KR20120138769A

KR20120138769A - 녹농균의 혈청형 ｂ 지질다당류에 대한 항체

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Publication number: KR20120138769A
Application number: KR1020127024178A
Authority: KR
Inventors: 지로 다나카; 페테르 세예르 안데르센; 다까후미 오쿠토미; 츠네요시 이나바; 게이코 오츠카; 히로토모 아카바네; 유카리 호시나; 히로시 나가소; 마사시 구마가이
Original assignee: 심포젠 에이/에스; 메이지 세이카 파루마 가부시키가이샤
Priority date: 2010-02-18
Filing date: 2011-02-18
Publication date: 2012-12-26
Also published as: CN102858977A; US20130004499A1; EP2536834A4; KR20120128688A; JP2013520161A; CA2790289A1; CA2790290A1; CA2790232A1; EP2536833A4; WO2011102555A1; JP2013520159A; CN102858799A; EP2536835A1; US20130022603A1; EP2536833A1; JP2013521758A; CN102858976A; EP2536759A1; CA2790276A1; EP2536759A4

Abstract

녹농균에 대한 우수한 항균활성을 갖는 신규의 항체가 제공된다. 만성 녹농균 폐 감염 낭포성 섬유증 환자로부터 얻은 형질아세포를 사용함에 의해, 혈청형 B의 녹농균 균주의 LPS에 결합하고 인 비트로 및 인 비보에서 우수한 항균 활성을 갖는 항체를 성공적으로 얻었다.

Description

녹농균의 혈청형 Ｂ 지질다당류에 대한 항체 {ANTIBODY AGAINST SEROTYPE B LIPOPOLYSACCHARIDE OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA}

본 발명은 녹농균의 혈청형 B 지질다당류에 대한 항체 및 그것의 적용에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 녹농균 균주의 혈청형 B 지질다당류에 특이적으로 결합하는 항체, 그리고 약제학적 조성물, 녹농균 감염에 대한 진단시약, 및 녹농균 검출 키트에 관한 것으로, 각각은 상기의 어느 항체를 포함한다.

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 토양, 수중 등 자연환경 중에 널리 일반적으로 분포되어 있는 그램 음성 간균이다. 녹농균은 무병원성 세균으로 일반적으로 적당한 항체 역가를 갖고 녹농균에 대한 충분한 건강한 면역기능을 갖는 개체에서는 발병하지 않는다. 그러나 일단 쇠약해진 환자가 녹농균에 감염되면, 녹농균은심각한 증상을 일으킬 수 있고 이것은 환자의 사망을 가져올 수 있다. 이러한 이유로, 녹농균은 병원내 감염과 기회감염의 주요 원인이 되는 세균으로서 주목받고 있고, 따라서 녹농균 감염의 예방 및 치료는 의료 분야에서 중요한 사안이 되어왔다.

녹농균 감염의 예방 및 진단을 위해, 항생물질 또는 합성 항균제가 주로 사용되고 있다. 그러나, 녹농균은 이러한 의약에 내성이 생기고, 따라서 이와 같은 의약들은 많은 경우 충분한 치료효과를 제공하지 않는다. 특히, 항생물질 등을 사용한 다제내성 녹농균 (MDRP)에 의한 감염의 치료는 어렵고, 제한되어 왔다. 이러한 이유로, 선택적인 방법으로서, 면역글로불린 제제를 사용한 치료가 수행되고 있다.

한편, 녹농균에 대한 항체를 사용한 녹농균 감염의 예방 또는 치료가 시험되어 왔다. 예를 들면, 각각 특이적 혈청형의 녹농균 균주에 특이적으로 결합하는 항체들이 개발되어 왔다 (특허문헌 1 내지 5, 및 비특허문헌 1과 2). 그러나, 지금까지 개발된 녹농균에 대한 항체들은 녹농균 감염의 예방 또는 치료에 충분한 효과를 제공하지 않는다.

[인용문헌]

[특허문헌]

[PTL 1] 일본 무심사 특허출원 공보 제 Hei 6-178688호

[PTL 2] 일본 무심사 특허출원 공보 제 Hei 6-178689호

[PTL 3] 일본 무심사 특허 출원 공보 제 Hei 7-327677호

[PTL 4] 국제공보 제 WO2004/101622호

[PTL 5] 국제 공보 제 WO2006/084758호

[비특허문헌]

[NPL 1] The Journal of Infectious Diseases, 152, 6, 1985, 1290-1299.

[NPL 2] Journal of General Microbiology, 133, 1987, 3581-3590.

본 발명은 상기의 상황을 고려하여 이루어졌고, 본 발명의 목적은 녹농균에 대한 우수한 항균 활성을 갖는 신규 항체를 제공하는 것이다. 본 발명의 하나의 목적은 녹농균 균주의 혈청형 B 지질다당류에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 다음과 같은 방법을 사용하였다. 우선, 혈액 샘플을 만성 녹농균 폐 감염 낭포성 섬유증 환자들과 건강한 지원자들로부터 채취하였다. 지질다당류(이하 "LPS"로 약칭함)에 특이적인 형질아세포를 고비율로 갖는 공여자 시편들을 다음과 같이 동정하였다: (1) 순환혈액 중 형질아세포와 형질세포의 양을 측정하는 FACS 분석; (2) 순환혈액 중, 특이 LPS 항원에 특이적인 항체를 생산하는 세포의 양을 측정하는 ELISPOT 분석; 및 (3) 특이 LPS 항원에 특이적인 면역글로불린의 존재 또는 부재를 측정하는 ELISA 분석. 그 다음, LPS를 인식하는 항체들을 이와 같이 동정된 공여자 시편들로부터 제조하였다.

구체적으로, 생존가능 형질아세포는 CD19, CD38, λ 경사슬, 및 사멸세포를 염색하고, 선택된 형질아세포에서 쌍 다중 겹침 확장 RT-PCR과 이어서 네스티드 PCR을 포함하는 2-단계 PCR에 의해 동일한 B 세포로부터 기원하는 중사슬 가변영역(VH)과 경사슬 가변영역(VL)을 암호화하는 DNA 서열의 쌍을 이룸으로써 선택되었다(도 1). 그 다음, 증폭된 DNA를 스크리닝 벡터에 삽입하였고, 그리고 나서 대장균(Escherichia coli)으로 변형시켰다. 증폭된 벡터의 목록을 대장균으로부터 정제하였다. 얻어진 항체 라이브러리를 동물 배양 세포에서 발현시켰다. 정제된 LPS에 결합하는 항체들을 암호화하는 클론들을 ELISA로 스크리닝하고, 그리고 LPS-특이 클론들을 선택하였다. 그리고 나서, 선택된 클론들의 염기서열을 결정하였다. 그 후, 이와 같이 얻은 클론들에 의해 암호화된 항체들을 그들의 다양한 활성, 그들의 혈청형 특이성 및 에피토프에 관하여 조사하였다.

그 결과, 동정된 항체들이 녹농균의 혈청형 B LPS에 결합하고, 인 비트로 및 인 비보에서 우수한 항균 활성을 갖는다는 것을 발견하였다.

구체적으로, 본 발명은 우수한 항균활성을 나타내는, 녹농균의 혈청형 B LPS에 결합하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항체의 적용에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 다음을 제공한다:

[1] 녹농균의 지질다당류의 B-밴드 LPS를 인식하고, 그리고 혈청형 B의 녹농균 균주의 표면에 실질적으로 결합하지만, 혈청형 A, C, D, E, F, G, H, I 및 M의 녹농균 군주 어느 것의 표면에는 실질적으로 결합하지 않는 항체.

[2] 제1항에 있어서, 혈청형 B의 녹농균 균주에 대해 옵소닌 활성을 갖는 항체.

[3] 제2항에 있어서, ATCC 33349로 동정된 녹농균 균주에 대한 옵소닌 활성의 EC50가 5 ㎍/ml 이하인 항체.

[4] 제2항에 있어서, ATCC 27578 및 ATCC BAA-47 중 하나로 동정된 녹농균 균주에 대한 옵소닌 활성의 EC50가 1 ㎍/ml 이하인 항체.

[5]제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 B의 녹농균 균주에 대한 응집활성을 갖는 항체.

[6] 제5항에 있어서, ATCC BAA-47로 동정된 녹농균 균주에 대한 IgG의 양(㎍)에 대한 응집 역가가 1000 이상인 항체.

[7] 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 B의 녹농균 균주에 의한 전신 감염에 대한 항균 효과를 갖는 항체.

[8] 제7항에 있어서, ATCC 27578로 동정된 녹농균 균주으로의 전신 감염의 호중성 백혈구 감소 마우스 모델에서의 항균 효과의 ED50가 베닐론(Venilon)의 것의 1/300 보다 크지 않은 것인 항체.

[9] 제7항에 있어서, ATCC BAA-47로 동정된 녹농균 균주으로의 전신 감염의 호중성 백혈구 감소 마우스 모델에서의 항균 효과의 ED50가 베닐론의 것의 1/100 보다 크지 않은 것인 항체.

[10] 하기 특성 (a) 및 (b) 중 어느 하나를 갖는 항체:

(a) SEQ ID NOs: 1 내지 3에 기재된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NOs: 1 내지 3에 기재된 아미노산 서열 중 최소한 하나에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함하는 경사슬 가변영역, 및

SEQ ID NOs: 4 내지 6에 기재된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NOs: 4 내지 6에 기재된 아미노산 서열 중 최소한 하나에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함하는 중사슬 가변영역을 포함; 그리고

(b) SEQ ID NOs: 9 내지 11에 기재된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NOs: 9 내지 11에 기재된 아미노산 서열 중 최소한 하나에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함하는 경사슬 가변영역, 및

SEQ ID NOs: 12 내지 14에 기재된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NOs: 12 내지 14에 기재된 아미노산 서열 중 최소한 하나에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함하는 중사슬 가변영역을 포함.

[11] 하기 특성 (a) 및 (b) 중 어느 하나를 갖는 항체:

(a) SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함하는 경사슬 가변영역, 및

SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함하는 중사슬 가변영역을 포함; 및

(b) SEQ ID NO: 15에 기재된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 15에 기재된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함하는 경사슬 가변영역, 및

SEQ ID NO: 16에 기재된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 16에 기재된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함하는 중사슬 가변영역을 포함.

[12] 항체의 경사슬 또는 경사슬 가변영역을 포함하는 펩티드로, 하기 특성 (a) 및 (b) 중 어느 하나를 갖는 펩티드:

(a) SEQ ID NOs: 1 내지 3에 기재된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NOs: 1 내지 3에 기재된 아미노산 서열 중 최소한 하나에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함; 및

(b) SEQ ID NOs: 9 내지 11에 기재된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NOs: 9 내지 11에 기재된 아미노산 서열 중 최소한 하나에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함.

[13] 항체의 경사슬 또는 경사슬 가변영역을 포함하는 펩티드로, 하기 특성 (a) 및 (b) 중 어느 하나를 갖는 펩티드:

(a) SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함; 및

(b) SEQ ID NO: 15에 기재된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 15에 기재된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함.

[14] 항체의 중사슬 또는 중사슬 가변영역을 포함하는 펩티드로, 하기 특성 (a) 및 (b) 중 어느 하나를 갖는 펩티드:

(a) SEQ ID NOs: 4 내지 6에 기재된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NOs: 4 내지 6에 기재된 아미노산 서열 중 최소한 하나에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함; 및

(b) SEQ ID NOs: 12 내지 14에 기재된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NOs: 12 내지 14에 기재된 아미노산 서열 중 최소한 하나에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함.

[15] 항체의 중사슬 또는 중사슬 가변영역을 포함하는 펩티드로, 하기 특성 (a) 및 (b) 중 어느 하나를 갖는 펩티드:

(a) SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함; 및

(b) SEQ ID NO: 16에 기재된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 16에 기재된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함.

[16] 혈청형 B의 녹농균 균주의 지질다당류 중에서, 하기 (a) 및 (b) 중 어느 하나에 기재된 항체의 에피토프에 결합하는 항체 :

(a) SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변영역과 SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변영역을 포함하는 항체; 및

(b) SEQ ID NO: 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변영역과 SEQ ID NO: 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변영역을 포함하는 항체.

[17] 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 펩티드를 암호화하는 DNA.

[18] 제1항 내지 제11항 및 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체를 생산하는 하이브리도마.

[19] 녹농균과 관련된 질병을 위한 약제학적 조성물로, 상기 조성물은:

제1항 내지 제11항 및 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체; 및 임의로

하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 것인 약제학적 조성물.

[20] 제19항에 있어서, 녹농균과 관련된 질병이 녹농균 감염에 의한 전신성 감염증인 약제학적 조성물.

[21] 제19항에 있어서, 녹농균과 관련된 질병이 녹농균 감염에 의한 폐 감염성 질환인 것인 약제학적 조성물.

[22] 녹농균의 검출을 위한 진단 시약으로, 제1항, 제10항, 제11항 및 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 것인 진단 시약.

[23] 녹농균의 검출을 위한 키트로, 제1항, 제10항, 제11항 및 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 것인 키트.

본 발명은 녹농균의 혈청형 B LPS에 결합하는 항체를 제공하고, 이것은 우수한 항균 활성을 나타낸다. 본 발명의 항체는 녹농균으로의 전신 감염에 대해 우수한 옵소닌 효과 및 우수한 항균 효과를 나타낸다. 더욱이, 본 발명의 항체는 만성 녹농균 폐 염증을 겪는 낭포성 섬유증 환자로부터 기인한 것이므로, 만성 녹농균 균주에 대한 우수한 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 항체는 인체로서 제조될 수 있고, 따라서 매우 안전하다. 본 발명의 항체의 사용은 다제 내성 녹농균을 포함하여, 녹농균에 의한, HAP/VAP, 균혈증, 패혈증, 및 화상 감염과 같은 감염을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있도록 한다.

도 1은 본 발명의 항체를 암호화하는 DNA를 얻기 위해 수행되는 2-단계 PCR을 나타내는 다이아그램이다.
도 2는 동일한 B 세포로부터 기원하는, 중사슬 가변 영역 (VH) 및 경사슬 가변 영역 (VL)를 암호화하는 서열의 쌍을 만드는데 사용되는 OO-VP-002 벡터를 나타내는 도면이다.

본 발명은 녹농균의 혈청형 B LPS에 결합하는 신규 항체를 제공한다. 본 발명에서 "항체"는 면역글로불린의 모든 류 및 모든 아류를 포함한다. 항체는 다중클론성 항체 및 단일클론성 항체를 포함하고, 또한 항체의 기능성 단편의 형체를 포함한다. "다중클론성 항체"는 다른 에피토프들에 대한 다른 종류의 항체들을 포함하는 항체 제제를 말한다. 한편, "단일클론성 항체"는 항체의 실질적으로 동종의 개체군으로부터 얻은 항체(항체 단편 포함)를 의미한다. 다중클론성 항체와 반대로, 단일클론성 항체는 항원에서 단일 결정인자를 인식한다. 본 발명에서 다중클론성 항체는 또한 항원에 대한 다중 에피토프를 인식할 수 있는 다수의 단일클론성 항체의 조합을 포함한다. 본 발명의 항체는 단리된 항체이고, 즉, 천연 환경에서 성분들로부터 분리되고 및/또는 회수된 항체이다.

