CN102858976A

CN102858976A - 铜绿假单胞菌b血清型脂多糖的抗体

Info

Publication number: CN102858976A
Application number: CN2011800102508A
Authority: CN
Inventors: 田中二朗; P·S·安德森; 奥富隆文; 稻叶常良; 大冢圭子; 赤羽宏友; 星名由佳利; 长曽宏; 熊谷正志
Original assignee: Symphogen AS; Meiji Seika Pharma Co Ltd
Current assignee: Symphogen AS; Meiji Seika Kaisha Ltd; Meiji Seika Pharma Co Ltd
Priority date: 2010-02-18
Filing date: 2011-02-18
Publication date: 2013-01-02
Also published as: EP2536759A1; JP2013521758A; EP2536835A4; WO2011102552A1; KR20120128687A; JP2013520161A; US20130004500A1; CA2790290A1; US20130004499A1; EP2536833A1; JP2013520159A; US20130045207A1; US20130022604A1; EP2536835A1; KR20120128688A; CA2790232A1; EP2536759A4; EP2536834A4; WO2011102553A1; KR20130048199A

Abstract

本发明提供对铜绿假单胞菌具有优异抗菌活性的新型抗体。通过使用从具有慢性铜绿假单胞菌肺部感染的囊性纤维化患者得到的成浆细胞作为初始材料，成功得到与B血清型铜绿假单胞菌株的LPS结合且在体内和体外具有优异抗菌活性的抗体。

Description

铜绿假单胞菌B血清型脂多糖的抗体

技术领域

本发明涉及铜绿假单胞菌B血清型脂多糖的抗体及其应用。更具体地，本发明涉及特异性结合铜绿假单胞菌株B血清型脂多糖的抗体，以及含有任何该抗体的药物组合物、铜绿假单胞菌感染诊断剂和铜绿假单胞菌检测试剂盒。

背景技术

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是广泛且主要分布于自然环境如土壤和水中的革兰氏阴性需氧杆菌。铜绿假单胞菌是通常不引起健康受试者致病的非致病细菌（avirulent bacterium），所述健康受试者对铜绿假单胞菌具有中度的抗体效价以及足够的免疫功能。然而，一旦体弱患者感染铜绿假单胞菌，铜绿假单胞菌可引起严重症状，其可导致所述患者死亡。为此，铜绿假单胞菌作为医院感染和机会感染的主要病原菌引人瞩目，因此预防和治疗铜绿假单胞菌感染已经是医学领域的重要问题。

为预防或治疗铜绿假单胞菌感染，已经主要使用抗生素或合成抗菌剂。然而，铜绿假单胞菌产生了对这些药物的抗药性，因此这种药物在许多情况下无法提供足够的治疗作用。特别地，使用抗生素等治疗耐多药铜绿假单胞菌（MDRP）的感染很难且有限制。为此，作为替代方法，已经开始进行使用免疫球蛋白制剂的治疗。

同时，已经检验了使用铜绿假单胞菌的抗体预防或治疗铜绿假单胞菌感染。例如，已经开发了各自与特定血清型铜绿假单胞菌株特异性结合的抗体（专利文献1-5，以及非专利文献1和2）。然而，到目前为止开发的铜绿假单胞菌的抗体在铜绿假单胞菌感染的预防或治疗中尚无法提供足够的作用。

引用列表

专利文献

专利文献1日本未审查专利申请公开号平6-178688

专利文献2日本未审查专利申请公开号平6-178689

专利文献3日本未审查专利申请公开号平7-327677

专利文献4国际公开号WO2004/101622

专利文献5国际公开号WO2006/084758

非专利文献

非专利文献1The Journal of Infectious Diseases,152,6,1985,1290-1299.

非专利文献2Journal of General Microbiology,133,1987,3581-3590.

发明内容

技术问题

鉴于上述情况作出本发明，且本发明的一个目标是提供对铜绿假单胞菌具有优异抗菌活性的新型抗体。本发明的一个主要目标是提供与铜绿假单胞菌株B血清型脂多糖特异性结合的抗体。

技术方案

为实现上述目标，本发明采用以下方法。首先，从慢性铜绿假单胞菌肺部感染的囊性纤维化患者和健康志愿者采集血液样本。借助如下手段鉴定具有高比例的对脂多糖（下文中有时简称为“LPS”）特异的成浆细胞的供体样本：（1）测定血液循环中成浆细胞和浆细胞的量的FACS分析；（2）测定血液循环中细胞量的ELISPOT分析，所述细胞制造对特定LPS抗原特异的抗体；和（3）测定存在或不存在对特定LPS抗原特异的免疫球蛋白的ELISA分析。下一步，由所述鉴定的供体样本制备识别LPS的抗体。

具体地，通过对CD19、CD38、λ-轻链和死细胞染色选择存活成浆细胞。在选出的成浆细胞上，通过包括多重重叠延伸RT-PCR和后续巢式PCR的两步PCR从相同B细胞获得编码重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的成对DNA序列（图1）。下一步，将扩增的DNA插入筛选载体，并随后转化到大肠杆菌（Escherichia coli）中。从所述大肠杆菌纯化扩增载体的集合。将得到的抗体库在动物培养细胞中表达。通过ELISA筛选编码结合至纯化的LPS分子的抗体的克隆，并选出LPS特异的克隆。随后，测定所选出克隆的碱基序列。随后，对由这样得到的克隆所编码的抗体检测其各种活性、其血清型特异性和抗原表位。

作为结果，发现所确定的抗体与铜绿假单胞菌B血清型LPS结合，并在体外和体内具有优异抗菌活性。

具体地，本发明涉及与铜绿假单胞菌B血清型LPS结合的抗体，其表现出优异的抗菌活性。本发明也涉及该抗体的用途。更具体地，本发明提供

[1]识别铜绿假单胞菌脂多糖的B带LPS的抗体，其与B血清型铜绿假单胞菌株的表面充分结合，但不与A、C、D、E、F、G、H、I和M血清型铜绿假单胞菌株的表面的任一种充分结合。

[2]根据第1条所述的抗体，其具有对B血清型铜绿假单胞菌株的调理素活性。

[3]根据第2条所述的抗体，其中对ATCC 33349标识的铜绿假单胞菌株的调理素活性的EC50为5μg/ml或更少。

[4]根据第2条所述的抗体，其中对ATCC 27578和ATCC BAA-47中的任一个标识的铜绿假单胞菌株的调理素活性的EC50为1μg/ml或更少。

[5]根据第1至4条的任一条所述的抗体，其具有对B血清型铜绿假单胞菌株的凝集活性。

[6]根据第5条所述的抗体，其中对ATCC BAA-47标识的铜绿假单胞菌株的单位量（μg）IgG的凝集效价为1000或更大。

[7]根据第1至6条的任一条所述的抗体，其对B血清型铜绿假单胞菌株的全身性感染具有抗菌作用。

[8]根据第7条所述的抗体，其中对全身性感染ATCC 27578标识的铜绿假单胞菌株的中性白细胞减少症小鼠模型的抗菌作用的ED50不大于青霉酮(Venilon)的1/300。

[9]根据第7条所述的抗体，其中对全身性感染ATCC BAA-47标识的铜绿假单胞菌株的中性白细胞减少症小鼠模型的抗菌作用的ED50不大于青霉酮(Venilon)的1/100。

[10]具有下列（a）和（b）特征任一个的抗体：

（a）包括

包括记载于SEQ ID NO:1至3的氨基酸序列或包括记载于SEQ IDNo:1至3的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的轻链可变区，和

包括记载于SEQ ID NO:4至6的氨基酸序列或包括记载于SEQ IDNO:4至6的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的重链可变区；

（b）包括

包括记载于SEQ ID NO:9至11的氨基酸序列或包括记载于SEQID NO:9至11的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的轻链可变区，和

包括记载于SEQ ID NO:12至14的氨基酸序列或包括记载于SEQID NO:12至14的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的重链可变区。

[11]具有下列（a）和（b）特征任一个的抗体：

（a）包括

包括记载于SEQ ID NO:7的氨基酸序列或包括记载于SEQ ID NO:7的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的轻链可变区，和

包括记载于SEQ ID NO:8的氨基酸序列或包括记载于SEQ ID NO:8的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的重链可变区；以及

（b）包括

包括记载于SEQ ID NO:15的氨基酸序列或包括记载于SEQ IDNO:15的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的轻链可变区，和

包括记载于SEQ ID NO:16的氨基酸序列或包括记载于SEQ IDNO:16的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入的重链可变区。

[12]含有抗体的轻链或轻链可变区的肽，该肽具有下列（a）和（b）特征任一个：

（a）包括记载于SEQ ID NO:1至3的氨基酸序列或包括记载于SEQ ID NO:1至3的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入；和

（b）包括记载于SEQ ID NO:9至11的氨基酸序列或包括记载于SEQ ID NO:9至11的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入。

[13]含有抗体的轻链或轻链可变区的肽，该肽具有下列（a）和（b）特征任一个：

（a）记载于SEQ ID NO:7的氨基酸序列或记载于SEQ ID NO:7的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入；和

（b）记载于SEQ ID NO:15的氨基酸序列或记载于SEQ ID NO:15的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入。

[14]含有抗体的重链或重链可变区的肽，该肽具有下列（a）和（b）特征任一个：

（a）包括记载于SEQ ID NO:4至6的氨基酸序列或包括记载于SEQ ID NO:4至6的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入；和

（b）包括记载于SEQ ID NO:12至14的氨基酸序列或包括记载于SEQ ID NO:12至14的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入。

[15]含有抗体的重链或重链可变区的肽，该肽具有下列（a）和（b）特征任一个：

（a）包括记载于SEQ ID NO:8的氨基酸序列或包括记载于SEQ IDNO:8的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入；和

