters, step-specific promoters, inducible promoters, and the like are known as promoters depending on their expression control properties.
  • promoter is used for the expression cassette in the present invention. What is necessary is just to select suitably as needed.
  • it is an overexpression promoter or a constitutive promoter.
  • the promoter is located 5 'upstream from the start codon of the fusion gene.
  • the terminator is not particularly limited as long as it is a sequence capable of terminating the transcription of the gene transcribed by the promoter in the recombinant bacterium.
  • An example is a histone-like protein terminator (HUT) (SEQ ID NO: 26).
  • HUT histone-like protein terminator
  • Preferred is a terminator derived from the same species as the promoter, and more preferred is a terminator paired with the promoter on the genome of the species from which the promoter is derived.
  • the terminator is located 3 'downstream of the fusion gene's stop codon.
  • a vector containing an expression cassette can be introduced into the same bacterium as an expression vector. Alternatively, it may be inserted into the genome of the same bacterium through homologous recombination.
  • a plasmid or the like can be used as the vector.
  • a vector that can replicate in the recombinant bacterium of the present invention and contains an appropriate selection marker gene that is stably retained in the microbial cell is used.
  • the vector may be a shuttle vector that can replicate in other bacteria such as E. coli. For example, pKKT427, pBESAF2, pPSAB1, etc. are mentioned.
  • the fusion gene When inserting into the genome of a recombinant bacterium, only the fusion gene may be inserted so that it can be expressed in the genome of the recombinant bacterium. That is, the fusion gene may be inserted under the control of an endogenous promoter or terminator of the recombinant bacterium.
  • the expression cassette may be a monocistronic that includes one fusion gene in one expression cassette, or may be a polycistronic that includes two or more fusion genes.
  • the recombinant bacterium of the present invention can be produced using molecular genetic methods known in the art.
  • a nucleic acid encoding a signal peptide and a single chain antibody for example, Green and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ausubelet al., Short Protocols What is necessary is just to construct
  • the base sequence information of the gene encoding the antibody that binds to TRAIL-R1 or TRAIL-R2 can be used.
  • the base sequence information of this antibody may be based on, for example, the above-described CDR and FR base sequences.
  • monoclonal antibodies against the antibody may be prepared according to methods known in the art. The production example is shown below.
  • the target extracellular domain of TRAIL-R1 or TRAIL-R2 is administered as an immunogen to a camelid animal for immunization.
  • an adjuvant may be added for effective immunization.
  • adjuvants include commercially available complete Freund's adjuvant (FCA), incomplete Freund's adjuvant (FIA) and the like, and these can be used alone or in combination.
  • FCA complete Freund's adjuvant
  • FIA incomplete Freund's adjuvant
  • a single dose of the immunogen solution should contain about 50-200 ⁇ g of immunogen per animal.
  • the immunization interval is not particularly limited, and booster immunization is performed 2 to 10 times, preferably 5 to 7 times at intervals of several days to several weeks, preferably 1 to 4 weeks after the initial immunization.
  • the antibody titer in the serum of the immunized animal is repeatedly measured by ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) method or the like.
  • ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
  • antibody-producing cells are collected from the immunized animal. Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, and peripheral blood cells, with peripheral blood cells being preferred.
  • RNA is extracted from peripheral blood cells, and cDNA is synthesized using oligo dT primer and random 6mer primer.
  • V HH region variable region of a camelid single chain antibody
  • pCANTAB6 McCafferty J., et al., 1994, Appl. Biochem. Biotech., 47, 157-173
  • the above gene is incorporated into a phagemid vector such as) and introduced into E. coli TG1 by electroporation.
  • the above-mentioned Escherichia coli TG1 is infected with M13K07 helper phage, and the phages are collected to obtain a camelid single chain antibody variable region (V HH region) expression phage library.
  • the standard library is 1 x 10 7 pfu or more.
  • Biopanning is performed to select phages that express antibodies against the target antigen. This is because the antibody phage library is reacted with the immobilized target antigen, the unbound phage is removed by washing, and then the bound phage is eluted and infected with E. coli to proliferate 3 to 5 times. This is a method for enriching phage specific to the target antigen. After reinfection of the panned phage with E. coli TG1, isolate TG1 clones containing the V HH- inserted pCANTAB phagemid vector, infect individual TG1 clones with KO7 helper phage, and clone the phages displaying V HH antibodies. obtain. Among these, a clone that reacts with the antigen is selected. The base sequence of the antibody can be obtained from the obtained phage.
  • the fusion gene is inserted into the expression cassette using a molecular genetic method so that it can be expressed.
  • the expression cassette is incorporated into a vector such as a plasmid as necessary.
  • a method such as cutting the 5 ′ end and 3 ′ end of the expression cassette with an appropriate restriction enzyme and inserting it into the corresponding restriction site such as a multiple cloning site in the vector. it can.
  • the vector is an expression vector that can be expressed in the recombinant bacterium of the present invention
  • the fusion gene is placed in the expression control region of the expression vector (such as a multicloning site between the promoter and terminator in the vector).
  • the target recombinant bacterium can be produced by introducing the expression vector, expression cassette or fusion gene into an obligate anaerobic gram-positive bacterium as a drug delivery carrier.
  • a molecular biological method known in the art may be used as a method for introducing an expression vector or the like into a target obligate anaerobic gram-positive bacterium.
  • a known method such as an electroporation method (electroporation method) or a calcium phosphate method can be used.
  • electroporation method electroporation method
  • calcium phosphate method a known method such as an electroporation method (electroporation method) or a calcium phosphate method.
  • the 2nd aspect of this invention is an antitumor agent.
  • the term “antitumor agent” refers to a drug that has cytotoxic activity against tumor cells, can cause the cells to undergo apoptosis, and as a result, can suppress the growth of tumor cells. However, its medicinal effect is only required to suppress the growth of tumor cells, and does not have to eradicate tumor cells.
  • the antitumor agent of the present invention is characterized by comprising the recombinant bacterium of the first aspect as an active ingredient.
  • the recombinant bacterium as an active ingredient grows only in a tumor, and three or more anti-TRAIL-R1 single-chain antibodies and / or three or more anti-TRAIL-R2 in the tumor By secreting a single chain antibody, apoptosis in the tumor can be efficiently induced and the tumor can be regressed.
  • the antitumor agent of the present invention contains the recombinant bacterium of the first aspect as an active ingredient.
  • the recombinant bacterium is a single-chain antibody that recognizes and binds to TRAIL-R1, which is a kind of surface antigen of tumor cells that are target cells, and / or a single chain that recognizes and binds to TRAIL-R2. It encodes an antibody. Therefore, the recombinant bacterium that is an active ingredient of the antitumor agent of the present invention secretes an extracellular secreted antitumor cell fusion protein.
  • the tumor that is the target of the antitumor agent of the present invention may be any tumor regardless of benign or malignant as long as it expresses TRAIL-R1 and / or TRAIL-R2.
  • brain cancer, thyroid cancer, oral cancer, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, pharyngeal cancer, lung cancer, liver cancer, renal cancer, adrenal cancer, pancreatic cancer, biliary tract cancer, cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, breast cancer , Prostate cancer, bladder cancer, fibrosarcoma, mastocytoma or melanoma may be mentioned as target tumors.
  • the recombinant bacterium of the present invention expresses a fusion gene, its product, an extracellular secreting anti-tumor cell fusion protein, is secreted extracellularly.
  • the secreted fusion protein binds to the target tumor cell with a single-chain antibody moiety, and induces apoptosis by multimerizing TRAIL-R1 and / or TRAIL-R2.
  • the recombinant bacterium which is an active ingredient of the present invention is included in an antitumor agent in a viable state.
  • the recombinant bacterium according to the first aspect of the present invention cannot grow in the presence of a high concentration of oxygen and will eventually die. Therefore, in a living body, growth and survival are possible only at a site where the oxygen partial pressure is low.
  • a typical example of such a site is a central site of a tumor (solid cancer) found in advanced cancer or the intestinal tract. Therefore, the antitumor agent of the present invention can be an antitumor agent having a high tumor selective delivery property when administered in vivo by injection or the like.
  • antitumor agent of the present invention can be used in combination with other antitumor agents as long as it does not inhibit or suppress the survival, growth, and expression and secretion of fusion proteins as active ingredients.
  • the antitumor agent of the present invention can be formulated by a method known in the art in principle, on the premise that the recombinant bacterium is maintained or preserved in a viable state.
  • a method known in the art in principle on the premise that the recombinant bacterium is maintained or preserved in a viable state.
  • the method described in Remington's Pharmaceutical Sciences May be used.
  • the specific formulation method varies depending on the administration method. The administration method is roughly classified into oral administration and parenteral administration, but parenteral administration is more preferable in the case of the antitumor agent of the present invention.
  • the antitumor agent of the present invention When the antitumor agent of the present invention is administered parenterally, specific examples thereof include administration by injection.
  • the recombinant bacterium When the antitumor agent of the present invention is administered by injection, the recombinant bacterium can be mixed with a pharmaceutically acceptable solvent, and if necessary, can be prepared as a suspension added with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the “pharmaceutically acceptable solvent” may be either water, a pharmaceutically acceptable aqueous solution other than that, or an oily liquid.
  • the aqueous solution include isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants.
  • Adjuvants include, for example, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, and other non-ionic surfactants at low concentrations (eg, polysorbate 80 (TM), HCO-60), polyoxy And ethylene sorbitan fatty acid esters.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which can be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • blend with buffer for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer, soothing agent, for example, procaine hydrochloride, stabilizer, for example, benzyl alcohol, phenol, antioxidant.
  • Injectables are combined in a pharmaceutically acceptable excipient, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, pH adjuster, etc., in appropriate combinations in unit dosage forms generally required for pharmaceutical practice. It is sufficient to formulate by doing so.
  • the injection includes, for example, intravascular injection, intralymphatic injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, etc., but the recombinant bacterium that is the active ingredient of the antitumor agent of the present invention grows in the tumor. From the mechanism of suppressing the growth of the tumor cells, when the location of the tumor nest is unclear, systemic administration such as intravascular injection or intralymphatic injection is preferred.
  • Intravascular injection includes intravenous injection and intraarterial injection, and any of them may be used when administering the antitumor agent of the present invention.
  • local administration that is directly administered to the tumor may be used in addition to the systemic administration.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may be added in addition to the recombinant bacterium which is an active ingredient.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” does not inhibit or suppress the action of the microbial cells in order to facilitate the formulation of drugs and application to living bodies, and to maintain the survival of recombinant bacteria as active ingredients.
  • a substance added in a range for example, an excipient, a binder, a disintegrant, a filler, an emulsifier, a fluid addition modifier, or a lubricant can be used.
  • excipient examples include sugars such as monosaccharides, disaccharides, cyclodextrins and polysaccharides (specifically, but not limited to, glucose, sucrose, lactose, raffinose, mannitol, sorbitol, inositol, Including dextrin, maltodextrin, starch and cellulose), metal salts (eg, sodium phosphate or calcium phosphate, calcium sulfate, magnesium sulfate), citric acid, tartaric acid, glycine, low, medium, high molecular weight polyethylene glycol (PEG), Pluronic or a combination thereof.
  • sugars such as monosaccharides, disaccharides, cyclodextrins and polysaccharides (specifically, but not limited to, glucose, sucrose, lactose, raffinose, mannitol, sorbitol, inositol, Including dextrin, mal
  • binder examples include starch paste using corn, wheat, rice, or potato starch, gelatin, tragacanth, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, and / or polyvinylpyrrolidone.
  • disintegrant examples include the starch, carboxymethyl starch, cross-linked polyvinyl pyrrolidone, agar, alginic acid, sodium alginate or salts thereof.
  • filler examples include the sugar and / or calcium phosphate (for example, tricalcium phosphate or calcium hydrogen phosphate).
  • emulsifier examples include sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, and propylene glycol fatty acid ester.
  • Examples of the “flow additive modifier” and “lubricant” include silicate, talc, stearate or polyethylene glycol.
  • flavoring agents suspending agents, diluents, surfactants, extenders, humectants, moisturizers (for example, glycerin, starch, etc.), adsorbents (for example, starch, lactose, kaolin) , Bentonite, colloidal silicic acid, etc.), disintegration inhibitors (eg, sucrose, stearin, cocoa butter, hydrogenated oil, etc.), coating agents, coloring agents, preservatives, antioxidants, fragrances, flavoring agents, sweetening agents, Buffering agents and the like can also be included. One or two or more of the above carriers may be used as necessary.
  • dosage forms of oral vaccines include solid preparations (including tablets, pills, sublingual tablets, capsules, and drop agents), granules, powders, powders, and liquids.
  • the solid preparation can be made into a dosage form known in the art, for example, a sugar-coated tablet, a gelatin-encapsulated tablet, an enteric tablet, a film-coated tablet, a double tablet, or a multilayer tablet, if necessary.
  • the specific shape and size of the dosage form are not particularly limited as long as each dosage form is within the range of dosage forms known in the art.
  • the content of the recombinant bacterium in the antitumor agent of the present invention is, in principle, an amount that allows the microbial cells to reach the target tumor in a viable and proliferative state with a single administration, and for the subject to which it is applied. And any amount that causes little or no harmful side effects.
  • Such content varies depending on the type of target cell of the anti-tumor agent, the degree of cancer progression, the size of the tumor, the number of tumors in the whole body, the dosage form of the anti-tumor agent and the administration method. And is determined as appropriate.
  • the administration target of the antitumor agent of the present specification is a subject having a tumor or having a high probability.
  • subject refers to an animal to which the antitumor agent of the present invention is applied.
  • mammals preferably humans, dogs, cats, horses, mice, rats, rabbits, cows, monkeys, etc., more preferably humans.
  • the recombinant bacterium as an active ingredient survives and grows only in a tumor having a low oxygen partial pressure, and secretes an antitumor cell fusion protein. Therefore, the fusion protein can be efficiently transmitted to the tumor cells and continuously act.
  • the oxygen partial pressure in the tissue increases due to tumor cell growth being suppressed by the action of the fusion protein and the tumor regressing, the recombinant bacteria that are obligately anaerobic Gram-positive bacteria become non-viable. Therefore, it can be automatically excluded from the living body.
  • anti-tumor effects can be achieved by intravenous administration alone, without the administration of other anti-tumor drugs in obligate anaerobic bacteria that are non-pathogenic to solid tumors. It is possible to provide a safe and simple treatment method capable of exerting.
  • the antitumor agent of the present invention can be injected intravenously, it has an advantage of low invasiveness to a subject.
  • the 3rd aspect of this invention is a marker for tumor detection.
  • the “tumor detection marker” is a marker that can detect a tumor in vivo.
  • the tumor detection marker of the present invention is characterized by comprising the recombinant bacterium of the first aspect as an active ingredient.
  • the recombinant bacterium as an active ingredient grows only in a tumor and secretes an enzyme, a fluorescent protein or a luminescent protein in the tumor, whereby the position and size of the tumor in the living body. Can be monitored.
  • the marker for tumor detection of the present invention comprises the recombinant bacterium of the first aspect as an active ingredient.
  • the recombinant bacterium encodes a single chain antibody that recognizes and binds to the surface antigen of the tumor cell that is the target cell, and the functional peptide encodes a labeled protein or a protein that induces labeling.
  • the labeled protein include the aforementioned fluorescent protein or photoprotein.
  • the protein that induces labeling include enzymes (luciferase and peroxidase) such as luciferin and luminol that use a luminescent element or a fluorescent element as a substrate. Therefore, the recombinant bacterium which is an active ingredient of the marker for tumor detection of the present invention secretes an extracellular secreted anti-tumor cell immunomarker (immunolabel).
  • the recombinant bacterium of the present invention expresses a fusion gene, its product, an extracellular secretory anti-tumor cell immunomarker, is secreted extracellularly.
  • the secreted immunomarker binds to TRAIL-R1 or TRAIL-R2 on the cell membrane of the tumor cell, which is a target substance, in the single chain antibody portion, and the cell is labeled.
  • the functional peptide is a labeled protein such as a luminescent protein or a fluorescent protein
  • tumor cells are directly labeled with the labeled protein linked to a single chain antibody moiety.
  • the functional peptide is an enzyme
  • the tumor cells are enzyme-labeled by the enzyme linked to the single chain antibody portion.
  • the tumor detection marker of the present invention can be used in combination with the antitumor agent of the second aspect.
  • the recombinant bacterium as the active ingredient secretes the marker for tumor detection and the antitumor agent as independent molecules, that is, secretes different fusion proteins including single chain antibodies that recognize the same target substance.
  • it may be a different recombinant bacterium, or a recombinant bacterium that secretes one fusion protein containing an exotoxin and a labeled protein or enzyme in the functional protein portion.
  • the same tumor cells can be labeled and at the same time, the tumor cells can be damaged by the action of exotoxin.
  • the tumor detection marker of the present invention is administered to a subject, if the individual has a tumor, the recombinant bacterium, which is an active ingredient, grows in the tumor and the antitumor cell immunomarker is secreted.
  • the Secreted immunomarkers label tumor cells. Detection of labeled tumor cells is performed by detecting the luminescence or fluorescence emitted by the labeled protein itself when the immunomarker is a labeled protein such as a luminescent protein or fluorescent protein, and in vivo when the immunomarker is used. What is necessary is just to detect the light emission or fluorescence by the enzyme reaction of administered substrates, such as luciferin.
  • the method for detecting an immunomarker is not particularly limited.
  • the immunomarker may be detected after the tumor has been exposed by surgery such as laparotomy, or the in vivo luminescence or fluorescence is detected non-invasively from outside the body. Also good.
  • a method of detecting from outside the body is preferred.
  • a method for detecting luminescence or fluorescence derived from an immunomarker from outside the body is not limited, and for example, an in vivo bioimaging method can be used.
  • Katz, MH et al., 2003, Cancer Res. 63: 5521-5525, Schmitt, CA et al., 2002, Cancer Cell, 1: 289-298, Katz, MH et al., 2003, J. Surg Res., 113: 151-160, etc. can be used for detection. Detection may be performed by a commercially available IVIS Imaging System (Caliper) or a similar device.
  • the position and size of a tumor in a living body can be monitored from outside the living body based on the immunomarker.
  • immunotoxin suppresses the growth of tumor cells, and the immunomarker detects an in vivo tumor from outside the living body. By this, it becomes possible to monitor tumor regression and healing effect over time.