본 발명의 항체가 결합하는 "지질다당류 (LPS)"는 그람-음성균의 세포벽의 외막의 구성성분이고, 지질과 다당류로 형성된 물질(당지질)이다. 탄수화물 사슬은 핵심 다당류 (또는 핵심 올리고당)으로 불리는 모이어티와 O 항원 (O 측쇄 다당류)로 불리는 모이어티로 형성된다. "A-밴드 LPS"는 그것의 O 항원을 형성하는 다당류가 다음의 구조를 갖는 LPS이다. 구체적으로는, 구조에서, "3)-α-D-Rha-(1→2)-α-D-Rha-(1→3)-α-D-Rha-(1"로 이루어진 단위 구조가 반복된다. 이들 단위에서, D-람노오스는 α-1,2 및 α-1,3 결합에 의해 링크된다. 그것의 구조식을 아래에 나타내었다; 그러나, α-1,2에 의해 링크된 D-람노오스 및 α-1,3 결합에 의해 링크된 D-람노오스의 분기 방식은 아래에 나타낸 것으로 제한되지 않는다.

화학식 1

한편, "B-밴드 LPS"는 O 항원을 형성하는 다당류에 각각 2 내지 5개의 당의 결합으로 이루어진 유니트가 반복되는 구조를 갖는 혈청형-특이 LPS이다. 아래에 설명하는 바와 같이, 녹농균 균주의 B-밴드 LPS에서의 반복 단위의 구조는 그들의 혈청형에 따라 서로 다르다(Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63 523-553 (1999) 참조).

화학식 2

본 발명에서 "혈청형"은 녹농균의 어느 공지의 혈청형을 의미한다. 표 1은 일본 녹농균 협회에 의해 후원되는 혈청형 위원회에 따른 군과 IATS (International Antigenic Typing System)에 따른 유형에 상응하는 것을 나타내고, 둘 다는 다른 혈청형의 녹농균 균주에 대해 현재 사용되고 있다. 녹농균 균주의 혈청형은 녹농균을 그룹화하기 위해 시판되는 면역 혈청을 사용하여 결정될 수 있다.

JPAS	IATS
I	O1
B	O2
A	O3
F	O4
B	O5
C	O7
G	O6
C	O8
D	O9
H	O10
E	O11
L	O12
K	O13
K	O14
J	O15
B	O16
N	O17
-	O18
-	O19
B	O20
JPAS: 일본 녹농균 협회
IATS: 국제 항원 범주화 시스템
참고문헌: Microbiology 17 273-304 (1990)

본 발명에서 동정된 항체들 중에서, 항체 "3099" 및 항체 "2754"는 혈청형 B의 녹농균 균주에 우수한 특이성을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 항체의 또 다른 구현예는 혈청형 B의 녹농균 균주의 지질다당류에 특이적으로 결합하는 항체이다 (이하, "항-혈청형 B LPS 항체"로 언급됨). 본 발명의 항-혈청형 B LPS 항체는 바람직하기는 녹농균의 지질다당류를 인식하는 항체이고, 이것은 실질적으로 혈청형 B의 녹농균 균주의 표면에 결합하지만, 실질적으로 혈청형, A, C, D, E, F, G, H, I 및 M의 녹농균 균주의 표면 중 어느 것에 결합하지 않는다. 본 발명의 항-혈청형 B LPS 항체의 경우, "실질적으로 결합하는"은, 예를 들면, 본 발명의 실시예에 기재된 전세포( whole-cell) ELISA 법에 의해 검출될 때, 결합 용량을 나타내는 흡광도가 0.25 이상이다. 한편, "실질적으로 결합하지 않는"은 예를 들면, 본 발명의 실시예에 기재된 전세포 ELISA법에 의해 검출될 때, 결합 용량을 나타내는 흡광도가 0.25 미만이다.

혈청형 B의 녹농균 균주의 예는 ATCC 수탁번호 27577 및 33350인 것들을 포함한다. 혈청형 B의 녹농균 균주의 예는 27578, 33349, BAA-47, 33352, 33363 및 43732인 것들을 포함한다. 혈청형 C의 녹농균 균주의 예는 33353, 27317 및 33355인 것들을 포함한다. 혈청형 D의 녹농균 균주의 예는 27580 및 33356인 것을 포함한다. 혈청형 E의 녹농균 균주의 예는 29260 및 33358인 것을 포함한다. 혈청형 F의 녹농균 균주의 예는 27582 및 33351인 것을 포함한다. 혈청형 G의 녹농균 균주의 예는 27584 및 33354인 것을 포함한다. 혈청형 H의 녹농균 균주의 예는 27316 및 33357인 것을 포함한다. 혈청형 I의 녹농균 균주의 예는 27586 및 33348인 것을 포함한다. 혈청형 J의 녹농균 균주의 예는 33362인 것이다. 혈청형 K의 녹농균 균주의 예는 33360 및 33361인 것을 포함한다. 혈청형 L의 녹농균 균주의 예는 33359인 것이다. 혈청형 M의 녹농균 균주의 예는 21636인 것이다. 혈청형 N의 녹농균 균주의 예는 33364인 것이다. 다른 혈청형 (018형 및 019형)의 녹농균 균주의 예는43390 및 43731인 것을 포함한다.

혈청형 B의 녹농균 균주의 예는 메이지 세이카 가부시키가이샤가 소유하는 혈청형 B/O5의 다제 내성 녹농균 (MDRP) 균주(MSC 17650, MSC 17663 등)를 포함한다. 본 발명에서 다제내성은 CLSI 중단점(breakpoints)에 따른 다음의 약제 중 적어도 3개에 내성으로 정의된다: 이미페넴 (≥16 ㎍/ml), 세프타지딤 (≥32 ㎍/ml), 토브라마이신 (≥16 ㎍/ml), 시프로플로사신 (≥4 ㎍/ml). (참조: National Surveillance of Antimicrobial Resistance in Pseudomonas aeruginosa Isolates Obtained from Intensive Care Unit Patients from 1993 to 2002, Marilee D. Obritsch, Douglas N. Fish, Robert MacLaren, and Rose Jung, ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, 48. 12. 2004, 4606-4610).

본 발명의 항-혈청형 B LPS 항체는 바람직하기는 상기 예로서 나타난 ATCC 수탁번호로 표시된 녹농균 균주 중에서, 오직 혈청형 B의 녹농균에만 실질적으로 결합하지만, 다른 혈청형의 녹농균 균주 중 어느 것에 실질적으로 결합하지 않는 항체이다. 더욱이, 본 발명의 항-혈청형 B LPS 항체는 바람직하기는 메이지 세이카 가부시키가이샤 소유의 혈청형 B/05의 MDRP에 실질적으로 결합하는 항체이다. 더욱 바람직하기는, 본 발명의 항-혈청형 B LPS 항체는 상기 예로서 나타난 ATCC 수탁번호로 표시된 녹농균 균주 중에서, 모든 혈청형 B의 녹농균에 실질적으로 결합하지만, 다른 혈청형의 녹농균 균주 중 어느 것에 실질적으로 결합하지 않는 항체이다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항-혈청형 B LPS 항체는 녹농균에 대해 옵소닌 활성을 갖는다. 본 발명의 항-혈청형 B LPS 항체는 혈청형 B의 녹농균에 대한 결합활성의 반영으로서, 혈청형 B의 녹농균 균주에 대해 옵소닌 활성을 가질 수 있다. 특히, 본 발명의 항체 "3099" 및 항체 "2745"는 각각 혈청형 B의 녹농균 균주에 대한 높은 옵소닌 활성을 나타낸다. 특히 현저하기는, 본 발명의 항체 "3099"의 옵소닌 활성이 혈청형 B (ATCC 33349)의 녹농균 균주를 사용하여, 그리고 본 발명의 실시예에 기재된 바와 같이, 지표로서, FITC-라벨된 녹농균에 병합된 인간 다핵형 백혈구의 형광 강도를 사용하는 검출방법을 적용하여 평가하였을 때, 항체 "3099"의 EC50은 3.13 ㎍/ml 이었다. 본 발명의 항-혈청형 B LPS 항체는 바람직하기는 우수한 옵소닌 활성을 갖고, 그리고 예를 들면, 혈청형 B(ATCC 33349)의 녹농균 균주에 대한 옵소닌 활성의 EC50은 5 ㎍/ml 이하(예를 들면, 4 ㎍/ml 이하 또는 3.5 ㎍/ml 이하)이다. 본 발명의 항체 "2759"의 옵소닌 활성이 각각 혈청형 B의 녹농균 균주(ATCC 27578) 및 혈청형 B의 녹농균 균주 (ATCC SAA-47)를 사용하여, 그리고 본 발명의 실시예에 기재된 바와 같이, 지표로서, FITC-라벨된 녹농균에 병합된 인간 다핵형 백혈구의 형광 강도를 사용하는 검출방법을 적용하여 평가하였을 때, 그들의 EC50은 각각 0.42 및 0.72 ㎍/ml 였다. 본 발명의 항-혈청형 B LPS 항체는 바람직하기는 우수한 옵소닌 활성을 갖고, 그리고 예를 들면, 혈청형 B의 녹농균 균주(ATCC 27578) 또는 혈청형 B의 녹농균 균주(ATCC BAA-47)에 대한 옵소닌 활성의 EC50은 1 ㎍/ml 이하(예를 들면, 0.8 ㎍/ml 이하, 0.7 ㎍/ml 이하 또는 0.6 ㎍/ml 이하 또는 0.5 ㎍/ml 이하)이다.

더욱이, 본 발명의 항-혈청형 B LPS 항체의 옵소닌 활성이 혈청형 B의 녹농균 균주(ATCC 33349)를 사용하고 그리고 본 발명의 실시예에 기재된 바와 같이, 지표로서, FITC-라벨된 녹농균에 병합된 인간 다핵형 백혈구의 형광 강도를 사용하는 검출방법을 적용하여 평가하였을 때, 30㎍/ml에서 항-혈청형 B LPS 항체의 평균 형광 강도 (MFI)값은 바람직하기는 1000 ㎍/ml에서의 베닐론의 평균 형광강도(MFI) 값의 적어도 5배 (예를 들면, 적어도 8배, 적어도 10배, 또는 적어도 12배)이다. 한편, 본 발명의 항-혈청형 B LPS 항체의 옵소닌 활성이 혈청형 B의 녹농균 균주 (ATCC 27578) 또는 혈청형 B의 녹농균 균주 (ATCC BAA-47)를 사용하고 그리고 본 발명의 실시예에 기재된 바와 같이, 지표로서, FITC-라벨된 녹농균에 병합된 인간 다핵형 백혈구의 형광 강도를 사용하는 검출방법을 적용하여 평가하였을 때, 10㎍/ml에서 항-혈청형 B LPS 항체의 평균 형광 강도 (MFI)값은 바람직하기는 1000 ㎍/ml에서의 베닐론의 평균 형광강도(MFI) 값의 (예를 들면, 적어도 1.5배, 적어도 2배)이다.

또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항-혈청형 B LPS 항체는 녹농균에 대한 응집활성을 갖는다. 본 발명의 항체 "3099"는, 혈청형 B의 녹농균 균주(ATCC BAA-47)가 사용될 때, 5659의 IgG의 양(㎍) 당 우수한 응집 역가를 나타낸다. 이와 같은 우수한 응집 활성을 갖기 때문에, 의약으로 사용된 본 발명의 항혈청형 B LPS 항체는 적은 투여량에서도 우수한 옵소닌 활성을 유도할 수 있고, 따라서 감염 예방 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 항-혈청형 B LPS 항체는, 혈청형 B의 녹농균 균주(ATCC BAA-47)가 사용될 때, 바람직하기는 IgI의 단위량(㎍) 당 응집 역가가 1000 이상 (예를 들면, 2000 이상, 3000 이상, 4000 이상 또는 5000 이상)이다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 항-혈청형 B LPS 항체는 녹농균에 의한 전신감염에 대해 항균 효과를 갖는다. 본 발명의 항체 "3099" 및 항체 "2745" 각각은 혈청형 B의 녹농균 균주에 의한 전신감염에 대한 항균 활성을 나타낸다. 놀랍게도, 혈청형 B/O2의 녹농균 균주 (ATCC 27578)로 동정된 녹농균 균주에 의한 전신 감염의 마우스 모델을 사용하고, 대조로서 베닐론을 사용하여 비교했을 때, 이들 항체들 각각의 항균 효과의 ED50 값은 베닐론의 ED50값의 1/300 이하였다. 특히, ATCC 27578로 동정된 녹농균 균주로 전신 감염된 마우스 모델의 경우, 항체 "3099"의 ED50값은 베닐론의 ED50 값의 1/1000 이하였다. 한편, 혈청형 B/O5의 녹농균 균주 (ATCC BAA-47)로 동정된 녹농균 균주에 의한 전신 감염의 마우스 모델을 사용하고, 대조로서 베닐론을 사용하여 비교했을 때, 이들 항체들 각각의 항균 효과의 ED50 값은 베닐론의 ED50값의 1/100 이하였다. 따라서, 혈청형 B/O2 (ATCC 27578)의 녹농균 균주에 의한 전신감염 마우스 모델을 사용할 때, 본 발명의 항-혈청형 B LPS 항체의 ED50 값은 바람직하기는 베닐론의 값의 1/300 이하 (예를 들면, 1/400 이하, 1/500 이하, 1/600 이하, 1/800 이하 또는 1/1000 이하)이다. 혈청형 B/O5의 녹농균 균주에 의한 전신 감염의 마우스 모델의 경우, 본 발명의 항-혈청형 B LPS 항체의 ED50값은 바람직하기는 베닐론의 값의 1/100 이하 (예를 들면, 1/150 이하, 또는 1/200 이하)이다.

본 발명의 항-혈청형 B LPS 항체는 상기 활성 중 어느 하나를 단독으로 가질 수 있지만, 다중 활성을 함께 갖는 것이 바람직하다.

본 발명의 항-혈청형 B LPS 항체의 또 다른 바람직한 구현예는 본 발명에서 동정된 항체 (3099 또는 2745)의 경사슬 CDR 1 내지 3을 포함하는 경사슬 가변영역 및 중사슬 CDR 1 내지 3을 포함하는 중사슬 가변영역을 포함하는 항체이다. 이들의 구체적인 예는 항체 (i) 및 (ii)를 포함한다:

(i) 경사슬 CDRs 1 내지 3(SEQ ID NOs 1 내지 3에 기재된 아미노산 서열)을 포함하는 경사슬 가변 영역 및 중사슬 CDRs 1 내지 3 (SEQ ID NOs 4 내지 6)을 포함하는 중사슬 가변 영역을 포함하는 항체, 예를 들면, 경사슬 가변영역은 SEQ ID NO:7에 기재된 아미노산을 포함하고 중사슬 가변영역은 SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체; 및

(ii) 경사슬 CDRs 1 내지 3 (SEQ ID NO: 9 내지 11에 기재된 아미노산 서열)을 포함하는 경사슬 가변영역 및 중사슬 CDRs 1 내지 3 (SEQ ID NO: 12 내지 14에 기재된 아미노산 서열)을 포함하는 중사슬 가변 영역을 포함하는 항체, 예를 들면, 경사슬 가변영역은 SEQ ID NO: 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 중사슬 가변영역은 SEQ ID. NO: 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.