（b）包括记载于SEQ ID NO:16的氨基酸序列或包括记载于SEQID NO:16的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、删除、添加和/或插入。

[16]在下列（a）和（b）任一项所述的抗体中，与血清型B的铜绿假单胞菌株的脂多糖B带LPS中的表位结合的抗体：

（a）含有包括记载于SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区和包括记载于SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区的抗体；和

（b）含有包括记载于SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区和包括记载于SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区的抗体。

[17]编码根据第1至16条任一条所述的抗体或肽的DNA。

[18]产生根据第1至11条和第16条的任一条所述的抗体的杂交瘤细胞。

[19]用于铜绿假单胞菌相关疾病的药物组合物，该药物组合物包括：

根据第1至11条和第16条的任一条所述的抗体；和任选地

至少一种可药用载体和/或稀释剂。

[20]根据第19条所述的药物组合物，其中铜绿假单胞菌相关疾病是由铜绿假单胞菌感染引发的全身性感染性疾病。

[21]根据第19条所述的药物组合物，其中铜绿假单胞菌相关疾病是由铜绿假单胞菌感染引发的肺部感染性疾病。

[22]用于检测铜绿假单胞菌的诊断剂，该诊断剂包括：根据第1、10、11和16条的任一条所述的抗体。

[23]用于检测铜绿假单胞菌的试剂盒，该试剂盒包括：根据第1、10、11和16条的任一条所述的抗体。

有益效果

本发明提供与铜绿假单胞菌B血清型LPS结合并表现出优异抗菌活性的抗体。本发明的抗体对铜绿假单胞菌的全身性感染表现出优异的调理素作用和优异的抗菌作用。此外，由于本发明的抗体源自慢性铜绿假单胞菌肺部感染的囊性纤维化患者，可以期待对临床铜绿假单胞菌株的优异作用。本发明的抗体可制备为人类抗体，并因此是高度安全的。使用本发明的抗体使其可有效治疗或预防由铜绿假单胞菌，包括耐多药铜绿假单胞菌引发的感染，如HAP/VAP、菌血症、败血症和烧伤创面感染。

附图说明

[图1]图1是示出了进行两步PCR得到编码本发明抗体的DNA的图。

[图2]图2是示出了用于使编码重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的序列配对的OO-VP-002载体的图，所述序列源于相同B细胞。

具体实施方式

本发明提供与铜绿假单胞菌B血清型LPS结合的新型抗体。本发明的“抗体”包括免疫球蛋白的所有类别和所有子类。所述“抗体”包括多克隆抗体和单克隆抗体，也包括抗体功能片段的形式。“多克隆抗体”指的是包括针对不同表位的不同种类抗体的抗体制剂。同时，“单克隆抗体”是指由基本上同质的抗体群体得到的抗体（包括抗体片段）。相比于多克隆抗体，单克隆抗体识别抗原上的单一决定子。本发明的多克隆抗体也包括能识别抗原上多个表位的多种单克隆抗体的结合物。本发明的抗体是已分离的抗体，即从自然环境中的组分分离和/或回收的抗体。

本发明的抗体结合的“脂多糖（LPS）”是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的组分，是由脂质和多糖形成的物质（糖脂）。其糖链由被称为核心多糖（或核心寡糖）的部分和被称为O抗原（O侧链多糖）的部分形成。“A带LPS”是其形成O抗原的多糖具有下述结构的LPS。具体地，在该结构中，各自由“3)-α-D-Rha-(1→2)-α-D-Rha-(1→3)-α-D-Rha-(1”组成的单元重复出现。在这些单元中，D-鼠李糖由α-1,2和α-1,3键连接。其结构式在下面给出；然而，由α-1,2键连接的D-鼠李糖和由α-1,3键连接的D-鼠李糖的支链模式不限于下图所示。

[化学式1]

同时，“B带LPS”是血清型特异性LPS，其具有下述结构：各自由形成O抗体的多糖中2至5个糖的键组成的单元重复出现。如将在下面示出的，铜绿假单胞菌株的B带LPS中的重复单元的结构互不相同，取决于它们的血清型（参考Microbiol.Mol.Biol.Rev.63523-553(1999)）。

[化学式2]

血清型O2

血清型O5

血清型O16

血清型O18

血清型O20

血清型O6

血清型O10

血清型O11

→3)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-D-FucNAc-(l→2）-β-D-Glc-(1→

血清型O15

→4)-α-D-GalpNAc-(l→2)-β-D-Ribf-(l→

血清型O17

→4)-β-D-ManNAc-(l→4)-α-L-Rha-(1→

本发明中“血清型”是指铜绿假单胞菌任何已知的血清型。表1给出根据日本铜绿假单胞菌协会发起的血清型委员会的分类与根据IATS（国际抗原分型系统,International Antigenic Typing System）的类型的对应，两者目前均用于不同血清型的铜绿假单胞菌株。铜绿假单胞菌株的血清型可通过使用市售的用于铜绿假单胞菌分类的免疫血清测定。

[表1]

JPAS：日本铜绿假单胞菌协会

IATS：国际抗原分型系统

参考文件：Microbiology 17273-304(1990)

在本发明鉴定的抗体中，抗体“3099”和抗体“2745”对B血清型铜绿假单胞菌株表现出优异的特异性。因此，本发明抗体的另一实施方案是特异性结合B血清型铜绿假单胞菌株脂多糖的抗体（下文中，称为“抗-B血清型LPS抗体”）。本发明的抗-B血清型LPS抗体优选地是识别铜绿假单胞菌脂多糖，并且与B血清型铜绿假单胞菌株表面充分结合，但与A、C、D、E、F、G、I和M血清型铜绿假单胞菌株中的任一种的表面不充分结合的抗体。对于本发明的抗-B血清型LPS抗体，短语“充分结合”意味着，例如，当通过本发明应用的实施例中记载的全细胞ELISA方法检测时，吸收率——其表示结合能力——为0.25或更大。同时，短语“不充分结合”意味着，例如，当通过本发明应用的实施例中记载的全细胞ELISA方法检测时，吸收率——其表示结合能力——小于0.25。

A血清型铜绿假单胞菌株的实例包括ATCC登录号为27577和33350的那些。B血清型铜绿假单胞菌株的实例包括ATCC登录号为27578、33349、BAA-47、33352、33363和43732的那些。C血清型铜绿假单胞菌株实例包括ATCC登录号为33353、27317和33355的那些。D血清型铜绿假单胞菌株实例包括ATCC登录号为27580和33356的那些。E血清型铜绿假单胞菌株实例包括ATCC登录号为29260和33358的那些。F血清型铜绿假单胞菌株实例包括ATCC登录号为27582和33351的那些。G血清型铜绿假单胞菌株实例包括ATCC登录号为27584和33354的那些。H血清型铜绿假单胞菌株实例包括ATCC登录号为27316和33357的那些。I血清型铜绿假单胞菌株实例包括ATCC登录号为27586和33348的那些。J血清型铜绿假单胞菌株的一个实例是ATCC登录号为33362的一个。K血清型铜绿假单胞菌株实例包括ATCC登录号为33360和33361的那些。L血清型铜绿假单胞菌株的一个实例是ATCC登录号为33359的一个。M血清型铜绿假单胞菌株的一个实例是ATCC登录号为21636的一个。N血清型铜绿假单胞菌株的一个实例是ATCC登录号为33364的一个。其他血清型（O18型和O19型）铜绿假单胞菌株的实例包括ATCC登录号为43390和43731的那些。

B血清型铜绿假单胞菌株的实例包括MEIJI SEIKA KAISHA,LTD的B/O5血清型耐多药铜绿假单胞菌株（MDRP）（MSC 17650,MSC 17663等）。注意本发明中耐多药定义为根据CLSI断点对至少三种以下制剂具有耐药性：亚胺培南（imipenem，≥16μg/ml）、头孢他啶（ceftazidime，≥32μg/ml）、妥布拉霉素（tobramycin，≥16μg/ml）、环丙沙星（ciprofloxacin，≥4μg/ml）。（参考文献：NationalSurveillance of Antimicrobial Resistance in Pseudomonas aeruginosaIsolates Obtained from Intensive Care Unit Patients from 1993 to 2002，Marilee D.Obritsch,Douglas N.Fish,Robert MacLaren,和Rose Jung,ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY,48.12.2004,4606–4610）。

本发明的抗-B血清型LPS抗体优选地是在上文作为实例所示由ATCC登录号确定的铜绿假单胞菌株中，仅与B血清型铜绿假单胞菌充分结合，但与任何一种其他血清型铜绿假单胞菌不充分结合的抗体。此外，本发明的抗-B血清型LPS抗体优选是与MEIJI SEIKA KAISHA,LTD的B/O5血清型的MDRP充分结合的抗体。更优选地，本发明的抗-B血清型LPS抗体是，在上文作为实例所示由ATCC登录号确定的铜绿假单胞菌株中，与所有B血清型和O18型铜绿假单胞菌株充分结合，但与任何一种其他血清型铜绿假单胞菌不充分结合的抗体。