  • Example 1 Preparation of anti-human TRAIL-R2 gene expression cassette for Bifidobacterium expression>
  • Gene expression cassette of anti-hTRAIL-R2 VHH antibody tetramer (4E6 tetramer) for expression of Bifidobacterium A promoter region derived from the longum hup gene (SEQ ID NO: 25); Longgam-derived usp secretion signal sequence (SEQ ID NO: 29), DTY (insertion sequence after signal sequence), 4E6 amino acid sequence described in WO / 2011/098520, (GGSGG) 2 linker peptide (SEQ ID NO: 8C7 EGFP gene) 28) and a terminator (HUT) derived from a histone-like protein (SEQ ID NO: 26), and a gene in which a DNA encoding a His-Tag sequence was added to the C-terminus was DNA-synthesized (SEQ ID NO: 1).
  • ⁇ Example 2 Production of Drosophila cultured cells expressing hTRAIL-R1: Fc, hTRAIL-R2: Fc, mTRAIL-R2: Fc secretion and purification of recombinant protein>
  • TRAIL-R2 Human TRAIL-R2 for expression of cultured Drosophila cells: Alpaca Fc (hTRAIL-R2: Fc) gene expression cassette KpnI site, translation initiation consensus sequence (Cavener DR, 1987, Nucleic Acids Res. 15, 1353-1361 ), Bip secretion signal (Life Technologies), hTRAIL-R2 extracellular region (Accession No. Q6FH58, 54-182 amino acids), IEGRMD linker (SEQ ID NO: 27), Lama pacos (alpaca) IgG1 Fc (Accession No. AM773729, 102) ( ⁇ 335 amino acids), a DNA composed of His-Tag sequence, stop codon, and XhoI site was synthesized. (SEQ ID NO: 5)
  • TRAIL-R2 gene expression cassette of alpaca Fc (mTRAIL-R2: Fc) KpnI site, translation initiation consensus sequence (Cavener DR, 1987, Nucleic Acids Res. 15, 1353-1361 ), Bip secretion signal (Life Technologies), mTRAIL-R2 extracellular region (Accession No. Q9QZM4, 52-177 amino acids), IEGRMD linker (SEQ ID NO: 27), Lama pacos (alpaca) IgG1 Fc (Accession No. AM773729, 102 ( ⁇ 335 amino acids), a DNA composed of His-Tag sequence, stop codon, and XhoI site was synthesized. (SEQ ID NO: 6)
  • HTRAIL-R1 Fc
  • hTRAIL-R2 Fc
  • mTRAIL-R2 Fc secretion expressing Drosophila cultured cells and purification of recombinant proteins hTRAIL-R1, hTRAIL-R2, mTRAIL-R2 extracellular region and alpaca
  • vectors expressing these recombinant proteins in S2 cells which are Drosophila cultured cells, pAc5.1 / hTRAIL-R1 Fc, pAc5.1 / hTRAIL-R2 Fc, pAc5. 1 / mTRAIL-R2 Fc was prepared.
  • the S2 secretion expression gene cassette of the recombinant protein was inserted into the KpnI and XhoI sites of the pAc5.1 / V5-HisA plasmid (Life Technologies). It was introduced into S2 cells at a ratio of 19: 1 with pCoHygro plasmid (Life Technologies) containing the hygromycin resistance gene by the calcium phosphate method. The cells were cultured in Schneider's Drosophila Medium (Life Technologies) containing 300 ⁇ g / mL hygromycin (Life Technologies) and 10% fetal bovine serum (Tissue Culture Biologicals) to obtain drug resistant cells.
  • Drug resistant cells (1 ⁇ 10 7 cells / mL) were cultured in EXPRESS FIVE SFM (Life Technologies) containing 20 mM glutamine, and the culture supernatant was collected on the 7th day.
  • the recombinant protein was purified using TALON resin (Takara Bio). Specifically, after adding the culture supernatant to a column packed with TALON resin, it was washed with a washing buffer (25 mM HEPES pH 7.4, 0.3 M NaCl, 5 mM imidazole), and an elution buffer (25 mM HEPES pH 7.4, 0.3). M NaCl, 150 mM imidazole) was used to elute the recombinant protein.
  • the purified proteins were subjected to SDS-polyacrylamide electrophoresis and stained with Coomassie Brilliant Blue (CBB) R-250 (Bio-Rad) to confirm the purification of each protein (FIG. 4).
  • CBB Coomas
  • Example 3 Expression / purification and binding activity of recombinant 4E6 monomer protein in E. coli BL21 (DE3)> (1) Preparation of anti-hTRAIL-R2 VHH antibody / Myc-Tag (4E6 monomer) gene expression cassette for E. coli expression Gene for E. coli expression based on amino acid sequence information of 4E6 VHH monomer described in WO / 2011/098520 DNA was synthesized (SEQ ID NO: 7).
  • coli was recovered and resuspended in 10 mL of extraction buffer (50 mM Na Phosphate pH 7.8, 300 mM NaCl, EDTA-Free protease inhibitor cocktail (Roche)).
  • extraction buffer 50 mM Na Phosphate pH 7.8, 300 mM NaCl, EDTA-Free protease inhibitor cocktail (Roche)
  • Sonifier 250 Branson
  • sonication was performed twice for 1 minute under the conditions of Output Control 2 and Duty cycle 80% to disrupt the cells.
  • the treated suspension was centrifuged at 15000 rpm at 4 ° C. for 20 minutes, and the supernatant was collected.
  • a His Trap column (GE Healthcare UK) was used.
  • the centrifugation supernatant of the sonicated suspension is directly applied to a His Trap column, the column is washed with a binding buffer (20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 20 mM Imidazole pH 7.4), and then the fusion protein is eluted with an eluate containing 500 mM Imidazole. Was eluted.
  • the purified sample was subjected to 15% acrylamide SDS electrophoresis, stained with CBB, 4E6 monomer protein purified to approximately 15 KDa was confirmed, and the concentration of 4E6 monomer was calculated by comparison with BSA (bovine serum albumin protein) staining did. As a result, the concentration of 4E6 monomer was ⁇ 3 ⁇ g / ⁇ l (FIG. 5).
  • the plate was washed 3 times with 400 ⁇ L / well of PBS-T, anti-mouse IgG goat antibody HRP was added at 40 ⁇ L / well, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour. Thereafter, the plate was washed 3 times with 400 ⁇ L / well of PBS-T, TMB reagent (Wako Pure Chemical Industries) was added at 50 ⁇ L / well, allowed to react for about 10 minutes, and then the reaction was stopped with 0.5 M sulfuric acid. Thereafter, the absorbance at 450 nm was measured, and the average value and standard deviation of the measurement performed in triplicate were calculated.
  • FIG. 7 shows sensorgrams and fitting curves at each concentration. 4E6 monomer and recombinant human TRAIL-R2: K D values of the Fc antigen was 7.5 x 10 -11 M.
  • Example 4 Acquisition of novel anti-hTRAIL-R1 VHH antibody (4P6 monomer)>
  • Alpaca was immunized 6 times with 100 ⁇ g of hTRAIL-R1: Alpaca Fc every 1 to 2 weeks, and after 8 weeks, leukocytes were collected and RNA was extracted using RNeasy (Qiagen, Venlo, Netherlands). From this RNA, cDNA was synthesized by using PrimeScriptII 1 st strand cDNA synthesis kit (Takara Bio) using oligo dT primer and random 6 primer. The VHH antibody gene was amplified by PrimeSTAR GXL DNA polymerase (Takara Bio) by PCR at 95 ° C for 1 minute in 1 cycle, 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, and 68 ° C for 1 minute in 25 cycles.
  • This amplified product was subjected to PCR in the same manner at 95 ° C for 1 minute for 1 cycle, 98 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 15 seconds, and 68 ° C for 1 minute for 20 cycles to amplify the antibody gene.
  • primers having the DNA sequences of primer DNA sequence 1 (SEQ ID NO: 8) and primer DNA sequence 2 (SEQ ID NO: 9) were used.
  • the sequence of the isolated antibody gene (4P6) was determined by the cycle sequence method using BigDye Terminator v3.1 (Life Technologies).
  • CDR1 has the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 22
  • CDR2 has the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 23
  • CDR3 has the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 24.
  • the cells were cultured in Schneider's Drosophila Medium (Life Technologies) containing 300 ⁇ g / mL hygromycin (Life Technologies) and 10% fetal calf serum to obtain drug resistant cells.
  • the drug resistant cells were cultured with EXPRESS FIVE SFM (Life Technologies) containing 20 mM glutamine to obtain a culture supernatant.
  • the 4P6 monomer was purified by HisTrap column (GE Healthcare). The purified protein was subjected to 12.5% SDS-polyacrylamide electrophoresis and stained with Oriole Fluorescent Gel Stain (Bio-Rad) (FIG. 8).
  • Example 5 Measurement of binding specificity of anti-hTRAIL-R1 VHH antibody monomer (4P6 monomer) and affinity with hTRAIL-R1>
  • Analysis of binding specificity of 4P6 monomer and 4E6 monomer by ELISA It was examined by ELISA that 4P6 monomer selectively binds to TRAIL-R1.
  • hTRAIL-R1 Fc
  • hTRAIL-R2 Fc
  • mTRAIL-R2 Fc (see Example 2) dissolved in 0.1 M NaHCO 3 , Bovine serum albumin was added at 4 ° C. overnight.
  • the measurement was performed by the single cycle kinetics method according to the instructions attached to the Biacore X-100, and the 4P6 monomer was continuously added in the order of 0.1 nM, 0.5 nM, 2.5 nM, 12.5 nM, 62.5 nM.
  • the sensorgram and the fitting curve are shown in FIG.
  • the K D value (dissociation constant) was 3.4 ⁇ 10 ⁇ 11 M.
  • Example 6 Production of 4E6 dimer Toxin, 4E6 dimer EGFP, and 4E6 tetramer, recombinant E. coli BL21 (DE3), and expression and purification of recombinant protein> (1) Preparation of gene expression cassette (1-1) Preparation of anti-hTRAIL-R2 VHH antibody dimer Pseudomonas aeruginosa exotoxin A subunit fusion (4E6 dimer Toxin) gene expression cassette for E. coli expression The 4E6 dimer Toxin gene for E.
  • coli expression is transformed into pBluescriptII (+) plasmid
  • amplification by PCR was performed using primer DNA sequences 5 (SEQ ID NO: 12) and 6 (SEQ ID NO: 13).
  • PCR conditions were as follows: PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (Takara Bio) was used as a DNA polymerase at 95 ° C for 1 minute for 1 cycle, 98 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 15 seconds, and 68 ° C for 2 minutes for 25 cycles.
  • the amplification product is purified using a MinElute column (Qiagen) according to the attached protocol, digested with restriction enzymes NdeI and NotI, electrophoresed with 1.2% agarose, the target band is cut out from the gel, and a DNA gel extraction kit ( Qiagen) and purified and isolated according to the attached protocol. This is inserted into the NdeI and NotI sites of pET-22b (+) (Novagen), and has a Strep Tag (Schmidt TG, Skerra A., 2007, Nat Protoc.
  • PCR conditions were as follows: PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (Takara Bio) was used as a DNA polymerase at 95 ° C for 1 minute for 1 cycle, 98 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 15 seconds, and 68 ° C for 2 minutes for 25 cycles.
  • the amplification product is purified using a MinElute column (Qiagen) according to the attached protocol, digested with restriction enzymes NdeI and NotI, electrophoresed with 1.2% agarose, cut out the desired band from the gel, and a DNA gel extraction kit (Qiagen). ) And purified according to the attached protocol.
  • the 4E6 tetramer gene for E. coli expression is a 4E6 tetramer gene expression cassette for bifidobacteria expression inserted into pEX-K plasmid ( Amplification by PCR was performed using primer DNA sequences 3 (SEQ ID NO: 10) and 4 (SEQ ID NO: 11) using SEQ ID NO: 1) as a template.
  • PCR conditions were as follows: PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (Takara Bio) was used as a DNA polymerase at 95 ° C for 1 minute for 1 cycle, 98 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 15 seconds, and 68 ° C for 2 minutes for 25 cycles.
  • the amplification product is purified using a MinElute column (Qiagen) according to the attached protocol, digested with restriction enzymes NdeI and NotI, electrophoresed with 1.2% agarose, cut out the desired band from the gel, and a DNA gel extraction kit (Qiagen). ) And purified according to the attached protocol.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside, Takara Bio
  • 20 mL extraction buffer 50 mM NaPhosphate pH 7.8, 300 mM NaCl, EDTA-Free protease inhibitor cocktail (Roche)
  • Sonifier 250 Sonifier 250
  • a HisTrap column (GE Healthcare) was used for purification of the fusion protein. Apply the centrifugal supernatant of the sonicated suspension directly to a HisTrap column, wash the column with a binding buffer (20 mM NaPhosphate, 0.5 M NaCl, 20 mM Imidazole pH 7.4), and then elute the fusion protein with an eluate containing 500 mM Imidazole. I let you.
  • the purified sample was subjected to 10% acrylamide SDS electrophoresis, stained with CBB, the purified recombinant protein was confirmed, and the concentration of the target protein band was calculated by comparison with BSA (bovine serum albumin protein) staining ( Figure 13a-c).
  • BSA bovine serum albumin protein
  • Example 7 Measurement of cancer cell death-inducing activity of 4E6 dimer Toxin and 4E6 tetramer> It was examined whether 4E6 dimer Toxin fusion protein has a cell death-inducing action on cultured hTRAIL-R2-expressing human cancer cells (Colo205, obtained from American Type Culture Collection).
  • each 2 x 10 5 cells was phosphate buffered saline (pH 7.4) containing 10 ⁇ g / mL 4E6 dimer EGFP and 2% fetal bovine serum. The mixture was reacted for 30 minutes on ice in 50 ⁇ L. The cells were washed twice with the above-described serum-containing phosphate buffered saline, and the fluorescence intensity of the cells was analyzed with FACSVerse (BD Biosciences). Both cells were stained with 4E6 dimer EGFP. On the other hand, neither cell was stained with the control dimer EGFP (FIG. 15). Therefore, 4E6 dimer is thought to bind to cells.
  • 4E6 dimer Toxin binds to TRAIL-R2 on the cell membrane, but cannot aggregate TRAIL-R2 molecules into trimers or more, nor is it incorporated into cells. It was thought that cell death could not be induced in the cells.
  • 4E6 monomer and 4E6 tetramer had a cell death inducing action
  • 4E6 monomer and 4E6 tetramer purified as described above were used at final concentrations of 25000, 5000, 1000, 200, 40, 8, 1.6.
  • 50 ⁇ L of a medium (2 ⁇ final concentration) to be 0.32 ⁇ pg / mL was added.
  • 4E6 monomer did not cause cell death, but 4E6 tetramer, which has the activity of aggregating TRAIL-R2 molecules into trimers or more, induced strong cell death in Colo205 cells (FIG. 14b).
  • anti-hTRAIL-R VHH antibody tetramer which has the activity of aggregating TRAIL-R into trimers or more, can induce cancer cell death more efficiently than anti-hTRAIL-R VHH antibody dimer Toxin. Show.
  • Example 8 Cell death-inducing action of 4E6 tetramer expressed in E. coli on human colon cancer cells and pancreatic cancer cells> The cancer cell death-inducing action of 4E6 tetramer on human colon cancer cell Colo205 and pancreatic cancer cell BxPC-3 (obtained from American Type Culture Collection) was examined.
  • Cells are suspended in RPMI1640 medium (Sigma) supplemented with 10% fetal bovine serum (Tissue Culture Biologicals), and cells are added to Falcon 96-well culture plates (Becton Dickinson) at 3 x 10 3 cells / 50 ⁇ L / well, After overnight culture, 50 ⁇ L each of a medium containing 4E6 tetramer and hTRAIL (Wako Pure Chemical Industries) was added. Colo205 cells were cultured overnight, and BxPC-3 cells were cultured overnight. Then, 10 ⁇ L of viable cell count reagent SF (Nacalai Tesque) was added, and further cultured for 4 to 6 hours, and absorbance at 450 nm was measured.
  • RPMI1640 medium Sigma
  • fetal bovine serum Tissue Culture Biologicals
  • Example 9 Secretion expression and purification of 4E6 tetramer and 4E6 dimer EGFP in bifidobacteria>
  • a pKKT427 vector (Yasui K., et al., Nucleic) is a vector gene cassette (see Example 1) for secreting and expressing 4E6 tetramer and 4E6 dimer EGFP in bifidobacteria. Acids Res. 2009) between HindIII and NotI and introduced into B. longum 105-A by electroporation. Electroporation was performed under the conditions of 2.4 kV, 25 ⁇ F, and 200 ohm.
  • Anaerobic culture was performed by using an airtight container containing Aneropac Kenki (Mitsubishi Gas Chemical Co., Tokyo, Japan) as an oxygen scavenger.
  • the culture medium cultured overnight was measured for absorbance (600 nm), and added to a new liquid medium so that the absorbance was 0.1.
  • the cells were anaerobically cultured for 6 to 7 hours, centrifuged at 9,400 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C., and the culture supernatant was collected. Purification of the recombinant protein was performed with a HisTrap column (GE Healthcare).
  • the culture supernatant was applied to a HisTrap column, and the column was washed with a binding buffer (50 mM NaPhosphate, 0.3 M NaCl, 20 mM Imidazole pH 7.8), and then the protein was eluted with an eluate containing 500 mM Imidazole.
  • Purified protein corresponding to the amount purified from 1 mL of culture supernatant was subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis and stained with Oriole Fluorescent Gel Stain (Bio-Rad) (FIG. 17). Both 4E6 tetramer and 4E6 dimer EGFP were detected around the estimated molecular weight (about 60 kDa).
  • the amount of secretion in the culture supernatant was estimated to be 400 ng / mL for 4E6 tetramer and 3.2 ng / mL for 4E6 dimer EGFP. From the above results, it was found that both recombinant proteins were secreted, and that 4E6 tetramer was secreted and expressed more efficiently than 4E6 dimer EGFP.
  • Example 10 Cancer cell death-inducing activity of anti-hTRAIL-R2 VHH antibody tetramer (4E6 tetramer) secreted and expressed in bifidobacteria>
  • the cancer cell death-inducing activity of 4E6 tetramer against human colon cancer Colo205 cells was examined. Cells are suspended in RPMI1640 medium (Sigma) supplemented with 10% fetal bovine serum (Tissue Culture Biologicals), and cells are added to Falcon 96-well culture plates (Becton Dickinson) at 3 x 10 3 cells / 50 ⁇ l medium / well. It was.