본 발명은 또한 항체의 경사슬, 중사슬 및 그들의 가변 영역을 포함하는 펩티드를 제공하고, 상기 펩티드는 본 발명의 항체 (3099 또는 2745)에서 동정된 CDR을 포함한다.

항체의 경사슬, 중사슬 및 그들의 가변영역 중 어느 하나를 포함하고, 항체 3099의 CDR을 포함하는 펩티드의 예는 다음의 펩티드 (i) 및 (ii)를 포함한다:

(i) 본 발명의 항체의 경사슬 또는 경사슬 가변 영역을 포함하는, SEQ ID NO: 1 내지 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 예를 들면, SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및

(ii) 본 발명의 항체의 중사슬 또는 중사슬 가변영역을 포함하고, SEQ ID NO: 4 내지 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 예를 들면, SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산을 포함하는 펩티드.

항체의 경사슬, 중사슬 및 그들의 가변영역 중 어느 하나를 포함하고, 항체 2745의 CDR을 포함하는 펩티드의 예는 다음의 펩티드 (i) 및 (ii)를 포함한다:

(i) 본 발명의 항체의 경사슬 또는 경사슬 가변 영역을 포함하는, SEQ ID NO: 9 내지 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 예를 들면, SEQ ID NO: 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및

(ii) 본 발명의 항체의 중사슬 또는 중사슬 가변영역을 포함하고, SEQ ID NO: 12 내지 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 예를 들면, SEQ ID NO: 16에 기재된 아미노산을 포함하는 펩티드.

기능적 항체는 이와 같은 펩티드를 예를 들면, 링커를 사용하여 링크하여 제조할 수 있다.

일단, 특이적 항-혈청형 B LPS 항체 (3099 또는 2745)가 얻어지면, 당업자들은 항체에 의해 인식되는 에피토프를 동정할 수 있고, 그 에피토프에 결합하는 다양한 항체들을 제조할 수 있다. 본 발명은 또한 항체 "3099" 및 항체 "2745" 중 어느 하나에 의해 인식되는 것과 동일한 에피토프를 인식하는 항체를 제공한다. 이와 같은 항체가 항체 "3099" 및 항체 "2745" 중 어느 하나의 상기 특징들 (녹농균에 대한 결합 활성의 혈청형 특이성, 옵소닌 활성, 응집 활성, 및 전신성 감염에 대한 항균 활성)을 갖는다는 것을 알 수 있다.

녹농균에 대한 항체의 결합은, 예를 들면, 본 발명의 실시예에 기재된 바와 같이, 전세포 ELISA법에 의해 평가될 수 있다. 그것에 의해, 항체가 결합활성을 나타내는 녹농균의 혈청형의 범위를 결정할 수 있다. 옵소닌 활성은, 예를 들면, 본 발명의 실시예에 기재된 바와 같이, 지표로서, FITC-라벨된 녹농균에 병합하는 인간 다핵형 백혈구의 형광 강도를 사용하는 검출방법에 의해 평가될 수 있다. 한편, 응집 활성은, 예를 들면, 본 발명의 실시예에 기재된 바와 같이, 일련의 희석된 세균 세포에 대한 항체의 응집 활성을 검출함에 의해, IgG의 양에 대한 응집 역가로서 평가될 수 있다. 한편, 전신성 감염에 대한 항균 활성은, 예를 들면, 본 발명의 실시예에 기재된 바와 같이, 항체가 투여된 마우스 모델의 생존률로 평가될 수 있다.

본 발명의 항체는 통상적으로 인간 항체이다. 그러나, 본 발명에서 동정된 에피토프에 대한 정보를 이용하거나 또는 본 발명에서 동정된 인간 항체의 CDR 영역 또는 가변 영역을 사용하여, 당업자들은 인간 항체에 더하여, 예를 들면, 키메릭 항체, 인간화 항체 및 마우스 항체와 같은 다양한 항체들을 제조할 수 있고, 또한 이들 항체의 기능적 단편들을 제조할 수 있다. 의약으로서 인간에게 투여하는 경우, 본 발명의 항체는, 부작용 감소의 관점에서, 인간 항체가 가장 바람직하다.

본 발명에서, "인간 항체"는 그것의 모든 영역이 인간으로부터 기원하는 항체를 말한다. 인간 항체의 제조를 위해, 본 발명의 실시예에 기재된 방법이 사용될 수 있다. 다른 방법으로서, 예를 들면 면역법에 의해 인간 항체의 목록들을 생산할 수 있는 유전자 이식 동물 (예를 들면, 마우스)이 사용되는 방법이 사용될 수 있다. 이와 같은 인간 항체의 제조방법은 공지되어 있다 (예를 들면, Nature, 362: 255-258 (1992), Intern. Rev. Immunol, 13: 65-93 (1995), J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991), Nature Genetics, 15: 146-156 (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 722-727 (2000), 일본 무심사 특허 출원 공보 Hei 10-146194, 일본 무심사 특허 출원 공보 Hei 10-155492, 일본 특허 2938569호, 일본 무심사 특허 출원 공보 Hei 11-206387, 및 국제 출원 일본-단계 공보 Hei 8-509612, 및 국제 출원 일본-단계 공보 Hei 11-505107).

본 발명에서, "키메릭 항체"는 한 종의 항체의 가변 영역을 다른 종의 항체의 불변 영역과 링크시켜 얻은 항체를 말한다. 예를 들면, 이와 같은 키메릭 항체는 다음과 같이 얻을 수 있다. 마우스를 항원으로 면역화한다. 항원에 결합한 항체 가변부 (가변 영역)을 암호화하는 부분을 마우스의 단일클론성 항체를 암호화하는 유전자로부터 절단한다. 이 부분을 인간 골수-유래 항체 불변부 (불변영역)을 암호화하는 유전자에 링크시킨다. 이들 링크된 유전자들을 발현 벡터에 병합시킨다. 그리고 나서, 발현 벡터를 키메릭 항체를 생산하는 숙주에 도입시킨다 (예를 들면, 일본 무심사 특허 출원 공보 Hei 8-280387호, 미국 특허 4816397호, 미국 특허 4816567호, 및 미국 특허 5807715호 참조. 한편, 본 발명에서, "인간화된 항체"는 인간 항체의 유전자 위에 비-인간-유래 항체의 항원-결합 부위(CDR)의 게놈 서열을 접목 (CDR 접목)함에 의해 얻어진 항체를 말한다. 이와 같은 키메릭 항체의 제조방법은 공지되어 있다 (예를 들면, EP239400, EP125023, WO90/07861, 및 WO96/02576 참조). 본 발명에서, 항체의 "기능적 단편"은 항체의 일부 (부분적 단편)을 의미하고, 이것은 그 부분이 기원하는 항체의 항원을 특이적으로 인식할 수 있는 능력을 보유한다. 기능적 단편의 구체적인 예는 Fab, Fab' F(ab')2, 가변 영역 단편(Fv), 이황화물-링크된 Fv, 단일-사슬 Fv (scFv), sc(Fv)2, 다이아바디, 다중특이성(polyspecific) 항체, 및 그들의 중합체이다.

여기서, "Fab"는 하나의 경사슬의 일부와 하나의 중사슬의 일부로 형성된, 면역글로불린의, 1가의 항원-결합 단편을 의미한다. Fab는 항체의 파파인-소화 또는 재조합법에 의해 얻어질 수 있다. "Fab'"는 Fab'에서 항체의 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 소수의 잔기가 중사슬 CH1 도메인의 카르복시 터미날에 첨가된다는 점에서 Fab와 다르다. "F(ab')2"는 둘 다의 경사슬 부분들과 둘 다의 중사슬 부분들로 제조된, 면역글로불린의 2가 항원-결합 단편을 의미한다.

"가변 영역 단편 (Fv)"은 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 갖는 최소의 항체 단편이다. Fv는 중사슬 가변 영역과 경사슬 가변 영역이 비-공유결합으로 강하게 링크된 다이머이다. "단일-사슬 Fv (scFv)"는 항체의 중사슬 가변 영역과 경사슬 가변 영역을 포함하고, "단일-사슬 Fv (scFv)"에서 이들 영역들은 단일 펩티드 사슬에 존재한다. "sc(Fv)2"는 2개의 중사슬 가변영역과 2개의 경사슬 가변영역이 링커 등에 의해 결합하여 얻은 단일 사슬이다. "다이아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항원 단편이다. 단편은 단일 폴리펩티드 사슬에서 경사슬 가변 영역에 결합된 중사슬 가변 영역을 포함하고, 이들 영역의 각각은 또 다른 사슬에서 상보적 영역과 쌍을 형성한다. "다중특이성 항체"는 최소한 2개의 다른 항원에 결합 특이성을 갖는 단일클론성 항체이다. 예를 들면, 이와 같은 다중특이성 항체는 2개의 면역글로불린 중사슬/경사슬 쌍의 공동발현에 의해 제조될 수 있고, 여기서 2가의 중사슬은 서로 다른 특이성을 갖는다.

본 발명의 항체는 아미노산 서열이 원하는 활성의 손상없이 변형된 항체를 포함한다 (녹농균에 대한 결합 활성 및 그들의 광대함 또는 그들의 특이성, 옵소닌 활성, 응집 활성, 전신성 감염 또는 폐 감염에 대한 항균활성 및/또는 기타 생물학적 특성). 본 발명의 항체의 아미노산 서열 변이는 본 발명의 항체 사슬을 암호화하는 DNA에 돌연변이를 도입함에 의해, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이와 같은 변형은, 예를 들면, 본 발명의 항체의 아미노산 서열에서 하나 또는 다중 잔기의 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입을 포함한다. 항체의 아미노산 서열의 변형 영역은 변형된 항체의 활성이 변형되지 않은 항체의 활성과 동등한 한, 항체의 중사슬 또는 경사슬의 불변 영역 또는 그들의 가변 영역 (골격 영역 또는 CDR)일 수 있다. CDR에서 이들 이외의 아미노산에서의 변형은 항원에 대한 결합 친화력에 비교적 작은 영향을 갖는다는 것을 생각할 수 있다. 현재로는, 항원에 대한 그들의 친화력이 CDR 중의 아미노산의 변형에 의해 강화되는 항체를 스크리닝하는 방법이 있다 (PNAS, 102: 8466-8471 (2005), Protein Engineering, Design & Selection, 21: 485-493 (2008), 국제출원 WO2002/051870호, J. Biol. Chem., 280: 24880-24887 (2005), and Protein Engineering, Design & Selection, 21: 345-351 (2008)).

변형되는 아미노산의 수는 바람직하기는 아미노산 10개 이하, 바람직하기는 5개 이하, 그리고 가장 바람직하기는 3개 이하이다 (예를 들면, 아미노산 2개 또는 아미노산 1개). 아미노산의 변형은 바람직하기는 보수적 치환이다. 본 발명에서, 용어 "보수적 치환"은 화학적으로 유사한 측쇄를 갖는 다른 아미노산 잔기로의 치환을 의미한다. 화학적으로 유사한 아미노산 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 본 발명이 포함되는 기술적 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 아미노산은 산성 아미노산 (아스파르트산과 글루탐산), 염기성 아미노산 (리신, 아르기닌 및 히스티딘), 그리고 중성 아미노산으로 그룹화될 수 있다. 중성 아미노산은 탄화수소기를 갖는 아미노산 (글리신, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 및 프롤린), 히드록시기를 갖는 아미노산 (세린가 트레오닌), 황-함유 아미노산 (시스테인과 메티오닌), 아미드기를 갖는 아미노산 (아스파라긴과 글루타민), 이미노기를 갖는 아미노산 (프롤린); 및 방향족기를 갖는 아미노산(페닐알라닌, 티로신 및 트립토판)으로 하위-분류될 수 있다.

본 발명의 변형은 항체의 후-변역 과정에서의 변형, 예를 들면, 글리코실화 부위의 수 또는 글리코실화의 장소의 변화일 수 있다. 이것은, 예를 들면, 항체의 ADCC 활성을 개선할 수 있다. 항체의 글리코실화는 통상적으로 N-링크된 또는 O-링크된 글리코실화이다. 항체의 글리코실화는 항체의 발현에 사용되는 숙주 세포에 크게 의존한다. 글리코실화 패턴의 변화는 탄수화물 생산과 관련되는 특정 효소의 도입 또는 결실과 같은 공지의 방법에 의해 수행될 수 있다 (일본 무심사 특허 출원 공보 No. 2008-113663, 미국 특허 5047335호, 미국 특허 5510261호, 미국 특허5278299 호, 국제 공보 WO99/54342호). 본 발명에서, 항체의 안정성을 증가시키는 목적 또는 다른 목적을 위해, 탈아미드화될 아미노산 또는 탈아미드화될 아미노산 주변의 아미노산은 탈아미드화를 막기 위해 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 더욱이, 글루탐산은 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 따라서 항체의 안정성을 증가시킬 수 있다. 본 발명은 또한 이와 같이 안정화된 항체를 제공한다.

본 발명의 항체의 다중클론성 항체는 다음과 같이 얻을 수 있다. 구체적으로, 면역 동물을 항원 (LPS, LPS의 부분 구조를 갖는 분자, 표면에 LPS와 LPS의 부분 구조를 갖는 분자 중 어느 하나가 노출된 녹농균 등)으로 면역화한다. 다중클론성 항체는 통상의 방법 (예를 들면, 염석법, 원심분리법, 삼투법, 칼럼 크로마토그래피법 등)으로 동물로부터 얻어진 항혈청의 정제에 의해 얻을 수 있다. 한편, 단일클론성 항체는 본 발명의 실시예에 기재된 방법들에 더하여, 표준 하이브리도마법 또는 표준 재조합 DNA법으로 제조될 수 있다.

하이브리도마법의 통상적인 예는 Kohler & Milstein 법 (Kohler & Milstein, Nature, 256: 495 (1975))이다. 이 방법의 세포 융합 과정에 사용된 항체-생산 세포는 항원 (LPS, LPS의 부분 구조를 갖는 분자, 표면에 LPS와 LPS의 부분 구조를 갖는 분자 중 어느 하나가 노출된 녹농균 등)으로 면역화된 동물(예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 원숭이 또는 염소)의 비장 세포, 림프절 세포, 말초혈액 백혈구 등이다. 배지에서, 상기 유형의 세포 및 미리 비-면역화된 동물로부터 단리된 백혈구 상에서 항원의 작용을 유발하여 얻어진 항체-생산 세포가 사용될 수 있다. 골수 세포로서, 여러 가지 공지의 세포 균주들이 사용될 수 있다. 항체-생산 세포 및 골수 세포들은, 항체-생산 세포와 골수 세포가 융합될 수 있는 한, 다른 동물 종으로부터 기원 될 수 있다. 그러나, 항체-생산 세포와 골수 세포가 동일한 동물 종으로부터 기원하는 것이 바람직하다. 하이브리도마는, 예를 들면, 항원으로 면역화된 마우스로부터 얻어진 비장 세포와 마우스 골수 세포간의 세포 융합에 의해 생산될 수 있다. 그리고 나서, 하이브리도마를 스크리닝함으로써, LPS 항원-특이 단일클론성 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻을 수 있다. LPS 항원에 대한 단일클론성 항체는 하이브리도마를 배양함에 의해, 또는 하이브리도마가 투여된 포유동물의 복수로부터 얻을 수 있다.