根据优选实施方案，本发明的抗-B血清型LPS抗体具有对铜绿假单胞菌的调理素活性。本发明的抗-B血清型LPS抗体可具有对B血清型铜绿假单胞菌株的调理素活性，作为对B血清型铜绿假单胞菌株结合活性的反映。特别地，本发明的抗体“3099”和抗体“2745”均表现出对B血清型铜绿假单胞菌株的高调理素活性。特别显著地，当如本发明应用的实施例中所述，通过使用B血清型铜绿假单胞菌株（ATCC33349）并采用使用包涵FITC-标记的铜绿假单胞菌的人多形核白细胞的荧光强度作为指标的检测方法评估本发明的抗体“3099”的调理素活性时，抗体“3099”的EC50为3.13μg/ml。本发明的抗-B血清型LPS抗体优选具有这种优异的调理素活性，并且例如是对B血清型铜绿假单胞菌株（ATCC 33349）的调理素活性的EC50为5μg/ml或更小（例如，4μg/ml或更小或3.5μg/ml或更小）的抗体。当如本发明的应用实施例中所述，分别使用B血清型铜绿假单胞菌株（ATCC 27578）和B血清型铜绿假单胞菌株（ATCC BAA-47）并采用使用包含FITC-标记的铜绿假单胞菌的人多形核白细胞的荧光强度作为指标的检测方法评估本发明抗体“2759”的调理素活性时，其EC50分别为0.42和0.72μg/ml。本发明的抗-B血清型LPS抗体优选具有这种优异调理素活性，并且为例如对B血清型铜绿假单胞菌株（ATCC27578）或B血清型铜绿假单胞菌株（ATCC BAA-47）的调理素活性的EC50为1μg/ml或更小（例如，0.8μg/ml或更小，0.7μg/ml或更小或0.6μg/ml或更小或0.5μg/ml或更小）的抗体。

此外，当如本发明应用的实施例中所述，通过使用B血清型铜绿假单胞菌株（ATCC 33349）并采用使用包含FITC-标记的铜绿假单胞菌的人多形核白细胞的荧光强度作为指标的检测方法评估本发明的抗-B血清型LPS抗体的调理素活性时，在30μg/ml下抗-B血清型LPS抗体的平均荧光强度（MFI）值优选不小于1000μg/ml的青霉酮的平均荧光强度（MFI）的5倍（例如，不小于8倍，不小于10倍，或不小于12倍）。同时，当使用B血清型铜绿假单胞菌株（ATCC 27578）或B血清型铜绿假单胞菌株（ATCC BAA-47）评估本发明的抗-B血清型LPS抗体的调理素活性时，在10μg/ml下抗-B血清型LPS抗体的平均荧光强度（MFI）值优选不小于1000μg/ml的青霉酮的平均荧光强度（MFI）（例如，不小于1.5倍，不小于2倍）。

根据另一个优选实施方案，本发明的抗-B血清型LPS抗体具有对铜绿假单胞菌的凝集活性。当使用B血清型铜绿假单胞菌株（ATCCBAA-47）时，本发明的抗体“3099”表现出5659的优异的单位量（μg）IgG的凝集效价。由于具有如此优异的凝集活性，用作药物的本发明的抗-B血清型LPS抗体甚至在低剂量下即可产生有效调理素活性，并因此可预期预防感染的作用。当使用B血清型铜绿假单胞菌株（ATCCBAA-47）时，本发明的抗-B血清型LPS抗体优选具有1000或更大（例如，2000或更大，3000或更大，4000或更大，或5000或更大）的单位量（μg）IgG的凝集效价。

根据另一个实施方案，本发明的抗-B血清型LPS抗体对铜绿假单胞菌全身性感染具有抗菌作用。本发明的抗体“3099”和抗体“2754”中的每一个都对B血清型铜绿假单胞菌株的全身性感染表现出抗菌作用。令人惊讶地，当使用全身性感染B/O2血清型铜绿假单胞菌株（ATCC 27578）的小鼠模型并通过使用青霉酮作为对照进行比较时，这些抗体中的每一个的抗菌作用的ED50值为青霉酮的ED50值的1/300或更小。特别地，对于全身性感染由ATCC 27578标识的铜绿假单胞菌株的小鼠模型，抗体“3099”的ED50值为青霉酮的ED50值的1/1000或更小。同时，当使用全身性感染B/O2血清型铜绿假单胞菌株（ATCCBAA-47）的小鼠模型并通过使用青霉酮作为对照进行比较时，这些抗体中的每一个的抗菌作用的ED50值为青霉酮的ED50值的1/100或更小。因此，当使用全身性感染B/O2血清型铜绿假单胞菌株（ATCC27578）的小鼠模型时，本发明的抗-B血清型LPS抗体的ED50值优选为青霉酮的ED50值的1/300或更小（例如，1/400或更小、1/500或更小、1/600或更小、1/800或更小或1/1000或更小）。当使用全身性感染B/O5血清型铜绿假单胞菌株（ATCC BAA-47）小鼠模型时，本发明的抗-B血清型LPS抗体的ED50值优选为青霉酮的ED50值的1/100或更小（例如，1/150或更小、或1/200或更小）。

本发明的抗-B血清型LPS抗体可单独具有上述活性的任一种，但优选同时具有多种活性。

本发明的抗-B血清型LPS抗体的另一个优选实施方案是含有包括本发明确定的抗体（3099或2745）的轻链CDR1至3的轻链可变区和包括其重链CDR1至3的重链可变区的抗体。其具体实例包括抗体（i）和（ii）：

（i）含有包括轻链CDR1至3（记载于SEQ ID NO:1至3的氨基酸序列）的轻链可变区和包括重链CDR1至3（记载于SEQ ID NO:4至6的氨基酸序列）的重链可变区的抗体，例如，其中轻链可变区包括记载于SEQ ID NO:7的氨基酸序列且重链可变区包括记载于SEQ IDNO:8的氨基酸序列的抗体；和

（ii）含有包括轻链CDR1至3（记载于SEQ ID NO:9至11的氨基酸序列）的轻链可变区和包括重链CDR1至3（记载于SEQ ID NO:12至14的氨基酸序列）的重链可变区的抗体，例如，其中轻链可变区包括记载于SEQ ID NO:15的氨基酸序列且重链可变区包括记载于SEQID NO:16的氨基酸序列的抗体。

本发明还提供含有抗体的轻链、重链和其可变区的任一种的肽，该肽含有本发明的抗体（3099或2745）中确定的CDR。

含有抗体的轻链、重链和其可变区的任一种的肽——该肽含有抗体3099的CDR——的实例包括以下肽（i）和（ii）：

（i）含有本发明抗体的轻链或轻链可变区的肽，该肽含有记载于SEQ ID NO:1至3的氨基酸序列，例如，含有记载于SEQ ID NO:7的氨基酸序列的肽；以及

（ii）含有本发明抗体的重链或重链可变区的肽，该肽含有记载于SEQ ID NO:4至6的氨基酸序列，例如，含有记载于SEQ ID NO:8的氨基酸序列的肽。

含有抗体的轻链、重链和其可变区的任一种的肽——该肽含有抗体2745的CDR——的实例包括以下肽（i）和（ii）：

（i）含有本发明抗体的轻链或轻链可变区的肽，该肽含有记载于SEQ ID NO:9至11的氨基酸序列，例如，含有记载于SEQ ID NO:15的氨基酸序列的肽；以及

（ii）含有本发明抗体的重链或重链可变区的肽，该肽含有记载于SEQ ID NO:12至14的氨基酸序列，例如，含有记载于SEQ ID NO:16的氨基酸序列的肽。

功能性抗体可通过用接头将这些肽连接而制备。

一旦得到特异性抗-B血清型LPS抗体（3099或2745），本领域技术人员即可确定所述抗体识别的表位，并制备与所述表位结合的多种抗体。本发明还提供识别与抗体“3099”和抗体“2745”的任一种所识别的表位相同的表位的抗体。可以想象这种抗体具有抗体“3099”和抗体“2745”的任一种的上述性质（对铜绿假单胞菌结合活性的血清型特异性、调理素活性、凝集活性以及对全身性感染的抗菌活性）。

可以例如通过如本发明应用的实施例中记载的全细胞ELISA方法，评估抗体与铜绿假单胞菌的结合。因此，可以测定所述抗体对其表现结合活性的铜绿假单胞菌株血清型的范围。可以，例如，如本发明应用的实施例中所述，通过使用包含FITC-标记的铜绿假单胞菌的人多形核白细胞的荧光强度作为指标的检测方法评估调理素活性。同时，可以如本发明应用的实施例中所述，通过检测抗体对系列稀释的细菌细胞的凝集能力，评估例如作为单位量IgG的凝集效价形式的凝集活性。同时，可以如本发明应用的实施例中所述，例如由被给予抗体的模型小鼠的存活率，评估对全身性感染的抗菌活性。

本发明的抗体通常是人类抗体。然而，通过使用本发明确定的表位上的信息或使用本发明确定的人抗体的CDR区或可变区，本领域技术人员可以制备各种抗体，例如，嵌合抗体、人源化抗体和鼠抗体以及人抗体，也可制备这些抗体的功能片段。为了作为药物给予人，从减小副作用的角度出发，本发明的抗体最优选人抗体。

在本发明中，“人抗体”指的是所有区均源自人的抗体。为制备人抗体，可采用本发明实施例中记载的方法。作为其他方法，例如，可使用其中使用能够通过免疫产生人抗体集合的转基因动物（例如老鼠）的方法。这种人抗体制备方法是已知的（例如，Nature,362:255-258(1992),Intern.Rev.Immunol,13:65-93(1995)；J.Mol.Biol,222:581-597(1991)；Nature Genetics,15:146-156(1997)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:722-727(2000)；日本未审查专利申请公开号平10-146194；日本未审查专利申请公开号平10-155492；日本专利2938569；日本未审查专利申请公开号平11-206387；以及国际申请日本阶段公开平8-509612；以及国际申请日本阶段公开平11-505107）。