  • IC 50 of hTRAIL produced in E. coli was 0.4 nmol / L. Therefore, 4E6 tetramer secreted and expressed in bifidobacteria was found to have higher cell death-inducing activity than hTRAIL.
  • Example 11 Examination of antitumor effect by intravenous administration of recombinant B. longum in Ceno205 cell transplanted Xenograft model> Recombinant B. longum 105-A that secretes and expresses anti-hTRAIL-R2 VHH antibody tetramer (4E6 tetramer) in Xenograft model in which human colon cancer Colo205 cells were transplanted subcutaneously into nude mice The antitumor effect when administered intravenously was examined.
  • the B. longum 105-A used was prepared by centrifugation and resuspension in saline. To supplement B. longum 105-A in the body, 1 mL of 20% lactulose was intraperitoneally administered daily.
  • Tumor diameter was measured with calipers 0, 2, 4, 7, 11, 14, 18, and 21 days after the day of administration of bifidobacteria.
  • the tumor volume was calculated by the formula “(minor axis) 2 x (major axis) / 2”. The results are shown in FIG.
  • On day 21 after administration of bifidobacteria recombinant bifidobacteria secreting and expressing the 4E6 tetramer inhibited tumor growth by 51% compared to no treatment.
  • the 4E6 dimer EGFP-secreting bifidobacteria-administered group which was a negative control, showed no tumor growth inhibitory effect.
  • Example 12 Examination of antitumor effect by intravenous administration of recombinant B. longum in Xenograft model transplanted with BxPC-3 cells> Recombinant B. longum 105- secreting and expressing anti-hTRAIL-R2 VHH antibody tetramer (4E6 tetramer) in Xenograft model in which human pancreatic cancer BxPC-3 cells were transplanted subcutaneously into nude mice The antitumor effect when A was administered intravenously was examined.
  • the B. longum 105-A used was prepared by centrifugation and resuspension in saline. To supplement B. longum 105-A in the body, 1 mL of 20% lactulose was intraperitoneally administered daily.
  • Tumor diameter was measured using calipers 0, 3, 6, 10, 13, and 17 days after the day of administration of bifidobacteria.
  • the tumor volume was calculated by the formula “(minor axis) 2 x (major axis) / 2”. The results are shown in FIG.
  • bifidobacteria On the 17th day after administration of bifidobacteria, recombinant bifidobacteria secreting and expressing the 4E6 tetramer suppressed tumor growth by 52% compared to no treatment.
  • the 4E6 dimer EGFP-secreting bifidobacteria-administered group which was a negative control, showed no tumor growth inhibitory effect.
  • Example 13 Production of 4P6 trimer recombinant E. coli BL21 (DE3) and expression / purification of recombinant protein>
  • 4P6 trimer Preparation of anti-hTRAIL-R1 VHH antibody trimer (4P6 trimer) gene expression cassette for E. coli expression Anti-hTRAIL-, which has Strep Tag at the N-terminus and His-Tag sequence at the C-terminus and was obtained according to Example 4
  • a gene encoding a 4P6 trimer in which three monomers of R1 VHH antibody are linked by two (GGSGG) 2 linker peptides (SEQ ID NO: 28) is inserted into the NdeI and NotI sites of pET-22b (+) (Novagen). Then, a 4P6 trimer gene expression cassette for E. coli expression was constructed (see Example 6).
  • coli was recovered and resuspended in 20 mL of extraction buffer (50 mM Na Phosphate pH 7.8, 300 mM NaCl, EDTA-Free protease inhibitor cocktail (Roche)).
  • extraction buffer 50 mM Na Phosphate pH 7.8, 300 mM NaCl, EDTA-Free protease inhibitor cocktail (Roche)
  • Sonifier 250 Branson
  • sonication was performed twice for 1 minute under the conditions of Output Control 2 and Duty cycle 80% to disrupt the cells.
  • the treated suspension was centrifuged at 9,400 ⁇ g for 20 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected.
  • a His Trap column (GE Healthcare UK) was used for purification of the fusion protein.
  • the centrifugation supernatant of the sonicated suspension is directly applied to a His Trap column, the column is washed with a binding buffer (20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 20 mM Imidazole pH 7.4), and then the fusion protein is eluted with an eluate containing 500 mM Imidazole. Was eluted. Further, the eluted fraction was added to a Strep-Tactin column (IBA) and purified according to the attached manual. Purified protein corresponding to 50 ng of BSA was subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis and stained with Oriole Fluorescent Gel Stain (Bio-Rad) (FIG. 23). The 4P6 trimer was detected around the estimated molecular weight (about 42 kDa). From the above results, it was found that 4P6 trimer can be expressed and purified in E. coli.
  • a binding buffer (20 mM sodium phosphate, 0.5 M
  • Example 14 Measurement of cancer cell death inducing activity of 4P6 trimer expressed in E. coli> The cancer cell death-inducing activity of 4P6 trimer against human colon cancer Colo205 cells (American Type Culture Collection) was examined. Cells are suspended in RPMI1640 medium (Sigma) supplemented with 10% fetal bovine serum (Tissue Culture Biologicals), and cells are added to Falcon 96-well culture plates (Becton Dickinson) at 3 x 10 3 cells / 50 ⁇ l medium / well. It was. After overnight culture, 50 ⁇ L of medium containing 4P6 trimer at a final concentration of 10 pM to 10 nM was added.
  • Example 15 Secretion expression and purification of anti-hTRAIL-R1 VHH antibody trimer (4P6 trimer) in Bifidobacteria> (1) Production of recombinant bifidobacteria by electroporation The 4P6 trimer prepared by replacing the 4E6 tetramer part of the expression cassette in Example 1 (1) with the 4P6 trimer obtained according to Example 4 (1) A vector gene cassette for secretory expression in Bifidobacteria is inserted between HindIII and NotI of pKKT427 vector (Yasui K., et al., Nucleic Acids Res. 2009), and electroporation to B. longum 105-A Introduced by. Electroporation was performed under the conditions of 2.4 kV, 25 ⁇ F, and 200 ohm.
  • Anaerobic culture was performed by using an airtight container containing Aneropac Kenki (Mitsubishi Gas Chemical Co., Tokyo, Japan) as an oxygen scavenger.
  • the culture medium cultured overnight was measured for absorbance (600 nm), and added to a new liquid medium so that the absorbance was 0.1.
  • the culture supernatant was applied to a HisTrap column, and the column was washed with a binding buffer (50 mM NaPhosphate, 0.3 M NaCl, 20 mM Imidazole pH 7.8), and then the protein was eluted with an eluate containing 500 mM Imidazole.
  • Purified protein corresponding to the amount purified from 0.6 mL of culture supernatant was subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis and stained with Oriole Fluorescent Gel Stain (Bio-Rad) (FIG. 25).
  • the 4P6 trimer was detected around the estimated molecular weight (about 42 kDa).
  • the secretion amount of 4P6 trimer in the culture supernatant was estimated to be 30 ng / mL. From the above results, it was found that 4P6 trimer is secreted and expressed in Bifidobacterium.
  • Example 16 Cancer cell death inducing activity of anti-hTRAIL-R1 VHH antibody trimer (4P6 trimer) secreted and expressed in bifidobacteria>
  • Cells are suspended in RPMI1640 medium (Sigma) supplemented with 10% fetal bovine serum (Tissue Culture Biologicals), and cells are added to Falcon 96-well culture plates (Becton Dickinson) at 3 x 10 3 cells / 50 ⁇ l medium / well. It was.
  • IC 50 of hTRAIL produced in E. coli was 0.4 nmol / L, 4P6 trimers secreted expressed in bifidobacteria has been found to have higher cell death-inducing activity than hTRAIL. As shown in FIG. 26b, 4P6 trimer also inhibited the proliferation of BxPC-3 cells in a concentration-dependent manner.
  • Example 17 Examination of antitumor effect by intravenous administration of recombinant B. longum secreting and expressing 4P6 trimer in Xenograft model transplanted with BxPC-3-Luc # 2 cells> Anti-hTRAIL-R1 VHH antibody trimmer (4P6 trimmer) in Xenograft model in which human pancreatic cancer BxPC-3-Luc # 2 cells (obtained from JCRB cell bank) were transplanted subcutaneously into nude mice We investigated the antitumor effect of recombinant B. longum 105-A secreting and expressing s.
  • the B. longum 105-A used was prepared by centrifugation and resuspension in saline. To supplement B. longum 105-A in the body, 1 mL of 20% lactulose was intraperitoneally administered daily.
  • Tumor diameter was measured with calipers 15, 19, 21, 24, 28, 31, and 35 days after the day of tumor implantation.
  • the tumor volume was calculated by the formula “(minor axis) 2 x (major axis) / 2”.
  • the results are shown in FIG.
  • On the 20th day after administration of bifidobacteria recombinant bifidobacteria secreting and expressing 4P6 trimer inhibited tumor growth by 65% compared to no treatment.
  • no tumor growth inhibitory effect was observed in the pKKT427-introduced bifidobacteria administration group, which was a negative control.
  • the weight of each group was measured 15, 19, 21, 24, 28, 31, and 35 days after the day of tumor implantation. As shown in FIG. 28, no weight loss was detected in the 4P6 trimer group compared to the untreated, pKKT427-introduced bifidobacteria group. From these results, it is considered that 4P6 trimer suppresses tumor growth by cell death-inducing activity without causing side effects that cause weight loss.

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Abstract

　本発明は、抗TRAIL-R1抗体及び抗TRAIL-R2抗体によって効果的ながん細胞死を誘導すると同時に、正常細胞への毒性を軽減することを目的とする。　3つ以上の抗TRAIL-R1単鎖抗体及び／又は3つ以上の抗TRAIL-R2単鎖抗体を含む融合タンパク質をコードする核酸を発現可能な状態で含む組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。