재조합 DNA법은 본 발명의 상기 항체가 다음과 같은 재조합 항체로서 생산되는 방법이다. 본 발명의 항체 또는 펩티드를 암호화하는 DNA는 하이브리도마, B 세포 등으로부터 클로닝된다. 클론된 DNA는 적절한 벡터에 병합되고, 벡터는 숙주 세포 (예를 들면, 포유동물 세포 균주, 대장균, 이스트 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등)에 도입된다 (예를 들면, P. J. Delves, Antibody Production: Essential Techniques, 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean Moncolonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, Vandamme A.M. et al., Eur. J. Biochem. 192: 767-775 (1990)). 본 발명의 항체를 암호화하는 DNA의 발현을 위해, 중사슬 및 경사슬을 암호화하는 DNA가 각각 발현 벡터에 도입될 수 있고, 숙주 세포가 변형된다. 선택적으로, 중사슬과 경사슬을 암호화하는 DNA들이 단일 발현 벡터에 도입되고, 그리고 숙주 세포가 변형될 수 있다 (WO94/11523 참조). 본 발명의 항체는 상기 숙주 세포의 배양, 숙주세포 또는 배지로부터의 분리 및 정제에 의해 실질적으로 순수하고 균일한 형태로 얻을 수 있다. 항체의 분리 및 정제를 위해, 폴리펩티드의 표준 정제에 사용되는 어느 방법이 사용될 수 있다. 항체 유전자가 도입된 유전자 변형 동물 (소, 염소, 양, 돼지 등)이 유전자변형 동물 생산 기술에 의해 생산될 때, 항체 유전자로부터 유래된 다량의 단일클론성 항체를 유전자 변형 동물의 젖으로부터도 얻을 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 상기 항체 또는 펩티드를 암호화하는 DNA, 그 DNA를 함유하는 벡터, 그 DNA를 갖는 숙주세포 및, 숙주세포를 배양하고 항체를 수집하는 것을 포함하는 항체의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 항체는 상기 활성을 가지므로, 본 발명의 항체는 녹농균과 관련된 질병의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 녹농균과 관련된 질병의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 활성 성분으로서 본 발명의 항체를 포함하고, 그리고 본 발명의 항체의 치료 또는 예방에 유효한 양을 인간을 포함한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 녹농균과 관련된 질병의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 본 발명의 치료 또는 예방 방법은 인간 이외에, 다양한 동물, 예를 들면, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소 및 토끼에 사용될 수 있다.

녹농균과 관련된 질병의 예는 다제내성 녹농균 감염을 포함하는, 녹농균 감염에 기인한 전신 감염성 질환, 예를 들면, 패혈증, 수막염, 및 심내막염을 포함한다. 다른 예들은 이비인후과 분야에서 중이염과 축농증; 폐 분야에서 폐렴, 만성 호흡기 감염, 및 카테터 감염; 외과 분야에서 수술 후 복막염 및 담도 등에서의 수술 후 감염; 안과 분야에서, 눈꺼풀의 종기, 누낭염, 결막염, 각막 궤양, 각막 종양, 전안구염, 및 궤도 감염; 및 비뇨기 분야에서 복합 요로감염, 카테터 감염 및 항문 주변 종기를 포함하는 요로 감염을 포함한다. 추가로, 예들은 화상 (심각한 화상과 호흡관 화상 포함), 욕창성 감염, 및 낭포성 섬유증을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물 또는 약제는 활성 성분으로서 본 발명의 항체를 사용하는 조성물의 형태로 사용될 수 있고, 바람직하기는 이것은 정제된 항체 조성물과 또 다른 성분, 예를 들면, 살린, 글루코스 용액 또는 인산 완충액을 함유한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 필요에 따라 액체 또는 동결건조 형태의 제제로 제형화될 수 있고, 그리고 임의로 약제학적으로 허용가능한 담체, 예를 들면, 안정화제, 보존제, 및 등장제(isotonic agent)를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체의 예는 다음을 포함한다: 동결건조 제제용으로서 만니톨, 락토스, 사카로스 및 인간 알부민; 및 액체 제제용으로서 살린, 주입수, 인산 완충액, 및 수산화 알루미늄. 그러나, 예가 이것으로 제한되는 것은 아니다.

투여는 투여 표적의 연령, 체중, 성별, 및 일반적인 건강 상태에 따라 다를 수 있다. 투여는 경구 투여 및 비경구 투여 (예를 들면, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 및 국소 투여)의 투여 경로에 의해 수행될 수 있다. 그러나 비경구 투여가 바람직하다.

약제학적 조성물의 투여량은 환자의 연령, 체중, 성별 및 전체적인 건강 상태, 녹농균 감염의 심각성 및 투여될 항체 조성물의 성분들에 따를 수 있다. 본 발명의 항체 조성물의 투여량은 일반적으로 정맥내 투여의 경우, 성인에게 0.1 내지 1000 mg, 바람직하기는 1 내지 100 mg/ 체중 kg/1일이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하기는 녹농균 감염이 진행될 수 있는 환자에게 미리 투여된다.

본 발명의 항체는 녹농균의 세포 표면에 노출된 LPS에 결합하기 때문에, 본 발명의 항체는 또한 녹농균 감염 진단제로서도 사용될 수 있다.

본 발명의 항체가 진단제로서 제조될 때, 진단제는 목적에 적합한 어느 수단에 적합시킴에 의해 어느 제형으로도 얻을 수 있다. 예를 들면, 복수, 관심의 항체를 함유하는 배지, 또는 정제된 항체가 항체 역가에 관하여 측정되고 PBS (살린을 함유하는 인산염 완충액)으로 적절히 희석되고; 그 후 0.1% 아지드 나트륨과 같은 보존제가 여기에 첨가된다. 선택적으로, 라텍스 등에 흡수된 본 발명의 항체가 항체 역가에 대해 측정되고 적절히 희석되고, 그리고 사용을 위해 여기에 보존제가 첨가된다. 상기와 같이 라텍스 입자에 결합된 본 발명의 항체는 진단제로서 바람직한 제형 중 하나이다. 이 경우, 라텍스로서 적합한 수지 재료, 예를 들면, 폴리스티렌, 폴리비닐 톨루엔, 또는 폴리부타디엔의 라텍스가 적합하다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 항체를 사용한 녹농균 감염에 대한 진단방법이 제공된다. 본 발명의 진단방법은 녹농균 감염이 진행되고 있는, 인간을 포함하여, 포유동물의 객담, 폐 세척 유체, 고름, 눈물, 혈액 또는 소변과 같은 생리적 샘플을 수집하고, 이어서 수집된 샘플을 본 발명의 항체와 접촉시키고, 그리고 항원-항체 반응의 발생 여부를 결정하는 것으로 수행된다.

본 발명에 따르면, 녹농균의 존재를 검출하는 키트가 제공되고, 상기 키트는 최소한 본 발명의 항체를 포함한다.

본 발명의 항체는 분류될 수 있다. 이러한 검출용 키트는 항원-항체 반응을 검출함으로써 녹농균의 존재를 검출한다.

그러므로, 본 발명의 검출 키트는 필요에 따라, 추가로 항원-항체 반응을 수행하기 위한 다양한 시약, 예를 들면, 2차 항체, 색원체 시약, 완충액, 지시사항 및/또는 ELISA법에 사용되는 기구 등을 포함할 수 있다.

실시예

이하, 본 발명은 실시예들을 근거로 더욱 구체적으로 기재될 것이다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 항- LPS 항체의 클로닝

(1) 혈액 공여자 모집

만성 PA 폐 감염 낭포성 섬유증 환자들과 건강한 지원자들로부터 혈액 샘플 250ml를 수집하였다. 공여자들은 일반적으로 건강하였고 연령, 만성 PA 감염 햇수, 및 면역반응 상태에서 다양한 범위를 나타내었다. 추가로 포함되는 기준은 연령 18세 초과, 체중 50 킬로그램 초과 및 정상 헤모글로빈 수치였다. 모든 공여는 생명의학 연구 윤리에 관한 덴마크 국가 위원회에 의해 승인되었다.

각각의 혈액 샘플에 대해 다음 유형의 분석을 수행하였다: i) 형질아세포와 플라즈마 세포의 순환량을 측정하기 위한 FACS 분석, ii) 특정 LPS 항원에 특이적인 항체 생산 세포의 순환량을 측정하기 위한 ELISPOT 분석, iii) 특정 LPS 항원을 향해 특이적 면역글로불린의 존재를 측정하기 위한 ELISA 분석.

하기의 Symplex 공정(WO2005/042774 참조)을 위해 LPS에 특이적인 형질아세포를 높은 비율로 갖는 공여자 샘플을 선택하였다.

(2) 인간 형질아세포의 FACS 선별

이 공정을 위한 출발 물질은 MACS-정제된 CD19 양성 B-세포이다. 이들 세포는 일반적으로 냉동 보관되고, 그리고 나서 분획들을 각각의 선별에 앞서 해동하였다. 생균 형질아세포를 CD19, CD38, 람다-경사슬 및 사멸세포에 대해 세포를 염색하여 동정하였다.

해동 직후의 세포들을 FACS PBS 4 ml로 2회 세척하고, 40㎕ FACS PBS 당 1x10⁶ 세포로 희석하였다. 1x10⁶ 세포 당, 다음의 시약을 추가하였다: 4 ℃에서 10 ㎕ CD19-FITC, 20 ㎕ CD38 APC 및 10 ㎕ 람다-PE 그리고 20분 동안 암실에서 얼음 위에 방치하였다. 샘플을 2 ml FACS 완충액으로 2회 세척하고 1 ml FACS PBS에 재현탁시키고, 그 후 프로피디움 아이오다이드를 첨가하였다 (1:100). 세포-현탁액을 50 ㎛ 주사기 falcon (FACS 필터)을 통해 여과시켜 Symplex PCR 플레이트로 직접 선별하도록 준비시켰다 (다음 섹션 참조). 선별 후, PCR 플레이트를 300xg에에서 1분 동안 원심분리하고 나중에 사용하기 위해 -80℃로 보관하였다.

(3) 동족 VH와 VL쌍의 링크

동일한 B 세포로부터 기인하는 중사슬 가변영역 (VH)과 경사슬 가변영역 (VL)을 암호화하는 서열의 쌍을 이루도록, VH와 VL을 암호화하는 서열을 플라즈마 세포로 게이트된 단일 세포에 링크하였다. 과정은 1-단계 멀티플렉스 오버랩-확장 RT-PCR과 이어서 네스티드 PCR(nested PCR)을 사용하였다. 본 실시예에서 사용된 프라이머 믹스는 오직 카파 경사슬 만을 증폭하였다. 동족 VH 및 VL 서열의 링크의 원리를 도 1에 나타내었다.

생산된 96-웰 PCR 플레이트를 해동하고 선별된 세포들을 멀티플렉스 오버랩-확장 RT-PCR을 위한 주형으로 사용하였다. 선별된 완충액을 반응 완충액(OneStep RT-PCR Buffer; Qiagen), RT-PCR용 프라이머 (표 2 참조) 및 RNase 억제제를 함유하는 단일-세포 선별에 앞서 각각의 웰에 첨가하였다. 이것을 1-단계 RT-PCR 효소 믹스 (25배 희석; Qiagen)와 dNTP 믹스 (각각 200 μM)에 현탁하여 20-㎕ 반응 부피에서 소정의 최종 농축물을 얻었다.

Symplex^TM 프라이머 믹스	서열 (5 3	최종 농도 (pmol/)
멀티플렉스 PCR
KC
IGKC2	ATATATATGCGGCCGCTTATTAACACTCTCCCCTGTTG (SEQ ID NO: 31)	51.25
HC set
IGHG	GACSGATGGGCCCTTGGTGG (SEQ ID NO: 32)	51.25
IGHA	GAGTGGCTCCTGGGGGAAGA (SEQ ID NO: 33)	51.25

HV set
HV1	TATTCCCATGGCGCGCCCAGRTGCAGCTGGTGCART (SEQ ID NO: 34)	10.24
HV2	TATTCCCATGGCGCGCCSAGGTCCAGCTGGTRCAGT (SEQ ID NO: 35)	10.24
HV3	TATTCCCATGGCGCGCCCAGRTCACCTTGAAGGAGT (SEQ ID NO: 36)	10.24
HV4	TATTCCCATGGCGCGCCSAGGTGCAGCTGGTGGAG (SEQ ID NO: 37)	10.24
HV5	TATTCCCATGGCGCGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGT (SEQ ID NO: 38)	10.24
HV6	TATTCCCATGGCGCGCCCAGSTGCAGCTGCAGGAGT (SEQ ID NO: 39)	10.24
HV7	TATTCCCATGGCGCGCCGARGTGCAGCTGGTGCAGT (SEQ ID NO: 40)	10.24
HV8	TATTCCCATGGCGCGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTC (SEQ ID NO: 41)	10.24
KV set
KV1	GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGACATCCAGWTGACCCAGTCT (SEQ ID NO: 42)	10.24
KV2	GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGATGTTGTGATGACTCAGTCT (SEQ ID NO: 43)	10.24
KV3	GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGAAATTGTGWTGACRCAGTCT (SEQ ID NO: 44)	10.24
KV4	GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGATATTGTGATGACCCACACT (SEQ ID NO: 45)	10.24
KV5	GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGAAACGACACTCACGCAGT (SEQ ID NO: 46)	10.24
KV6	GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGAAATTGTGCTGACTCAGTCT (SEQ ID NO: 47)	10.24

네스티드 PCR
KC
IGKC1	ACCGCCTCCACCGGCGGCCGCTTATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT (SEQ ID NO: 48)	51.25
HJ set
IGHJ 1-2	GGAGGCGCTCGAGACGGTGACCAGGGTGCC (SEQ ID NO: 49)	51.25
IGHJ 3	GGAGGCGCTCGAGACGGTGACCATTGTCCC (SEQ ID NO: 50)	51.25
IGHJ 4-5	GGAGGCGCTCGAGACGGTGACCAGGGTTCC (SEQ ID NO: 51)	51.25
IGHJ 6	GGAGGCGCTCGAGACGGTGACCGTGGTCCC (SEQ ID NO: 52)	51.25

플레이트를 30분 동안 55℃에서 배양하여 각각의 세포로부터 RNA의 역전사가 일어나도록 하였다. 역전사 후, 플레이트를 다음과 같이 PCR 순환하였다: 94℃에서 10분, 35x(94℃에서 40초, 60℃에서 40초, 72℃에서 10분), 72℃에서 10분.

PCR 반응을 24개 96-웰 플레이트에 대해 필 실(Peel Seal) 바스켓이 있는 H20BIT 열순환기 (ABgene)에서 수행하여 고-처리량이 가능하도록 하였다. 순환 후 PCR 플레이트를 -20℃에서 보관하였다.