在本发明中，“嵌合抗体”指的是通过将一个物种的抗体的可变区与另一物种的抗体的恒定区连接得到的抗体。例如，这种嵌合抗体可如下所述得到。用抗原免疫小鼠。将编码与所述抗原结合的抗体可变部（可变区）的部分从编码所述小鼠的单克隆抗体的基因中切下。将该部分与编码人骨髓源性抗体恒定部（恒定区）的基因连接。将这些连接的基因结合纳入表达载体。随后将所述表达载体导入产生嵌合抗体的宿主（参考，例如，日本未审查专利申请公开号平8-280387；美国专利号4816397；美国专利号4816567；和美国专利号5807715）。同时，在本发明中，“人源化抗体”指的是通过将非人源抗体的抗原结合位点（CDR）的基因组序列移植到人抗体的基因上（CDR移植）而得到的抗体。这种嵌合抗体的制备方法是已知的（参见，例如，EP239400、EP125023、WO90/07861、和WO96/02576）。在本发明中，抗体的“功能片段”意味着抗体的一部分（部分片段），其保留了特异性识别产生该部分的抗体的抗原的能力。功能片段的具体实施例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、可变区片段（Fv）、二硫键连接的Fv、单链Fv(scFv)、sc(Fv)2、双抗体（diabody）、多特异性抗体及其聚合体。

本文中，“Fab”是指由一条轻链的一部分与一条重链的一部分形成的、免疫球蛋白的单价抗原结合片段。Fab可通过抗体的木瓜蛋白酶消化或重组方法得到。“Fab′”与Fab的不同之处在于，在Fab′中，包括一或多个抗体铰链区的半胱氨酸的少量残基被加至重链CH1区的羧基末端。“F(ab’)2”是指由全部两条轻链的部分与全部两条重链的部分构成的、免疫球蛋白的二价抗原结合片段。

“可变区片段（Fv）”是具有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。Fv是二聚体，其中重链可变区和轻链可变区通过非共价键牢固连接。“单链Fv(scFv)”包括抗体的重链可变区和轻链可变区，在所述“单链Fv(scFv)”中，这些区域存在于单条多肽链中。“sc(Fv)2”是通过用接头或类似物连接的两个重链可变区和两个轻链可变区得到的单链。“双抗体”是具有两个抗原结合位点的小抗体片段。该片段包括单条多肽链中与轻链可变区结合的重链可变区，且所述每个区域与另一条链中的互补区域成对。“多特异性抗体”是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。例如，这种多特异性抗体可通过两对免疫球蛋白重链/轻链的共表达制备，其中所述两条重链具有互不相同的特异性。

本发明的抗体包括氨基酸序列被修饰而不损害所需活性（对铜绿假单胞菌的结合活性及其广泛性或其特异性、调理素活性、凝集活性、对全身性感染或肺部感染的抗菌活性和/或其他生物学特性）的抗体。本发明抗体的氨基酸序列变体可通过将突变引入编码本发明抗体链的DNA或通过肽合成制备。所述修饰包括，例如，本发明抗体的氨基酸序列中一个或多个残基的置换、删除、添加和/或插入。所述抗体的氨基酸序列的修饰区可以是所述抗体的重链或轻链的恒定区或其可变区（构架区或CDR），条件是得到的抗体具有与那些未修饰的抗体等同的活性。可以想象对非CDR中的氨基酸的修饰对抗原结合亲和力具有相对小的影响。截至目前，存在筛检对抗原的亲和力通过CDR中氨基酸的修饰得以提高的抗体的方法（PNAS,102:8466-8471(2005)；ProteinEngineering,Design&Selection,21:485-493(2008)；国际公开号WO2002/051870；J.Biol.Chem.,280:24880-24887(2005)；和ProteinEngineering,Design&Selection,21:345-351(2008)）。

修饰的氨基酸的数量优选10个氨基酸或更少，更优选5个氨基酸或更少，且最优选3个氨基酸或更少（例如，2个氨基酸或更少，或1个氨基酸或更少）。氨基酸的修饰优选保守性置换。在本发明中，术语“保守性置换”意味着用具有化学上相似的侧链的不同氨基酸残基置换。具有化学上相似的氨基酸侧链的氨基酸类是本发明所属技术领域已知的。例如，氨基酸可分为酸性氨基酸（天门冬氨酸和谷氨酸），碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸和组氨酸），以及中性氨基酸。中性氨基酸可次分类为含有烃基的氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸）、含有羟基的氨基酸（丝氨酸和苏氨酸）、含硫氨基酸（半胱氨酸和甲硫氨酸）、含有酰胺基的氨基酸（天冬酰胺和谷氨酰胺）、含有亚氨基的氨基酸（脯氨酸），以及含有芳基的氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）。

对本发明抗体的修饰可以是对抗体的翻译后过程的修饰，例如糖基化位点数量或糖基化位置的变化。这可以改善，例如，抗体的ADCC活性。抗体糖基化通常为N联或O联糖基化。抗体糖基化极大依赖于用于表达所述抗体的宿主细胞。糖基化模式的改变可通过已知方法例如引入或缺失某种涉及碳水化合物产生的酶来进行（日本未审查专利申请公开号2008-113663，美国专利号5047335，美国专利号5510261，美国专利号5278299，国际公开号WO99/54342）。在本发明中，为了提高抗体稳定性的目的或其他目的，可以将进行脱酰胺的氨基酸或与进行脱酰胺的氨基酸相邻的氨基酸置换为不同的氨基酸从而防止脱酰胺。此外，可将谷氨酸置换为不同的氨基酸从而提高抗体的稳定性。本发明也提供稳定的抗体。

本发明抗体的多克隆抗体可如下得到。具体地，用抗原（LPS，具有LPS部分结构的分子，表面上暴露有LPS和具有LPS部分结构的分子的任一种的铜绿假单胞菌，等等）使免疫动物免疫。多克隆抗体可通过常规方法（例如，盐析、离心、透析、柱层析等）纯化从动物得到的抗血清获得。同时，除了本发明实施例中记载的方法，单克隆抗体还可通过标准杂交方法或标准重组DNA方法得到。

杂交方法的典型实例是Kohler&Milstein法（Kohler&Milstein,Nature,256:495(1975)）。用于该方法的细胞融合过程中的抗体生成细胞是被抗原（LPS，具有LPS部分结构的分子，表面上暴露有LPS和具有LPS部分结构的分子的任一种的铜绿假单胞菌，等等）免疫的动物（例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猴或山羊）的脾细胞、淋巴结细胞、外周血白细胞等。可以使用通过在培养基中引发抗体对上文记载类型的任何细胞以及提前从非免疫动物分离的淋巴结细胞起作用得到的抗体生成细胞。各种已知细胞株可以用作骨髓瘤细胞。抗体生成细胞和骨髓瘤细胞可以源自不同动物种，条件是所述抗体生成细胞和骨髓瘤细胞可以融合。然而，抗体生成细胞和骨髓瘤细胞优选源自相同动物种。杂交瘤细胞可通过，例如，从抗原免疫的小鼠得到的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞之间的细胞融合产生。随后，通过筛检杂交瘤细胞，可以得到产生LPS抗原特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。抗LPS抗原的单克隆抗体可以通过培养所述杂交瘤细胞或从注入所述杂交瘤细胞的哺乳动物腹水中得到。

所述重组DNA方法是一种如下以重组抗体的形式产生上述本发明抗体的方法。从杂交瘤细胞、B细胞等克隆编码本发明抗体或肽的DNA。将所克隆的DNA纳入合适的载体，并将该载体导入宿主细胞（例如，哺乳动物细胞株、大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞等）（例如，P.J.Delves,Antibody Production:Essential Techniques,1997WILEY,P.Shepherd and C.Dean Monoclonal Antibodies,2000OXFORD UNIVERSITY PRESS,Vandamme A.M.等,Eur.J.Biochem.192:767-775(1990)）。为表达编码本发明抗体的DNA，可以分别将编码重链和轻链的DNA纳入表达载体，并用其转化宿主细胞。或者，可将编码重链和轻链的DNA纳入单个表达载体，并用其转化宿主细胞（参考WO94/11523）。本发明的抗体可通过培养上述宿主细胞，并从所述宿主细胞或培养基分离和纯化而以基本上纯且同质的形式得到。为进行抗体的分离和纯化，可以使用任何用于多肽标准纯化的方法。当通过转基因动物生产技术产生纳入抗体基因的转基因动物（牛、山羊、绵羊、猪等），大量源自所述抗体基因的单克隆抗体也可从转基因动物的乳汁得到。

本发明也提供编码本发明上述抗体或肽的DNA，含有该DNA的载体、具有该DNA的宿主细胞，以及产生抗体的方法，该方法包括培养宿主细胞和收集抗体。

由于本发明的抗体具有上述活性，本发明的抗体可用于预防或治疗与铜绿假单胞菌有关的疾病。因此，本发明也提供用于预防或治疗与铜绿假单胞菌有关的疾病的药物组合物，该药物组合物包括作为活性成分的本发明抗体，以及用于预防或治疗与铜绿假单胞菌有关的疾病的方法，该方法包括将预防或治疗有效剂量的本发明抗体给予哺乳动物包括人类的步骤。除了人类,本发明的治疗或预防方法还可用于各种哺乳动物，包括，例如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、和兔。

与铜绿假单胞菌有关的疾病的实例包括由铜绿假单胞菌感染，包括耐多药铜绿假单胞菌感染引发的全身性感染疾病，例如，败血症、脑膜炎、和心内膜炎。其他实例包括：耳鼻喉领域的中耳炎和鼻窦炎；肺部领域的肺炎、慢性呼吸道感染和导管感染；外科领域中的术后腹膜炎和胆道中等等的术后感染；眼科领域的眼睑脓肿、泪囊炎、结膜炎、角膜溃疡、角膜脓肿、全眼球炎和眼眶感染；以及泌尿外科领域的尿路感染包括复杂性尿路感染、导尿管感染和肛门周围脓肿。此外，所述实例还包括烧伤（包括严重烧伤和呼吸道烧伤）、褥疮感染和囊性纤维化。