Description

組換え偏性嫌気性グラム陽性菌
　本発明は、組換え偏性嫌気性グラム陽性菌を有効成分とする抗腫瘍剤及び腫瘍検出用マーカーに関する。
　TRAIL（TNF-related apoptosis-inducing ligand）は、TNFスーパーファミリーに属し、さまざまながん細胞に細胞死（アポトーシス）を誘導するタンパク質である。TRAILは、生体内では3量体を形成し、細胞内にデスドメインをもつTRAIL受容体（TRAIL-R1、TRAIL-R2）に結合する。TRAILが結合するとTRAIL受容体は凝集して3量体を形成し、それによって、細胞死シグナルを細胞内に伝達することが知られている。TRAILの受容体には、前記TRAIL-R1、TRAIL-R2以外にもTRAIL-R3、TRAIL-R4、及び可溶型受容体であるオステオプロテゲリンが知られている（図１）。TRAIL-R3、TRAIL-R4、及びオステオプロテゲリンはデスドメインを完全、もしくは部分的に欠失しており、これらの受容体はTRAILが結合しても細胞死を誘導しないことから、おとり受容体と呼ばれている。
　TRAILは、正常細胞には細胞死を起こしにくいことから、抗腫瘍薬として開発が進められている。しかしながら、TRAILを利用してがん細胞に細胞死を効率的に誘導させるためには、前記おとり受容体に結合することなく、TRAIL-R1及びTRAIL-R2に効率的に結合し、細胞内に細胞死シグナルを伝達するシステムを開発する必要がある。TRAIL-R1及びTRAIL-R2に対する作動性（アゴニスト）抗体は、上記おとり受容体に結合しないため、TRAILよりも効果的に細胞死を誘導でき、また血中の半減期が長いため、投与間隔を長くできる。それ故に、これらの抗体は現在臨床段階にある（非特許文献1）。しかしながら、HGS-ETR1（抗hTRAIL(ヒトTRAIL)-R1作動性抗体）及びHGS-ETR2（抗hTRAIL-R2作動性抗体）は、二価であるため、Fc受容体を持ったNK細胞やマクロファージによる抗体のクロスリンクなしに、TRAIL受容体の3量体形成を誘導することができない（図2a）。そのため、これらの抗体は臨床試験では顕著な治療効果が見られないという問題があった（非特許文献2）。
　NK細胞やマクロファージの関与なしに直接がん細胞膜上のhTRAIL-R2分子を凝集させて細胞死シグナルを伝えることができる強力なアゴニスト抗体としてHGS-TR2J（KMTR2）が知られている（非特許文献3）（図2b）。また、hTRAIL-R2に対するラマ一本鎖VHH抗体の3～5量体が、NK細胞やマクロファージの関与なしに、hTRAIL-R2発現がん細胞に対して非常に強力な細胞死を誘導することも知られている（特許文献1）（図3）。一方、hTRAIL-R1及びhTRAIL-R2はがん細胞だけでなく、さまざまなヒト正常組織に発現しており、特に、ヒト正常肝細胞はhTRAIL、抗hTRAIL-R作動性抗体に感受性であるため（非特許文献4及び非特許文献5）、hTRAIL-R作動性抗体は、副作用として肝障害を引き起こすと考えられる。
PCT WO/2011/098520
Ghobrialら, 2005, CA Cancer J Clin., 55(3), pp. 178-194 Micheauら, 2013, Br J Pharmacol., 169(8), pp.1723-1744 Motokiら, 2005, Clin Cancer Res., 11(8), pp.3126-3135 Joら, 2000, Nat Med., 6(5), pp.564-567 Moriら, 2004, Cell Death Differ., 11(2), pp.203-207
　本発明は、抗TRAIL-R1抗体及び抗TRAIL-R2抗体によって効果的ながん細胞死を誘導すると同時に、正常細胞への毒性を軽減することを目的とする。
　上記課題を解決するため鋭意検討した結果、本発明者は、強力なアゴニスト活性を有する抗hTRAIL-R2 VHH抗体を発現し、分泌するビフィズス菌を作製して、この組換えビフィズス菌の静脈内投与によって腫瘍局所でのがん細胞死を誘導できることを初めて明らかにした。また、本発明者は、がん細胞膜上のhTRAIL-R1分子を認識できる新規な抗hTRAIL-R1 VHH抗体を取得した。本発明により、強力なアゴニスト活性を有する抗hTRAIL-R1及び抗hTRAIL-R2抗体の腫瘍部位局所投与によって、正常細胞への毒性を軽減しながら、効果的にがん細胞死を誘導することが可能となる。
　本発明は、当該研究結果に基づくものであって、具体的には以下の発明を提供する。
（１）シグナルペプチド、並びに3つ以上の抗TRAIL-R1単鎖抗体及び／又は3つ以上の抗TRAIL-R2単鎖抗体を含む融合タンパク質をコードする核酸を発現可能な状態で含む組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。
（２）偏性嫌気性グラム陽性菌がビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）である、（１）に記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。
（３）抗TRAIL-R1単鎖抗体が、
　CDR1が配列番号22で示されるアミノ酸配列を含み、
　CDR2が配列番号23で示されるアミノ酸配列を含み、及び
　CDR3が配列番号24で示されるアミノ酸配列を含む、
（１）又は（２）に記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。
（４）抗TRAIL-R2単鎖抗体が、
　CDR1が配列番号15で示されるアミノ酸配列を含み、
　CDR2が配列番号16で示されるアミノ酸配列を含み、及び
　CDR3が配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む、
（１）～（３）のいずれかに記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。
（５）前記融合タンパク質が、さらに機能性ペプチドを含む、（１）～（４）のいずれかに記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。
（６）機能性ペプチドが、標識タンパク質である、（５）に記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。
（７）（１）～（６）のいずれかに記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌を有効成分とする抗腫瘍剤。
（８）CDR1が配列番号22で示されるアミノ酸配列を含み、
　CDR2が配列番号23で示されるアミノ酸配列を含み、及び
　CDR3が配列番号24で示されるアミノ酸配列を含む、
抗TRAIL-R1抗体。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2014-003441号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明により、強力なアゴニスト活性を有する抗hTRAIL-R1及び抗hTRAIL-R2抗体の腫瘍部位局所投与によって、正常細胞への毒性を軽減しながら、効果的ながん細胞死を誘導することが可能となる。
図1は、TRAIL及びその受容体の構造と、細胞死誘導のシグナル伝達の概略図である。 図2は、TRAIL-Rに対する通常の抗体aとアゴニスト活性を持つ抗体bとの細胞死シグナルの細胞内伝達の相違を示す概略図である（通常の抗体の場合、TRAILを介するアポトーシスにNK細胞やマクロファージcによるクロスリンクを必要とする。KMTR2抗体の場合、TRAILを介するアポトーシスにNK細胞やマクロファージによるクロスリンクを必要としない）。 図3は、一本鎖VHH抗体の3～5量体（この図ではVHH4）が、NK細胞やマクロファージによるクロスリンクなしにhTRAIL-R発現がん細胞に対してアポトーシスを誘導することを示す概略図である。 図4は、精製hTRAIL-R1:Fc（a）、hTRAIL-R2:Fc（b（１））、及びmTRAIL(マウスTRAIL)-R2:Fc（b（2））のSDS-PAGE（SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動）像を示す。 図5は、精製した4E6モノマーのSDS-PAGE像を示す。矢印が4E6モノマーを示す。 図6は、4E6モノマーのhTRAIL-R2:Fc抗原への結合活性のELISAによる測定結果を示す。 図7は、4E6モノマーとhTRAIL-R2:Fc抗原の解離定数のBiacore X-100による測定結果を示す。 図8は、精製した4P6モノマーのSDS-PAGE像を示す。 図9は、4P6モノマー及び4E6モノマーの結合特異性のELISAによる解析結果を示す。 図10は、4P6モノマーとhTRAIL-R1:Fc抗原の解離定数のBiacore X-100による測定結果を示す。 図11は、4P6モノマー及び4E6モノマーのアンタゴニスト活性を示す。 図12は、大腸菌で発現させた4E6ダイマーToxin（a）、4E6ダイマーEGFP（b）、及び4E6テトラマー（c）の遺伝子構造の模式図である。 図13は、精製した大腸菌発現組換えタンパク質（a：4E6ダイマーToxin、b: 4E6ダイマーEGFP、及びc：4E6テトラマー）のSDS-PAGE像を示す。 図14は、ヒト大腸がん細胞Colo205細胞に対する組換えタンパク質（a：4E6ダイマーToxin及び4E6ダイマーEGFP並びにb：4E6モノマー及び4E6テトラマー）の細胞死誘導活性を示す。 図15は、4E6ダイマーEGFPによるがん細胞（a：Colo205細胞及びb：BxPC-3細胞）の蛍光染色を示す。縦軸は細胞数、横軸は、4E6ダイマーEGFPの蛍光強度を示す。 図16は、大腸菌で発現した抗hTRAIL-R2 VHH抗体テトラマー（4E6テトラマー）のヒト大腸がん細胞Colo205細胞（a）及び膵臓がん細胞BxPC-3細胞（b）に対する細胞死誘導作用を示す。 図17は、ビフィズス菌培養上清1mLから精製した4E6テトラマー、及び4E6ダイマーEGFPのSDS-PAGE像を示す。4E6テトラマーは3クローン、4E6ダイマーEGFPは2クローンの結果を示す。 図18は、ビフィズス菌培養上清から精製した4E6テトラマー（4E6テトラマー）のColo205細胞に対するがん細胞死誘導活性を示す。 図19は、Colo205細胞を移植したヌードマウスにおける4E6テトラマー分泌ビフィズス菌の抗腫瘍効果を示す。腫瘍体積はmm3で、平均値＋標準誤差（n=6）で示す。 図20は、Colo205細胞を移植したヌードマウスにおいて4E6 テトラマー分泌ビフィズス菌を投与したときの体重変化を示す。体重は、平均値＋標準偏差（n=6）で示す。 図21は、BxPC-3細胞を移植したヌードマウスにおける4E6 テトラマー分泌ビフィズス菌の抗腫瘍効果を示す。腫瘍体積はmm3で、平均値＋標準誤差（n=6）で示す。 図22は、BxPC-3細胞を移植したヌードマウスにおいて4E6 テトラマー分泌ビフィズス菌を投与したときの体重変化を示す。体重は、平均値＋標準偏差（n=6）で示す。 図23は、精製した大腸菌発現組換えタンパク質（4P6トリマー）のSDS-PAGE像を示す。 図24は、大腸菌で発現した抗hTRAIL-R1 VHH抗体トリマー（4P6トリマー）のヒト大腸がん細胞Colo205細胞に対する細胞死誘導作用を示す。 図25は、ビフィズス菌培養上清から精製した4P6トリマーのSDS-PAGE像を示す。 図26は、ビフィズス菌培養上清から精製した抗hTRAIL-R1 VHH抗体トリマー（4P6トリマー）のヒト大腸がん細胞Colo205細胞（a）及び膵臓がん細胞BxPC-3細胞（b）に対する細胞死誘導作用を示す。 図27は、BxPC-3-Luc#2細胞を移植したヌードマウスにおける4P6 トリマー分泌ビフィズス菌の抗腫瘍効果を示す。腫瘍体積はmm3で、平均値＋標準誤差（n=5）で示す。 図28は、BxPC-3-Luc#2細胞を移植したヌードマウスにおいて4P6 トリマー分泌ビフィズス菌を投与したときの体重変化を示す。体重は、平均値＋標準誤差（n=5）で示す。
　以下で本発明について具体的に説明をする。
１．組換え偏性嫌気性グラム陽性菌
１－１．概要及び定義
　本発明の第１の態様は、組換え偏性嫌気性グラム陽性菌（以下、しばしば「組換え細菌」と略称する）である。本発明の組換え細菌は、融合タンパク質をコードする核酸を発現可能な状態で含む薬剤送達用の担体である。
　「偏性嫌気性グラム陽性菌」とは、グラム陽性菌に分類される偏性嫌気性菌をいう。ここで、「偏性嫌気性菌」とは、絶対嫌気性菌とも呼ばれ、高酸素存在下では増殖できず、死滅する性質を有する細菌をいう。したがって、哺乳動物の体内においては、低酸素で嫌気状態の消化器官内、主として腸内では増殖可能であるが、溶存酸素の存在する血液等の体液中や通常の組織内では増殖することができない。「グラム陽性菌」とは、グラム染色により紫色又は紺色に染色される細菌の総称である。グラム陽性菌には、桿菌、球菌、らせん菌が知られるが、本明細書では特に限定はしない。グラム陽性菌は、内毒素（エンドトキシン）を含まないことから、死後も内毒素を放出しない。それ故、安全性の面で本発明の薬剤送達用担体として好ましい。本発明の組換え細菌としては、例えば、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）（本明細書では、以下ビフィドバクテリウム属を総称して「ビフィズス菌」と呼ぶ）、クロストリジウム属（Clostridium）が該当し得る。好ましくはビフィズス菌である。これは、ビフィズス菌が外毒素（エキソトキシン）を分泌せず、また乳酸菌として日常的に利用されており、人体等に対する安全性が確認されているからである。ビフィズス菌は、いずれの種であってもよいが、好ましくは人間の腸管内に生息する種類、具体的には、B．ビフィドゥム（B. bifidum）、B．ロンガム（B. longum）、B．ブレイブ（B. brave）、B．インファンティス（B. infantis）及びB．アドレセンティス（B.adolescentis）である。
１－２．構成
　本発明の偏性嫌気性グラム陽性菌は、融合タンパク質をコードする核酸（以下、しばしば「融合遺伝子」とする）を発現可能な状態で含む。以下、本発明の組換え細菌を特徴付ける融合遺伝子及びそれを発現可能な状態にする発現カセットの構成について具体的に説明をする。
１－２－１．融合遺伝子の構成
　本明細書において「融合タンパク質をコードする核酸（融合遺伝子）」とは、遺伝子組換え技術によって複数の遺伝子等を融合して構築された、融合タンパク質をコードする外来性核酸をいう。融合遺伝子は、後述する発現カセット内に挿入された状態で本発明の組換え細菌内に導入されている。
　本明細書において「融合タンパク質」とは、シグナルペプチド、3つ以上の単鎖抗体、及び任意に機能性ペプチドを含み、それらを連結した細胞外分泌性タンパク質である。シグナルペプチド、単鎖抗体及び機能性ペプチドは、直接連結されていてもよいし、リンカーペプチドを介して間接的に連結されていてもよい。リンカーペプチドの長さやアミノ酸配列は、単鎖抗体及び機能性ペプチドのそれぞれの機能を阻害しなければ、特に限定はしない。例えば、20アミノ酸以下、又は15アミノ酸以下で自己フォールディングしないアミノ酸配列等が好適である。本発明に用いられるリンカーペプチドとして、例えば、IEGRMDリンカーペプチド（配列番号27）及び(GGSGG)2リンカーペプチド（配列番号28）が挙げられる。以下、融合タンパク質を構成するシグナルペプチド、単鎖抗体及び機能性ペプチドについて、具体的に説明をする。
（１）シグナルペプチド
　シグナルペプチドは、細胞内で生合成されたタンパク質の細胞外移行に必要なペプチドである。通常、N末端側にLys及びArgのような正電荷を有するアミノ酸を配し、それに続いてAla、Leu、Val、Ile、Val、及びPheのような疎水性の高いアミノ酸配列を配する。また、シグナルペプチドのC末端側には、シグナルペプチドの切断と分泌を促進するシグナル配列後挿入配列及び／又は融合タンパク質からシグナルペプチドを切断するシグナルペプチダーゼ認識部位を含むアミノ酸配列を有していてもよい。シグナルペプチドは、本発明の細菌内で発現された前記融合タンパク質を、膜に存在するトランスロケーター等を介して細胞外に分泌する機能を担う。シグナルペプチドのアミノ酸配列は、特に限定はしない。偏性嫌気性グラム陽性菌内で機能し得る公知のあらゆるシグナル配列のアミノ酸配列を利用することができる。また、シグナルペプチドのアミノ酸長も、特に限定はしない。通常は、3アミノ酸～60アミノ酸の範囲内にあればよい。ただし、融合タンパク質の分子量が大きくなりすぎないようにするためアミノ酸長の短いシグナルペプチドが好ましい。
　シグナルペプチドは、融合タンパク質のN末端側に配置する。
（２）単鎖抗体
　前記融合タンパク質には、3つ以上の単鎖抗体が含まれる。本明細書において「単鎖抗体」とは、一本鎖ポリペプチドで構成され、かつ単体で標的物質を認識し、結合することのできる抗体をいう。二本鎖以上で構成される抗体は、分子量的に大き過ぎるため偏性嫌気性グラム陽性菌内では発現しない可能性や、抗体機能を有する適切な立体構造が構築されない可能性が高いためである。したがって、本発明の単鎖抗体は、１つあたりの分子量が35kDa以下の低分子抗体であることが好ましい。天然抗体及び人工抗体は、問わない。
　本発明の単鎖抗体は、典型的に、相補性決定領域（CDR）及びフレームワーク領域（FR）からなる可変領域で構成される。相補性決定領域は、可変性を示して抗体に結合特異性を付与する領域である。一方、フレームワーク領域は、可変領域の相対的に保存されている部分である。完全な可変ドメインは3つのCDRにより連結された4つのFRを含む。3つのCDRはそのN末から順にCDR1、CDR2、及びCDR3と呼ばれ、4つのFRはそのN末から順にFR1、FR2、FR3、及びFR4と呼ばれている。従って、可変領域において、前記CDRとFRは、アミノ酸末端からカルボキシ末端方向にFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及びFR4の順序で配列される。
　本明細書で「天然抗体」とは、いずれかの脊椎動物が産生する抗体と同一のアミノ酸配列を有する抗体をいう。天然抗体の単鎖抗体の具体例としては、例えば、ラクダ科の動物が産生する一本鎖抗体が挙げられる（Hamers-Casterman C., et al., 1993, Nature 363: 446-448）（以下、本明細書では「ラクダ科一本鎖抗体」とする）。ラクダ科一本鎖抗体は、L鎖がなくH鎖のみで構成される抗体であり、H鎖のVH領域のみで抗原と結合できるため、分子量は、約14kDaと、通常の抗体の10分の1程度しかない。また、一般に抗原親和性が高く、熱、酸及び塩基に対する耐性が高いという性質がある（Deffar, K., et al., 2009, African Journal of Biotechnology 8 (12): 2645-2652)。それ故、本発明における単鎖抗体として非常に好適である。ラクダ科の動物種は、ラクダ科一本鎖抗体を産生できれば、その種類は問わない。例えば、ラマ、アルパカ、ラクダ等のいずれの動物種由来の抗体も利用することができる。
　本明細書で「人工抗体」とは、人工的に構築された抗体である。例えば、前記天然抗体のアミノ酸配列に適当な変異を導入した単鎖抗体の他、天然界には原則存在しない構造上の改変を行った単鎖抗体が挙げられる。このような人工抗体の具体例として、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖Fv（scFv ：single chain Fragment of variable region）（Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995, Pierce Chemical Co., Rockford, IL）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）又はテトラボディ（tetrabody）等が挙げられる。
　「キメラ抗体」とは、抗体分子の可変領域と定常領域が、それぞれ異種の動物に由来する抗体をいう。キメラ抗体の作製は公知の方法を用いて行うことができ、例えば、抗体Ｖ領域をコードする核酸とヒト抗体Ｃ領域をコードする核酸とを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより得られる。
　「ヒト化抗体」とは、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される改変抗体である。ヒト化抗体は、免疫動物由来の抗体のCDRを、ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによって構築される。その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。
　一本鎖Fvは、免疫グロブリン分子において、L鎖とH鎖に位置する可変領域（すなわち、それぞれVL及びVH）を十分な長さの柔軟性リンカーによって連結し、1本のポリペプチド鎖に包含した構造を有する、分子量約35kDa以下の合成抗体である。一本鎖Fv内において両可変領域は、互いに自己集合して１つの機能的な抗原結合部位を形成することができる。
　前記融合タンパク質において、単鎖抗体は、TRAILを凝集させ3量体を形成させるために、3つ以上含まれていなければならない。ただし、抗体数が多くなると融合タンパク質の分子量が大きくなるため、通常は、数個、例えば3～6個、3～5個又は3～4個が好ましい。個々の単鎖抗体は、適当なリンカーペプチドで連結されていることが望ましい。リンカーペプチドの長さやアミノ酸配列は、それぞれの単鎖抗体の抗原結合活性を阻害しなければ、特に限定はしない。