네스티드 PCR 단계에서, 96-웰 PCR 플레이트를 소정의 최종 농도를 얻기 위해 각각의 웰에서 다음의 혼합물로 제조하였다 (20-㎕ 반응물): 1xFastStart 완충액 (Roche), dNTP 믹스 (각각 200 μM), 네스티드 프라이머 믹스 (표 1 참조), Phusion DNA 폴리머라제 (0.08 U; Finnzymes) 및 FastStart 고정확성 효소 블렌드 (0.8 U; Roche). 네스티드 PCR용 주형으로서, 1㎕를 멀티플렉스 오버랩-확장 PCR 반응물로부터 옮겼다. 네스티드 PCR 플레이트를 다음과 같이 열순환하였다: 35x(95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 90초), 72℃에서 10 분.

무작위로 선택한 반응 산물들을 1% 아가로스 겔에서 분석하여 대략 1050 염기쌍 (bp)의 오버랩-확장 단편의 존재를 증명하였다. 플레이트를 PCR 단편의 추가의 처리까지 -20℃에서 보관하였다. 네스티드 PCR로부터 링크된 VH 및 VL 암호화 쌍의 목록을, 다른 공여자로부터의 쌍을 혼합하지 않으면서 모았고, 예비 1% 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다.

(4) 동족 VH 및 VL 암호화 서열 쌍을 스크리닝 벡터에 삽입

LPS에 결합 특이성을 갖는 항체를 동정하기 위해, 얻어진 VH 및 VL 암호화 서열을 전장 항체로 발현시켰다. 이것은 VH와 VL 암호화 쌍의 목록을 발현 벡터로 삽입하고 숙주세포로 트랜스펙션하는 것을 포함한다.

링크된 VH와 VL 암호화 쌍을 함유하는 발현 벡터의 목록을 생성하는데 2단계 클로닝 과정을 적용하였다. 통계적으로, 발현 벡터의 목록이 스크리닝 목록의 발생을 위해 사용되는 동족 쌍을 이루는 VH와 VL PCR 산물의 수만큼 많은 재조합 플라즈미드의 10배를 함유한다면, 모든 고유의 유전자 쌍을 표현할 수 있을 가능성은 99%이다. 그러므로, 400개의 오버랩-확장 V-유전자 단편들이 얻어졌다면, 스크리닝을 위해 최소한 4000개의 클론 목록이 생성된다.

즉, 링크된 VH와 VL 암호화 쌍의 목록의 정제된 PCR 산물은 PCR 산물의 터미날에 도입되는 인식 분위에서 XhoI와 NotI DNA 엔도뉴클레아제로 분열되었다. 분열되고 정제된 단편들을 XhoI/NotI 소화된 포유동물 발현 벡터, OO-VP-002 (FIG. 2) 로 표준 결찰 공정에 의해 결찰시켰다. 결찰 믹스를 E. coli로 전기천공시키고 (electroporated) 그리고 적절한 항생제를 함유하는 2xYT 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 벡터의 증폭된 목록을 표준 DNA 정제법을 사용하여 플레이트로부터 회수된 세포로부터 정제하였다(Qiagen).

플라즈미드를 AscI 및 NheI 엔도뉴클레아제를 사용하는 분열에 의해 프로모터-리터 단편을 삽입하기 위해 준비하였다. 이들 효소들의 제한 부위들은 VH 및 VL 암호화 유전자 쌍 사이에 위치하였다. 벡터의 정제 후, AscI-NheI 소화된 2-방향성 포유동물 프로모터-리터 단편을 표준 결찰과정에 의해 AscI 및 NheI 제한 부위에 삽입하였다. 결실된 벡터를 E. coli에서 증폭시키고 플라즈미드를 표준법으로 정제하였다. 스크리닝 벡터의 발생된 목록을 통상의 과정으로 E. coli로 전환시켰다. 얻어진 콜로니들을 384-웰 마스터 플레이트에 통합시키고 저장하였다. 384-웰 플레이트로 이송된 콜로니의 수는 사용된 PCR 산물의 수를 최소한 3-배 초과하였고, 따라서 얻어진 모든 고유의 V-유전자 쌍의 존재 확률은 95%였다.

M166이 키메릭 IgG 항체로서 발현되었다. N166의 가변 유전자 아미노산 서열은 특허 WO2002/064161에 기재된 바와 같이 녹농균 PcrV 단백질에 특이적인 뮤린 항체로부터 기원한다. 가변 유전자들을 GENEART AG (BioPark, Josef-Engert-Str. 11, 93053 Regensburg, Germany)에서 그리고 뮤린 경사슬 가변 유전자가 인간 카파 불변 유전자에 링크하는 공정에서 합성하였다. 뮤린 중사슬 가변 유전자와 키메릭 경사슬 유전자를 포유동물 세포에서 유전자 발현에 필요한 요소 뿐만 아니라 인간 중사슬 불변 유전자의 나머지 부분을 품는(harboring) 발현 벡터에 삽입하였다.

(5) 총합체 목록의 발현

마스터 플레이트 상의 세균 콜로니를 384-웰 플레이트에서 배지에 심고, 밤새 배양하였다. 트란스펙션을 위한 DNA를 TempliPhi DNA 증폭 키트 (Amersham Biosciences)를 사용하여 그것의 매뉴얼에 따라 각각의 웰로부터 제조하였다. 트란스펙션 전날, Flp-In^TM-CHO 세포(Invitrogen)를 384-웰 플레이트에 웰 (배지 20 ㎕)당 3000 세포로 심었다. 증폭된 DNA들을 FuGENE 6 (Roche)을 사용하여 그것의 매뉴얼에 따라 세포에 도입하였다. 배양 3일 후, 전장 항체를 함유하는 현탁액을 수집하고, 항원 특이 스크리닝을 위해 저장하였다.

(6) LPS에 대한 결합에 관한 스크리닝

ELISA법에 의해, 항체 라이브러리의 스크리닝을 지표로서 관련 녹농균 유형 균주로부터 단리한 정제된 LPS 분자들의 혼합물에 대한 결합을 이용하여 수행하였다. Nunc MaxiSorp 384-웰 플레이트를 정제된 LPS 분자들의 혼합물을 50 mM 탄산염 완충액 (pH:9.6)으로 희석시켜 얻은 LPS 혼합물 (분석 당 최대 6 혈청형을 함유)로 4℃에서 밤새도록 코팅시켜 각각의 LPS 혈청형의 정제된 LPS 10 ㎍/ml이 함유되도록 하였다. 웰 플레이트를 탈지유 (SM) 2%를 함유하는 PBS-T (PBS + 0.05% Tween) 50 ㎕로 블록하고, 그리고 나서 PBS-T로 한번 세척하였다. 항체 현탁액 15 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 1.5 시간 동안 배양을 실시하였다. 그리고 나서, 플레이트를 PBS-T로 한번 세척하였다. 웰과 결합된 항체를 검출하기 위해, 2% SM-PBS-T로 10,000-배 희석시킨 2차 항체 (HRP-염소-항-인간 IgG, Jackson)를 각각의 웰에 첨가하고, 그리고 나서 배양을 실온에서 1시간 동안 실시하였다. 플레이트를 일단 PBS-T로 세척하고, 그리고 나서 각각의 웰에 25 ㎕의 기질(Kemen-tec Diagnostics, 목록 번호 4390)을 첨가하였다. 그리고 나서, 배양을 5분 동안 실시하였다. 배양 후, 1M 황산 25 ㎕을 첨가하여 반응을 종료시켰다. 특이적 신호를 450 nm-ELISA 판독기에 의해 검출하였다.

(7) 서열 분석 및 클론 선택

ELISA에서 LPS-특이로서 동정된 클론들을 원래의 마스터 플레이트(384-웰 포맷)로부터 회수하고 새로운 플레이트에 병합시켰다. DNA를 클론으로부터 단리하고 V-유전자의 DNA 서열화에 사용하였다. 서열들을 정렬시키고 모든 고유의(unique) 클론들을 선택하였다. 얻어진 서열의 다양한 정렬은 각각의 특정 클론들의 고유성(uniqueness)을 나타내었고 고유의 항체를 동정할 수 있도록 하였다. 관련 서열의 각각의 클러스터는 아마도 통상의 전구체 클론의 신체적 초고돌연변이 (somatic hypermutations)를 통해 유도되었을 것이다. 결국, 각각의 클러스터로부터 1 내지 2개의 클론을 서열과 특이성의 검증을 위해 선택하였다.

(8) 서열 및 특이성 검증

항체 암호화 클론을 검증하기 위해, DNA 플라즈미드를 제조하고 2-ml 규모로 FreeStyle CHO-S 세포의 트란스펙션을 발현을 위해 수행하였다. 상청액을 트란스펙션 후 96시간에 수확하였다. 발현 수준을 표준 항-IgG ELISA으로 평가하였고, 특이성을 LPS-특이 ELISA로 결정하였다.

(9) 동정된 항체

상기의 결과로서, 동정된 항-LPS 항체와 CDR과 항-LPS 항체의 가변 영역들의 서열은 다음과 같다. 동정된 항-LPS 항체의 불변 영역의 서열은 WO 2005/042774에 기재된 바에 따른다는 것을 명심하라.

<항-혈청형 B LPS 항체>

"3099"

SEQ ID NOs: 1 내지 3 ㆍㆍ 경사슬 CDR 1 내지 3의 아미노산 서열

SEQ ID NOs: 4 내지 6 ㆍㆍ 중사슬 CDR 1 내지 3의 아미노산 서열

SEQ ID NO: 7 ㆍㆍ 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열

SEQ ID NO: 8 ㆍㆍ 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열

SEQ ID NO: 25 ㆍㆍ 경사슬 가변 영역의 염기 서열

SEQ ID NO: 26 ㆍㆍ 중사슬 가변 영역의 염기 서열

"2745"

SEQ ID NOs: 9 내지 11 ㆍㆍ 경사슬 CDR 1 내지 3의 아미노산 서열

SEQ ID NOs: 12 내지 14 ㆍㆍ 중사슬 CDR 1 내지 3의 아미노산 서열

SEQ ID NO: 15 ㆍㆍ 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열

SEQ ID NO: 16 ㆍㆍ 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열

SEQ ID NO: 27 ㆍㆍ 경사슬 가변 영역의 염기 서열

SEQ ID NO: 28 ㆍㆍ 중사슬 가변 영역의 염기 서열

<광범위하게 반응하는 항-LPS 항체>

"2459"

SEQ ID NO: 17 내지 19 ㆍㆍ 경사슬 CDR 1 내지 3의 아미노산 서열

SEQ ID NO: 20 내지 22 ㆍㆍ 중사슬 CDR 1 내지 3의 아미노산 서열

SEQ ID NO: 23 ㆍㆍ 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열

SEQ ID NO: 24 ㆍㆍ 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열

SEQ ID NO: 29 ㆍㆍ 경사슬 가변 영역의 염기 서열

SEQ ID NO: 30 ㆍㆍ 중사슬 가변 영역의 염기 서열

실시예 2. 항-혈청형 B LPS 항체의 분석

(1) LPS 정제

표 3에 나타낸 다양한 혈청형의 각각의 녹농균 균주를 LB 매질 5 ml에 현탁시켰다. 이 세균 세포 현탁물을 사용하여, 10-배 연속 희석에 의해 1-배 내지 10⁴- 배 희석액을 제조하였다. 이들 희석액을 37℃에서 6시간 동안 흔들어 배양하였다. 배양 후, 세균 성장이 관찰된 희석액 중에서 최대 희석 인자를 갖는 희석액으로부터 세균액을 취하였다. 이 세균액을 개별적으로 제조된 희석인자 1000의 LB 매질에 현탁시키고, 그리고 나서 배양되도록 37℃에서 밤새도록 흔들었다. 배양 후, 액체를 5000 ×g에서 20분 동안 원심분리시키고, 그것에 의해 세균 세포를 수집하였다. 세균 세포의 중량을 측정하고, 정제수를 세균 세포에 수분 중량으로 120 mg/ml로 첨가하였다. 더욱이, 사용전 68℃로 가온된 동량의 90% 페놀 용액(NACALAI TESQUE, INC.)을 세균 세포에 첨가하고, 그리고 혼합물을 20분 동안 교반하였다. 그리고 나서, 혼합물을 수조에서 68℃에서 20분 동안 가끔씩 교반하면서 가열하였다. 그리고 나서, 냉각 후, 혼합물을 5000 ×g에서 20분 동안 원심분리하였다. 수성층을 수집하고, 정제수에 대해 투석하고, 그리고 냉동건조하였다. 생성된 산물을 각각 LPS로 사용하였다

(2) A-밴드 LPS 정제

혈청형 G의 녹농균 균주 ATCC 27584로부터 상기 (1)에서 추출된 LPS G를 원재료로 사용하였다. 이 LPS를 주입용수에 다시 현탁시키고, 그리고 초원심분리 (40000 rpm, 3 hr)를 2회 반복하여 핵산을 제거하였다. 수집된 침전물을 냉동건조시켰다. 여기서 얻은 LPS G를 개략 여과(coarse fractionation)를 위해 겔 여과 칼럼 (HiPrep 26/60 Sephacryl S-200 HR, GE healthcare bioscience, 17-1195-01)을 통과시켰다. 정제 작업을 위해, AKTA explore 10S (GE healthcare bioscience)를 사용하였다. 이동상으로서, 0.2% 데옥시콜레이트산 나트륨 (NACALAI TESQUE, INC., 10712-54), 0.2 M NaCl (NACALAI TESQUE, INC., 31319-45) 및 5 mM EDTA (NACALAI TESQUE, INC., 15105-35)을 함유하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (NACALAI TESQUE, INC., 35406-75) (pH: 8.3)을 사용하였다. 검출을 위해, 시차 굴절계(SHIMAZU, RID-10A)를 사용하였다. 얻어진 개략 정제 분획을 정제수로 밤새도록 투석하고, 그리고 나서 냉동건조시켰다. 냉동건조된 재료를 다시 0.5 M NaCl 용액에 현탁시키고, 여기에 10-배의 양의 에탄올을 첨가하여 LPS의 침전을 일으켰다. 침전물을 다시 70% 에탄올로 세척하여 남아있는 계면활성제를 제거하였다. 그리고 나서, LPS를 냉동건조시키고, 0.1 N NaOH (NACALAI TESQUE, INC., 31511-05) 및 0.2 M NaBH₄(NACALAI TESQUE, INC., 31228-22)의 용액에 현탁시키고, 37℃에서 24 시간 동안 반응시켰다. 그것에 의해, 오직 B-밴드 LPS 함유된 것만이 Eur. J. Biochem. 167, 203-209 (1987)에 기재된 방법에 따라 분해되었다. 이 반응액을 1% 아세트산(NACALAI TESQUE, INC., 00211-95)으로 중화하고, 한외여과로 농축시키고 (Amicon Ultra-15, MWCO 10000, Millipore), 그리고 나서 다시 겔 여과 칼럼(Superdex peptide 10/300 GL, GE healthcare bioscience, 17-5176-01)으로 정제하였다. 이동상으로서 PBS(-) (Sigma-Aldrich Corporation, D1408)를 사용하여 용출된 분획을 수집하였다. 그리고 나서, 정제수로 완충액을 교환하고 한외여과로 농축하였다. 그리고 나서, 냉동건조하여 정제된 A-밴드 LPS를 얻었다.