本发明的药物组合物或制剂可以以使用本发明的抗体作为活性成分且优选含有纯化的抗体组合物和其他组分——例如，盐水、葡萄糖水溶液或磷酸盐缓冲液——的组合物的形式使用。

必要时本发明的药物组合物可制成液体或冻干形式的制剂，且可任选含有可药用载体，例如，稳定剂、防腐剂和等渗剂。可药用载体的实例包括：甘露醇、乳糖、蔗糖和用于冻干制剂的人血清白蛋白；以及盐水、用于注射的水、磷酸盐缓冲液、和用于液体制剂的氢氧化铝。然而，所述实例不限于此。

给药根可据给药目标的年龄、体重和一般健康状况而不同。给药可通过口服和肠胃外给药（例如静脉给药、动脉给药和局部给药）的任何给药途径进行。然而，优选肠胃外给药。

药物组合物的剂量可根据患者的年龄、体重、性别和一般健康状况、铜绿假单胞菌感染严重性以及待给药抗体组合物的成分而变化。静脉给药的情况下，本发明的抗体组合物的剂量对于成年人通常为每天每kg体重0.1至1000mg，优选1至100mg。

本发明的药物组合物优选对可能出现铜绿假单胞菌感染的患者提前给药。

由于本发明的抗体与暴露于铜绿假单胞菌细胞表面的LPS结合，本发明的抗体也可用作铜绿假单胞菌感染诊断剂。

当将本发明的抗体制备为诊断剂时，该诊断剂可通过采用任何适用于此目的的方法以任何剂型得到。例如，对腹水、含有目的抗体的培养基或纯化抗体测量抗体效价并用PBS（含有盐水的磷酸盐缓冲液）等适当稀释；随后，向其中加入防腐剂如0.1%的叠氮化钠。或者，对吸收至乳胶等的本发明抗体测量抗体效价并适当稀释，并向其中加入防腐剂待用。如上文所述的与乳胶颗粒结合的本发明抗体是作为诊断剂的优选剂型之一。在这种情况下，合适的树脂材料，例如，聚苯乙烯、聚乙烯基甲苯或聚丁二烯的乳胶适合作为乳胶。

根据本发明，提供使用本发明抗体诊断铜绿假单胞菌感染的方法。本发明的诊断方法可如下进行，收集生物样本如哺乳动物包括人——其可能出现铜绿假单胞菌感染——的痰、肺灌洗液、脓、眼泪、血液或尿，随后将收集的样本与本发明的抗体接触，并测定是否发生抗原-抗体反应。

根据本发明，提供用于检测铜绿假单胞菌存在的试剂盒，该试剂盒至少包括本发明的抗体。

本发明的抗体可以被标记。此检测试剂盒通过检测抗原-抗体反应检测铜绿假单胞菌的存在。

因此，如果需要，本发明的检测试剂盒还可包括用于进行抗原-抗体反应的各种试剂，例如，第二抗体、显色剂、缓冲液、说明书和/或用于ELISA方法的器械等。

实施例

下文中，本发明将在实施例的基础上更具体地描述。然而，本发明并不限于这些实施例。

实施例1抗LPS抗体的克隆

（1）献血者招募

从慢性PA肺部感染的囊性纤维化患者和健康志愿者采集250ml血液样本。捐赠者通常具有良好的健康状态且呈现大的年龄范围、慢性PA感染年数范围以及免疫反应状态范围。其他准入标准是年龄超过18岁，体重超过50千克以及正常血红蛋白水平。所有捐赠经丹麦国家生物医学研究伦理委员会核准。

对每一血液样本进行以下类型的分析：i）FACS分析，测定循环血浆成浆细胞和浆细胞的量；ii）ELISPOT分析，测定对具体LPS抗原特异的循环抗体生成细胞的量；iii）ELISA分析，测定对具体LPS抗原特异的免疫球蛋白的存在。

选择具有高百分比的对LPS抗原特异的成浆细胞的捐赠样本用于下文记载的Symplex法（参考WO2005/042774）。

（2）人类成浆细胞的FACS分选

用于此过程的初始原料是MACS-纯化CD19阳性B-细胞。这些细胞通常冷冻储藏并随后在每次分选前部分解冻。活成浆细胞通过对细胞染色确定为CD19、CD38、λ-轻链和死细胞。

刚刚解冻的细胞用4ml FACS PBS清洗两次，稀释至每40μl FACSPBS含有1x10⁶细胞。在4°C下向每1x10⁶细胞中加入以下试剂：10μlCD19-FITC、20μl CD38APC和10μl λ-PE并于黑暗中在冰上放置20分钟。用2ml FACS缓冲液清洗样本两次并重悬浮于1ml FACS PBS中，随后加入碘化丙啶（1:100）。细胞悬浮液通过50μm falcon针头过滤器（FACS过滤器）过滤，并准备直接分选入Symplex PCR板中（参见下一部分）。分选后，将所述PCR板在300xg下离心1分钟并保存在-80°C下备用。

（3）同源VH和VL对的连接

为了使编码源自相同B细胞的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的序列配对，将编码VH和VL的序列在被选择作为浆细胞的单个细胞上连接。该过程使用基于一步多重重叠延伸RT-PCR继之以巢式PCR的两步PCR过程。本实施例中使用的引物混合物仅仅扩增κ轻链。同源VH和VL序列连接的机理示于图1。

将产生的96孔PCR板解冻并将分选的细胞用作所述多重重叠延伸RT-PCR的模板。在所述单个细胞分选前加入每个孔的分选缓冲液含有反应缓冲液（一步RT-PCR缓冲液；Qiagen）、用于RT-PCR的引物（参考表2）和RNase抑制剂（RNasin,Promega）。在此中补充一步RT-PCR酶混合液(25x稀释液；Qiagen）和dNTP混合液（每种200μM）以得到20μl反应体积中的给定最终浓度。

表2

将所述板在55°C下孵育30分钟以实现每个细胞的RNA反转录。反转录后，使所述板进行如下PCR循环：94°C下10分钟；35个循环（94°C下40秒，60°C下40秒，72°C下5分钟）；72°C下10分钟。

所述PCR反应在配有有利于高通量的24个96孔板剥离密封篮(Peel Seal Basket)的H20BIT热循环仪(ABgene)中进行。循环后所述PCR板保存在-20°C下。

对于巢式PCR步骤，96孔PCR板在每个孔（20μl反应体系）中用以下混合物准备以得到给定最终浓度：1x快速开始缓冲液（Roche）、dNTP混合液（各200μM）、巢式引物混合物（参见表1）、Phusion DNA聚合酶（0.08U;Finnzymes）和快速开始高保真酶混合液(FastStart HighFidelity Enzyme Blend)（0.8U;Roche）。从所述多重重叠延伸PCR反应体系中转移1μl作为所述巢式PCR的模板。使所述巢式PCR板进行以下热循环：35个循环（95°C下30秒，60°C下30秒，72°C下90秒），72°C下10分钟。

将随机选择的反应产物在1%琼脂糖凝胶上分析以验证大约1050个碱基对（bp）的重叠延伸片段的存在。该板保存在-20°C下直到进一步处理所述PCR片段。合并来自所述巢式PCR的连接的VH和VL编码对的集合——但不混合来自不同捐赠者的VH和VL编码对——并通过制备性1%琼脂糖凝胶电泳纯化。

（4）将同源VH和VL编码序列对插入筛选载体

为了确定对LPS具有结合特异性的抗体，将得到的VH和VL编码序列表达为全长抗体。这包括将所述VH和VL编码对的集合插入表达载体并转染到宿主细胞中。

采用两步克隆法以产生含有连接的VH和VL编码对的表达载体的集合。统计上，如果表达载体集合含有10倍于用于产生筛选集合的同源配对VH和VL PCR产物数量的重组质粒，则有99%可能性出现所有不同基因对。因此，如果得到400个重叠延伸V基因片段，则产生至少4000个克隆的集合用于筛选。

简言之，将连接的VH和VL编码对的集合的纯化PCR产物用XhoI和NotI DNA核酸内切酶在引入到所述PCR产物末端的识别位点切断。将切断并纯化的片段通过标准连接过程连接到XhoI/NotI消化哺乳动物IgG表达载体OO-VP-002（图2）中。将连接混合液电穿孔至大肠杆菌中并加至含有适当抗生素的2xYT板并在37°C下孵育过夜。使用通过标准DNA纯化方法（Qiagen）从回收自所述板的细胞纯化扩增的载体集合。

通过使用AscI和NheI核酸内切酶切断来处理所述质粒用于启动子-前导序列片段的插入。这些酶的酶切位点位于VH和VL编码基因对之间。载体纯化后，通过常规连接方法将AscI-NheI消化双向哺乳动物启动子-前导序列片段插入到所述AscI和NheI酶切位点。在大肠杆菌中扩增所述连接载体并使用常规方法纯化所述质粒。通过常规过程将产生的筛选载体集合转化到大肠杆菌中。将得到的菌落置于384孔样板中并保存。转移至384孔板的菌落数量超过使用的PCR产物数量的至少3倍，因此有95%的可能性存在所有得到的不同V基因对。

M166表达为嵌合IgG抗体。M166的可变基因氨基酸序列源自专利WO2002/064161所记载的对铜绿假单细胞菌PcrV蛋白特异的小鼠抗体。可变基因在GENEART AG合成（BioPark,Josef-Engert-Str.11,93053 Regensburg,Germany）并在该过程中将小鼠轻链可变基因与人类κ恒定基因连接。小鼠重链可变基因和嵌合轻链基因被插入包含人类重链恒定基因的剩余部分以及哺乳动物细胞中基因表达所需要素的表达载体。