　前記融合タンパク質は、同一の抗原を認識する単鎖抗体を3つ以上含む。例えば、hTRAIL-R1を抗原とする場合、前記融合タンパク質は、いずれも同一のhTRAIL-R1を認識する単鎖抗体を3つ以上含む。
　本発明において、抗体の「価」とは、抗体1分子が有する抗原結合部位の数をいう。例えば、IgGは1分子に2つの抗原結合部位を有する2価の抗体である。上記単鎖抗体は、1分子あたり1つの抗原結合部位を有する1価の抗体である。本発明の融合タンパク質は、3つ以上の単鎖抗体を含むことから、全体として3価以上である。
　単鎖抗体は、融合タンパク質において、シグナルペプチドのC末端側であれば、後述する機能性ペプチドとの順序は特に制限はしないが、機能性ペプチドのN末端側に配置することが好ましい。
　本発明における単鎖抗体の標的物質は、TRAIL-R1又はTRAIL-R2である。前述のように本発明の組換え細菌は、嫌気性環境下でのみ増殖可能であることから、生体内において嫌気的環境下となる細胞が標的細胞として好適である。具体的には、好適な標識細胞として、腫瘍細胞又は腸管上皮細胞が挙げられる。以下、抗TRAIL-R1抗体及び抗TRAIL-R2抗体について、具体的に説明する。
（ｉ）抗TRAIL-R1抗体
　本発明において、「抗TRAIL-R1単鎖抗体」とは、TRAIL-R1（TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 1、TRAIL受容体1）に対する単鎖抗体をいう。本発明に用いる抗TRAIL-R1単鎖抗体は、TRAIL-R1に特異的に結合するものであれば、特に限定しない。本発明に用いられる抗TRAIL-R1単鎖抗体として、例えば本明細書の実施例で取得し、使用した4P6が挙げられる。4P6は、アルパカ由来の一本鎖VHH抗体であり、CDR1が配列番号22で示されるアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号23で示されるアミノ酸配列を含み、及びCDR3が配列番号24で示されるアミノ酸配列を含む。本発明で用いる抗TRAIL-R1単鎖抗体のフレームワーク領域の配列は特に限定しないが、例えば、Maass D.R., et al., 2007, J Immunol Methods. 324: 13-25に記載されているアルパカ単鎖抗体（例えば、上記文献に記載のClone A02）のフレームワーク領域の配列を用いる事ができる。したがって、抗TRAIL-R1単鎖抗体は、限定するものではないが、例えば、FR1が配列番号18で示されるアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号19で示されるアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号20で示されるアミノ酸配列を含み、及びFR4が配列番号21で示されるアミノ酸配列を含んでよい。
　本発明に用いる融合タンパク質は、特に、TRAIL-R1に結合して、アポトーシスを誘導するアゴニスト活性を有することが望ましい。TRAIL-R1は3量体以上に凝集することでアポトーシスを誘導するため、TRAIL-R1を活性化させるために、前記融合タンパク質が、前述したように3つ以上、4つ以上、5つ以上、又は6つ以上、例えば3つ、4つ、5つ、又は6つの抗TRAIL-R1単鎖抗体を含むのが特に好ましい。
　本発明の一態様として、CDR1が配列番号22で示されるアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号23で示されるアミノ酸配列を含み、及びCDR3が配列番号24で示されるアミノ酸配列を含む、抗TRAIL-R1抗体が挙げられる。該抗体のフレームワーク領域の配列は特に限定しないが、例えば、上記のMaass D.Rの文献に記載された配列を用いてよく、したがって、FR1が配列番号18で示されるアミノ酸配列を含み、FR2が配列番号19で示されるアミノ酸配列を含み、FR3が配列番号20で示されるアミノ酸配列を含み、及びFR4が配列番号21で示されるアミノ酸配列を含んでよい。TRAIL-R1を活性化させるために、該抗体は3価以上であるのが好ましい。また、該抗体は上記のような人工抗体、例えばキメラ抗体又はヒト化抗体であってよい。
　TRAIL-R1に対する作動性抗体は、TRAIL-R1を介してアポトーシスを誘導するため、本発明の抗体はアポトーシス誘導剤として使用することができる。
（ii）抗TRAIL-R2抗体
　本発明において、「抗TRAIL-R2単鎖抗体」とは、TRAIL-R2（TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 2、TRAIL受容体2）に対する単鎖抗体をいう。本発明に用いる抗TRAIL-R2単鎖抗体は、TRAIL-R2に特異的に結合するものであれば、特に限定しない。本発明に用いられる抗TRAIL-R2単鎖抗体として、例えば、上記文献WO2011/098520に記載されている4E6が挙げられる。4E6は、ラマ一本鎖VHH抗体であり、CDR1が配列番号15で示されるアミノ酸配列を含み、CDR2が配列番号16で示されるアミノ酸配列を含み、及びCDR3が配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む。
　本発明に用いる融合タンパク質は、特に、TRAIL-R2に結合して、アポトーシスを誘導するアゴニスト活性を有することが望ましい。TRAIL-R2は3量体以上に凝集することでアポトーシスを誘導するため、TRAIL-R2を活性化させるために、前記融合タンパク質が、前述したように3つ以上、4つ以上、5つ以上、又は6つ以上、例えば3つ、4つ、5つ、又は6つの抗TRAIL-R2単鎖抗体を含むのが特に好ましい。
　TRAIL-R2に対する作動性抗体は、TRAIL-R2を介してアポトーシスを誘導するため、本発明の抗体はアポトーシス誘導剤として使用することができる。
（３）機能性ペプチド
　前記融合タンパク質には、任意に機能性ペプチドが含まれる。本明細書において「機能性ペプチド」とは、生体内又は細胞内において、特定の生物活性、例えば、酵素活性、触媒活性、基質としての機能、又は生物学的阻害若しくは亢進機能（例えば、細胞傷害活性）を有するペプチドをいう。具体的には、例えば、蛍光タンパク質若しくは発光タンパク質、酵素、又は外毒素が挙げられる。
　機能性ペプチドの由来する生物種は問わない。また、機能性ペプチドは、天然型又は非天然型のいずれであってもよい。天然型の機能性ポリペプチドとは、天然界に存在するペプチドをいう。一方、非天然型の機能性ポリペプチドとは、天然型の機能性ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、その機能性ペプチドが有する特有の機能を失わない範囲においてアミノ酸配列に適当な変異（アミノ酸の付加、欠失、置換を行ったもの）を導入した改変ペプチドをいう。
　前記融合タンパク質において、機能性ペプチドは二以上含まれていてもよい。ただし、複数の機能性ペプチドを含む場合、融合タンパク質全体の分子量が大きくなり過ぎることから、機能性ペプチドの総分子量は、80kDa以下、好ましくは40kDa以下とするのがよい。二以上の機能性ペプチドを包含する場合、それぞれの機能性ペプチドの種類は、同一であっても異なっていてもよい。例えば、外毒素と酵素、又は外毒素と蛍光タンパク質又は発光タンパク質を組み合わせた機能性ペプチドが挙げられる。二以上の機能性ペプチドを包含する場合、個々の機能性ペプチドは、直接連結されていてもよいが、それぞれの機能性ペプチドが独自の機能を効率的に発揮し得るように適当なリンカーペプチドで連結されていることが好ましい。リンカーペプチドの長さやアミノ酸配列は、機能性ペプチドの機能を阻害しなければ、特に限定はしない。二以上の異なる機能性ペプチドを1つの融合タンパク質に包含させることによって、単鎖抗体が認識する標的物質に対して異なる機能を付与することが可能となる。
　機能性ペプチドは、融合タンパク質において、シグナルペプチドのC末端側であれば、特に制限はしないが、前記単鎖抗体のC末端側に配置することが好ましい。
　以下、本発明の組換え細菌において、機能性ペプチドとして働き得る、上述の蛍光タンパク質若しくは発光タンパク質、酵素、又は外毒素について具体的に説明をする。
（ｉ）蛍光タンパク質又は発光タンパク質（標識タンパク質）
　機能性ペプチドとしての蛍光タンパク質の種類は、塩基配列が既知であれば特に問わない。上記天然型及び非天然型のいずれであってもよい。ただし、上記理由からアミノ酸長の短いものが好ましい。また、励起波長、蛍光波長も特に限定はしない。これらの波長は、状況及び必要に応じて適宜選択すればよい。具体的な蛍光タンパク質としては、例えば、CFP、RFP、DsRed、YFP、PE、PerCP、APC、GFP等が挙げられる。
　また、発光タンパク質についても、塩基配列が既知であればその種類は、特に問わない。上記蛍光タンパク質と同様に、天然型及び非天然型のいずれであってもよいが、アミノ酸長の短いものが好ましい。具体的な発光タンパク質としては、例えば、イクオリン等が挙げられる。
（ii）酵素
　機能性ペプチドとしての酵素の種類は、塩基配列が既知であれば特に問わない。標的物質に対して直接作用する酵素であってもよいし、標的物質に対して直接作用はせず、その周辺で機能する酵素であってもよい。後者の具体的な例としては、発光に寄与するルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）等が挙げられる。前記単鎖抗体に酵素が連結された融合タンパク質は、イムノエンザイム（免疫酵素）として機能し得る。
（iii）外毒素
　「外毒素」（エキソトキシン）とは、細菌が菌体外に分泌する毒性タンパク質である。外毒素は、細胞傷害活性を有し、かつその塩基配列が既知であれば種類は問わない。例えば、緑膿菌毒素(Pseudomonas toxin; PT）及びその派生物、例えば、PTから細胞接着ドメインを除去した外毒素A、ジフテリア毒素（Diphtheria toxin: DT）及びその派生物、並びにリシン(Ricin)及びその派生物が挙げられる（Brinkmann U. & Pastan I., 1994, Biochimica et Biophysica Acta, 1198(1):27-45）。緑膿菌外毒素Aは、癌細胞内へ取り込まれた後、EF-2をADPリボシル化して不活性化することでタンパク質合成を阻害し、強い殺細胞効果を発揮することが知られている。前記単鎖抗体に外毒素が連結された融合タンパク質は、イムノトキシン（免疫毒素）として機能し得る。
１－２－２．発現カセットの構成
　本明細書において「発現カセット」とは、前記融合遺伝子を含み、それを融合タンパク質として発現可能な状態にすることのできる発現システムをいう。本明細書において、「発現可能な状態」とは、当該発現カセットに含まれる融合遺伝子が組換え細菌内で発現可能なように、遺伝子発現に必要なエレメントの制御下に配置されている状態をいう。遺伝子発現に必要なエレメントには、プロモーター及びターミネーターが挙げられる。
　プロモーターは、組換え細菌内で作動可能なプロモーターであれば、特に制限はしないが、使用する偏性嫌気性グラム陽性菌由来のプロモーターが好ましい。例えば、偏性嫌気性グラム陽性菌にビフィズス菌のB.ロンガムを使用する場合には、B.ロンガムのhup遺伝子プロモーター（配列番号25）が挙げられる。また、プロモーターには、その発現制御の性質により過剰発現型プロモーター、構成的プロモーター、部位特異的プロモーター、段階特異的プロモーター、又は誘導性プロモーター等が知られている。本発明における発現カセットに使用するプロモーターがいずれのプロモーターであるかは、特に限定はしない。必要に応じて適宜選択すればよい。好ましくは、過剰発現型プロモーター又は構成的プロモーターである。前記発現カセットにおいて、プロモーターは、前記融合遺伝子の開始コドンよりも上流の5’側に配置される。
　ターミネーターは、組換え細菌内で、前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であれば特に限定はしない。例えば、ヒストン様タンパク質ターミネーター（HUT）（配列番号26）が挙げられる。好ましくはプロモーターと同一生物種由来のターミネーターであり、より好ましくはプロモーターが由来する生物種のゲノム上で、そのプロモーターと組となっているターミネーターである。前記発現カセットにおいて、ターミネーターは、前記融合遺伝子の終止コドンよりも下流の3’側に配置される。
　前記融合タンパク質を組換え細菌内で安定的に発現させるため、発現カセットを包含するベクターを発現ベクターとして同菌体内に導入することができる。又は、相同性組換えを介して同菌のゲノム内に挿入してもよい。発現ベクターを使用する場合、ベクターには、プラスミド等を使用することができる。ベクターは、本発明の組換え細菌内で複製可能であり、また菌体内で安定的に保持される適当な選抜マーカー遺伝子を含むものを用いる。ベクターは、大腸菌等の他の細菌内でも複製可能なシャトルベクターであってもよい。例えば、pKKT427、pBESAF2、pPSAB1等が挙げられる。組換え細菌のゲノム内に挿入する場合、融合遺伝子のみを組換え細菌のゲノム中に発現可能な状態となるように挿入してもよい。すなわち、組換え細菌の内在性のプロモーターやターミネーターの制御下に融合遺伝子を挿入してもよい。
　発現カセットは、1つの発現カセット内に1つの融合遺伝子を含むモノシストロニックであってもよいし、二以上の融合遺伝子を含むポリシストロニックであってもよい。
１－３．組換え偏性嫌気性グラム陽性菌の製造方法
　本発明の組換え細菌は、当該分野で公知の分子遺伝学的方法を用いて製造することができる。例えば、前記融合遺伝子であれば、シグナルペプチド、及び単鎖抗体をそれぞれコードする核酸を、例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory PressやAusubelet al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Ed., A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley ＆ Sonsに記載の手法を用いて構築すればよい。
　上記単鎖抗体を取得するのに、TRAIL-R1又はTRAIL-R2に結合する抗体をコードする遺伝子の塩基配列情報を使用することができる。この抗体の塩基配列情報は、例えば前述のCDR及びFRの塩基配列に基づいてもよい。
　TRAIL-R1又はTRAIL-R2に対する抗体を新たに作製する場合、それらに対するモノクローナル抗体の作製は、当該分野で公知の方法に従って行えばよい。以下に、その作製例を示す。
　標的とするTRAIL-R1又はTRAIL-R2の細胞外ドメインを免疫原としてラクダ科の動物に投与して免疫する。必要であれば、免疫を効果的に行うためにアジュバントを添加してもよい。アジュバントの例としては、市販の完全フロイントアジュバント（FCA）、不完全フロイントアジュバント（FIA）等が挙げられ、これらを単独で又は混合して用いることができる。免疫原溶液の1回の投与量は、前記動物１匹当たり約50～200μgの免疫原を含んでいればよい。免疫の間隔は、特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは1～4週間間隔で、2～10回、好ましくは5～7回追加免疫を行う。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をELISA（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）法等により繰り返し行う。続いて、免疫された動物から抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、末梢血細胞が好ましい。次に、末梢血細胞からRNAを抽出し、オリゴdTプライマー及びランダム6merプライマーを用いてcDNAを合成する。このcDNAから、ラクダ科一本鎖抗体の可変領域（VHH領域）の遺伝子をPCRにより増幅し、pCANTAB6（McCafferty J., et al., 1994, Appl. Biochem. Biotech., 47, 157-173）などのファージミドベクターに上記遺伝子を組み込み、エレクトロポレーション法で大腸菌TG1に導入する。上記の大腸菌TG1にM13K07ヘルパーファージを感染させ、ファージを回収することにより、ラクダ科一本鎖抗体可変領域（VHH領域）発現ファージライブラリーを取得する。標準的には1×107pfu種以上のライブラリーとなる。
　標的抗原に対する抗体を発現するファージを選別するにはバイオパニングを行う。これは、固定化した標的抗原に抗体ファージライブラリーを反応させ、結合しなかったファージを洗浄により除去した後に、結合したファージを溶出し大腸菌に感染させて増殖させるという操作を3回から5回行うことで標的抗原に特異的なファージを濃縮する方法である。パニングしたファージを大腸菌TG1に再感染させた後、VHH挿入pCANTABファージミドベクターを含むTG1クローンを単離し、個々のTG1クローンにKO7ヘルパーファージを感染させて、VHH抗体を提示したクローン化ファージを得る。これらの中から抗原に反応するクローンを選択する。取得したファージから抗体の塩基配列を得ることができる。
　融合遺伝子は、発現可能なように上記発現カセット内に分子遺伝学的方法を用いて挿入される。発現カセットは、必要に応じて、例えば、プラスミド等のベクターに組み込む。ベクターに発現カセットを組み込むには、発現カセットの5’末端及び3’末端を適当な制限酵素で切断し、ベクター内のマルチクローニングサイト等の対応する制限部位に挿入する方法等を採用することができる。また、ベクターが本発明の組換え細菌内で発現可能な発現用ベクターである場合、前記融合遺伝子をその発現用ベクターの発現制御領域内（ベクター内のプロモーター及びターミネーター間のマルチクローニング部位等）に挿入することで、発現カセットを構築すると同時に目的の発現ベクターを構築することも可能である。これらの具体的な方法については、例えば、上記Green and Sambrook(2012)に記載の方法を参照されたい。
　目的の組換え細菌は、前記発現ベクター、発現カセット又は融合遺伝子を薬剤送達用担体である偏性嫌気性グラム陽性菌に導入することによって製造できる。発現ベクター等を目的の偏性嫌気性グラム陽性菌内へ導入する方法は、当該分野で公知の分子生物学的方法を用いればよい。例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）やリン酸カルシウム法の公知の方法を用いることができる。これらの具体的な方法については、例えば、上記Green and Sambrook(2012)に記載の方法を参照されたい。
２．抗腫瘍剤
２－１．概要
　本発明の第２の態様は、抗腫瘍剤である。本発明において「抗腫瘍剤」とは、腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を有し、該細胞をアポトーシスに至らしめ、その結果、腫瘍細胞の増殖を抑制することのできる薬剤をいう。ただし、その薬効は、腫瘍細胞の増殖を抑制できればよく、腫瘍細胞を根絶させずともよい。
　本発明の抗腫瘍剤は、第１態様の組換え細菌を有効成分とすることを特徴とする。本発明の抗腫瘍剤によれば、有効成分である組換え細菌が腫瘍内でのみ増殖し、腫瘍内で3つ以上の抗TRAIL-R1単鎖抗体及び／又は3つ以上の抗TRAIL-R2単鎖抗体を分泌することによって、効率的に腫瘍におけるアポトーシスを誘導し、腫瘍を退縮させることができる。
２－２．構成
　本発明の抗腫瘍剤は、前述のように第１態様の組換え細菌を有効成分とする。この場合の組換え細菌は、融合遺伝子が標的細胞である腫瘍細胞の表面抗原の一種であるTRAIL-R1を認識して結合する単鎖抗体及び／又はTRAIL-R2を認識して結合する単鎖抗体をコードしている。したがって、本発明の抗腫瘍剤の有効成分である組換え細菌は、細胞外分泌性抗腫瘍細胞融合タンパク質を分泌することとなる。
　本発明の抗腫瘍剤の標的となる腫瘍は、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2を発現しているものであれば、良性、悪性を問わず、いずれの腫瘍であってもよい。例えば、脳腫瘍、甲状腺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、大腸癌、咽頭癌、肺癌、肝臓癌、腎癌、副腎癌、膵臓癌、胆道癌、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、線維肉腫、肥満細胞腫又はメラノーマが標的腫瘍として挙げられる。
　本発明の組換え細菌が融合遺伝子を発現した場合、その産物である細胞外分泌性抗腫瘍細胞融合タンパク質は、細胞外に分泌される。分泌された融合タンパク質は、単鎖抗体部分で標的物質である腫瘍細胞に結合し、TRAIL-R1及び／又はTRAIL-R2を多量体化することによってアポトーシスを誘導する。
　本発明の有効成分である組換え細菌は、抗腫瘍剤において生菌状態で含まれる。本発明の第１態様に記載の組換え細菌は、高濃度の酸素存在下では増殖できず、やがて死滅する。したがって、生体内においては、酸素分圧の低い部位でのみ増殖、生存が可能である。そのような部位の代表的な例として、進行癌に見られる腫瘍（固形癌）の中心部位又は腸管内が挙げられる。それ故、本発明の抗腫瘍剤は、注射等により体内投与した場合、腫瘍選択的送達性の高い抗腫瘍剤となり得る。