(3) 웨스턴 블롯팅 및 전세포 ELISA

- 웨스턴 블롯팅 -

실시예 2(1)에서 제조된 다양한 혈청형의 ATCC 균주로부터 얻은 각각의 LPS들과 실시예 2(2)에서 제조된 정제된 A-밴드 LPS (이들은 냉동건조되었다)를 1 mg/ml가 되도록 PBS에 용해시켰다. 용액을 동량의 샘플 완충액 (62.5 mM Tris-HCL (pH: 6.8), 5% 2-메르캅토에탄올, 2% SDS, 20% 글리세롤, 0.005% 브로모페놀 블루)과 혼합하고, 사용 전에 100℃에서 10분간 가열하였다. LPS 10 ㎕를 16 웰-유형 5-20% 또는 15% SDS-PAGE (XV PANTERA Gel, DRC)의 각각의 웰에 첨가하였고, 그리고 나서 15분 동안 전기영동하였다. 반건식 블롯팅 장치(AE-6677, ATTO corporation) 또는 건식 겔 블롯팅 장치(iBlotdry 겔 블롯팅 시스템, Invitrogen)를 사용하여 니트로셀룰로스 막으로 이동시킨 후, Immunoblock^TM (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.)을 사용하여 실온에서 30분 동안 블로킹을 수행하였다. 항체를 TBST (0.05% Tween 20을 함유하는 트리스-완충 살린) 중의 5% Immunoblock^TM으로 3 또는 10 ㎍/ml으로 희석하고, 4℃에서 하루 밤낮 동안 이동막과 반응시켰다. TBST로 10분 동안 3회 세척한 후, 이동막을 염소 항-인간 IgG (Fc) 항체 HRP 컨쥬게이트를 TBST 중의 5% Immunoblock^TM (1:5000)으로 희석시켜 얻은 반응 용액에 담그고, 그리고 반응을 37℃에서 1시간 동안 수행하였다. 그리고 나서, 이동막을 TBST로 10분 동안 3회 세척한 후, 반응을 실온에서 2분 동안 ECL 플러스 웨스턴 블롯팅 검출 시스템 (GE Healthcare, 코드: RPN2132)의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 화학발광을 FLA-3000 형광상 분석기 (FUJIFILM Corporation)로 검출하였다. 표 3에 결과를 나타내었다.

1차 항체로서 항체 2745 및 항체 3099가 첨가된 각각의 막 위에, 아마도 O 항원을 포함하는 B-밴드 LPS에 상응하는 다중 밴드가, 혈청형 11가지의 ATCC 균주로부터 얻어진 LPS 중에서, 임상적으로 주로 만나게 되는 혈청형 B 균주로부터 얻어진 LPS의 오직 저분자량 영역으로부터 고분자량 영역까지만 관찰되었다. 다른 혈청형 B 균주 ATCC 33349 (B/O2), 33352 (B/O5), 33363 (B/O16) 및 43732 (B/O20)으로부터 얻은 LPS가 사용되는 경우, 대표로 선택한 항체 3099는 동일한 결과를 나타내었다. 더욱이, 항체 3099는 정제된 A-밴드 LPS에 대하여 어떠한 반응성도 보이지 않았다. 따라서, 이들 항체가 혈청형 B LPS의 B-밴드 LPD를 특이적으로 인식한다는 것을 확인하였다.

ATCC	혈청형	2745	3099
27577	A/O3	ND	ND
27578	B/O2	B 밴드	B 밴드
33349	B/O2	NT	B 밴드
BAA-47	B/O5	B 밴드	B 밴드
33352	B/O5	NT	B 밴드
33363	B/O16	NT	B 밴드
43732	B/O20	NT	B 밴드
27317	C/O8	ND	ND
27580	D/O9	ND	ND
29260	E/O11	ND	ND
27582	F/O4	ND	ND
27584	G/O6	ND	ND
27316	H/O10	ND	ND
27586	I/O1	ND	ND
21636	M	ND	ND

NT: 시험 안됨

ND: 검출 안됨

- 전세포 ELISA (1)-

고정화에 사용된 세균 현탁물은 원래의 세균 현탁물을 LB 매질에서 밤새도록 배양시킨 다양한 혈청형의 녹농균 균주의 세균 현탁액을 PBS로 세척하고 세척된 재료를 각각 10-배 희석시킨 세균 현탁액의 흡광도가 595 nm에서의 0.20 내지 0.23이 되도록 재현탁하여 제조한 것이었다. 세균 현탁물을 96-웰 ELISA 플레이트(F96 MaxiSorp Nunc-Immuno Plate, Nalge Nunc International K. K.)에 웰당 100 ㎕로 놓고 4℃에서 밤새도록 고정화를 수행하였다. 그리고 나서, TBS 200 ㎕로 세척을 한번 수행하였다. 블로킹 완충액(2% 송아지 혈청 알부민을 함유하는 TBS)을 각각의 웰에 첨가하였고, 30분 동안 실온에서 블로킹을 실시하였다. 그리고 나서, 샘플 완충액 (1% 송아지 혈청 알부민을 함유하는 TBS)으로 희석시킨 (1 ㎍/ml) 항-혈청형 B LPS 항체 2745 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 반응을 37℃에서 2시간 동안 실시하였다. 그리고 나서, 매회 세척 완충액(0.05% Tween 20을 함유하는 TBS) 200 ㎕으로 세척을 3회 실시하였다. 샘플 완충액으로 10000-배 희석시킨 2차 항체 염소 항-인간 IgG (Fc) 항체 HRP 컨쥬게이트(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.) 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 반응을 수행하였다. 그리고 나서, 세척 완충액으로 세척을 3회 실시하였다. 발색 기질(TMB Microwell Peroxidase substrate System, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.) 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 암실에서 반응을 실시하였다. 그리고 나서, 효소 반응을 1M 인산 용액으로 중지시키고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 표 4에 결과를 나타내었다. 흡광도가 0.25보다 큰 것을 양성으로 판단할 때, 항체 2745는 오직 혈청형 B 서브타입 (02, 5, 16 및 20)에만 결합능력을 갖는다는 것을 확인하였다. 항체 2745는 혈청형 B 서브타입의 균주에 특이성을 나타냈다.

ATCC	혈청형	2745	베닐론
27577	A/O3	0.043	0.022
27578	B/O2	0.492	0.025
33349	B/O2	0.381	-0.012
BAA-47	B/O5	0.780	-0.034
33352	B/O5	0.825	0.022
33363	B/O16	0.673	0.009
43732	B/O20	0.776	0.021
33353	C/O7	0.026	0.015
27580	D/O9	0.004	0.014
29260	E/O11	0.024	0.054
27582	F/O4	0.046	0.007
27584	G/O6	0.007	0.013
27316	H/O10	0.012	0.012
27586	I/O1	0.024	0.076
21636	M	0.003	0.012

NT: 시험 안됨

- 전세포 ELISA (2) -

전세포 ELISA를 항-혈청형 B LPS 항체 3099 (1.0 ㎍/ml)에서, 총 31개의 균주를 사용하여 수행하였고, 여기에는 다양한 혈청형 균주가 추가로 포함되었다. 표 5에 결과를 나타내었다. 평가는 다음과 같다: 흡광도가 0.25 미만인 경우는 -로 표시하였다; 흡광도가 0.25 이상 0.5 미만인 경우는 +로 표시; 흡광도가 0.5 이상 0.75 미만인 경우는 ++로 표시; 그리고 흡광도가 0.75 이상인 경우는 +++로 표시. 대조군인 인간 면역글로불린 제제, 베닐론 (TEIJIN PHARMA LIMITED)은 31개의 균주에 대하여 결합 능력을 나타내지 않았다. 반대로, 항체 3099는 혈청형 B 서브타입 (O2, 5, 16 및 20)의 균주에만 하나는 +++, 3개는 ++, 2개는 +로 결합능력을 나타내었다. 항체 3099는 또한 B 서브타입 균주와 유사한 구조를 갖는 혈청형 O18 균주에는 ++였고, 다른 균주들에는 -였다. 항체 3099는 혈청형 B 서브타입 균주와 혈청형 O18 균주에 특이성을 나타내었다.

ATCC	혈청형	3099		베닐론
27577	A/O3	0.011	-	0.025	-
33350	A/O3	0.007	-	0.008	-
27578	B/O2	0.480	+	0.032	-
33349	B/O2	0.617	++	0.068	-
BAA-47	B/O5	0.490	+	0.032	-
33352	B/O5	0.655	++	0.045	-
33363	B/O16	0.754	+++	0.043	-
43732	B/O20	0.514	++	0.155	-
33353	C/O7	-0.002	-	0.003	-
27317	C/O8	0.021	-	0.029	-
33355	C/O8	0.006	-	0.015	-
27580	D/O9	0.015	-	0.020	-
33356	D/O9	0.008	-	0.013	-
29260	E/O11	0.017	-	0.028	-
33358	E/O11	0.030	-	0.031	-
27582	F/O4	-0.011	-	0.007	-
33351	F/O4	-0.001	-	0.018	-
27584	G/O6	0.059	-	0.037	-
33354	G/O6	0.012	-	0.026	-
27316	H/O10	0.005	-	0.008	-
33357	H/O10	0.019	-	0.014	-
27586	I/O1	0.012	-	0.012	-
33348	I/O1	0.009	-	0.009	-
33362	J/O15	-0.001	-	0.016	-
33360	K/O13	0.004	-	0.012	-
33361	K/O14	0.050	-	0.024	-
33359	L/O12	0.012	-	0.023	-
21636	M	0.028	-	0.028	-
33364	N/O17	0.005	-	0.020	-
43390	O18	0.536	++	0.014	-
43731	O19	0.004	-	0.009	-

- 전세포 ELISA (3) -

본 발명의 항-혈청형 B LPS 항체 3099의 메이지 세이카 가부시키가이샤가 소유하는 혈청형 B/O5의 다제내성 녹농균 (MDRP)의 두 균주에 대한 결합능을 조사하였다. 평가는 다음과 같다: 흡광도가 0.25 미만인 경우는 -로 표시하였다; 흡광도가 0.25 이상 0.5 미만인 경우는 +로 표시; 흡광도가 0.5 이상 0.75 미만인 경우는 ++로 표시; 그리고 흡광도가 0.75 이상인 경우는 +++로 표시.

대조군인 인간 면역글로불린 제제, 베닐론 (TEIJIN PHARMA LIMITED, 1.0 ㎍/ml)은 시험된 2 개의 균주에 대하여 결합 능력을 전혀 나타내지 않았다. 반대로, 항체 3099는 두 균주 모두에 대해 ++로 평가되었고, 항생물질 내성이 존재함에도 불구하고 MDRP에도 강한 결합 능력을 나타내었다. 결과를 표 6에 나타내었다.

균주	혈청형	3099		베닐론
MSC17650	B/O5	0.721	++	0.017	-
MSC17663	B/O5	0.668	++	0.012	-

(4) 교차반응성 시험

항-혈청형 B LPS 항체 3099(1.0 ㎍/ml)의 교차 반응을 시험하기 위해, 전세포 ELISA를 상기 (1)과 동일한 방법으로 다양한 그램-음성 및 그램-양성 병원균을 사용하여 수행하였다. 표 7에 결과를 나타내었다. 항-혈청형 B LPS 항체 3099는 혈청형 B/05 ATCC BAA-47 균주를 특이적으로 인식하고 강하게 결합하였지만, 다른 세균 균주와는 반응하지 않았다.

(5) 응집 활성

녹농균 ATCC BAA-47 균주 (혈청형 B/O5)를 사용하여, 항체 3099의 응집활성을 측정하였다. 이 균주를 트리피카제 소이 아가 매질에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 그리고 나서, 여러 클로니를 LB 매질에 현탁한 후, 매질을 37℃에서 밤새 배양하는 동안 흔들었다. 세균 배양물을 PBS로 세척하고 PBS에 재현탁하였다. 그리고 나서, 4% 파라포름알데히드를 함유하는 인산염 완충액 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)을 여기에 첨가하고, 30분 이상 불활성화 처리를 실시하였다. 이 처리 산물을 시험에 사용하였다. 불활성화된 ATCC BAA-47 균주를 PBS에 현탁시켜 단백질 농도가 2 mg/ml가 되도록 하였다. 항체 3099 (원래의 액체에서의 IgG의 농도: 5.79 mg/ml)를 PBS로 연속적으로 희석하였다. 동량 (8 ㎕)의 불활성화 ATCC BAA-47 균주 현탁액과 연속적으로 희석된 항체 3099를 96-웰 둥근바닥 플레이트에서 서로 혼합하였다.

각각의 혼합물을 37℃에서 1시간 이상 또는 실온에서 밤새도록 또는 그 이상 방치하였다. 그리고 나서, 세균 세포의 응집을 판단하였다. 결과에 따르면, 항체 3099의 응집 역가는 512였고, 다시 말하면, 응집은 희석물의 최대 512 배가 관찰되었고, IgG의 양(㎍)당 응집 역가는 5659였다. 한편, 대조군인 면역글로불린 제제, 베닐론, (50 mg/ml, TEIJIN PHARMA LIMITED)의 응집 역가는 4였고, 다시 말하면, 응집은 희석물의 최대 4배 였고, IgG의 양(㎍) 당 응집 역가는 0.04였다.

(6) 옵소닌 활성

-시험 1-

혈청형 B 녹농균 균주 ATCC 33349를 LB 매질 중에서 밤새 배양하였다. 세균 배양물을 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 라벨링을 수행하기 위해, 실온에서 1시간 동안 플루오레세인-4-이소티오시아네이트(FITC) 1mM 용액 중에 현탁하였다. Mono-Poly 분석 매질 (DS Pharma Biomedical Co. Ltd.)을 사용한 밀도 구배 원심분리법에 의해, 인간 다핵형 백혈구 (이하, PMN이라 함)을 건강한 공여자로부터 시트르산을 사용하여 수집한 혈액 50 ml로부터 정제하였고, 그리고 5×10⁶cells/ml의 밀도를 갖도록 제조하였다. 혈청형 B 특이 항체 3099 20 ㎕ 및 FITC-라벨된 녹농균 균주 (30 ㎕, 5×10⁶)를 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 그리고 나서, 보체로서, 새끼 토끼 혈청 (10 ㎕)과 PMN (40 ㎕, 2×10⁵ 세포)을 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 더욱 배양하여 식균작용을 수행하였다. 플레이트를 얼음 위로 옮기고, 그것에 의해 반응을 중지시켰다. 세포 표면에 부착된 세균의 형광발광을 0.2% 트립신 블루(100 ㎕)를 함유하는 PBS로 끄고(quenched), 그리고 나서 세포를 0.5% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 유세포 분석기(BECKMAN COULTER)를 사용하여, 세포의 형광 (평균 형광 강도, 이하 MFI로 약칭함)을 측정하였다. 옵소닌 활성을 FITC-라벨 녹농균 균주를 병합하는 PMN의 형광 강도로부터 PMN의 고유 형광에 의한 형광 강도를 빼서 얻은 값으로 산출하였다.