（5）Symplex集合的表达

将样板上的菌落接种于384孔板中的培养基中，并培养过夜。使用TempliPhi DNA扩增试剂盒（Amersham Biosciences）根据其手册由每个孔制备转染DNA。转染前一天，将Flp-In^TM-CHO细胞（Invitrogen）以每孔3000细胞接种于384孔板中（在20μl培养基中）。使用FuGENE6(Roche)根据其手册将扩增的DNA导入细胞。培养3天后，收集含有全长抗体的上清液，并保存用于抗原特异性筛检。

（6）筛检对LPS的结合

通过ELISA方法，使用与纯化LPS分子混合物的结合作为指标进行抗体文库的筛检，所述LPS分子从相关铜绿假单胞菌型菌株分离。Nunc MaxiSorp 384孔板在4°C下用LPS混合物（每次分析最多含有6个血清型）包被过夜，所述LPS混合物通过用50mM碳酸盐缓冲液（pH：9.6）稀释纯化的LPS分子混合物得到，从而对于每种LPS血清型含有10μg/ml的纯化LPS。将所述孔板用50μl含有2%脱脂乳（SM）的PBS-T（PBS+0.05%吐温）封闭，并随后用PBS-T清洗一次。向每个孔中加入15μl抗体上清液并在室温下孵育1.5小时。随后，用PBS-T清洗板一次。为了检测与孔结合的抗体，向每个孔中加入用2%SM-PBS-T稀释10,000倍的第二抗体（HRP-Goat-anti-human IgG,Jackson），随后在室温下孵育1小时。用PBS-T清洗板一次，随后向每个孔中加入25μl底物（Kemen-tec Diagnostics,商品目录号4390）。然后孵育5分钟。孵育后，加入25μl 1M硫酸终止所述反应。通过450nm-ELISA酶标仪检测特异性信号。

（7）序列分析和克隆选择

从原始样板（384孔型）回收ELISA中确定为LPS特异性的克隆并置于新板中。从所述克隆分离DNA并提交用于V基因的DNA测序。比对序列并选择所有不同的克隆。所得序列的多重比对显示每个特定克隆的唯一性并能确定唯一的抗体。确定了多个遗传上不同的抗体序列簇。每簇相关序列可能源自常规前体克隆的体细胞超突变。总之，从每一簇选择1至2个克隆用于验证序列和特异性。

（8）序列和特异性验证

为了验证所述抗体编码克隆，制备DNA质粒并以2ml规模进行FreeStyl CHO-S细胞(Invitrogen)的转染用于表达。转染96小时后采收上清液。用常规抗-IgG ELISA评估表达水平，并通过LPS特异性ELISA测定特异性。

（9）确定抗体

由此，确定的抗-LPS抗体和CDR序列以及确定的抗-LPS抗体的可变区如下。注意确定的抗-LPS抗体的恒定区序列记载于WO2005/042774。

<抗-B血清型LPS抗体>

“3099”

SEQ ID NO:1至3··轻链CDR 1至3的氨基酸序列

SEQ ID NO:4至6··重链CDR 1至3的氨基酸序列

SEQ ID NO:7··轻链可变区氨基酸序列

SEQ ID NO:8··重链可变区氨基酸序列

SEQ ID NO:25··轻链可变区碱基序列

SEQ ID NO:26··重链可变区碱基序列

“2745”

SEQ ID NO:9至11··轻链CDR 1至3的氨基酸序列

SEQ ID NO:12至14··重链CDR 1至3的氨基酸序列

SEQ ID NO:15··轻链可变区氨基酸序列

SEQ ID NO:16··重链可变区氨基酸序列

SEQ ID NO:27··轻链可变区碱基序列

SEQ ID NO:28··重链可变区碱基序列

广谱抗LPS抗体

“2459”

SEQ ID NO:17至19··轻链CDR 1至3的氨基酸序列

SEQ ID NO:20至22··重链CDR 1至3的氨基酸序列

SEQ ID NO:23··轻链可变区氨基酸序列

SEQ ID NO:24··重链可变区氨基酸序列

SEQ ID NO:29··轻链可变区碱基序列

SEQ ID NO:30··重链可变区碱基序列

实施例2抗-B血清型LPS抗体分析

（1）LPS纯化

将表3中示出的各种血清型的每种铜绿假单胞菌株悬浮在5ml LB培养基中。使用这种细菌细胞悬浮液，通过10倍连续稀释制得1至104倍稀释液。将这些稀释液在37°C下摇动培养6小时。培养后，从可观察到细菌生长的稀释液中具有最大稀释因子的稀释液体中取出菌液。将这种菌液悬浮于单独制备的稀释因子为1000的LB培养基中，并随后在37°C下摇动培养过夜。培养后，将液体在5000×g下离心20分钟，从而收集细菌细胞。测定细菌细胞的重量，并随后向所述细菌细胞加入纯净水至以湿重计120mg/ml。此外，向细菌细胞中加入提前加热到68°C的等量90%苯酚溶液(NACALAI TESQUE,INC.)，并将混合物搅拌20分钟。随后，间歇搅拌下将混合物在68°C水浴中加热20分钟。然后，冷却后，将混合物在5000×g下离心20分钟。收集水层，用纯净水透析，并冻干。得到的产物用作各自LPS。

（2）A带LPS纯化

将上文（1）中从G血清型铜绿假单胞菌株ATCC 27584抽提的LPSG用作原料。将该LPS再次悬浮在水中用于注射，并重复两次超速离心（40000rpm,3小时）从而移除核酸。将收集的沉淀物冻干。将此处得到的LPS G通过凝胶过滤柱（HiPrep 26/60 Sephacryl S-200HR,GEhealthcare bioscience,17-1195-01）粗分。为进行纯化操作，使用AKTAexplore 10S（GE healthcare bioscience）。作为流动相，使用含有0.2%脱氧胆酸钠（NACALAI TESQUE,INC.，10712-54）、0.2M NaCl（NACALAI TESQUE,INC.,31319-45）和5mM EDTA（NACALAITESQUE,INC.,15105-35）的20mM Tris-HCl缓冲液（NACALAITESQUE,INC.,35406-75）（pH:8.3）。为进行检测，使用差式折光计（SHIMAZU，RID-10A）。得到的粗纯化级分用纯净水透析过夜，并冻干。将冻干的材料再次悬浮于0.5M NaCl溶液，并向其中加入10倍量的乙醇从而引起LPS沉淀。再次用70%乙醇清洗沉淀物，以移除剩余表面活性剂。随后，将LPS冻干，悬浮于0.1N NaOH（NACALAITESQUE,INC.,31511-05）和0.2M NaBH4（NACALAI TESQUE,INC.,31228-22）溶液中，并在37°C下反应24小时。因此，根据记载于Eur.J.BioChem.167,203-209(1987)的方法，仅所含的B带LPS分解。将该反应液体用1%乙酸（NACALAI TESQUE,INC.，00211-95）中和，通过超滤（Amicon Ultra-15,MWCO 10000,Millipore）浓缩，并随后再次通过凝胶过滤柱（Superdex peptide 10/300GL,GE healthcarebioscience,17-5176-01）。收集使用PBS(-)（Sigma-Aldrich Corporation,D1408）作为流动相洗脱的部分。随后，通过超滤将缓冲液替换为纯净水并浓缩。然后，进行冻干以得到纯净A带LPS。

（3）蛋白质印迹和全细胞ELISA

-蛋白质印迹-

将冻干的在实施例2（1）中制备的由各种血清型的ATCC菌株得到的每种LPS和实施例2（2）中纯化的A带LPS溶解在PBS中至1mg/ml。将溶液与等量的样本缓冲液（62.5mM Tris-HCL(pH:6.8),5%2-巯基乙醇,2%SDS,20%丙三醇,0.005%溴酚蓝）混合，并在使用前于100°C下加热10分钟。将10μl LPS加入16孔型5-20%或15%SDS-PAGE（XV PANTERA Gel,DRC）的每个孔中，随后电泳15分钟。在使用半干印迹仪（AE-6677,ATTO corporation）或干凝胶印迹仪（iBlotdry gel blotting system,Invitrogen)转移至硝酸纤维膜后，在室温下使用Immunoblock^TM（Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.）进行封闭30分钟。在TBST（含有0.05%吐温20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水）中用5%Immunoblock^TM将抗体样本稀释至3或10μg/ml，并与所述转移膜在4°C下反应一天一夜。用TBST清洗3次，每次10分钟后，将所述转移膜浸入反应液并在37°C反应1小时，所述反应液通过用在TBST（1:5000）中的5%Immunoblock^TM稀释羊抗人IgG（Fc）抗体HRP缀合物(Kirkegaard&Perry Laboratories,Inc.)得到。随后，将所述转移膜用TBST清洗3次，每次10分钟后，根据ECL PLUS免疫印迹检测系统（GE Healthcare,Code:RPN2132）的手册在室温下进行反应2分钟。通过FLA-3000荧光成像分析仪（FUJIFILMCorporation）检测化学发光。表3显示结果。

在向其添加抗体2745和抗体3099作为第一抗体的每个膜上，仅在从临床上经常遇到的B血清型菌株得到的LPS（由11种血清型ATCC菌株得到的LPS之一）的低分子量区至高分子量区中观察到假定对应于包括O抗原的B带LPS的多带。当使用从其他B血清型菌株ATCC33349（B/O2）、33352（B/O5）、33363（B/O160）和43732（B/O20）得到的LPS时，作为代表的抗体3099表现出相同结果。此外，抗体3099对纯化的A带LPS不表现出任何反应活性。因此，可以确认这些抗体特异性识别B血清型LPS的B带LPS。