　また、本発明の抗腫瘍剤は、有効成分である組換え細菌の生存、増殖、融合タンパク質の発現及び分泌を阻害又は抑制しない範囲において、他の抗腫瘍剤と併用することができる。
　本発明の抗腫瘍剤は、組換え細菌を生菌状態で維持又は保存することを前提として、原則として当該分野で公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences（Merck Publishing Co．，Easton，Pa．）に記載の方法を用いればよい。具体的な製剤化の方法は、投与方法によって異なる。投与方法は、経口投与と非経口投与に大別されるが、本発明の抗腫瘍剤の場合、非経口投与がより好ましい。
　本発明の抗腫瘍剤を非経口投与する場合、その具体例としては、注射による投与が挙げられる。本発明の抗腫瘍剤を注射で投与する場合、組換え細菌を製薬上許容可能な溶媒と混合し、必要に応じて製薬上許容可能な担体を加えた懸濁液剤として調製することができる。
　「製薬上許容可能な溶媒」は、水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る水溶液、又は油性液のいずれであってもよい。水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液が挙げられる。補助剤としては、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート80（TM）、HCO-60）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。油性液としては、ゴマ油、大豆油が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はベンジルアルコールと併用することもできる。また、緩衝剤、例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えば、ベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。
　注射剤は、製薬上許容される賦形剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、pH調節剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化すればよい。
　注射は、例えば、血管内注射、リンパ管内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等が挙げられるが、本発明の抗腫瘍剤の有効成分である組換え細菌が腫瘍内で増殖して、その腫瘍細胞の増殖を抑制するという機序から、腫瘍巣の位置が明確でない場合には、全身投与である血管内注射又はリンパ管内注射等の循環器内投与が好ましい。血管内注射には、静脈内注射及び動脈内注射等があるが、本発明の抗腫瘍剤を投与する場合いずれであってもよい。一方、腫瘍巣の位置が確定している場合には、前記全身投与の他、腫瘍へ直接的に投与する局所投与であってもよい。
　本発明の抗腫瘍剤を経口投与する場合については、有効成分である組換え細菌に加えて、製薬上許容可能な担体を添加してもよい。
　「製薬上許容可能な担体」とは、薬剤の製剤化や生体への適用を容易にし、また有効成分である組換え細菌の生存を維持するために、その菌体の作用を阻害又は抑制しない範囲で添加される物質をいう。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤又は潤滑沢剤が挙げられる。
　「賦形剤」としては、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖（具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム）、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（PEG）、プルロニック、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。
　「結合剤」としては、例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。
　「崩壊剤」としては、例えば、前記デンプンや、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム又はそれらの塩が挙げられる。
　「充填剤」としては、例えば、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が挙げられる。
　「乳化剤」としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが挙げられる。
　「流動添加調節剤」及び「滑沢剤」としては、例えば、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが挙げられる。
　その他、必要に応じて、矯味矯臭剤、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、増量剤、付湿剤、保湿剤（例えば、グリセリン、澱粉等）、吸着剤（例えば、澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等）、崩壊抑制剤（例えば、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等）、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤等を含むこともできる。上記のような担体を、一又は二以上、必要に応じて適宜使用すればよい。
　経口ワクチン剤の剤形としては、例えば、固形剤（錠剤、丸剤、舌下剤、カプセル剤、ドロップ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤等を挙げることができる。さらに固形剤は、必要に応じ、当該分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠とすることができる。剤形の具体的な形状、大きさについては、いずれもそれぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。
　本発明の抗腫瘍剤における組換え細菌の含有量は、原則1回の投与でその菌体が標的の腫瘍に生存かつ増殖可能な状態で達し得る量で、かつそれを適用する被検体に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量であればよい。このような含有量は、抗腫瘍剤の標的細胞の種類、癌の進行度、腫瘍の大きさ、全身における腫瘍巣数、抗腫瘍剤の剤形及び投与方法によって異なるため、それぞれの条件を勘案し、適宜定められる。
　本明細書の抗腫瘍剤の投与対象は、腫瘍を有するか又はその蓋然性の高い被検体である。本明細書で「被検体」とは、本発明の抗腫瘍剤を適用する動物いう。例えば、哺乳動物、好ましくはヒト、イヌ、ネコ、ウマ、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、サル等、より好ましくはヒトである。
２－３.効果
　本発明の抗腫瘍剤によれば、有効成分である組換え細菌が酸素分圧の低い腫瘍内でのみ生存及び増殖し、抗腫瘍細胞融合タンパク質を分泌する。それ故、該融合タンパク質を腫瘍細胞にまで効率的に伝達し、かつ継続的に作用させることができる。また、融合タンパク質の作用により腫瘍細胞の増殖が抑制され、腫瘍が退縮することによって、組織中の酸素分圧が高まると、偏性嫌気性グラム陽性菌である組換え細菌は、生存不能となることから生体内から自動的に排除することができる。これにより、従来の細菌療法と比較して、固形がんに対して非病原性の偏性嫌気性菌で他の抗腫瘍薬を投与することなく、単独の静脈内への投与により抗腫瘍効果を発揮することのできる安全でかつ簡便な治療法を提供することができる。
　また、本発明の抗腫瘍剤は、静脈内注射が可能であることから、被検体に与える侵襲性も低いという利点を有する。
３．腫瘍検出用マーカー
３－１．概要
　本発明の第３の態様は、腫瘍検出用マーカーである。本発明において「腫瘍検出用マーカー」とは、生体内において腫瘍を検出することができるマーカーである。
　本発明の腫瘍検出用マーカーは、第１態様の組換え細菌を有効成分とすることを特徴とする。本発明の腫瘍検出用マーカーによれば、有効成分である組換え細菌が腫瘍内でのみ増殖し、腫瘍内で酵素、蛍光タンパク質又は発光タンパク質を分泌することによって、生体内における腫瘍の位置や大きさをモニタリングすることができる。
３－２．構成
　基本的な構成は、第２態様の抗腫瘍剤に準じる。そこで、ここでは主に前記抗腫瘍剤と異なる点について説明をし、重複する構成については原則省略する。
　本発明の腫瘍検出用マーカーは、前述のように第１態様の組換え細菌を有効成分とする。この場合の組換え細菌は、融合遺伝子が標的細胞である腫瘍細胞の表面抗原を認識して、結合する単鎖抗体をコードし、機能性ペプチドが標識タンパク質又は標識化を誘導するタンパク質をコードしている。標識タンパク質としては、例えば、前述の蛍光タンパク質又は発光タンパク質が挙げられる。また、標識化を誘導するタンパク質としては、ルシフェリンやルミノールのような発光素又は蛍光素を基質とする酵素（ルシフェラーゼやペルオキシダーゼ）が挙げられる。したがって、本発明の腫瘍検出用マーカーの有効成分である組換え細菌は、細胞外分泌性抗腫瘍細胞イムノマーカー（免疫標識子）を分泌することとなる。
　本発明の組換え細菌が融合遺伝子を発現した場合、その産物である細胞外分泌性抗腫瘍細胞イムノマーカーは、細胞外に分泌される。分泌されたイムノマーカーは、単鎖抗体部分で標的物質である腫瘍細胞の細胞膜上のTRAIL-R1又はTRAIL-R2に結合し、その細胞は標識化される。具体的には、機能性ペプチドが発光タンパク質又は蛍光タンパク質のような標識タンパク質であった場合、単鎖抗体部分と連結されたそれらの標識タンパク質によって腫瘍細胞が直接標識化されることとなる。一方、機能性ペプチドが酵素であった場合、単鎖抗体部分と連結された酵素によって腫瘍細胞が酵素標識されることとなる。
　本発明の腫瘍検出用マーカーは、第２態様の抗腫瘍剤と併用することができる。この場合、有効成分である組換え細菌が、腫瘍検出用マーカーと抗腫瘍剤をそれぞれ独立した分子として分泌する、すなわち同一標的物質を認識する単鎖抗体を含む異なる融合タンパク質を分泌する、同一の又は異なる組換え細菌であってもよいし、機能性タンパク質部分に外毒素と標識タンパク質又は酵素を含む1つの融合タンパク質を分泌する組換え細菌であってもよい。これらの場合、同一の腫瘍細胞を標識化すると同時に、外毒素の作用によって腫瘍細胞を傷害することが可能となる。
　また、有効成分である組換え細菌の生存、増殖、イムノマーカーの発現、及び分泌を阻害又は抑制しない範囲において、他の抗腫瘍剤と併用することもできる。
３－３．検出
　本発明の腫瘍検出用マーカーを被検体に投与した場合、その個体が腫瘍を有していれば、有効成分である組換え細菌がその腫瘍内で増殖し、抗腫瘍細胞イムノマーカーが分泌される。分泌されたイムノマーカーは、腫瘍細胞を標識化する。標識化された腫瘍細胞の検出は、イムノマーカーが発光タンパク質又は蛍光タンパク質のような標識タンパク質の場合には、その標識タンパク質自身の発する発光又は蛍光を、また酵素標識の場合には、生体内に投与されたルシフェリン等の基質の酵素反応による発光又は蛍光を、検出すればよい。イムノマーカーの検出方法は、特に限定はしない。腫瘍の多くは、生体内部に存在するため、開腹等の手術によって腫瘍を露出させた上でイムノマーカーを検出してもよいし、生体内の発光又は蛍光を体外から非侵襲的に検出してもよい。好ましくは体外から検出する方法である。イムノマーカー由来の発光又は蛍光を体外から検出する方法としては、限定はしないが、例えば、in vivoバイオイメージング法を用いることができる。例えば、Katz, M.H. et al., 2003, Cancer Res. 63: 5521-5525、Schmitt, C.A. et al., 2002, Cancer Cell, 1: 289-298, Katz, M.H. et al., 2003, J. Surg. Res., 113: 151-160等に記載の方法を用いて検出することができる。市販のIVIS Imaging System（Caliper）やそれに類似する装置により検出してもよい。
３－４．効果
　本発明の腫瘍検出用マーカーによれば、生体内の腫瘍の位置及び大きさをイムノマーカーに基づいて生体外部からモニタリングすることができる。また、本発明の腫瘍検出用マーカーと第２態様の抗腫瘍剤とを併用することで、イムノトキシンにより腫瘍細胞の増殖を抑制させると共に、イムノマーカーにより生体内の腫瘍を生体外部から検出することによって、腫瘍の退縮や治癒効果を経時的にモニタリングすることが可能となる。
＜実施例1：ビフィズス菌発現用抗ヒトTRAIL-R2遺伝子発現カセットの作製＞
(1) ビフィズス菌発現用抗hTRAIL-R2 VHH抗体4量体（4E6テトラマー）の遺伝子発現カセット
　B．ロンガム hup遺伝子由来のプロモーター領域（配列番号25）、B．ロンガム由来のusp分泌シグナル配列（配列番号29）、DTY（シグナル配列後挿入配列）、WO/2011/098520に記載された4E6のアミノ酸配列、8C7 EGFP遺伝子由来の(GGSGG)2リンカーペプチド（配列番号28）、及びヒストン様タンパク質由来のターミネーター（HUT）（配列番号26）を用い、C末端にはHis-Tag配列をコードするDNAを付加した遺伝子をDNA合成した（配列番号1）。
(2) ビフィズス菌発現用抗hTRAIL-R2 VHH抗体ダイマー緑膿菌外毒素Aサブユニット融合体（4E6ダイマーToxin）の遺伝子発現カセット
　B．ロンガム hup遺伝子由来のプロモーター領域（配列番号25）、B．ロンガム由来のusp分泌シグナル配列（配列番号29）、DTY（シグナル配列後挿入配列）、WO/2011/098520に記載された4E6のアミノ酸配列、8C7 EGFP遺伝子由来の(GGSGG)2リンカーペプチド（配列番号28）、緑膿菌外毒素A（pJH8（ATCCから購入）にコードされるExotoxinAのDNA配列）、及びヒストン様タンパク質由来のターミネーター（HUT）（配列番号26）を用い、C末端にはHis-Tag配列をコードするDNAを付加した遺伝子をDNA合成した（配列番号2）。
(3) ビフィズス菌発現用抗hTRAIL-R2 VHH抗体ダイマー緑色蛍光タンパク質融合体（4E6ダイマーEGFP）の遺伝子発現カセット
　B．ロンガム hup遺伝子由来のプロモーター領域（配列番号25）、B．ロンガム由来のusp分泌シグナル配列（配列番号29）、DTY（シグナル配列後挿入配列）、及びヒストン様タンパク質由来のターミネーター（HUT）（配列番号26）を用い、4E6ダイマー遺伝子の3’末端に、8C7 EGFP遺伝子由来の(GGSGG)2リンカーペプチド（配列番号28）+EGFP（Zhang G. et al., 1996, Biochem Biophys Res Commun, 227(3):707-711）遺伝子+His-Tag配列をコードするDNA配列を付加した（配列番号3）。
＜実施例2：hTRAIL-R1:Fc、hTRAIL-R2:Fc、mTRAIL-R2:Fc分泌発現ショウジョウバエ培養細胞の作製と組換えタンパク質の精製＞
(1)遺伝子発現カセットの作製
(1-1) ショウジョウバエ培養細胞発現用ヒトTRAIL-R1:アルパカFc（hTRAIL-R1:Fc）の遺伝子発現カセット
　KpnIサイト、翻訳開始コンセンサス配列（Cavener D.R., 1987, Nucleic Acids Res. 15, 1353-1361）、Bip分泌シグナル（Life Technologies）、hTRAIL-R1細胞外領域（Accession No. AAC51226、109～239アミノ酸）、IEGRMDリンカー（配列番号27）、Lama pacos (alpaca) IgG1　Fc　(Accession No. AM773729、102～335アミノ酸)、His-Tag配列、終止コドン、XhoIサイトから構成されるDNAを合成した。（配列番号4）
(1-2) ショウジョウバエ培養細胞発現用ヒトTRAIL-R2:アルパカFc （hTRAIL-R2:Fc）の遺伝子発現カセット
　KpnIサイト、翻訳開始コンセンサス配列（Cavener D.R., 1987, Nucleic Acids Res. 15, 1353-1361）、Bip分泌シグナル（Life Technologies）、hTRAIL-R2細胞外領域(Accession No. Q6FH58、54～182アミノ酸)、IEGRMDリンカー（配列番号27）、Lama pacos (alpaca) IgG1　Fc　(Accession No. AM773729、102～335アミノ酸)、His-Tag配列、終止コドン、XhoIサイトから構成されるDNAを合成した。（配列番号5）
(1-3) ショウジョウバエ培養細胞発現用マウスTRAIL-R2:アルパカFc（mTRAIL-R2:Fc）の遺伝子発現カセット
　KpnIサイト、翻訳開始コンセンサス配列（Cavener D.R., 1987, Nucleic Acids Res. 15, 1353-1361）、Bip分泌シグナル（Life Technologies）、mTRAIL-R2細胞外領域(Accession No. Q9QZM4、52～177アミノ酸)、IEGRMDリンカー（配列番号27）、Lama pacos (alpaca) IgG1　Fc　(Accession No. AM773729、102～335アミノ酸)、His-Tag配列、終止コドン、XhoIサイトから構成されるDNAを合成した。（配列番号6）
(2) hTRAIL-R1:Fc、hTRAIL-R2:Fc、mTRAIL-R2:Fc分泌発現ショウジョウバエ培養細胞の作製と組換え蛋白質の精製
　hTRAIL-R1、hTRAIL-R2、mTRAIL-R2の細胞外領域とアルパカIgG1のFcを融合したタンパク質を得るため、これらの組換えタンパク質をショウジョウバエ培養細胞であるS2細胞で分泌発現するベクター、pAc5.1/hTRAIL-R1 Fc、pAc5.1/hTRAIL-R2 Fc、pAc5.1/mTRAIL-R2 Fcを作成した。pAc5.1/V5-HisAプラスミド（Life Technologies）のKpnI、XhoIサイトに組換えタンパク質のS2分泌発現遺伝子カセットを挿入した。リン酸カルシウム法により、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むpCoHygroプラスミド（Life Technologies）と19:1の比でS2細胞に導入した。細胞は、300μg/mLハイグロマイシン（Life Technologies）、10%ウシ胎児血清（Tissue Culture Biologicals）を含むSchneider’s Drosophila Medium（Life Technologies）で培養し、薬剤耐性細胞を得た。薬剤耐性細胞（1×107細胞/mL）は、20 mMグルタミンを含むEXPRESS FIVE SFM (Life Technologies）で培養し、7日目に培養上清を回収した。組換えタンパク質は、TALONレジン（タカラバイオ）を用いて精製した。具体的には、TALONレジンを充填したカラムに、培養上清を添加後、洗浄バッファー（25mM HEPES pH7.4、0.3M NaCl、5mMイミダゾール）で洗浄し、溶出バッファー（25mM HEPES pH7.4、0.3M NaCl、150mMイミダゾール）で組換えタンパク質を溶出した。精製タンパク質は、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動し、Coomassie Brilliant Blue（CBB） R-250 (Bio-Rad)で染色して、各タンパク質の精製を確認した（図4）。
＜実施例3：E. coli BL21(DE3)における組換え4E6モノマータンパク質の発現・精製、及び結合活性＞
(1) 大腸菌発現用抗hTRAIL-R2 VHH抗体/Myc-Tag（4E6モノマー）遺伝子発現カセットの作製
　WO/2011/098520に記載された4E6 VHHモノマーのアミノ酸配列情報を基に、大腸菌発現用の遺伝子をDNA合成した（配列番号7）。
(2) 4E6モノマーの大腸菌による発現・精製
　4E6モノマーを発現するベクターは、pET22b(+)のNdeIとNotI部位に挿入した。E.coli BL21StarTM(DE3)One Shot（Life technologies）に本発現ベクタープラスミドDNAを導入した。付属マニュアルに従って組換え大腸菌を100mLの100μg/mLアンピシリン（シグマアルドリッチ）入り2YT培地を用いて37℃で培養し、OD600=0.4～0.5に達した時に、0.5 mM IPTG（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド、タカラバイオ）を添加して30℃で3時間培養した。培養終了後、大腸菌を回収して、10mLの抽出バッファー（50mM Na Phosphate pH7.8, 300mM NaCl, EDTA-Free protease inhibitor cocktail(Roche))に再懸濁した。氷中でSonifier 250(Branson)を用いて、Output Control 2、Duty cycle 80%の条件で超音波処理を1分間、2回行い、菌体を破砕した。処理後の懸濁液を15000rpmで4℃にて20分遠心して、上清を回収した。融合タンパク質の精製は、His Trapカラム（GE Healthcare UK）を用いた。超音波処理懸濁液の遠心上清をそのままHis Trapカラムにかけ、結合バッファー（20mM リン酸ナトリウム, 0.5M NaCl, 20mM Imidazole pH 7.4）でカラムを洗浄した後、500mM Imidazoleを含む溶出液で融合タンパク質を溶出させた。精製サンプルを15％アクリルアミドSDS電気泳動に供し、CBBで染色し、約15KDaに精製された4E6モノマータンパク質を確認し、BSA（ウシ血清アルブミンタンパク質）の染色と比較して、4E6モノマーの濃度を算出した。その結果、4E6モノマーの濃度は、～3μg/μlであった（図5）。