그 결과, 혈청형 B 균주 ATCC 33349의 경우, 항체가 첨가되지 않은 군의 MFI 값은 0.63이었고, 항-혈청형 B LPS 항체 3099가 첨가된 군의 MFI 값은 농도-의존적으로 증가하여, MFI 값은 30 ㎍/ml에서 49.26이었고, 그리고 EC50는 3.13 ㎍/ml였다. 대조로서 사용되는, 면역 글로불린 제제, 베닐론 (TEIJIN PHARMA LIMITED)의 MFI 값은 1000 ㎍/ml에서 3.93이었다.

상기 결과는 항-혈청형 B LPS 항체 3099가 임상적으로 주로 만나는 혈청형 B의 균주에 대해 강한 옵소닌 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.

-시험 2-

혈청형 B 녹농균 균주 ATCC 27578 (O2)을 뮬러-힌톤(Mueller-Hinton) 아가 매질에서 밤새 배양하였다. 그리고 나서, 그것으로부터 3개의 콜로니들을 취하고, 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 배지에서 배양하고, 37℃에서 16시간 흔들면서 배양하였다 (180 rpm). 배지를 원심분리하였다 (2,000×g, 10 분, 실온). 생성된 재료를 인산염-완충 살린 (PBS)으로 1회 세척하고, 그리고 나서 플루오레스신-4-이소티오시아네이트의 1 mM 용액중에 실온에서 1시간 동안 현탁시켜 라벨링하였다. Mono-Poly 분석 매질(DS Pharma Biomedical Co. Ltd.)을 사용하여 밀도구배 원심분리법으로, 인간 다핵형 백혈구(이하 PMN이라 함)를 건강한 공여자로부터 시트르산을 사용하여 수집된 혈액 50 ml로부터 정제하였고, 5×10⁶cells/ml의 농도가 되도록 제조하였다. 항-혈청형 B LPS 항체 2745 20 ㎕와 FITC-라벨된 녹농균 균주 PMN (30 ㎕, 5×10⁶)를 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 그리고 나서, 주형으로서, 새끼 토끼 혈청 (10 ㎕)과 PMN (40 ㎕, 2×10⁵cells)를 첨가하고, 혼합물을 식균작용을 수행하도록 30분 동안 추가로 배양하였다. 플레이트를 얼음 위로 옮기고, 그것에 의해 반응을 중지시켰다. 세포 표면에 부착된 세균의 형광을 0.2% 트립신 블루(100 ㎕)를 함유하는 PBS로 끄고, 그리고 나서 세포를 0.5% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 유세포분석기 (BECKMAN COULTER)를 사용하여, 세포의 형광 (평균 형광 강도, 이하 MFI로 약칭함)을 측정하였다. 옵소닌 활성을 FITC-라벨 녹농균 균주를 병합하는 PMN의 형광 강도로부터 PMN의 고유 형광에 의한 형광 강도를 빼서 얻은 값으로 산출하였다.

그 결과, 혈청형 B 균주 ATCC 27578 (O2)의 경우, 항체가 첨가되지 않은 군의 MFI 값은 1.60이었고, 항체 2745가 첨가된 군의 MFI 값은 농도-의존적으로 증가하여, MFI 값은 10 ㎍/ml에서 4.18이었고, 그리고 EC50는 0.42 ㎍/ml였다. 대조로서 사용되는, 면역 글로불린 제제, 베닐론 (TEIJIN PHARMA LIMITED)의 MFI 값은 1000 ㎍/ml에서 1.93이었다.

한편, 혈청형 B 균주 ATCC BAA-47 (O5)의 경우, 항체가 첨가되지 않은 군의 MFI 값은 3.19였고, 항체 2745가 첨가된 군의 MFI 값은 농도-의존적으로 증가하여, MFI 값은 10 ㎍/ml에서 10.07이었고, 그리고 EC50는 0.72 ㎍/ml였다. 대조로서 사용되는, 면역 글로불린 제제, 베닐론 (TEIJIN PHARMA LIMITED)의 MFI 값은 1000 ㎍/ml에서 4.35였다.

상기 결과는 항-혈청형 B LPS 항체 2745가 혈청형 B의 녹농균 균주에 대해 강한 옵소닌 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.

(7) 전신성 감염 모델에 대한 효과 1

호중성 백혈구 감소증 마우스를 다음과 같이 준비하였다. 시클로포스파미드 (Sigma-Aldrich)를 복막주입하였다 각각 6-주령 BALB/c 수컷 마우스 (Charles river laboratories Japan, inc., n=6)에 125 mg/kg으로, 주입하는 날을 제0일로 하여, -5, -2 및 0일에 총 3회 주입하였다. 그것에 의해 말초혈액에서의 호중성이 감소하였다. 마우스에, ATCC 27578 균주 (혈청형 B/02)를 1.75×10⁵cfu/mouse (대략 140 LD50)로 복막내 접종하였고, 그것에 의해 전신 감염을 유발하였다. 그 직후, 샘플을 200 ㎕/mouse로 꼬리 정맥을 통해 투여하고, 감염에 대한 보호 활성을 접종 후 7일에 생존을 기준으로 판단하였다. 결과로서, 면역글로불린 제제, 베닐론 (TEIJIN PHARMA LIMITED)을 200, 1000 및 5000 ㎍/mouse로 투여한 대조군의, 감염 후 제7일의 생존률은 각각 16.7, 0 및 0%였고, ED50는 >5000 ㎍/mouse으로 평가되었다. 항-PcrV 항체 M166을 40 및 200 ㎍/mouse로 투여한 군의, 감염 후 제7일의 생존률은 모두 0%였고, ED50는 >200 ㎍/mouse로 평가되었다. 반대로, 항-혈청형 B LPS 항체 2745를 0.32, 1.6, 8.0, 40 및 200 ㎍/mouse로 투여한 군의, 감염 후 제7일의 생존률은 각각 0, 0, 16.7, 83.3, 및 83.3%로, 감염에 대한 강한 보호 활성을 나타내었고, ED50는 11.71 ㎍/mouse로 평가되었다.

(8) 전신성 감염 모델에 대한 효과 2

호중성 백혈구 감소증 마우스를 다음과 같이 준비하였다. 시클로포스파미드 (Sigma-Aldrich)를 복막주입하였다 각각 6-주령 BALB/c 수컷 마우스 (Charles river laboratories Japan, inc., n=6)에 125 mg/kg으로, 주입하는 날을 제0일로 하여, -5, -2 및 0일에 총 3회 주입하였다. 그것에 의해 말초혈액에서의 호중성이 감소하였다. 마우스에, ATCC 27578 균주 (혈청형 B/02)를 2.075×10⁵cfu/mouse (대략 170 LD50)를 복막내 접종하여 전신 감염을 유발하였다. 그 직후, 샘플을 200 ㎕/mouse로 꼬리 정맥을 통해 투여하고, 감염에 대한 보호 활성을 접종 후 7일에 생존을 기준으로 평가하였다. 그 결과, 면역글로불린 제제, 베닐론, (TEIJIN PHARMA LIMITED)를 40, 200, 1000 및 5000 ㎍/mouse로 투여한 대조군의, 감염 후 제7일의 생존률은 각각 50, 0, 50 및 50%였고, ED50는 > 5000 ㎍/mouse으로 평가되었다. 항-PcrV 항체 M166을 0.32, 1.6, 8.0, 40 및 200 ㎍/mouse로 투여한 군의 감염 후 제7일의 생존률은 각각 16.7, 16.7, 16.7, 0, 및 16.7%였고, ED50는 >200 ㎍/mouse 였다. 대조로, 항-혈청형 B LPS 항체 3099를 0.32, 1.6, 8.0, 40 및 200 ㎍/mouse로 투여한 군의, 감염 후 제7일의 생존률은 각각 0, 50, 83.3, 50 및 100%로, 감염에 대한 강한 보호 활성을 나타내었고, ED50는 4.61 ㎍/mouse로 평가되었다.

(9) 전신 감염 모델에 대한 효과 3

호중성 백혈구 감소증 마우스를 다음과 같이 준비하였다. 시클로포스파미드 (Sigma-Aldrich)를 복막주입하였다 각각 6-주령 BALB/c 수컷 마우스 (Charles river laboratories Japan, inc., n=6)에 125 mg/kg으로, 주입하는 날을 제0일로 하여, -5, -2 및 0일에 총 3회 주입하였다. 그것에 의해 말초혈액에서의 호중성이 감소하였다. 마우스에, 상기 (8)에서 사용한 균주와 다른, ATCC BAA-47 균주 (혈청형 B/05)를 2.175×10⁴cfu/mouse (대략 7.3 LD50)를 복막내 접종하여, 전신 감염을 유발하였다. 그 직후, 샘플을 200 ㎕/mouse로 꼬리 정맥을 통해 투여하고, 감염에 대한 보호 활성을 접종 후 7일에 생존을 기준으로 평가하였다. 그 결과, 면역글로불린 제제, 베닐론, (TEIJIN PHARMA LIMITED)를 200, 1000 및 5000 ㎍/mouse로 투여한 대조군의, 감염 후 제7일의 생존률은 각각 33.3, 50 및 66.7%였고, ED50는 1000 ㎍/mouse으로 평가되었다. 항-PcrV 항체 M166을 8.0, 40 및 200 ㎍/mouse로 투여한 군의 감염 후 제7일의 생존률은 모두 0%였고, ED50는 >200 ㎍/mouse 였다. 대조로, 항-혈청형 B LPS 항체 2745를 0.32, 1.6, 8.0, 40 및 200 ㎍/mouse로 투여한 군의, 감염 후 제7일의 생존률은 각각 16.7, 66.7, 100, 83.3 및 50%로, 감염에 대한 강한 보호 활성을 나타내었고, ED50는 0.59 ㎍/mouse로 평가되었다.

(10) 전신 감염 모델에 대한 효과 4

호중성 백혈구 감소증 마우스를 다음과 같이 준비하였다. 시클로포스파미드 (Sigma-Aldrich)를 복막주입하였다 각각 6-주령 BALB/c 수컷 마우스 (Charles river laboratories Japan, inc., n=6)에 125 mg/kg으로, 주입하는 날을 제0일로 하여, -5, -2 및 0일에 총 3회 주입하였다. 그것에 의해 말초혈액에서의 호중성이 감소하였다. 마우스에, ATCC BAA-47 균주 (혈청형 B/05)를 2.425×10⁴cfu/mouse (대략 8.1 LD50)를 복막내 접종하여, 전신 감염을 유도하였다. 그 직후, 샘플을 200 ㎕/mouse로 꼬리 정맥을 통해 투여하고, 감염에 대한 보호 활성을 접종 후 7일에 생존을 기준으로 평가하였다. 그 결과, 면역글로불린 제제, 베닐론, (TEIJIN PHARMA LIMITED)를 40, 200, 1000 및 5000 ㎍/mouse로 투여한 대조군의, 감염 후 제7일의 생존률은 각각 33.3, 83.3, 66.7 및 83.3%였고, ED50는 62.95 ㎍/mouse으로 평가되었다. 항-PcrV 항체 M166을 0.32, 1.6, 8.0 및 40 ㎍/mouse로 투여한 군의 감염 후 제7일의 생존률은 각각, 0, 0, 0 및 33.3%였고, ED50는 >40 ㎍/mouse 였다. 대조로, 항-혈청형 B LPS 항체 3099를 0.064, 0.32, 1.6, 8.0, 40 및 100 ㎍/mouse로 투여한 군의, 감염 후 제7일의 생존률은 각각 16.7, 66.7, 83.3, 83.3, 100 및 50%로, 감염에 대한 강한 보호 활성을 나타내었고, ED50는 0.27 ㎍/mouse로 평가되었다.

실시예 3. 항-혈청형 B LPS 항체 3099 및 반응성이 광범위한 항- LPS 항체 2459의 조합

- 옵소닌 활성 -

혈청형 B/O2 녹농균 균주 ATCC 33349를 LB 매질에서 밤새 배양하였다. 세균 배양물을 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 플루오레스신-4-이소티오시아네이트 (FITC) 1mM 용액 중에 실온에서 1시간 동안 현탁시켜 라벨링을 수행하였다. Mono-Poly 분해 매질 (DS Pharma Biomedical Co. Ltd.)을 사용한 밀도 구배 원심분리법에 의해, 인간 다핵형 백혈구 (이하, PMN라 함)을 건강한 공여자로부터 시트르산을 사용하여 수집한 혈액 50 ml로부터 정제하였고, 농도가 5×10⁶cells/ml이 되도록 제조하였다. 항-혈청형 B LPS 항체 3099, 광의로 반응성인 항-LPS 항체 2459 (녹농균의 당지질의 A-밴드 LPS를 인식하고, 그리고 적어도 혈청형 A, B, C, D, E, G, H, I, M, N, O18 및 O19의 표면에는 실질적으로 결합하는 항체; SEQ ID NOs 17 내지 19에 기재된 경사슬 CDRs 1 내지 3의 아미노산 서열, SEQ ID NOs 20 내지 22에 기재된 중사슬 CDRs 1 내지 3의 아미노산 서열, SEQ ID NO 23에 기재된 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열; SEQ ID NO 24에 기재된 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열; SEQ ID NO 29에 기재된 경사슬 가변 영역의 염기 서열;SEQ ID NO 30에 기재된 중사슬 가변 영역의 염기 서열;) 및 FITC-라벨된 녹농균 균주와 그들의 혼합물의 샘플 (30 ㎕, 5×10⁶) 각각의 20 ㎕를 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 첨가하고 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 그리고 나서, 보체로서, 새끼 토끼 혈청 (10 ㎕)과 PMN (40 ㎕, 2×10⁵ 세포)을 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 더욱 배양하여 식균작용을 수행하였다. 플레이트를 얼음 위로 옮기고, 그것에 의해 반응을 중지시켰다. 세포 표면에 부착된 세균의 형광발광을 0.2% 트립신 블루(100 ㎕)를 함유하는 PBS로 끄고(quenched), 그리고 나서 세포를 0.5% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 유세포 분석기(BECKMAN COULTER)를 사용하여, 세포의 형광 (평균 형광 강도, 이하 MFI로 약칭함)을 측정하였다. 옵소닌 활성을 FITC-라벨 녹농균 균주를 병합하는 PMN의 형광 강도로부터 PMN의 고유 형광에 의한 형광 강도를 빼서 얻은 값으로 산출하였다.

그 결과, 항체가 첨가되지 않은 군의 MFI 값은 0.63이었고, 항-혈청형 B LPS 항체 3099가 0.12 및 1.11 ㎍/ml로 첨가된 군의 MFI 값은 각각 1.07 및 15.46이었다. 반응성이 광범위한 항-LPS 항체 2459가 0.12 및 1.11 ㎍/ml로 첨가된 군의 MFI 값은 각각 5.76 및 29.16였다. 한편, 항-혈청형 B LPS 항체 3099및 반응성이 광범위한 항-LPS 항체 2459의 동량 혼합에 의해 얻어진 샘플이 0.25 및 2.22 ㎍/ml로 첨가된 군의 MFI 값은 각각 34.66 및 65.06이었다 대조로서 사용되는, 면역 글로불린 제제, 베닐론 (TEIJIN PHARMA LIMITED)의 MFI 값은 1000 ㎍/ml에서 3.93이었다.