表3

NT:未测试

ND:未检出

-全细胞ELISA(1)-

用于固定的细菌悬液是通过用PBS清洗在LB培养基中培养过夜的各种血清型的铜绿假单胞菌株的细菌悬液，并将经清洗的材料重悬浮从而使每种10倍稀释的细菌悬液在595nm的吸光度为0.20至0.23而制备的初始细菌悬液。将所述细菌悬液以每孔100μl置于96孔ELISA板（F96MaxiSorp Nunc-Immuno Plate,Nalge Nunc International K.K.）中，并在4°C下进行固定过夜。随后，用200μl TBS进行一次清洗。将封闭缓冲液（含有2%牛血清白蛋白的TBS）加入每个孔中，并在室温下进行封闭30分钟。然后，将100μl用样本缓冲液（含有1%牛血清蛋白的TBS）稀释的抗-B血清型抗体2745(1μg/ml)加入每个孔中，并在37°C下反应2小时。随后，进行3次清洗，每次用200μl清洗缓冲液（含有0.05%吐温20的TBS）。将100μl用样本缓冲液稀释10000倍的第二抗体羊抗人IgG（Fc）抗体HRP缀合物（Kirkegaard&PerryLaboratories,Inc.）加入每个孔中，并在37°C下反应1小时。随后，用清洗缓冲液进行3次清洗。将100μl显色底物（TMB MicrowellPeroxidase substrate System,Kirkegaard&Perry Laboratories,Inc.）加入每个孔中，并在暗处进行反应。然后，用1M磷酸溶液终止所述酶反应，并测定在450nm的吸光度。表4显示结果。可以确认，当认为吸光度大于0.25为阳性时，抗体2745仅与B血清型亚型菌株（O2、5、16和20）有结合能力。抗体2745表现出对B血清型亚型菌株的特异性。

表4

ATCC	血清型	2745	青霉酮
				27577	A/O3	0.043	0.022
27578	B/O2	0.492	0.025
				33349	B/O2	0.381	-0.012
BAA-47	B/O5	0.780	-0.034
				33352	B/O5	0.825	0.022
33363	B/O16	0.673	0.009
				43732	B/O20	0.776	0.021
33353	C/07	0.026	0.015
				27580	D/O9	0.004	0.014
29260	E/O11	0.024	0.054
				27582	F/O4	0.046	0.007
27584	G/O6	0.007	0.013
				27316	H/O10	0.012	0.012
27586	I/O1	0.024	0.076
				21636	M	0.003	0.012

-全细胞ELISA(2)-

对抗-B血清型LPS抗体3099（1.0μg/ml）进行全细胞ELISA，使用总共31个菌株，其还包括各种血清型菌株。表5显示结果。标准如下：吸光度小于0.25的情况标注-；吸光度为0.25或更大但小于0.5的情况标注+；吸光度为0.5或更大但小于0.75的情况标注++；吸光度为0.75或更大的情况标注+++。作为对照的人类免疫球蛋白制剂，青霉酮（TEIJIN PHARMA LIMITED），对所述31个菌株没有表现出结合能力。相比之下，抗体3099仅对B血清型菌株亚型（O2、5、16和20）表现出结合能力，其中一个呈+++，三个呈++，两个呈+。抗体3099也对O18血清型菌株——其具有与B亚型菌株的O抗原结构相似的O抗原——呈++，且对其他菌株呈-。抗体3099表现出对B血清型亚型菌株和O18血清型菌株的特异性。

表5

-全细胞ELISA(3)-

测试本发明的抗-B血清型LPS抗体3099与MEIJI SEIKAKAISHA,LTD拥有的B/O5血清型的耐多药铜绿假单胞菌（MDRP）的两种菌株的结合能力。标准如下：吸光度小于0.25的情况标注-；吸光度为0.25或更大但小于0.5的情况标注+；吸光度为0.5或更大但小于0.75的情况标注++；吸光度为0.75或更大的情况标注+++。作为对照的人类免疫球蛋白制剂，青霉酮（TEIJIN PHARMA LIMITED，1.0μg/ml），完全未对两种测试菌株表现出结合能力。相比之下，尽管存在抗生素耐药性，抗体3099（1.0μg/ml）对所述两种菌株呈++，表现出对MDRP的强结合能力。表6显示结果。

表6

（4）交叉反应试验

为测试抗-B血清型LPS抗体3099（1.0μg/ml）的交叉反应，以与上文（1）相同的方法使用各种革兰阴性和革兰阳性致病细菌进行全细胞ELISA。表7显示结果。抗-B血清型LPS抗体3099特异性识别并与B/O5血清型ATCC BAA-47菌株牢固结合，但不与其他细菌菌株反应。

表7

（5）凝集活性

使用铜绿假单胞菌ATCC BAA-47菌株（B/O5血清型）测量了抗体3099的凝集活性。将该菌株于37°C下在胰胨豆胨琼脂培养基中培养过夜。随后，在将一些菌落悬浮于LB培养基中后，将所述培养基于37°C下摇动培养过夜。用PBS清洗细菌培养物并重悬浮于PBS中。随后，向其中加入含有4%多聚甲醛（Wako Pure Chemical Industries,Ltd.）的磷酸盐缓冲液，并进行30分钟或更长时间的灭活处理。此处理后的产物用于测试。将灭活ATCC BAA-47菌株悬浮于PBS中至蛋白质浓度为2mg/ml。用PBS系列稀释抗体3099（初始液体中IgG浓度：5.79mg/ml）。在96孔圆底板上将等量（8μl）的灭活ATCC BAA-47菌株悬浮液与系列稀释的抗体3099相互混合。

每种混合物在37°C下保持1小时或更长，或在室温下保持过夜或更长。随后，评估细菌细胞的凝集。结果显示，抗体3099的凝集效价为512，换句话说，最高达512倍稀释可观察到凝集，且单位量（μg）IgG的凝集效价为5659。同时，作为对照的免疫球蛋白制剂青霉酮（50mg/ml,TEIJIN PHARMA LIMITED）的凝集效价为4，换句话说，最高达4倍稀释可观察到凝集，且单位量（μg）IgG的凝集效价为0.04。

（6）调理素活性

-测试1-

在LB培养基中培养B血清型铜绿假单胞菌株ATCC 33349过夜。用4%多聚甲醛固定细菌培养物，并悬浮于1mM异硫氰酸-4-荧光素（FITC）溶液中在室温下放置1小时进行标记。通过使用单-聚分离培养基(Mono-Poly resolving medium)（DS Pharma Biomedical Co.Ltd.）的密度梯度离心法，从使用柠檬酸采集自健康捐赠者的50ml血液中纯化人类多形核白细胞（下文中，称为PMN），并制备为具有5×106细胞/ml的浓度。将20μl B血清型特异性抗体3099和FITC标记的铜绿假单胞菌株（30μl,5×10⁶个细胞）加入96孔圆底板，并在37°C下孵育15分钟。随后，将仔兔血清（10μl）和PMN（40μl,2×105个细胞）作为补充物加入，并将混合物再孵育30分钟进行吞噬作用。将该板转移至冰上，由此终止反应。附着在细胞表面的细菌的荧光通过含有0.2%台盼蓝（100μl）的PBS淬灭，并随后用0.5%多聚甲醛固定细胞。使用流式细胞仪（BECKMAN COULTER）测量了所述细胞的荧光（平均荧光强度，下文中简称MFI）。调理素活性计算为由包含FITC标记的铜绿假单胞菌株的PMN的荧光强度减去因PMN固有荧光引起的荧光强度而得到的数值。

结果显示，对于B血清型菌株ATCC 33349，不加入抗体的组的MFI值为0.63，加入抗-B血清型LPS抗体3099的MFI值浓度依赖性地提高，其中在30μg/ml下MFI值为49.26，且EC50为3.13μg/ml。用作对照的免疫球蛋白制剂青霉酮的MFI值在1000μg/ml下为3.93。

上述结果显示抗-B血清型LPS抗体3099对B血清型菌株——其在临床中经常遇到——具有很强的调理素活性。

-测试2-

在Mueller-Hinton琼脂培养基上各自培养B血清型铜绿假单胞菌株ATCC 27578（O2）和ATCC BAA-47（O5）过夜。随后，从中挑取3个菌落，接种在Luria-Bertani培养基中，并在37°C下摇动（180rpm）培养16小时。将培养基进行离心（2,000×g,10分钟,室温下）。得到的材料用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗一次，并随后悬浮于1mM异硫氰酸-4-荧光素（FITC）溶液中在室温下放置1小时进行标记。通过使用单-聚分离培养基（DS Pharma Biomedical Co.Ltd.）的密度梯度离心法，从使用柠檬酸采集自健康捐赠者的50ml血液中纯化人类多形核白细胞（下文中，称为PMN），并制备为具有5×10⁶细胞/ml的浓度。将20μl的抗-B血清型LPS抗体2745与FITC标记的铜绿假单胞菌株（30μl,5×10⁶个细胞）加入96孔圆底板，并在37°C下孵育15分钟。随后，将仔兔血清（10μl）和PMN（40μl,2×10⁵个细胞）作为补充物加入，并将混合物再孵育30分钟进行吞噬作用。将该板转移至冰上，由此终止反应。附着在细胞表面的细菌的荧光通过含有0.2%台盼蓝（100μl）的PBS淬灭，并随后用0.5%多聚甲醛固定细胞。使用流式细胞仪（BECKMAN COULTER）测量了细胞的荧光性（平均荧光强度，下文中简称MFI）。调理素活性计算为由包含FITC标记的铜绿假单胞菌株的PMN的荧光强度减去因PMN固有荧光引起的荧光强度而得到的数值。

作为结果，对于B血清型菌株ATCC 27578（O2），不加入抗体的组的MFI值为1.60，加入抗体2745的组的MFI值浓度依赖性地提高，其中在10μg/ml下MFI值为4.18，且EC50为0.42μg/ml。用作对照的免疫球蛋白制剂青霉酮（TEIJIN PHARMA LIMITED）的MFI值在1000μg/ml下为1.93。