(3) ELISAによる4E6モノマーのhTRAIL-R2:Fc抗原への結合活性の確認
　hTRAIL-R2:Fcは実施例2のように調製した。96ウェルイムノプレート（Nunc）に50μL/ウェルで0.1M NaHCO3(Blank)、又は1μg/mL若しくは10μg/mLのBSAを含む0.1M NaHCO3(BSA陰性抗原)、又は1μg/mL若しくは10μg/mLのhTRAIL-R2:Fcを含む0.1M NaHCO3を添加して、4℃で一晩置いた。そこに350μL/ウェルのSuperBlock-PBS（サーモサイエンティフィック）を加えて室温で1時間放置した。400μL/ウェルのPBS-T（0.05% Tween20を含むリン酸緩衝生理食塩水）で洗浄後、40μL/ウェル、1μg/mLの4E6モノマーを含むSuperBlock-PBSを加えて、室温で1時間反応させた。再度、400μL/ウェルのPBS-Tで3回洗浄し、40μL/ウェルのSuperBlock-PBSで500倍希釈した抗Mycマウスモノクローナル抗体9E10（Santa Cruz Biotechnology）を加えて1時間、室温で反応させた。400μL/ウェルのPBS-Tで3回洗浄し、40μL/ウェルで抗マウスIgGヤギ抗体HRPを加えて1時間、室温に置いた。その後、400μL/ウェルのPBS-Tで3回洗浄し、50μL/ウェルでTMB試薬（和光純薬）を加えて、10分間程度反応させた後、0.5M硫酸で反応をストップさせた。その後、450nmの吸光度を測定し、トリプリケートで行った測定の平均値と標準偏差を算出した。精製した4E6モノマータンパク質は、hTRAIL-R2:Fcに特異的に結合した（図6）。
(4) 4E6モノマーとhTRAIL-R2 ECD (extracellular domain)との解離定数（KD）の測定
　4E6モノマーとhTRAIL-R2:Fc（実施例2参照）との結合親和性を、Biacore X-100（GEヘルスケア）を用いた表面プラズモン共鳴法にて解析した。測定はBiacore X-100付属の説明書に従って、マルチサイクルカイネティクス法で行い、4E6モノマーを0.919nM、1.838nM、3.675nM、7.35nM、14.7nM、29.4nM、58.8nM、及び117.6nMで測定した。
　各濃度におけるセンサーグラム及びフィッティングカーブを図7に示す。4E6モノマーと組換えヒトTRAIL-R2：Fc抗原のKD値は7.5 x 10-11Mであった。
＜実施例4：新規抗hTRAIL-R1 VHH抗体（4P6モノマー）の取得＞
(1) 新規抗hTRAIL-R1 VHH抗体（4P6モノマー）遺伝子の単離
　抗TRAIL-R1 VHH抗体はこれまでに知られていなかったため、以下の方法により作成した。すなわち、Maassらによる文献（J Immunol Methods., 2007, 324, 13-25）を参考にし、hTRAIL-R1:ヒトFc（R&D Systems）に結合するVHH抗体遺伝子をファージディスプレイ法により単離した。100 μgのhTRAIL-R1:アルパカFcを1～2週おきに、アルパカに6回免疫し、8週後、白血球を回収し、RNeasy（Qiagen、Venlo、Netherland）を用いてRNAを抽出した。このRNAから、PrimeScriptII 1st strand cDNA synthesis kit (タカラバイオ)により、オリゴdTプライマー、ランダム6プライマーを用いてcDNAを合成した。VHH抗体遺伝子は、PrimeSTAR GXL DNA polymerase（タカラバイオ）により、95℃ 1分を1サイクル、98℃ 10秒、55℃　15秒、68℃　1分を25サイクルでPCRを行い、増幅した。この増幅産物に対し、95℃ 1分を1サイクル、98℃　10秒、60℃　15秒、68℃　1分を20サイクルで同様にPCRを行い、抗体遺伝子を増幅した。PCRには、プライマーDNA配列1（配列番号8）及びプライマーDNA配列2（配列番号9）のDNA配列を有するプライマーを使用した。単離した抗体遺伝子の配列（4P6）は、BigDye Terminator v3.1 (Life Technologies)を用いて、サイクルシークエンス法により決定した。その結果、単離した抗体は、CDR1が配列番号22で示されるアミノ酸配列を有し、CDR2が配列番号23で示されるアミノ酸配列を有し、及びCDR3が配列番号24で示されるアミノ酸配列を有していた。
(2) ショウジョウバエ培養細胞発現用4P6モノマー遺伝子発現カセットの作製
　KpnIサイト、翻訳開始コンセンサス配列（Cavener D.R., 1987, Nucleic Acids Res. 15, 1353-1361）、Bip分泌シグナル（Life Technologies）、4P6遺伝子、His-Tag配列、Myc-Tag配列、終止コドン、XhoIサイトから構成されるDNAを合成した。
(3) 抗hTRAIL-R1 VHH抗体モノマー（4P6モノマー）分泌発現ショウジョウバエ培養細胞の作製と組換えタンパク質の精製
　pAc5.1/V5-HisAプラスミド（Life Technologies）のKpnI、XhoIサイトの間に、上記(2)の遺伝子発現カセットを挿入することにより、4P6モノマーをショウジョウバエ培養細胞であるS2細胞で分泌発現するベクター、pAc5.1/4P6モノマーを作成した。このプラスミドをリン酸カルシウム法により、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むpCoHygroプラスミドと19:1の比でS2細胞に導入した。細胞は、300μg/mLハイグロマイシン（Life Technologies）、10%ウシ胎児血清を含むSchneider’s Drosophila Medium（Life Technologies）で培養し、薬剤耐性細胞を得た。薬剤耐性細胞は、20 mMグルタミンを含むEXPRESS FIVE SFM (Life Technologies）で培養し、培養上清を得た。4P6モノマーは、HisTrapカラム（GE Healthcare）により精製した。精製タンパク質は、12.5% SDS-ポリアクリルアミド電気泳動し、Oriole Fluorescent Gel Stain (Bio-Rad)で染色した（図8）。
＜実施例5：抗hTRAIL-R1 VHH抗体モノマー（4P6モノマー）の結合特異性とhTRAIL-R1との親和性の測定＞
(1)4P6モノマー及び4E6モノマーのELISAによる結合特異性の解析
　4P6モノマーがTRAIL-R1に選択的に結合することをELISAにより調べた。96ウェルのヌンクイムノプレート（Thermo Scientific）に、0.1 M NaHCO3に溶解した1μg/mLのhTRAIL-R1:Fc、hTRAIL-R2:Fc、mTRAIL-R2:Fc（実施例2参照）、Bovine serum albuminを50μL加え、一晩4℃に置いた。SuperBlock(TBS) Blocking Buffer(Thermo Scientific)を300μL加え、1時間室温に置いた。各ウェルの溶液を除いた後、10μg/mLでBlocking Bufferに溶解した4P6モノマー又は4E6モノマーを50μL/ウェルで加え、室温に1時間置いた。0.05% Tween20を含むPBSで、3回洗浄後、67 ng/mLでBlocking Buffer に溶解した9E10 抗Myc抗体（Santa Cruz Biotechnology）を50μL加え、室温に1時間置いた。3回洗浄後、Blocking Buffer に溶解した抗マウスIgG HRPを50μL加え、1時間室温に置いた。3回洗浄後、TMB溶液(和光純薬)を50μL加え、10分間室温に置いた。0.5 M硫酸を50μL加え、450 nmの吸光度を測定した。各サンプルを2ウェルずつ解析し、測定値の平均値と誤差を算出した。4P6モノマーはhTRAIL-R1に、4E6モノマーはhTRAIL-R2に、それぞれ特異的に結合することが確認できた（図9）。
(2) 抗hTRAIL-R1 VHH抗体モノマー（4P6モノマー）とhTRAIL-R1 ECD (extracellular domain)との解離定数の測定
　4P6モノマーと組換えヒトTRAIL-R1 ECDとの結合親和性を、Biacore X-100（GE Healthcare）を用いた表面プラズモン共鳴法にて解析した。hTRAIL-R1: Fc （hTRAIL-R1:Fc、実施例2参照）をセンサーチップ（CM5）に約1000 RUで固定した。測定はBiacoreX-100付属の説明書に従って、シングルサイクルカイネティクス法で行い、4P6モノマーを0.1 nM、0.5 nM、2.5 nM、12.5 nM、62.5 nMの順で連続添加して測定した。センサーグラム及びフィッティングカーブを図10に示す。KD値(解離定数)は3.4 x 10-11 Mであった。
(3) 4P6モノマー及び4E6モノマーのアンタゴニスト活性
　4P6モノマーが、がん細胞のhTRAIL-R1に結合し、細胞死を誘導するhTRAILに対してアンタゴニスト活性を示すかどうか、解析した。ヒト大腸がんColo205細胞を、10%ウシ胎児血清（Tissue Culture Biologicals）を添加したRPMI1640培地（Sigma）に懸濁し、Falcon 96ウェル培養プレート（ベクトン・ディッキンソン）に3 x 103cells/50μL培地/ウェルで細胞を加えた。一晩培養し、終濃度100ng/mLのTRAILと、4P6モノマー、抗hTRAIL-R2 VHH抗体（4E6モノマー）を、さまざまな濃度で含む培地を50μLずつ添加した。さらに一晩培養し、10μLの生細胞数測定試薬SF（ナカライテスク）を加え、2時間培養後450 nmの吸光度を測定した。細胞を加えなかった培地のみのウェルをバックグラウンドとして差し引いた。細胞のみのウェルを100%として、その相対値をデータとした。各濃度3 ウェルの平均値+標準偏差で示した。図11に示すように、4P6モノマー、4E6モノマー単独ではTRAILによる細胞死を抑制することはできなかった。しかし、4P6モノマーと4E6モノマーを同時に加えると、用量依存的に細胞死を抑制した。hTRAIL、4P6モノマー、4E6モノマーの分子量はほぼ等しいため、VHH抗体100ng/mLは、hTRAIL100ng/mLとモル濃度がほぼ等しい。以上の結果から、4P6モノマー、4E6モノマーはそれぞれ、細胞表面のhTRAIL-R1、hTRAIL-R2に結合するだけでなく、アンタゴニストとして作用することが示された。
　以上の様に、hTRAIL-R1に対して特異的に結合し、アンタゴニストとしても作用し得る新規抗体である4P6を取得することができた。
＜実施例6：4E6ダイマーToxin、4E6ダイマーEGFP 、及び4E6テトラマー、組換えE. coli BL21(DE3)の作製及び組換えタンパク質の発現・精製＞
(1) 遺伝子発現カセットの作製
(1-1) 大腸菌発現用抗hTRAIL-R2 VHH抗体ダイマー緑膿菌外毒素Aサブユニット融合体（4E6ダイマーToxin）遺伝子発現カセットの作製
　大腸菌発現用4E6ダイマーToxin遺伝子は、pBluescriptII(+)プラスミドに挿入されたビフィズス菌発現用4E6ダイマーToxin遺伝子発現カセット（配列番号2）を鋳型として、プライマーDNA配列5（配列番号12）及び6（配列番号13）を用いてPCRによる増幅を行った。PCRの条件はDNAポリメラーゼとしてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ）を用いて95℃ 1分を1サイクル、98℃ 10秒、60℃ 15秒、68℃ 2分を25サイクルで実施した。増幅産物は、MinEluteカラム（Qiagen）を用いて添付のプロトコルに従って精製し、NdeI及びNotIで制限酵素消化後、1.2%アガロースで電気泳動を行い、ゲルから目的のバンドを切り出してDNAゲル抽出キット（Qiagen）を用いて添付のプロトコルに従って精製単離した。これをpET-22b(+)(Novagen)のNdeIとNotI部位に挿入し、N末端にStrep Tag（Schmidt T.G., Skerra A., 2007, Nat Protoc. 2(6):1528-1535）を持ち、2つのVHHモノマーどうしを(GGSGG)2リンカーペプチド（配列番号28）で連結し、4E6ダイマーのC末端にXbaI配列（SerArg）を介して緑膿菌外毒素サブユニットA（Toxin）を結合させた4E6ダイマーToxinを構築した（図12a）。
(1-2) 大腸菌発現用抗hTRAIL-R2 VHH抗体ダイマー緑色蛍光タンパク質融合体（4E6ダイマーEGFP）遺伝子発現カセットの作製
　大腸菌発現用4E6ダイマーEGFP遺伝子は、pBluescriptII(+)プラスミドに挿入されたビフィズス菌発現用4E6ダイマーToxin遺伝子発現カセット（配列番号3）を鋳型として、プライマーDNA配列5（配列番号12）及び7（配列番号14）を用いてPCRによる増幅を行った。PCRの条件はDNAポリメラーゼとしてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ）を用いて95℃ 1分を1サイクル、98℃ 10秒、60℃ 15秒、68℃ 2分を25サイクルで実施した。増幅産物は、MinEluteカラム（Qiagen）を用いて添付のプロトコルに従って精製し、NdeI及びNotIで制限酵素消化後、1.2%アガロースで電気泳動を行い、ゲルから目的のバンド切り出してDNAゲル抽出キット（Qiagen）を用いて添付のプロトコルに従って精製単離した。これをpET-22b(+)(Novagen)のNdeIとNotI部位に挿入し、N末端にStrep Tagを持ち、2つのVHHモノマーどうしを(GGSGG)2リンカーペプチド（配列番号28）で連結し、4E6ダイマーのC末端にXbaI配列（SerArg）を介して、N末端に(GGSGG)2リンカーペプチド（配列番号28）を結合した緑色蛍光タンパク質（EGFP）を結合させた4E6ダイマーEGFPを構築した（図12b）。
(1-3) 大腸菌発現用抗hTRAIL-R2 VHH抗体テトラマー（4E6テトラマー）遺伝子発現カセットの作製
　大腸菌発現用4E6テトラマー遺伝子は、pEX-Kプラスミドに挿入されたビフィズス菌発現用4E6テトラマー遺伝子発現カセット（配列番号1）を鋳型として、プライマーDNA配列3（配列番号10）及び4（配列番号11）を用いてPCRによる増幅を行った。PCRの条件はDNAポリメラーゼとしてPrimeSTAR GXL DNA Polymerase（タカラバイオ）を用いて95℃ 1分を1サイクル、98℃ 10秒、60℃ 15秒、68℃ 2分を25サイクルで実施した。増幅産物は、MinEluteカラム（Qiagen）を用いて添付のプロトコルに従って精製し、NdeI及びNotIで制限酵素消化後、1.2%アガロースで電気泳動を行い、ゲルから目的のバンド切り出してDNAゲル抽出キット（Qiagen）を用いて添付のプロトコルに従って精製単離した。これをpET-22b(+)(Novagen)のNdeIとNotI部位に挿入し、N末端にStrep Tagを持ち、4つのVHHモノマーどうしを3つの(GGSGG)2リンカーペプチド（配列番号28）で連結した4E6テトラマーを構築した（図12c）。
(2) 大腸菌における組換えタンパク質の発現
　上記のように作製した4E6テトラマー、4E6ダイマーToxin、及び4E6ダイマーEGFP遺伝子をpET22b(+)のNdeIとNotI部位に挿入した。E.coli RosettaGami(DE3)2（Novagen）に本発現ベクタープラスミドDNAを導入し、付属マニュアルに従って組換え大腸菌を200mLの100μg/mLアンピシリン（シグマアルドリッチ）入り2YT培地を用いて37℃で培養し、OD600=0.4～0.5に達した時に、1mM IPTG（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド、タカラバイオ）を添加して30℃で3時間培養した。培養終了後、大腸菌を回収して、20mLの抽出バッファー（50mM NaPhosphate pH7.8, 300mM NaCl, EDTA-Free protease inhibitor cocktail(Roche))に再懸濁して、氷中でSonifier 250(Branson)を用いて、Output Control 2、Duty cycle 80%の条件で超音波処理を1分間、2回行い、菌体を破砕した。処理後の懸濁液を15000rpmで4℃にて20分遠心して、上清を回収した。融合タンパク質の精製には、HisTrapカラム（GEヘルスケア）を用いた。超音波処理懸濁液の遠心上清をそのままHisTrapカラムにかけ、結合バッファー（20mM NaPhosphate, 0.5M NaCl, 20mM Imidazole pH7.4）でカラムを洗浄した後、500mM Imidazoleを含む溶出液で融合タンパク質を溶出させた。精製サンプルを10％アクリルアミドSDS電気泳動に供し、CBBで染色し、精製された組換えタンパク質を確認し、BSA（ウシ血清アルブミンタンパク質）の染色と比較して、目的タンパク質バンドの濃度を算出した（図13a-c）。4E6ダイマーToxin、4E6ダイマーEGFP、4E6テトラマーの濃度はそれぞれ、0.8mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mLと算定された。
＜実施例7： 4E6ダイマーToxin及び4E6テトラマーのがん細胞死誘導活性の測定＞
　4E6ダイマーToxin融合タンパク質が培養hTRAIL-R2発現ヒトがん細胞（Colo205、American Type Culture Collectionより入手）に対して、細胞死誘導作用があるかどうかを調べた。Falcon 96ウェル培養プレート（ベクトン・ディッキンソン）に5×104cells/50μL培地(0.2%ウシ胎児血清（Tissue Culture Biologicals）を含むRPMI1640培地)/ウェルで細胞を加え、2時間培養後、上記のように精製した4E6ダイマーToxin、4E6ダイマーEGFPを終濃度で2000、800、160、32、6.4、1.28、0.256、0.0512 ng/mLになる培地（2 x終濃度）を50μLずつ添加した。培養2日目に10μLのMTT試薬（ナカライテスク）を加えた。さらに2時間培養後に100μL/ウェルで可溶化液を加え、ピペッティングで細胞を溶解してOD570 nmの吸光度を測定した。細胞無添加培地のウェルの測定値をバックグラウンド値として全測定値から減じた。抗体を添加しなかったコントロールのウェルを100%として、その相対値で示した。アッセイはトリプリケートで行い、3ウェルの平均値を取った。図14aに示すように、抗TRAIL-R2 VHH抗体ダイマーとToxin融合体、即ちイムノトキシンは、全く細胞死を誘導しなかった。
　4E6ダイマーが細胞に結合していることを確認するため、以下の試験を行った。すなわち、ヒト大腸がんColo205細胞、膵臓がんBxPC-3細胞について、各2 x 105 細胞を10 μg/mL 4E6ダイマーEGFPと2%ウシ胎児血清を含むリン酸緩衝生理食塩水（pH 7.4） 50μL中で氷上30分反応させた。上記の血清入りリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、FACSVerse（BD Biosciences）で細胞の蛍光強度を解析した。2つの細胞とも、4E6ダイマーEGFPにより染色された。一方、対照ダイマーEGFPでは、どちらの細胞も染色されなかった（図15）。したがって、4E6ダイマーは細胞に結合すると考えられる。
　以上の結果から、4E6ダイマーToxinは、細胞膜上のTRAIL-R2に結合するが、TRAIL-R2分子を3量体以上に凝集させることができず、また、細胞内にも取り込まれないため、Colo205細胞に細胞死を誘導できないと考えられた。
　続いて、4E6モノマー及び4E6テトラマーの細胞死誘導作用があるかどうかを調べるために、上記のように精製した4E6モノマー、4E6テトラマーを終濃度で25000、5000、1000、200、40、8、1.6、0.32 pg/mLになる培地（2×終濃度）を50μLずつ添加した。その結果、4E6モノマーは細胞死を引き起こさなかったが、TRAIL-R2分子を3量体以上に凝集させる活性を持つ4E6テトラマーは、Colo205細胞に強力な細胞死を誘導した（図14b）。
　これらの結果は、TRAIL-Rを3量体以上に凝集させる活性を持つ抗hTRAIL-R VHH抗体テトラマーが、抗hTRAIL-R VHH抗体ダイマーToxinよりも、効率的にがん細胞死を誘導できることを示している。
＜実施例8：大腸菌で発現した4E6テトラマーのヒト大腸がん細胞及び膵臓がん細胞に対する細胞死誘導作用＞