상기 결과는 항-혈청형 B LPS 항체 3099와 반응성이 넓은 항-LPS 항체 2459의 조합에 의해 첨가 또는 시너지 효과를 가질 수 있다는 것을 나타낸다.

산업상 이용가능성

본 발명의 항체는 녹농균에 대해 우수한 항균 활성을 갖고, 따라서 녹농균 감염의 치료 및 예방에 사용될 수 있다. 본 발명의 항체들은 임상적으로 단리된 균주의 넓은 범위에 대해 강한 항균 활성을 나타내는 다중클론성 제제를 형성하도록 결합될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체는 인간 항체이고, 따라서 매우 안정하다. 따라서, 본 발명의 항체는 의료에 매우 유용하다. 또한, 본 발명의 단일클론성 항체는 녹농균 감염의 진단, 다양한 혈청형의 녹농균 균주의 검출 또는 스크리닝에 사용될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> MEIJI SEIKA KAISHA, LTD. Symphogen A/S <120> ANTIBODY AGAINST SEROTYPE B LIPOPOLYSACCHARIDE OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA <130> M0907 <150> JP2010/033429 <151> 2010-02-18 <160> 52 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(6) <223> CDR1 of Light Chain(3099) <400> 1 Gln Gly Ile Thr Thr Tyr 1 5 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(3) <223> CDR2 of Light Chain(3099) <400> 2 Gly Ala Ser 1 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(9) <223> CDR3 of Light Chain(3099) <400> 3 Gln Gln Leu Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(10) <223> CDR1 of Heavy Chain(3099) <400> 4 Gly Asp Ser Ile Asn Thr Glu Gly Tyr Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(7) <223> CDR2 of Heavy Chain(3099) <400> 5 Ile Tyr Lys Gly Gly Asn Ile 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(6) <223> CDR3 of Heavy Chain(3099) <400> 6 Ala Arg Ile Pro Gly Pro 1 5 <210> 7 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(106) <223> Variable Region of Light Chain(3099) <400> ? 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Arg Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ile Pro Gly Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(12) <223> CDR1 of Light Chain(2745) <400> 9 Gln Ser Val Phe Val Gly Pro Asn Asn Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(3) <223> CDR2 of Light Chain(2745) <400> 10 Trp Ser Ser 1 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(11) <223> CDR3 of Light Chain(2745) <400> 11 Gln Gln Cys Tyr Gly Ser Pro Pro Met His Thr 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(10) <223> CDR1 of Heavy Chain(2745) <400> 12 Gly Ala Ser Ile Ser Ser Ser Gly Tyr Cys 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(7) <223> CDR2 of Heavy Chain(2745) <400> 13 Ile Cys Tyr Ser Ala Asn Ala 1 5 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(12) <223> CDR3 of Heavy Chain(2745) <400> 14 Ala Arg Ser Arg Ser Met Ser Phe Pro Gly Asp Asp 1 5 10 <210> 15 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(115) <223> Variable Region of Light Chain(2745) <400> 15 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Val Gly 20 25 30 Pro Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ser Ser Ala Arg Glu Ala Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Cys Tyr Gly Ser Pro Pro Met His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu 100 105 110 Glu Ile Arg 115 <210> 16 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(120) <223> Variable Region of Heavy Chain(2745) <400> 16 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 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Ile Pro 85 90 95 Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 <210> 24 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1)..(124) <223> Variable Region of Heavy Chain(2459) <400> 24 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Thr Ser Gly Phe Ser Phe Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Gly Asp Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Lys Ser Val 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Pro Ala Gln His Asn Thr Ile Trp Tyr Gly Pro Asp Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 25 <211> 318 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> V_region <222> (1)..(318) <223> Variable Region of Light Chain(3099) <400> 25 gacatccagc tgacccagag ccccagcttt ctgagcgcca gcgtgggcga tagagtgacc 60 gtgacctgca gagccagcca gggcatcacc acctacctgg cctggtatca ccagaagccc 120 ggcgaggccc ccaagctgct gatctacggc gccagctctc tgcagggagg cgtgcctagc 180 agattcagcg gcagcggctc cggcaccgag ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag ctgtactcct acccctggac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggaagtg 318 <210> 26 <211> 335 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> V_region <222> (1)..(342) <223> Variable Region of Heavy Chain(3099) <400> 26 caggtgcagc tgcaggaatc tggccctggc ctggtcaagc ccagcgagac actgagcctg 60 acctgcaccg tgtccggcga cagcatcaac accgagggct actactggtc ctggatcaga 120 cagccagccg gcagaggcct ggaatggatc ggccggatct acaagggcgg caacatcatc 180 tacaacccca gcctgaagtc cagagtgaca atcgccctgg acaccagcaa gagccagttc 240 agcctgcggc tgacaagcgt gacagccgcc gacaccgccg tgtactactg cgccagaatc 300 ccaggccctt ggggacaggg cacactggtc acagtctcgagt 342 <210> 27 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> V_region <222> (1)..(345) <223> Variable Region of Light Chain(2745) <400> 27 gacatcgtga tgacccagag ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga gcgggccacc 60 atcaactgca agagcagcca gagcgtgttc gtgggcccca acaacaagaa ctacctggcc 120 tggtatcaga agaagcccgg ccagcccccc aagctgctga tctactggtc cagcgccagg 180 gaagctggcg tgcccgaccg gtttagcggc agcggctccg gcaccgactt caccctgacc 240 atcagcagcg tgcaggccga ggacgtggcc gtgtactact gccagcagtg ctacggcagc 300 ccccccatgc acaccttcgg ccagggcacc cggctggaaa tccgg 345 <210> 28 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> V_region <222> (1)..(360) <223> Variable Region of Heavy Chain(2745) <400> 28 caggtgcagc tgcaggaaag cggccctggc ctggtgaagc ccagccagac cctgagcctg 60 acctgcaccg tgtccggcgc cagcatcagc agcagcggct actgctgggg ctgggtgcgc 120 cagcctcccg gcaagggcct ggaatggatc ggctacatct gctacagcgc caacgcctac 180 tacaacccca gcctgaagag cagagtgacc atcagcgtgg gcaccagcgg ccagcacttc 240 agcctgaagc tgtccagcgt gacagccgcc gacaccgccg tgtactactg cgcccggtcc 300 agaagcatga gcttccccgg cgacgactgg ggccagggca ccctggtgac cgtctcgagt 360 <210> 29 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> V_region <222> (1)..(321) <223> Variable Region of Light Chain(2459) <400> 29 gagatcgtgc tgacccagag ccccggcacc ctgagcctga gccctggcga gcgggccacc 60 ctgagctgtg gcgccagcca gagcgtgggc ttcaactacc tggcctggta tcagcagaag 120 cccggccagg cccccaggct gctgatctac ggcgccagca accgggccac cgacatcccc 180 gaccggttca gcggcagcgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatcag ccggctggaa 240 cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagtacggca acatcccccg gaccttcggc 300 cagggcacca aggtggagat c 321 <210> 30 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> V_region <222> (1)..(372) <223> Variable Region of Heavy Chain(2459) <400> 30 caggtgcagc tggtcgagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60 agctgcagca ccagcggctt cagcttcagc acctctggca tgcactgggt gcgccaggcc 120 cctggcaagg gactggaata cgtggccgcc atcaccggcg acggcgccaa cacctactac 180 gccaagagcg tgaccggcag gttcaccgtg tccagggaca acagcaagac caccctgtac 240 ctgcagatga gcagcctgcg gaccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggcccca 300 gcccagcaca acaccatttg gtacggcccc gacgactact ggggacaggg caccctggtg 360 accgtctcgagt 372 <210> 31 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 31 atatatatgc ggccgcttat taacactctc ccctgttg 38 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 32 gacsgatggg cccttggtgg 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 33 gagtggctcc tgggggaaga 20 <210> 34 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 34 tattcccatg gcgcgcccag rtgcagctgg tgcart 36 <210> 35 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 35 tattcccatg gcgcgccsag gtccagctgg trcagt 36 <210> 36 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 36 tattcccatg gcgcgcccag rtcaccttga aggagt 36 <210> 37 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 37 tattcccatg gcgcgccsag gtgcagctgg tggag 35 <210> 38 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 38 tattcccatg gcgcgcccag gtgcagctac agcagt 36 <210> 39 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 39 tattcccatg gcgcgcccag stgcagctgc aggagt 36 <210> 40 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 40 tattcccatg gcgcgccgar gtgcagctgg tgcagt 36 <210> 41 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 41 tattcccatg gcgcgcccag gtacagctgc agcagtc 37 <210> 42 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 42 ggcgcgccat gggaatagct agccgacatc cagwtgaccc agtct 45 <210> 43 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 43 ggcgcgccat gggaatagct agccgatgtt gtgatgactc agtct 45 <210> 44 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 44 ggcgcgccat gggaatagct agccgaaatt gtgwtgacrc agtct 45 <210> 45 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 45 ggcgcgccat gggaatagct agccgatatt gtgatgaccc acact 45 <210> 46 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 46 ggcgcgccat gggaatagct agccgaaacg acactcacgc agt 43 <210> 47 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 47 ggcgcgccat gggaatagct agccgaaatt gtgctgactc agtct 45 <210> 48 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 48 accgcctcca ccggcggccg cttattaaca ctctcccctg ttgaagctct t 51 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 49 ggaggcgctc gagacggtga ccagggtgcc 30 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 50 ggaggcgctc gagacggtga ccattgtccc 30 <210> 51 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 51 ggaggcgctc gagacggtga ccagggttcc 30 <210> 52 <211> <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 52 ggaggcgctc gagacggtga ccgtggtccc 30

Claims

녹농균의 지질다당류의 B-밴드 LPS를 인식하고, 그리고 혈청형 B의 녹농균 균주의 표면에 실질적으로 결합하지만, 혈청형 A, C, D, E, F, G, H, I 및 M의 녹농균 군주 중 어느 것의 표면에도 실질적으로 결합하지 않는 항체.
제1항에 있어서, 혈청형 B의 녹농균 균주에 대해 옵소닌 활성을 갖는 항체.
제2항에 있어서, ATCC 33349로 동정된 녹농균 균주에 대한 옵소닌 활성의 EC50가 5 ㎍/ml 이하인 항체.
제2항에 있어서, ATCC 27578 및 ATCC BAA-47 중 어느 하나로 동정된 녹농균 균주에 대한 옵소닌 활성의 EC50가 1 ㎍/ml 이하인 항체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 B의 녹농균 균주에 대한 응집활성을 갖는 항체.
제5항에 있어서, ATCC BAA-47로 동정된 녹농균 균주에 대한 IgG의 단위량(㎍)에 대한 응집 역가가 1000 이상인 항체.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청형 B의 녹농균 균주에 의한 전신 감염에 대한 항균 효과를 갖는 항체.
제7항에 있어서, ATCC 27578로 동정된 녹농균 균주으로의 전신 감염의 호중성 백혈구 감소 마우스 모델에서의 항균 효과의 ED50가 베닐론(Venilon)의 값의 1/300 보다 크지 않은 것인 항체.
제7항에 있어서, ATCC BAA-47로 동정된 녹농균 균주으로의 전신 감염의 호중성 백혈구 감소 마우스 모델에서의 항균 효과의 ED50가 베닐론의 값의 1/100 보다 크지 않은 것인 항체.
하기 특성 (a) 및 (b) 중 어느 하나를 갖는 항체:
(a) SEQ ID NOs: 1 내지 3에 기재된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NOs: 1 내지 3에 기재된 아미노산 서열 중 최소한 하나에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함하는 경사슬 가변영역, 및
SEQ ID NOs: 4 내지 6에 기재된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NOs: 4 내지 6에 기재된 아미노산 서열 중 최소한 하나에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함하는 중사슬 가변영역을 포함; 그리고
(b) SEQ ID NOs: 9 내지 11에 기재된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NOs: 9 내지 11에 기재된 아미노산 서열 중 최소한 하나에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함하는 경사슬 가변영역, 및
SEQ ID NOs: 12 내지 14에 기재된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NOs: 12 내지 14에 기재된 아미노산 서열 중 최소한 하나에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함하는 중사슬 가변영역을 포함.
하기 특성 (a) 및 (b) 중 어느 하나를 갖는 항체:
(a) SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함하는 경사슬 가변영역, 및
SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함하는 중사슬 가변영역을 포함; 그리고
(b) SEQ ID NO: 15에 기재된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 15에 기재된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함하는 경사슬 가변영역, 및
SEQ ID NO: 16에 기재된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 16에 기재된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함하는 중사슬 가변영역을 포함.
항체의 경사슬 또는 경사슬 가변영역을 포함하는 펩티드로, 하기 특성 (a) 및 (b) 중 어느 하나를 갖는 펩티드:
(a) SEQ ID NOs: 1 내지 3에 기재된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NOs: 1 내지 3에 기재된 아미노산 서열 중 최소한 하나에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함; 그리고
(b) SEQ ID NOs: 9 내지 11에 기재된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NOs: 9 내지 11에 기재된 아미노산 서열 중 최소한 하나에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함.
항체의 경사슬 또는 경사슬 가변영역을 포함하는 펩티드로, 하기 특성 (a) 및 (b) 중 어느 하나를 갖는 펩티드:
(a) SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함; 그리고
(b) SEQ ID NO: 15에 기재된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 15에 기재된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함.
항체의 중사슬 또는 중사슬 가변영역을 포함하는 펩티드로, 하기 특성 (a) 및 (b) 중 어느 하나를 갖는 펩티드:
(a) SEQ ID NOs: 4 내지 6에 기재된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NOs: 4 내지 6에 기재된 아미노산 서열 중 최소한 하나에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함; 그리고
(b) SEQ ID NOs: 12 내지 14에 기재된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NOs: 12 내지 14에 기재된 아미노산 서열 중 최소한 하나에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함.
항체의 중사슬 또는 중사슬 가변영역을 포함하는 펩티드로, 하기 특성 (a) 및 (b) 중 어느 하나를 갖는 펩티드:
(a) SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함; 그리고
(b) SEQ ID NO: 16에 기재된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 16에 기재된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입된 서열을 포함.
혈청형 B의 녹농균 균주의 지질다당류의 B-밴드 중에서, 하기 (a) 및 (b) 중 어느 하나에 기재된 항체의 에피토프에 결합하는 항체 :
(a) SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변영역과 SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변영역을 포함하는 항체; 그리고
(b) SEQ ID NO: 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변영역과 SEQ ID NO: 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변영역을 포함하는 항체.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 펩티드를 암호화하는 DNA.
제1항 내지 제11항 및 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체를 생산하는 하이브리도마.
녹농균과 관련된 질병을 위한 약제학적 조성물로, 상기 약제학적 조성물은:
제1항 내지 제11항 및 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체; 및, 임의로
하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제19항에 있어서, 녹농균과 관련된 질병이 녹농균 감염에 의한 전신성 감염증인 약제학적 조성물.
제19항에 있어서, 녹농균과 관련된 질병이 녹농균 감염에 의한 폐 감염성 질환인 것인 약제학적 조성물.
녹농균의 검출을 위한 진단 시약으로, 제1항, 제10항, 제11항 및 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 것인 진단 시약.
녹농균의 검출을 위한 키트로, 제1항, 제10항, 제11항 및 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 것인 키트.