同时，对于B血清型菌株ATCC BAA-47（O5），不加入抗体的组的MFI值为3.19，加入抗体2745的组的MFI值浓度依赖性地提高，其中在10μg/ml下MFI值为10.07，且EC50为0.72μg/ml。用作对照的免疫球蛋白制剂青霉酮（TEIJIN PHARMA LIMITED）的MFI值在1000μg/ml下为4.35。

上述结果显示抗-B血清型LPS抗体2745对B血清型铜绿假单胞菌株具有调理素活性。

（7）对全身性感染模型1的作用

如下准备中性白细胞减少症小鼠。将环磷酰胺（Sigma-Aldrich）以125mg/kg的总量在第-5、-2和0天共三次腹膜内注射至每只6周大BALB/c雄性小鼠（Charles river laboratories Japan,inc.,n=6），其中感染日标记为第0天。由此，外周血中嗜中性粒细胞减少。向小鼠以1.75×10⁵cfu/小鼠（约140LD50）的量腹膜内接种ATCC 27578菌株（B/O2血清型）导致全身性感染。随后立刻以200μl/小鼠的量经尾静脉注入样本，并根据其接种7天后的存活率判断对感染的保护活性。结果显示，以200、1000和5000μg/小鼠的量注射免疫球蛋白制剂青霉酮（TEIJIN PHARMA LIMITED）的对照组感染后第7天的存活率分别为16.7%、0%和0%，且ED50估算为>5000μg/小鼠。以40和200μg/小鼠的量注射抗-PcrV抗体M166的组在感染后第7天的全部存活率为0%，且ED50估算为>200μg/小鼠。相比之下，以0.32、1.6、8.0、40和200μg/小鼠的量注射抗-B血清型LPS抗体2745的组在感染后第7天的存活率分别为0、0、16.7、83.3和83.3%，表现出对感染的强保护活性，且ED50估算为11.71μg/小鼠。

（8）对全身性感染模型2的作用

如下准备中性白细胞减少症小鼠。将环磷酰胺（Sigma-Aldrich）以125mg/kg的总量在第-5、-2和0天共三次腹膜内注射至每只6周大BALB/c雄性小鼠（Charles river laboratories Japan,inc.,n=6），其中感染日标记为第0天。由此，外周血中嗜中性粒细胞减少。向小鼠以2.075×10⁵cfu/小鼠（约170LD50）的量腹膜内腹腔接种ATCC 27578菌株（B/O2血清型），由此引发全身性感染。随后立刻以200μl/小鼠的量经尾静脉注入样本，并根据其接种7天后的存活率判断对感染的保护活性。因此，以40、200、1000和5000μg/小鼠的量注射免疫球蛋白制剂青霉酮（TEIJIN PHARMA LIMITED）的对照组感染接种后第7天的存活率分别为50、0、50和50%，且ED50估算大于5000μg/小鼠。以0.32、1.6、8.0、40和200μg/小鼠的量注射抗-PcrV抗体M166的组在感染接种后第7天的存活率分别为16.7、16.7、16.7、0和16.7%，且ED50估算为>200μg/小鼠。相比之下，以0.32、1.6、8.0、40和200μg/小鼠的量注射抗-B血清型LPS抗体3099的组在感染接种后第7天的存活率分别为0、50、83.3、50和100%，表现出对感染的强保护活性，且ED50估算为4.61μg/小鼠。

（9）对全身性感染模型3的作用

如下准备中性白细胞减少症小鼠。将环磷酰胺（Sigma-Aldrich）以125mg/kg的总量在第-5、-2和0天共三次腹膜内注射至每只6周大BALB/c雄性小鼠（Charles river laboratories Japan,inc.,n=6），其中感染日标记为第0天。由此，外周血中嗜中性粒细胞减少。向小鼠以2.175×10⁴cfu/小鼠（约7.3LD50）的量腹膜内接种与上述（8）中使用的菌株不同的ATCC BAA-47菌株（B/O5血清型），由此引发全身性感染。随后立刻以200μl/小鼠的量经尾静脉注入样本，并根据其接种7天后的存活率判断对感染的保护活性。因此，以200、1000和5000μg/小鼠的量注射免疫球蛋白制剂青霉酮（TEIJIN PHARMA LIMITED）的对照组在感染后第7天的存活率分别为33.3、50和66.7%，且ED50估算为1000μg/小鼠。以8.0、40和200μg/小鼠的量注射抗-PcrV抗体M166在感染后第7天的所有存活率为0%，且ED50估算为>200μg/小鼠。相比之下，以0.32、1.6、8.0、40和200μg/小鼠的量注射抗-B血清型LPS抗体2475的组在感染后第7天的存活率分别为16.7、66.7、100、83.3和50%，表现出对感染的强保护活性，且ED50估算为0.59μg/小鼠。

（10）对全身性感染模型4的作用

如下准备中性白细胞减少症小鼠。将环磷酰胺（Sigma-Aldrich）以125mg/kg的总量在第-5、-2和0天共三次腹膜内注射至每只6周大BALB/c雄性小鼠（Charles river laboratories Japan,inc.,n=6），其中感染日标记为第0天。由此，外周血中嗜中性粒细胞减少。向小鼠以2.425×10⁴cfu/小鼠（约8.1LD50）的量腹膜内接种ATCC BAA-47菌株（B/O5血清型），由此引发全身性感染。随后立刻以200μl/小鼠的量经尾静脉注入样本，并根据其接种7天后的存活率判断对感染的保护活性。因此，以40、200、1000和5000μg/小鼠的量注射免疫球蛋白制剂青霉酮（TEIJIN PHARMA LIMITED）的对照组在感染后第7天的存活率分别为33.3、83.3、66.7和83.3%，且ED50估算为62.95μg/小鼠。以0.32、1.6、8.0和400μg/小鼠的量注射抗PcrV抗体M166的组在感染后第7天的存活率分别为0、0、0和33.3%，且ED50估算为>40μg/小鼠。相比之下，以0.064、0.32、1.6、8.0、40和100μg/小鼠的量注射抗-B血清型LPS抗体3099的组在感染后第7天的存活率分别为16.7、66.7、83.3、83.3、100和100%，且ED50估算为0.27μg/小鼠。

实施例3抗-B血清型LPS抗体3099和广谱抗-LPS抗体2459的结合

-调理素活性-

在LB培养基中培养B/O2血清型铜绿假单胞菌株ATCC 33349过夜。用4%多聚甲醛固定细菌培养物，并悬浮于1mM异硫氰酸-4-荧光素（FITC）溶液中在室温下放置1小时进行标记。通过使用单-聚分离培养基（DS Pharma Biomedical Co.Ltd.）的密度梯度离心法，从使用柠檬酸采集自健康捐赠者的50ml血液中纯化人类多形核白细胞（下文中，称为PMN），并制备为具有5×10⁶细胞/ml的浓度。将各20μl抗-B血清型LPS抗体3099、广谱抗-LPS抗体2459（该抗体识别铜绿假单胞菌株脂多糖A带LPS，且至少与A、B、C、D、E、G、H、I、M、N、O18和O19血清型铜绿假单胞菌株表面充分结合；轻链CDR 1至3的氨基酸序列记载于SEQ ID NO：17至19，重链CDR 1至3的氨基酸序列记载于SEQ ID NO：20至22，轻链可变区的氨基酸序列记载于SEQID NO：23，重链可变区的氨基酸序列记载于SEQ ID NO：24，轻链可变区的碱基序列记载于SEQ ID NO：29，重链可变区的碱基序列记载于SEQ ID NO：30.）和其与FITC标记的铜绿假单胞菌株的混合物样本（30μl,5×10⁶个细胞）加入96孔圆底板，并在37°C下孵育15分钟。随后，将仔兔血清（10μl）和PMN（40μl,2×10⁵个细胞）作为补充物加入，并将混合物再孵育30分钟进行吞噬作用。将该板转移至冰上，由此终止反应。附着在细胞表面的细菌的荧光通过含有0.2%台盼蓝（100μl）的PBS淬灭，并随后用0.5%多聚甲醛固定细胞。使用流式细胞仪（BECKMAN COULTER）测量了所述细胞的荧光（平均荧光强度，下文中简称MFI）。调理素活性计算为由包含FITC标记的铜绿假单胞菌株的PMN的荧光强度减去因PMN固有荧光引起的荧光强度而得到的数值。

作为结果，不加入抗体的组的MFI值为0.63，以0.12和1.11μg/ml加入抗-B血清型抗体3099组的MFI值分别为1.07和15.46。以0.12和1.11μg/ml加入广谱抗-LPS抗体2459的MFI值分别为5.76和29.16。同时，通过以0.25和2.22μg/ml加入等量混合抗-B血清型LPS抗体3099和广谱抗-LPS抗体2459获得的样本的组的MFI值分别为34.66和65.06。用作对照的免疫球蛋白制剂青霉酮（TEIJIN PHARMALIMITED）的MFI值在1000μg/ml下为3.93。

上文记载的结果显示通过结合抗-B血清型LPS抗体3099和广谱抗-LPS抗体2459能够预期加合或协同作用。

工业实用性

本发明的抗体具有优异的对铜绿假单胞菌的抗菌活性，并因此可用于治疗或预防铜绿假单胞菌感染。本发明的抗体可结合形成对广泛的临床分离菌株具有强抗菌活性的多克隆制剂。此外本发明的抗体是人抗体，且因此高度安全。因此，本发明的抗体极其适用于医疗保健。此外，本发明的单克隆抗体可用于铜绿假单胞菌感染的诊断，各种血清型铜绿假单胞菌株的检测和筛选，等等。