　ヒト大腸がん細胞Colo205及び膵臓がん細胞BxPC-3（American　Type Culture Collectionより入手）に対する4E6テトラマーのがん細胞死誘導作用を検討した。細胞は、10%ウシ胎児血清（Tissue Culture Biologicals）を添加したRPMI1640培地（Sigma）に懸濁し、Falcon 96ウェル培養プレート（ベクトン・ディッキンソン）に3 x 103 cells/50μL/ウェルで細胞を加え、一晩培養後、4E6テトラマー、hTRAIL（和光純薬）を含む培地を50μLずつ添加した。Colo205細胞は一晩、BxPC-3細胞は二晩培養後、10μLの生細胞数測定試薬SF（ナカライテスク）を加え、更に4～6時間培養し、450 nmの吸光度を測定した。細胞を加えなかった培地のみのウェルをバックグラウンドとして差し引いた。細胞のみのウェルを100%として、その相対値をデータとした。各濃度3ウェルの平均値+標準偏差で示した。図16に示すように、4E6テトラマーは濃度依存にColo205細胞、BxPC-3細胞の細胞死を誘導し、IC50はそれぞれ2 pmol/L、8 pmol/Lであった。大腸菌で作製したhTRAILのIC50は400 pmol/Lであり、4E6テトラマーはhTRAILよりも低濃度で細胞死を誘導できることがわかった。
＜実施例9： 4E6テトラマー及び4E6ダイマーEGFPのビフィズス菌における分泌発現と精製＞
(1)エレクトロポレーションによる組換えビフィズス菌の作製
　4E6テトラマー及び4E6ダイマーEGFPをビフィズス菌で分泌発現するためのベクター遺伝子カセット（実施例1参照）をpKKT427ベクター（Yasui K., et al., Nucleic Acids Res. 2009）のHindIIIとNotIの間に挿入し、B.longum 105-Aにエレクトロポレーション法により導入した。エレクトロポレーションは、2.4 kV、25μF、200オームの条件で行った。
(2)ビフィズス菌で分泌発現された4E6テトラマー、4E6ダイマーEGFPの精製
　(1)で得た組換えビフィズス菌を、スペクチノマイシン100μg/mLを含むMRS液体培地（Lactobacilli MRS Broth、Difco Laboratories, Detroit, MI）、50 mM ショ糖、3.4 mg/mL L-アスコルビン酸ナトリウム塩、及び0.2 mg/mL L-システイン塩酸塩に加え、一晩嫌気培養した。嫌気培養は、脱酸素剤であるアネロパック・ケンキ（三菱ガス化学、東京、日本）を入れた密閉容器を使用することにより行った。一晩培養した培養液は、吸光度（600 nm）を測定し、吸光度が0.1になるように、新しい液体培地に加えた。6～7時間嫌気培養し、4℃、9,400 x gで10分遠心し、培養上清を採取した。組換えタンパク質の精製は、HisTrapカラム（GE Healthcare）で行った。培養上清をHisTrapカラムにかけ、結合バッファー（50mM NaPhosphate, 0.3M NaCl, 20mM Imidazole pH7.8）でカラムを洗浄した後、500mM Imidazoleを含む溶出液でタンパク質を溶出した。培養上清1 mLから精製した量に相当する精製タンパク質を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動し、Oriole Fluorescent Gel Stain (Bio-Rad)で染色した（図17）。4E6テトラマー、4E6ダイマーEGFPともに推定分子量付近（約60 kDa）に検出された。培養上清中の分泌量は、4E6テトラマーは400 ng/mL、4E6ダイマーEGFPは3.2 ng/mLと見積もられた。以上の結果から、どちらの組換えタンパク質も分泌され、4E6テトラマーの方が、4E6ダイマーEGFPと比較して、効率良く分泌発現されることがわかった。
＜実施例10：ビフィズス菌で分泌発現した抗hTRAIL-R2 VHH抗体テトラマー（4E6テトラマー）のがん細胞死誘導活性＞
　ヒト大腸がんColo205細胞（American Type Culture Collection）に対する4E6テトラマーのがん細胞死誘導活性を検討した。細胞は、10%ウシ胎児血清（Tissue Culture Biologicals）を添加したRPMI1640培地（Sigma）に懸濁し、Falcon 96ウェル培養プレート（ベクトン・ディッキンソン）に3 x 103 cells/50μl培地/ウェルで細胞を加えた。一晩培養し、4E6テトラマー、TRAILを、終濃度0.3 pM～10 nMで含む培地を50μLずつ添加した。さらに一晩培養し、10μLの生細胞数測定試薬SF（ナカライテスク）を加え、6時間培養後450 nmの吸光度を測定した。細胞を加えなかった培地のみのウェルをバックグラウンドとして差し引いた。細胞のみのウェルを100%として、その相対値をデータとした。各濃度3 ウェルの平均値+標準偏差で示した。図18に示すように、4E6テトラマーは濃度依存的に増殖を抑制し、IC50は0.02 nmol/Lであった。一方、大腸菌で作製したhTRAIL（和光純薬）のIC50は0.4 nmol/Lであった。したがって、ビフィズス菌で分泌発現された4E6テトラマーは、hTRAILよりも細胞死誘導活性が高いことがわかった。
＜実施例11：Colo205細胞移植Xenograft modelにおける、組換えB. longum の静脈内投与による抗腫瘍効果の検討＞
　ヌードマウスの皮下にヒト大腸がんColo205細胞を移植して固形がんを形成させたXenograft modelにおいて、抗hTRAIL-R2 VHH抗体テトラマー（4E6テトラマー）を分泌発現する組換えB. longum 105-Aを静脈内に投与した場合の抗腫瘍効果を検討した。具体的には、6週齢の雌のKSN/Slcヌードマウスに、2 x106のColo205細胞を皮下移植し、9日後に各群(n=6、無処置、4E6テトラマー、4E6ダイマーEGFP)の腫瘍塊の体積が約280mm3になるように群分けした後、実施例9に従って作製した組換えビフィズス菌を、1匹当り1.5x109個で静脈内に投与した。使用したB.longum 105-Aは遠心及び生理食塩水への再懸濁によって調製した。体内のB.longum 105-Aの栄養補助のために、毎日1mLの20%ラクツロースを腹腔内に投与した。腫瘍径はビフィズス菌を投与した日から0、2、4、7、11、14、18、21日後にノギスを用いて計測した。腫瘍体積は「(短径)2 x(長径)/2」の計算式で算出した。結果を図19に示す。ビフィズス菌投与後21日目で、4E6テトラマーを分泌発現する組換えビフィズス菌は無処置と比較して、腫瘍増殖を51%抑制した。一方、陰性対照とした、4E6ダイマーEGFP分泌ビフィズス菌投与群では腫瘍増殖抑制効果はみられなかった。
　腫瘍径の計測と同時に、ビフィズス菌を投与した日から0、2、4、7、11、14、18、21日後に各群の体重を計測した。図20に示すように、無処置、4E6ダイマーEGFP群と比較して、4E6テトラマー群で体重減少は検出されなかった。これらの結果から、4E6テトラマーは、体重減少を引き起こすような副作用を生じることなく、細胞死誘導活性により腫瘍増殖を抑制すると考えられる。
＜実施例12：BxPC-3細胞移植Xenograft modelにおける、組換えB. longum の静脈内投与による抗腫瘍効果の検討＞
　ヌードマウスの皮下にヒト膵臓がんBxPC-3細胞を移植して固形がんを形成させたXenograft modelにおいて、抗hTRAIL-R2 VHH抗体テトラマー（4E6テトラマー）を分泌発現する組換えB. longum 105-Aを静脈内に投与した場合の抗腫瘍効果を検討した。具体的には、8週齢の雌のKSN/Slcヌードマウスに、2x106のBxPC-3細胞を皮下移植し、8日後に各群(n=6、無処置、4E6テトラマー、4E6ダイマーEGFP)の腫瘍塊の体積が約230mm3になるように群分けした後、実施例9に従って作製した組換えビフィズス菌を、1匹当り1.5x109個で静脈内に投与した。使用したB.longum 105-Aは遠心及び生理食塩水への再懸濁によって調製した。体内のB.longum 105-Aの栄養補助のために、毎日1mLの20%ラクツロースを腹腔内に投与した。腫瘍径はビフィズス菌を投与した日から0、3、6、10、13、17日後にノギスを用いて計測した。腫瘍体積は「(短径)2 x(長径)/2」の計算式で算出した。結果を図21に示す。ビフィズス菌投与後17日目で、4E6テトラマーを分泌発現する組換えビフィズス菌は無処置と比較して、腫瘍増殖を52%抑制した。一方、陰性対照である、4E6ダイマーEGFP分泌ビフィズス菌投与群では腫瘍増殖抑制効果はみられなかった。
　腫瘍径の計測と同時に、ビフィズス菌を投与した日から0、3、6、10、13、17日後に各群の体重を計測した。図22に示すように、無処置、4E6ダイマーEGFP群と比較して、4E6テトラマー群で体重減少は検出されなかった。これらの結果から、4E6テトラマーは、体重減少を引き起こすような副作用を生じることなく、細胞死誘導活性により腫瘍増殖を抑制すると考えられる。
＜実施例13：4P6トリマー組換えE. coli BL21(DE3)の作製及び組換えタンパク質の発現・精製＞
(1) 大腸菌発現用抗hTRAIL-R1 VHH抗体トリマー（4P6トリマー）遺伝子発現カセットの作製
　N末端にStrep Tag、C末端にHis-Tag配列を持ち、実施例4（1）に従って取得した抗hTRAIL-R1 VHH抗体の3つのモノマーどうしを2つの(GGSGG)2リンカーペプチド（配列番号28）で連結した4P6トリマーをコードする遺伝子を、pET-22b(+)(Novagen)のNdeIとNotI部位に挿入し、大腸菌発現用4P6トリマー遺伝子発現カセットを構築した（実施例6参照）。
(2) 大腸菌における組換えタンパク質の発現
　上記のように作製したプラスミドベクターを、E.coli BL21StarTM(DE3)One Shot（Life technologies）に導入した。付属マニュアルに従って組換え大腸菌を200mLの100μg/mLアンピシリン（シグマアルドリッチ）入り2YT培地を用いて37℃で培養し、OD600=0.4～0.5に達した時に、1 mM IPTG（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド、タカラバイオ）を添加して30℃で3時間培養した。培養終了後、大腸菌を回収して、20mLの抽出バッファー（50mM Na Phosphate pH7.8, 300mM NaCl, EDTA-Free protease inhibitor cocktail(Roche))に再懸濁した。氷中でSonifier 250(Branson)を用いて、Output Control 2、Duty cycle 80%の条件で超音波処理を1分間、2回行い、菌体を破砕した。処理後の懸濁液を9,400xgで4℃にて20分遠心して、上清を回収した。融合タンパク質の精製には、His Trapカラム（GE Healthcare UK）を用いた。超音波処理懸濁液の遠心上清をそのままHis Trapカラムにかけ、結合バッファー（20mM リン酸ナトリウム, 0.5M NaCl, 20mM Imidazole pH 7.4）でカラムを洗浄した後、500mM Imidazoleを含む溶出液で融合タンパク質を溶出させた。さらに、溶出画分は、Strep-Tactinカラム（IBA）に添加し、付属マニュアルに従って精製した。50ng のBSAに相当する精製タンパク質を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動し、Oriole Fluorescent Gel Stain (Bio-Rad)で染色した（図23）。4P6トリマーは、推定分子量付近（約42 kDa）に検出された。以上の結果から、4P6トリマーは大腸菌で発現、精製できることがわかった。
＜実施例14： 大腸菌で発現した4P6トリマーのがん細胞死誘導活性の測定＞
ヒト大腸がんColo205細胞（American Type Culture Collection）に対する4P6トリマーのがん細胞死誘導活性を検討した。細胞は、10%ウシ胎児血清（Tissue Culture Biologicals）を添加したRPMI1640培地（Sigma）に懸濁し、Falcon 96ウェル培養プレート（ベクトン・ディッキンソン）に3 x 103 cells/50μl培地/ウェルで細胞を加えた。一晩培養後、4P6トリマーを、終濃度10 pM～10 nMで含む培地を50μLずつ添加した。さらに二晩培養後、10μLの生細胞数測定試薬SF（ナカライテスク）を加え、4時間培養後450 nmの吸光度を測定した。細胞を加えなかった培地のみのウェルをバックグラウンドとして差し引いた。細胞のみのウェルを100%として、その相対値をデータとした。各濃度3 ウェルの平均値+標準偏差で示した。図24に示すように、4P6トリマーは濃度依存的にColo205細胞の増殖を抑制し、IC50は0.4 nmol/Lであった。大腸菌で作製したhTRAIL（和光純薬）のIC50は0.4 nmol/Lであり、大腸菌で発現した4P6トリマーは、hTRAILと同程度の細胞死誘導活性を示した。
＜実施例15：抗hTRAIL-R1 VHH抗体トリマー（4P6トリマー）のビフィズス菌における分泌発現と精製＞
(1)エレクトロポレーションによる組換えビフィズス菌の作製
　実施例1(1)における発現カセットの4E6テトラマーの部分を、実施例4（1）に従って取得した4P6のトリマーに置き換えて作製した、4P6トリマーをビフィズス菌で分泌発現するためのベクター遺伝子カセットをpKKT427ベクター（Yasui K., et al., Nucleic Acids Res. 2009）のHindIIIとNotIの間に挿入し、B.longum 105-Aにエレクトロポレーション法により導入した。エレクトロポレーションは、2.4 kV、25μF、200オームの条件で行った。
(2)ビフィズス菌で分泌発現された4P6トリマーの精製
　(1)で得た組換えビフィズス菌を、スペクチノマイシン100μg/mLを含むMRS液体培地（Lactobacilli MRS Broth、Difco Laboratories, Detroit, MI）、50 mM ショ糖、3.4 mg/mL L-アスコルビン酸ナトリウム塩、及び0.2 mg/mL L-システイン塩酸塩に加え、一晩嫌気培養した。嫌気培養は、脱酸素剤であるアネロパック・ケンキ（三菱ガス化学、東京、日本）を入れた密閉容器を使用することにより行った。一晩培養した培養液は、吸光度（600 nm）を測定し、吸光度が0.1になるように、新しい液体培地に加えた。7時間嫌気培養し、4℃、9,400 x gで10分遠心し、培養上清を採取した。組換えタンパク質の精製は、HisTrapカラム（GE Healthcare）で行った。培養上清をHisTrapカラムにかけ、結合バッファー（50mM NaPhosphate, 0.3M NaCl, 20mM Imidazole pH7.8）でカラムを洗浄した後、500mM Imidazoleを含む溶出液でタンパク質を溶出した。培養上清0.6 mLから精製した量に相当する精製タンパク質を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動し、Oriole Fluorescent Gel Stain (Bio-Rad)で染色した（図25）。4P6トリマーは、推定分子量付近（約42 kDa）に検出された。BSAを用いて定量した結果、4P6トリマーの培養上清中の分泌量は、30 ng/mLと見積もられた。以上の結果から、4P6トリマーはビフィズス菌で分泌発現されることがわかった。
＜実施例16：ビフィズス菌で分泌発現した抗hTRAIL-R1 VHH抗体トリマー（4P6トリマー）のがん細胞死誘導活性＞
　ヒト大腸がんColo205細胞（American Type Culture Collection）及び膵臓がんBxPC-3細胞（American Type Culture Collection）に対する4P6トリマーのがん細胞死誘導活性を検討した。細胞は、10%ウシ胎児血清（Tissue Culture Biologicals）を添加したRPMI1640培地（Sigma）に懸濁し、Falcon 96ウェル培養プレート（ベクトン・ディッキンソン）に3 x 103 cells/50μl培地/ウェルで細胞を加えた。一晩培養し、4P6トリマーを、終濃度0.3 pM～10 nMで含む培地を50μLずつ添加した。さらに二晩培養し、10μLの生細胞数測定試薬SF（ナカライテスク）を加え、2時間培養後450 nmの吸光度を測定した。細胞を加えなかった培地のみのウェルをバックグラウンドとして差し引いた。細胞のみのウェルを100%として、その相対値をデータとした。各濃度3 ウェルの平均値+標準偏差で示した。図26aに示すように、4P6トリマーは濃度依存的にColo205細胞の増殖を抑制し、IC50は0.08 nmol/Lであった。大腸菌で作製したhTRAIL（和光純薬）のIC50は0.4 nmol/Lであり、ビフィズス菌で分泌発現された4P6トリマーは、hTRAILよりも細胞死誘導活性が高いことがわかった。図26bに示すように、4P6トリマーは濃度依存的にBxPC-3細胞の増殖も抑制した。
＜実施例17：BxPC-3-Luc#2細胞移植Xenograft modelにおける、4P6トリマーを分泌発現する組換えB. longum の静脈内投与による抗腫瘍効果の検討＞
　ヌードマウスの皮下にヒト膵臓がんBxPC-3-Luc#2細胞（JCRB細胞バンクより入手）を移植して固形がんを形成させたXenograft modelにおいて、抗hTRAIL-R1 VHH抗体トリマー（4P6トリマー）を分泌発現する組換えB. longum 105-Aを静脈内に投与した場合の抗腫瘍効果を検討した。具体的には、6週齢の雌のKSN/Slcヌードマウスに、3x106のBxPC-3-Luc#2細胞を皮下移植し、15日後に各群(n=5、無処置、4P6トリマー、pKKT427ベクターのみ)の腫瘍塊の体積が約135mm3になるように群分けした後、実施例15に従って作製した組換えビフィズス菌を、1匹当り3x108個で静脈内に投与した。使用したB.longum 105-Aは遠心及び生理食塩水への再懸濁によって調製した。体内のB.longum 105-Aの栄養補助のために、毎日1mLの20%ラクツロースを腹腔内に投与した。腫瘍径は腫瘍を移植した日から15、19、21、24、28、31、35日後にノギスを用いて計測した。腫瘍体積は「(短径)2 x(長径)/2」の計算式で算出した。結果を図27に示す。ビフィズス菌投与後20日目で、4P6トリマーを分泌発現する組換えビフィズス菌は無処置と比較して、腫瘍増殖を65%抑制した。一方、陰性対照である、pKKT427導入ビフィズス菌投与群では腫瘍増殖抑制効果はみられなかった。
　腫瘍径の計測と同時に、腫瘍を移植した日から15、19、21、24、28、31、35日後に各群の体重を計測した。図28に示すように、無処置、pKKT427導入ビフィズス菌群と比較して、4P6トリマー群で体重減少は検出されなかった。これらの結果から、4P6トリマーは、体重減少を引き起こすような副作用を生じることなく、細胞死誘導活性により腫瘍増殖を抑制すると考えられる。
　本発明により、正常細胞への毒性を軽減しながら、強力なアゴニスト活性を有する抗hTRAIL-R1及びR2抗体の腫瘍部位局所投与によって効果的ながん細胞死を誘導することが可能となる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (8)

  1. 　シグナルペプチド、並びに3つ以上の抗TRAIL-R1単鎖抗体及び／又は3つ以上の抗TRAIL-R2単鎖抗体を含む融合タンパク質をコードする核酸を発現可能な状態で含む組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。
  2. 　偏性嫌気性グラム陽性菌がビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）である、請求項１に記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。
  3. 　抗TRAIL-R1単鎖抗体が、
    　CDR1が配列番号22で示されるアミノ酸配列を含み、
    　CDR2が配列番号23で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　CDR3が配列番号24で示されるアミノ酸配列を含む、
    請求項１又は２に記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。
  4. 　抗TRAIL-R2単鎖抗体が、
    　CDR1が配列番号15で示されるアミノ酸配列を含み、
    　CDR2が配列番号16で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　CDR3が配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む、
    請求項１～３のいずれか1項に記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。
  5. 　前記融合タンパク質が、さらに機能性ペプチドを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。
  6. 　機能性ペプチドが、標識タンパク質である、請求項５に記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の組換え偏性嫌気性グラム陽性菌を有効成分とする抗腫瘍剤。
  8. 　CDR1が配列番号22で示されるアミノ酸配列を含み、
    　CDR2が配列番号23で示されるアミノ酸配列を含み、及び
    　CDR3が配列番号24で示されるアミノ酸配列を含む、
    抗TRAIL-R1抗体。
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